Summary
Denne protokol skitserer, hvordan et tredimensionelt cellekultursystem kan bruges til at modellere, behandle og analysere kromatinmodifikationer i en næsten fysiologisk tilstand.
Abstract
Flade kulturer af pattedyrceller er en meget anvendt in vitro-tilgang til forståelse af cellefysiologi, men dette system er begrænset til modellering af fast væv på grund af unaturligt hurtig cellereplikation. Dette er især udfordrende ved modellering af modent kromatin, da hurtigt replikerende celler ofte er involveret i DNA-replikation og har en heterogen polyploid population. Præsenteret nedenfor er en arbejdsgang til modellering, behandling og analyse af quiescent kromatinmodifikationer ved hjælp af et tredimensionelt (3D) cellekultursystem. Ved hjælp af denne protokol dyrkes hepatocellulære carcinomcellelinjer som reproducerbare 3D-sfæroider i en inkubator, der giver aktiv næringsdiffusion og lave forskydningskræfter. Behandling med natriumsmoyrat og natriumsuccinat inducerede en stigning i henholdsvis histonacetylering og succinylering. Stigninger i niveauer af histonacetylering og succinylering er forbundet med en mere åben kromatintilstand. Sfæroider indsamles derefter til isolering af cellekerner, hvorfra histonproteiner ekstraheres til analyse af deres posttranslationelle modifikationer. Histonanalyse udføres via væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri efterfulgt af en intern beregningsrørledning. Endelig vises eksempler på datarepræsentation for at undersøge hyppigheden og forekomsten af kombinatoriske histonmærker.
Introduction
Siden slutningen af det 19. århundrede er cellekultursystemer blevet brugt som model til at studere vækst og udvikling af celler uden for menneskekroppen 1,2. Deres anvendelse er også blevet udvidet til at undersøge, hvordan væv og organer fungerer i både sunde og syge sammenhænge 1,3. Suspensionsceller (f.eks. blodlegemer) vokser i petriskåle eller kolber problemfrit og i flæng, da de ikke samles i tredimensionelle (3D) strukturer in vivo. Celler afledt af faste organer kan vokse i enten todimensionelle (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i et monolag, der klæber til en flad overflade 2,4. 2D-cellekultursystemer er kendetegnet ved eksponentiel vækst og en hurtig fordoblingstid, typisk 24 timer til et par dage5. Celler i 3D-systemer vokser til at danne indviklede celle-celle-interaktioner, der modellerer vævslignende konglomerater tættere, og de er kendetegnet ved deres evne til at nå en dynamisk ligevægt, hvor deres fordoblingstid kan nå 1 måned eller længere5.
Præsenteret i dette papir er en innovativ metode til at dyrke 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer, der simulerer reduceret tyngdekraft6. Dette er et forenklet derivat af et cellekultursystem introduceret af NASA i 1990'erne7. Denne fremgangsmåde minimerer forskydningskræfterne, som forekommer i eksisterende metoder som spindekolber, og øger sfæroidreproducerbarheden6. Derudover øger den roterende bioreaktor aktiv næringsdiffusion, hvilket minimerer nekrotisk dannelse, der forekommer i systemer som hængende dråbecellekultur, hvor medieudveksling er upraktisk6. På denne måde vokser cellerne for det meste uforstyrret, hvilket muliggør dannelse af strukturelle og fysiologiske egenskaber forbundet med celler, der vokser i væv. C3A-hepatocytter (HepG2 / C3A) dyrket på denne måde havde ikke kun ultrastrukturelle organeller, men producerede også mængder ATP, adenylatkinase, urinstof og kolesterol, der kunne sammenlignes med niveauer observeret in vivo 1,2. Derudover udviser celler dyrket i 2D vs.3D cellekultursystemer forskellige genekspressionsmønstre8. Genekspressionsanalyse af C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste, at disse celler udtrykte en bred vifte af leverspecifikke proteiner såvel som gener involveret i nøgleveje, der regulerer leverfunktion8. Tidligere publikationer viste forskellene mellem proteomer af eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk ligevægt i 3D-sfæroidkulturer5. Disse forskelle omfatter cellulær metabolisme, som igen påvirker strukturen, funktionen og fysiologien af cellen5. Proteomet af celler dyrket i 2D-kultur var mere beriget i proteiner involveret i cellereplikation, mens proteomet af 3D-sfæroider var mere beriget i leverfunktionalitet5.
Den langsommere replikationshastighed for celler, der dyrkes som 3D-sfæroider, modellerer mere præcist specifikke fænomener forbundet med kromatintilstand og modifikationer (f.eks.Histonklipning 9). Histonklipning er en irreversibel histon post-translationel modifikation (PTM), der forårsager proteolytisk spaltning af en del af histon N-terminal halen. Mens dens biologiske funktion stadig diskuteres 10,11,12,13, er det klart, at dets tilstedeværelse i primære celler og levervæv er modelleret af HepG2 / C3A-celler dyrket som sfæroider, men ikke som flade celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikationer regulerer DNA-udlæsning for det meste ved at modulere tilgængeligheden til gener og dermed deresekspression 14. Histon PTM'er påvirker enten kromatintilstanden direkte ved at påvirke nettoladningen af nukleosomerne, hvor histoner samles, eller indirekte ved at rekruttere kromatinforfattere, læsere og viskelædere14. Hundredvis af histon PTM'er er blevet identificeret til dato15, hvilket forstærker hypotesen om, at kromatin er vært for en "histonkode", der bruges af cellen til at fortolke DNA16. Identifikationen af et utal af PTM-kombinationer15 og opdagelsen af, at kombinationer af histon-PTM'er ofte har forskellige biologiske funktioner fra PTM'er, der er til stede isoleret (f.eks. Fischle, et al.17), understreger imidlertid, at der kræves mere arbejde for at dekryptere "histonkoden".
I øjeblikket er histon PTM-analyse enten baseret på teknikker, der anvender antistoffer (f.eks. Western blots, immunofluorescens eller kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistofbaserede teknikker har høj følsomhed og kan give detaljerede oplysninger om den genom-brede lokalisering af histonmærker, men er ofte begrænset til at studere sjældne PTM'er eller PTM'er til stede i kombinationer 18,19,20. MS er mere velegnet til høj gennemstrømning og upartisk identifikation og kvantificering af enkelt- og sameksekserende proteinmodifikationer, navnlig histonproteiner 18,19,20. Af disse grunde har dette og flere andre laboratorier optimeret MS-rørledningen til analyse af histonpeptider (bottom-up MS), intakte histonhaler (mid-down MS) og histonproteiner i fuld længde (top-down MS)21,22,23.
Detaljeret nedenfor er en arbejdsgang til dyrkning af HepG2 / C3A-sfæroider og forberedelse af dem til histonpeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri (nLC-MS / MS). En 2D-cellekultur blev dyrket, og cellerne blev høstet og overført til en bioreaktor, hvor de ville begynde at danne sfæroider (figur 1). Efter 18 dage i kultur blev sfæroider behandlet med natriumsmolyrat eller natriumsuccinat for at øge de relative mængder histonacetylering og kortfattethed. Især kan 3D-kulturer behandles med genotoksiske forbindelser lige så godt som deres flade kulturækvivalenter; Faktisk fremhæver nylige publikationer, at toksikologiresponsen fra celler i 3D-kultur ligner mere primært væv end dem i 2D flad kultur24,25. Celler blev derefter indsamlet på bestemte tidspunkter, og nuklear isolering blev udført. Derefter blev histoner ekstraheret og afledt med propionisk anhydrid før og efter trypsinfordøjelse i henhold til en protokol, der først blev udviklet af Garcia et al.26. Denne procedure genererer peptider af en passende størrelse til online adskillelse med omvendt fasekromatografi (C18) og detektion med MS. Endelig blev histonpeptider identificeret og kvantificeret, og de genererede data blev repræsenteret på flere måder for en mere fuldstændig biologisk fortolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af buffere og reagenser
- Cellevækstmedier (for HepG2/C3A-celler): Tilsæt føtalt kvægserum (FBS) (10% v/v), ikke-essentielle aminosyrer (1% v/v), L-glutamintilskud (1% v/v) og penicillin/streptomycin (0,5% v/v) til Dulbeccos modificerede ørnemedium (DMEM, indeholdende 4,5 g/l glucose). Vækstmedier opbevares ved 4 °C i højst 2 uger.
- 200 mM natriumbutyrat (NaBut) opløsning: Til fremstilling af 10 ml skal du resuspend 220,18 mg NaBut i 10 mlddH20. Opbevar 1 ml alikvoter ved -20 °C. Før cellebehandling filtreres opløsningen ved hjælp af et 0,45 mm sprøjtefilter og tilsættes 1 ml af den filtrerede opløsning til 9 ml cellevækstmedier til en arbejdskoncentration på 20 mM.
- 100 mM natriumsuccinatopløsning (NaSuc): Til fremstilling af 10 ml resufhænger 162,05 mg NaSuc i 10 mlddH20. Opbevar 1 ml aliquot ved -20 °C. Før cellebehandling filtreres opløsningen ved hjælp af et 0,45 mm sprøjtefilter og tilsættes 1 ml af den filtrerede opløsning til 9 ml cellevækstmedier til en arbejdskoncentration på 10 mM.
- Kold 0,2 MH2SO4: For at forberede 1 L tilsættes 10 ml koncentreretH2SO4 til 990 ml vand af HPLC-kvalitet. Opbevares ved 4 °C.
- Kold acetone + 0,1% saltsyre (HCI): Tilsæt koncentreret HCI (0,1% v/v) til acetone. Opbevares ved 4 °C.
- 100 mMNH4HCO3-opløsning, pH 8,0: For at fremstille 1 L skal du genbruge 7,91 gNH4HCO3 i 1 liter vand af HPLC-kvalitet. Opbevar 50 ml alikvoter ved -20 °C.
- 0,1 % trifluoreddikesyreopløsning (TFA): Tilsæt koncentreret TFA (0,1 % v/v) til vand af HPLC-kvalitet. Opbevares ved 4 °C.
- 60 % acetonitril/0,1 % TFA-opløsning: Tilsæt acetonitril af HPLC-kvalitet (60 % v/v) til vand af HPLC-kvalitet. Derefter tilsættes koncentreret TFA (0,1 % v/v) til denne opløsning. Opbevares ved 4 °C.
- 2% HPLC-grade acetonitril + 0,1% myresyre: Tilsæt HPLC-grade acetonitril (2% v/v) til VAND af HPLC-kvalitet. Derefter tilsættes koncentreret myresyre (0,1% v/v) til denne opløsning.
- 80 % HPLC-grade acetonitril + 0,1 % myresyre: Tilsæt HPLC-grade acetonitril (80 % v/v) til vand af HPLC-kvalitet. Derefter tilsættes koncentreret myresyre (0,1% v/v) til denne opløsning.
2. Forberedelse af 3D-kultursystemet
BEMÆRK: Forskellige celler, primære eller udødeliggjorte, har forskellige kulturegenskaber, så dannelsen af sfæroider kan variere mellem celletyper. Denne protokol er etableret for HepG2 / C3A sfæroiddannelse ved hjælp af bioreaktorer og et innovativt 3D-cellekultursystem.
- Ved hjælp af standard vækstmedier vokser celler som et monolag, indtil de er 80% sammenflydende.
- Cellerne vaskes med HBSS (5 ml for en 75 cm2 kolbe) og inkuberer celler med 5 ml 0,05 % trypsin-EDTA fortyndet i HBSS (1:2 fortynding) i 5 minutter ved 37 oC med 5 % CO2.
- Kontroller celleløsning under et mikroskop og neutraliser trypsin ved at tilsætte 3 ml føtalt kvægserum (FBS) eller vækstmedier (indeholdende 5% -10% FBS).
- Tæl antallet af celler og fortynd cellesuspensionen for at opnå 1 x 106 celler i et maksimalt volumen på 1,5 ml.
- Ligevægt en ultralav fastgørelse 24-brønd rund bundplade (indeholdende flere mikrobrønde pr. Brønd) ved at vaske brøndene med 0,5 ml vækstmedier. Centrifugering af pladen i 5 min ved 3.000 x g for at fjerne luftbobler fra brøndens overflade.
- Overfør cellesuspensionen til pladen og centrifugen i 3 minutter ved 120 x g.
- Inkuber pladen i 24 timer ved 37 oC med 5% CO2 til sfæroiddannelse. I mellemtiden ligestilles bioreaktoren ved at fylde fugtighedskammeret med 25 ml sterilt vand og cellekammeret med 9 ml vækstmedier.
- Inkuber bioreaktoren, der roterer i clinostatinkubatoren, i 24 timer ved 37 oC med 5% CO2.
3. Vækst af sfæroider i bioreaktorer
BEMÆRK: For at bevare strukturen af sfæroider bruges brede borespidser til håndtering af 3D-strukturerne.
- Fjern sfæroider fra den ultralave fastgørelsesplade ved forsigtigt at pipettere op og ned med 1 ml brede borespidser og overfør til en vævskulturbehandlet skål.
- Vask pladen med 0,5 ml forvarmede vækstmedier og overfør til samme fad.
- Evaluer kvaliteten af sfæroider ved mikroskopi og vælg tilstrækkeligt dannede sfæroider. Sfæroider af god kvalitet har ensartet størrelse, kompaktitet og rundhed.
- Overfør sfæroider til ligevægtede bioreaktorer fyldt med 5 ml friske vækstmedier. Efter overførsel af sfæroiderne skal du fylde bioreaktoren fuldstændigt med friske vækstmedier.
- Placer bioreaktoren i clinostatinkubatoren og juster rotationshastigheden til 10-11 o / min.
- Udveksle vækstmedier hver 2-3 dage ved at fjerne 10 ml gamle medier og erstatte det med 10 ml friske medier.
- Juster rotationshastigheden i henhold til sfæroidvækst, stigende, når sfæroider vokser i størrelse og antal.
- Efter 18 dage i kultur er sfæroider klar til behandling og / eller indsamling
4. Sfæroid behandling og indsamling
BEMÆRK: I denne protokol behandles HepG2 / C3A-sfæroider med natriumbutyrat (NaBut) og natriumsuccinat (NaSuc) for at evaluere niveauerne af histonmærker, der indeholder henholdsvis acetylering og succinylering.
- Forbered vækstmedier med den passende arbejdskoncentration af forbindelsen (f.eks. 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc). Udveksle medierne i bioreaktoren med det behandlede medie.
BEMÆRK: For at etablere en kontroltilstand skal du enten indsamle nok sfæroider til eksperimenter, før behandlingen tilsættes, eller udpege en bioreaktor til ubehandlede sfæroider. - Saml sfæroider til proteomisk analyse efter tilstrækkelig behandlingstid (f.eks. 48 timer til 1 uge til NaSuc-behandling eller 48-72 timer til NaBut-behandling).
BEMÆRK: Til histonekstraktion ved hjælp af denne protokol blev der indsamlet seks til otte sfæroider indeholdende ca. 1 x 106 celler.- Fjern 3-5 ml medier fra bioreaktoren gennem den øverste port.
- Åbn den forreste port, og brug en 1 ml bred borespids til at fjerne sfæroider og placere dem i mikrocentrifugerør.
- Centrifugering af sfæroiderne ved 100 x g i 5 minutter og kassér medier.
BEMÆRK: Mediet i bioreaktoren kan ændres, og bioreaktoren kan returneres til inkubatoren for yderligere behandlingstid eller genopretning. - Vask sfæroider med 200 μL HBSS for at fjerne FBS. Centrifuger ved 100 x g i 5 min og fjern supernatanten.
BEMÆRK: Sfæroider kan opbevares ved -80 oC indtil behandling.
5. Histonekstraktion
BEMÆRK: De mange basiske aminosyrerester, der er til stede i histoner, giver dem mulighed for tæt at interagere med DNA, som har en fosforsyre rygrad. Fordi histoner er nogle af de mest basale proteiner i kernen, når de ekstraheres med iskold svovlsyre (0,2MH2SO4), er der minimal forurening. De ikke-histonproteiner vil udfælde i stærk syre. Stærkt koncentreret trichloreddikesyre (TCA) fortyndet til en endelig koncentration på 33% anvendes bagefter til at udfælde histonerne fra svovlsyren. Opbevar alle prøver, rør og reagenser på is til hele histonekstraktionen.
- Tilsæt fem volumener (~ 100 μL) kold 0,2 M H2SO4 til cellepillen (~ 10-20 μL) og pipette op og ned for at forstyrre pelleten og frigive histoner.
- Inkuber rør i op til 4 timer ved konstant rotation eller omrystning ved 4 oC.
BEMÆRK: For resuspenderede prøver, der har et volumen større end 500 μL, er en 2 timers inkubation tilstrækkelig til at ekstrahere histoner (længere inkubation kan resultere i ekstraktion af andre basiske nukleare proteiner). For resuspenderede prøver med et volumen mindre end 200 μL kræves en 4 timers inkubation for et bedre udbytte. - Centrifuge ved 3.400 x g i 5 min ved 4 °C. Saml supernatant i et nyt rør og kassér pillen senere.
- Tilsæt koldkoncentreret TCA, så den udgør en endelig 25% -33% v / v (f.eks. 40-60 μL kold TCA: 120 μL supernatant) og bland ved at vende røret et par gange.
- Inkuber rør i mindst 1 time ved konstant rotation eller omrystning ved 4 oC.
BEMÆRK: Ved mindre startpillestørrelser anbefales en inkubation natten over. - Centrifuge ved 3.400 x g i 5 min ved 4 oC. Kassér supernatant ved pipettering. Aspirer supernatanten omhyggeligt; Rør ikke ved siderne af røret eller pillen.
BEMÆRK: Histoner aflejres på begge sider og bunden af røret. Den hvide uopløselige pellet dannet i bunden af røret indeholder for det meste ikke-histonproteiner og andre biomolekyler. - Vask røret (vægge og pellet) med kold acetone + 0,1% HCI ved hjælp af en pasteur-pipette af glas (~ 500 μL / rør).
- Centrifuge ved 3.400 x g i 5 min ved 4 oC. Kassér supernatant ved at vende røret.
- Vask røret (vægge og pellet) med 100% kold acetone ved hjælp af en pasteur-pipette af glas (~ 500 μL / rør). Centrifuge ved 3.400 x g i 5 min ved 4 oC.
- Kassér supernatant ved at vende røret og pipette den resterende acetone ud. Åbn låget, og lufttør prøven på bænken i ~20 minutter.
- Fortsæt til propionylering eller opbevar prøver i -80 oC indtil brug.
6. Første runde af derivatisering
BEMÆRK: Brugen af trypsin til at fordøje histonproteiner fører til for små peptider, der er vanskelige at identificere ved hjælp af traditionelle proteomics-opsætninger. Af denne grund anvendes propionisk anhydrid til kemisk at derivatisere ɛ-aminogrupperne af umodificerede og monomethyllysinrester. Dette begrænser trypsinproteolyse til C-terminale argininrester. For prøver i plader med 96 brønde anbefales det at anvende flerkanalspipetter og reservoirer til opsamling af reagenser (figur 2A). Derivatisering udføres også efter fordøjelsen for at mærke peptidernes frie N-termini, der øger peptidhydrofobicitet og dermed omvendt fase kromatografisk retention.
- Resuspendprøver i 20 μL 15%-20% acetonitril i 100 mM ammoniumbicarbonat (pH 8,0). Vortex i 15 s, og derefter spinde ned ved 1.000 x g i 30 s.
- Hvis der er otte eller flere prøver, overføres hver resuspended prøve til en plade med 96 brønde.
BEMÆRK: Hvis prøverne ikke er blevet overført til en plade med 96 brønde, kan en enkeltkanalpipette anvendes i trin 6.3-6.7, 7.1-7.5 og 8.1-8.5. - Under emhætten tilsættes 2 μL propionanhydrid ved hjælp af en flerkanalspipette. Bland ved at pipettere op og ned 5x.
- Tilsæt hurtigt 10 μL ammoniumhydroxid ved hjælp af en flerkanalspipette. Bland ved at pipettere op og ned 5x.
BEMÆRK: Propionsyre er et produkt af reaktionen mellem propionsyreanhydrid og frie aminer fra peptider og kan nedsætte prøvens pH-værdi. pH 8 kan genetableres ved at tilsætte ammoniumhydroxid til prøven i et forhold på 1:5 (v/v). - Sørg for, at pH-værdien er 8 ved hjælp af pH-testpapir. Hvis pH < 8, justeres ved at tilsætte 1 μL ammoniumhydroxid. Hvis pH > 8, justeres ved at tilsætte 1 μL myresyre eller eddikesyre. Når pH > 10, er mærkning af andre aminosyrerester med højere pKa mulig.
- Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Gentag trin 6.3-6.6. En dobbelt runde histonpropionylering sikrer næsten fuldstændig reaktionseffektivitet.
- Tør pladen i hastighedsvakuum, indtil alle brønde er helt tørret (~ 9 timer).
- Fortsæt med at trypsin fordøjelse eller opbevar prøver ved -80 oC indtil brug.
7. Histon fordøjelse
BEMÆRK: Histoner fordøjes til peptider ved hjælp af trypsin, som skærer på carboxylsiden af arginin- og lysinrester. Da propionylering imidlertid ændrer lysinrester, spaltes kun argininrester (figur 2B).
- Forbered trypsinopløsning (25 ng/μL i 50 mMNH4HCO3, pH 8,0). Der tilsættes 20 μL trypsin (500 ng) til hver prøve.
- For at fremstille 50 mMNH4HCO3-opløsning fortyndes 100 mM NH4HCO3-opløsning 1:1 v/v med vand af HPLC-kvalitet.
- Sørg for, at pH er 8 ved hjælp af pH-testpapir. Hvis pH < 8, justeres ved at tilsætte 1 μL ammoniumhydroxid. Hvis pH > 8, justeres ved at tilsætte 1 μL myresyre eller eddikesyre.
- Fordøje ved stuetemperatur natten over eller inkuber ved 37 oC i 6-8 timer.
- Hvis det er muligt, skal du kontrollere pH efter ~ 3 timers fordøjelse, da det kan være faldet. Hvis pH < 8, justeres ved at tilsætte 1 μL ammoniumhydroxid.
- Tilsæt yderligere 5 μL 50 ng/μL trypsinopløsning (250 ng) og fortsæt fordøjelsen.
- Fortsæt til anden propionyleringsrunde, eller opbevar prøver ved -80 oC indtil brug.
8. Derivatisering af peptid N-termini
BEMÆRK: Propionyleringen af histonpeptider ved deres N-terminus forbedrer tilbageholdelsen af de korteste peptider ved væskekromatografi med omvendt fase (f.eks. Aminosyrer 3-8 af histon H3), da propionylgruppen øger peptidhydrofobicitet.
- Under emhætten tilsættes 2 μL propionanhydrid ved hjælp af flerkanalpipetten. Bland ved at pipettere op og ned 5x.
- Tilsæt hurtigt 10 μL ammoniumhydroxid ved hjælp af flerkanalspipetten. Bland ved at pipettere op og ned 5x.
BEMÆRK: Propionsyre er et produkt af reaktionen mellem propionanhydrid og frie aminer fra peptider og kan reducere prøvens pH-værdi. pH 8 kan genetableres ved at tilsætte ammoniumhydroxid til prøven i et forhold på 1:5 (v/v). - Sørg for, at pH-værdien er 8 ved hjælp af pH-testpapir. Hvis pH < 8, justeres ved at tilsætte 1 μL ammoniumhydroxid. Hvis pH > 8, justeres ved at tilsætte 1 μL myresyre eller eddikesyre. Når pH > 10, er mærkning af andre aminosyrerester med højere pKa mulig.
- Inkuber ved stuetemperatur i 10 minutter.
- Gentag trin 8.1-8.4. En dobbelt runde histonpropionylering sikrer næsten fuldstændig reaktionseffektivitet.
- Tør pladen i hastighedsvakuum, indtil alle brønde er helt tørret (~ 9 timer).
- Fortsæt til afsaltningstrinnet, eller opbevar prøver ved -80 oC indtil brug.
9. Afsaltning og prøveoprydning
BEMÆRK: Salte, der er til stede i prøven, forstyrrer massespektrometrianalysen. Salte ioniseres også under elektrospray og kan undertrykke signaler fra peptider. Salte kan danne ioniske addukter på peptider, hvilket får det adductede peptid til at have en anden masse. Dette reducerer peptidets signalintensitet og forhindrer korrekt identifikation og kvantificering. Opsætningen til afsaltning er illustreret i figur 2C.
- Begynd at blande HLB-harpiksen (50 mg/ml i 100 % acetonitril) på en magnetisk omrøringsplade.
- Sørg for, at der er en 96-brønds opsamlingsplade placeret under 96-brønds polypropylenfilterpladen for at opsamle gennemstrømningen.
- Tilsæt 70 μL HLB-suspension pr. brønd til filterpladen. Tænd forsigtigt vakuumet for at forhindre stænk. Kassér gennemstrømningen.
- Vask harpiksen med 100 μL 0,1% TFA. Tænd forsigtigt vakuumet for at forhindre stænk. Kassér gennemstrømningen.
- Resuspend hver prøve i 100 μL af 0,1% TFA. Kontroller pH-værdien; det skal være ~ 2-3.
- Læg hver prøve i hver brønd. Tænd forsigtigt for støvsugeren for at forhindre stænk. Kassér gennemstrømningen.
- Vask med 100 μL 0,1% TFA. Tænd forsigtigt for støvsugeren for at forhindre stænk. Kassér gennemstrømningen.
- Udskift opsamlingspladen med en ny opsamlingsplade med 96 brønde.
- Tilsæt 60 μL 60% acetonitril/0,1% TFA pr. Brønd. Tænd forsigtigt for støvsugeren for at forhindre stænk. Opsaml gennemstrømningen og tør i et hastighedsvakuum.
- Fortsæt til LC-MS/MS eller opbevar prøver ved -80 oC indtil brug.
10. Histonpeptidanalyse via væskekromatografi kombineret med massespektrometri
- Forbered de mobile faser til at køre på den højtydende væskekromatografi (HPLC). Mobil fase A (MPA): 2% HPLC-grade acetonitril + 0,1% myresyre. Mobil fase B (MPB): 80% HPLC-grade acetonitril + 0,1% myresyre.
- Programmer HPLC-metoden som følger: (1) 4% -34% MPB over 30 min; 2) 34-90 % MPB over 5 minutter og (3) isokratisk 90% MPB i 5 minutter. Brug følgende anbefalede kolonneegenskaber: C18 3 μm emballagemateriale, 75 μm indvendig diameter, 20-25 cm længde. Indstil strømningshastigheden til 250-300 nL/min for nanosøjler med en indvendig diameter på 75 μm.
- I tilfælde af at HPLC ikke er programmeret til at automatisere kolonneligevægt før prøveindlæsning, skal du inkludere (4) 90% -4% MPB over 1 min og (5) isokratisk 4% MPB over 10 min.
- Programmér MS-anskaffelsesmetoden.
- Sørg for, at instrumentet udfører en fuld MS-scanning i begyndelsen af hver arbejdscyklus. Instrumentering i høj opløsning (f.eks. orbitrap eller time-of-flight analysatorer) anbefales på grund af den massenøjagtighed, der kan bruges under signalekstraktion. Instrumentering med lav opløsning kan dog også anvendes som tidligere beskrevet27,28.
- Sørg for, at den fulde MS-scanning efterfølges af 16 MS/MS-scanningshændelser, hver med en isolationsbredde på 50 m/z, der spænder over m/z-området 300-1100. For eksempel skal den første scanning isolere signaler ved 300-350 m/z, den anden ved 350-400 m/z osv. Hvis det er muligt, skal du også erhverve MS / MS-scanninger i høj opløsning, men lavere opløsning sammenlignet med den fulde MS-scanning er tilstrækkelig (på grund af de mindre masser af fragmentioner sammenlignet med intakte ioner).
- HPLC-metoden genererer kromatografiske signaler med topbredder på ~ 3-40 s; for at sikre korrekt signalkvantificering skal det sikres, at massespektrometeret udfører mindst 10 driftscyklusser pr. kromatografisk top (dvs. en driftscyklus på 3 s eller hurtigere).
- Hvis du bruger en masseanalysator i fældestil (orbitrap, ionfælde), skal du sikre dig, at tidsgrænsen for ionindsprøjtning er indstillet til <200 ms; for andre analysatorer (quadrupole, time-of-flight) er dette ikke et problem på grund af deres hurtigere scanningstid. En foreløbig test kan være påkrævet.
BEMÆRK: Flere detaljer om MS-metoder til histonpeptidanalyse findes i følgende referencer 27,28,29.
- Resuspend prøve i 10 μL MPA, hvilket svarer til ~1 μg/μL fordøjet histonprøve. Den nøjagtige belastningsmængde er ikke kritisk (heller ikke triviel at vurdere), hvis alle prøver i batchen er indlæst ved hjælp af lignende fortyndinger og volumener.
- Læg 1 μL prøve på HPLC-kolonnen.
- Kør LC-MS/MS-metoden, der er programmeret i trin 10.1-10.3.
11. Analyse af data
- Importer MS-rådatafilerne til software, der er designet til at udføre peak area-integration.
BEMÆRK: EpiProfile 30,31 anvendes i den aktuelle undersøgelse og anbefales generelt, da den er optimeret til pålidelig peak area ekstraktion af kendte histonpeptider. Anden frit tilgængelig software til ekstraheret ionkromatografi såsom Skyline32,33 er imidlertid egnet. - Beregn den relative overflod af et givet (u)modificeret peptid som arealet af et enkelt peptid divideret med det samlede areal af peptidet i alle dets modificerede former. Software som EpiProfile30,31 indeholder allerede biblioteker af peptider til signalekstraktion. Ellers skal du generere et bibliotek af peptider af interesse enten manuelt eller via peptididentifikation ved hjælp af rutinemæssige proteomics-rørledninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokol blev HepG2/C3A-sfæroider behandlet med 20 mM NaBut og 10 mM NaSuc, som begge påvirkede globale niveauer af histon-PTM'er (figur 3A). Histon PTM'er blev derefter identificeret og kvantificeret på niveauet for enkeltrestkoncentrationer via MS/MS-erhvervelse (figur 3B).
Når prøver køres i replikater, kan statistisk analyse udføres for at vurdere foldændringsberigelsen af en PTM mellem prøver samt reproducerbarheden af observationen. De viste data viser, at peptider modificeret med acetyleringer er beriget med sfæroider behandlet med NaBut vs. kontrol (figur 3C), mens prøver behandlet med NaSuc har en højere relativ overflod af histonpeptider modificeret med lysinsuccinylering (figur 3D). Disse beregninger blev foretaget i et regnearksprogram som beskrevet i en separat publikation34. En samlet stigning i en given histonmodifikation kan være bedre repræsenteret i radarplots, hvor observation af en højere global overflod af en bestemt modifikation bliver mere intuitiv, selv samtidig med at der opretholdes detaljerede oplysninger om de analyserede modifikationssteder (figur 3E,F).
Denne protokol genererer et peptid fra histon H3-aminosyrerester 9-17, som omfatter de ofte modificerede rester K9, S10 og K14. De viste data indikerer, at behandling med NaBut øger niveauerne af H3K14ac, men kun på histoner, der er sammodificeret med H3K9me2 og ikke H3K9me3 (figur 4A). Sameksistensfrekvensen mellem to modifikationer kan repræsenteres mere intuitivt som en ringgraf, hvor knudeknuderne repræsenterer individuelle modifikationer, mens tykkelsen af forbindelseslinjer repræsenterer sameksistensfrekvensen mellem de to PTM'er (figur 4B). Nogle gange er sameksistensfrekvensen upåvirket, men data, der er repræsenteret som søjlediagramter, kan være vildledende. For eksempel indikerer dataene i figur 4A , at kombinationen H3K9me2K14ac er mere rigelig i NaBut-behandling end i kontrol. Dette er korrekt, men denne givne kombination er den hyppigste uanset behandlingen. Figur 4B viser tydeligt, at H3K9me2K14ac og H3K9me3K14ac er de hyppigste kombinatoriske mønstre uanset behandlingen (linjetykkelse), men at globale niveauer af H3K14ac (knude) er det, der virkelig ændrer sig i eksperimentet.
Denne protokol genererer et peptid fra histon H4-rester 4-17, som indbefatter modificerbare rester i positionerne K5, K8, K12 og K16 (for det meste ved acetyleringer). Når man sammenligner kontrol og NaBut-behandling, er det muligt at observere en stigning i kombinationer af acetyleringer ved at repræsentere data som for eksempel ordskyer (figur 4C). Denne repræsentation fremhæver tydeligt, at den umodificerede version af histon H4 er mest rigelig i kontrolprøven, mens sfæroider behandlet med NaBut er beriget med dobbelt, tredobbelt og firedobbelt acetyleret histon H4-proteoformer. Ordskyer er dog begrænsede til at vise nøjagtige værdier; den relative overflod af en histonkode bør de-indvikles af tekstens størrelse, som kan estimeres unøjagtigt. Derfor kan Venn-diagrammer eller mere moderne ækvivalenter såsom UpSetR-repræsentation35 bruges til at vise den nøjagtige kvantificering af samekst eksisterende histon-PTM'er (figur 4D,E). De viste data fremhæver endnu en gang, at udvalgte kombinationer af acetyleringer på histon H4 er relativt mere rigelige i NaBut-behandling sammenlignet med kontrol.
Figur 1: Arbejdsgang til histonpeptidanalyse af 3D-sfæroider. HepG2 / C3A-celler dyrkes først i 2D-kultur, indtil de når 80% sammenløb. Cellerne overføres derefter til en ligevægtig bioreaktor og placeres i clinostatinkubatoren, hvor de roterer ved 10-11 o / min for at danne sfæroider. Efter 18 dage behandles sfæroiderne med enten 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc og høstes efter deres tilsvarende tidspunkter. Kerner isoleres fra cellerne, og histonekstraktion udføres med 0,2 MH2SO4. Histonderivatisering udføres derefter med propionisk anhydrid før og efter trypsinfordøjelse for at sikre tilbageholdelse af de resulterende korte peptider ved væskekromatografi. Prøver afsaltes og køres derefter ved hjælp af LC-MS / MS-metoden, der er nævnt i trin 10, og de resulterende data analyseres som beskrevet i trin 11. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Opsætning til propionylering og afsaltningstrin. (A) Propionylering udføres i en stinkhætte, og alle komponenter er lagt ud, så trinnene kan udføres hurtigt efter hinanden. (B) Skematisk oversigt over første runde af propionylering, trypsinfordøjelse og anden propionyleringsrunde på histon H3.1-halen. (C) Afsaltning udføres på bænken ved hjælp af en vakuummanifold med 96 brønde og en 96-brønds polypropylenfilterplade. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Repræsentation af individuelle histonmodifikationer. (A) Søjlegraf, der viser den relative overflod af almindelige globale histonmodifikationer i kontrol og behandlet (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2 / C3A sfæroider. (B) Søjlediagram, der viser forekomsten af enkelt histon PTM'er, der forekommer på restkoncentrationer 9-17 af histon H3-peptid (KSTGGKAPR) i kontrol og behandlet (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-sfæroider. (C,D) Vulkandiagrammer, der viser foldændringen og betydningen af differentiel ekspression af histonpeptid PTM'er efter behandling med 20 mM NaBut (C) eller 10 mM NaSuc (D). Fremhævede blå og grønne punkter repræsenterer henholdsvis acetylerede og succinylerede rester. (E,F) Radardiagramfer, der viser overflod af enkelt histonpeptidacetylering (E) eller kortfattethed (F) efter behandling med henholdsvis 20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc sammenlignet med kontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentation af samekslerende histonmodifikationer. (A) Søjlegraf, der viser overflod af kombinatoriske histon PTM'er, der forekommer på restkoncentrationer 9-17 af histon H3 (KSTGGKAPR) i kontrol og behandlet (20 mM NaBut eller 10 mM NaSuc) HepG2/C3A-sfæroider. (B) Ringgrafer, der viser forholdet mellem kombinatoriske histon PTM'er på restkoncentrationer 9-17 af histon H3 (KSTGGKAPR) i kontrol og behandlede (20 mM NaBut) HepG2/C3A sfæroider. Intensiteten af knudefarven svarer til overflod af en enkelt PTM inden for dens behandlingsgruppe, mens linjetykkelsen svarer til hyppigheden af PTM-samtidig forekomst. (C) Ordskyer, der viser hyppigheden af kombinatoriske histon PTM'er på histon H4-rester i kontrol og behandlede (20 mM NaBut) HepG2/C3A-sfæroider. Størrelsen af teksten svarer til overflod af den specificerede kombinatoriske PTM. (D,E) Venn-diagram, der repræsenterer hyppigheden af samekslerende modifikationer på histon H4-peptidrester 4-17 i kontrol og 20 mM NaBut-behandlede prøver. Data vises ved hjælp af ShinyApp UpSetR35. Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende tabel 1: Liste over peptider påvist ved hjælp af denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Analysen af histon PTM'er er fundamentalt forskellig fra den typiske proteomics-analysepipeline. De fleste histon PTM'er har stadig gådefulde biologiske funktioner; som følge heraf er kommentarer såsom gen ontologi eller pathway databaser ikke tilgængelige. Der findes flere ressourcer, der forbinder histonmodifikationer med enzymet, der er ansvarligt for deres katalyse eller proteiner, der indeholder domæner, der binder disse PTM'er (f.eks. HISTome36). Det er også muligt at spekulere i kromatinens samlede tilstand, når globale niveauer af histon PTM'er reguleres. For eksempel er en samlet stigning i histonacetylering eller andre acylationer som succinylering normalt forbundet med kromatindekondensation37,38.
MS-analyse giver mere detaljerede oplysninger om disse ændringer, såsom deres nøjagtige lokalisering på aminosyresekvensen. I denne protokol anvendes MS / MS-erhvervelse til at identificere og kvantificere histon PTM'er, hvilket kan være kritisk for biologisk fortolkning. For eksempel er trimethylering på lysin 4 af histon H3 (H3K4me3) beriget på promotorer af aktivt transskriberede gener39, mens den samme modifikation på lysin 9 (H3K9me3) benchmarks konstitutive heterochromatin40. Histonmodifikationer anvendes i øjeblikket som biomarkører i specifikke sygdomme; som sådan kan histonanalyse bruges til at studere sygdomspatologi ud over responsen på behandling (f.eks. med epigenetiske lægemidler)41,42.
Det er mere udfordrende visuelt at repræsentere interaktioner mellem flere PTM'er i modsætning til enkelte PTM'er. Mens eksisterende diagrammer såsom ringgrafer kan vise sameksistensfrekvensen for to PTM'er, kan de ikke repræsentere sameksistensfrekvensen mellem mere end to PTM'er ad gangen, da dette ville kræve en tredimensionel repræsentation af netværket. Af denne grund kan andre repræsentationer være mere hensigtsmæssige til at fremhæve ændringer i histonkoder, når tre eller flere PTM'er overvejes. Generelt giver diversificering af datarepræsentation større chancer for at observere betydelige ændringer mellem prøver. Denne protokol præsenterer eksempler på forskellige illustrationer til visning af regler for histon PTM'er og samekspindende PTM'er.
Selvom denne protokol genererer relativt små histonpeptider på grund af trypsinfordøjelse (ca. 4-20 aminosyrer), indeholder udvalgte peptider flere modificerbare rester. Analysen af disse peptider gør det muligt at kvantificere sameksistensfrekvenser af PTM'er, hvilket kan afsløre vigtige oplysninger om, hvilke kombinatoriske histonmærker der reguleres i et givet datasæt. Især er der ingen trin under prøveforberedelsen, hvor kvantificering af histoner udføres. Der er fire grunde til dette: (1) trypsin har en bred vifte af aktiviteter og kan anvendes ved en bred vifte af enzym til prøveforhold (1: 10-1: 200). Selv når det eksperimentelle udbytte af ekstraherede histoner adskiller sig fra det forventede, er der ikke opstået problemer med fordøjelsen ved hjælp af denne protokol. (2) Denne protokol er beregnet til små mængder materiale, hvor histonkvantificering kan være vanskelig at udføre på grund af manglende følsomhed. (3) Ved at anvende en konstant trypsinkoncentration uanset mængden af histonmateriale kan vi bruge tryptiske peptider (som trypsinautaflyser) til at benchmarke kromatografiens ydeevne. Små variationer i prøveudbyttet normaliseres af dataanalysesoftware (trin 11), der bruger alle (u)modificerede signaler for et givet peptid som nævneren under normaliseringsprocessen. (4) Endelig kan en dramatisk undervurdering af mængden af udgangsmateriale skabe problemer med overbelastning af nanoLC-kromatografisk søjle. Udførelse af afsaltningstrinnet som angivet i denne protokol forhindrer imidlertid dette problem i at finde sted. I tilfælde af for store mængder udgangsmateriale (f.eks. >100 μg) overskrides grænsen for afsaltningsharpiksens kapacitet, og eventuelle overskydende prøver vaskes væk under lastningstrinnet.
Det er vigtigt at bemærke, at ikke alle de peptider, der påvises ved denne analyse, er blevet fremhævet i figur 3 og figur 4. Det er heller ikke alle histonmodifikationer, der kan påvises ved hjælp af disse specifikke prøveforberedelses- og erhvervelsesmetoder. Supplerende tabel 1 er angivet for at liste alle peptidsignaler, der ekstraheres ved hjælp af den beskrevne rørledning. Et par velkendte modifikationer er ikke angivet i tabellen, da det beskrevne prøvepræparat ikke er egnet til deres påvisning. Bemærkelsesværdige eksempler er ubiquitinylerede peptider fra histon H2A og H2B og fosforylering af histon H2A. X (en generel markør for DNA-skade). Dette skyldes, at propionyleringen af peptiderne forbundet med disse PTM'er fører til for lange peptider, som ikke er egnede til C18-kromatografi og den beskrevne MS-detektionsmetode. Andre ændringer, der er til stede i litteraturen, men som ikke er til stede i supplerende tabel 1 , er meget lave overflodsmodifikationer (i øjeblikket kun påviselige ved hjælp af MS efter berigelsesstrategier såsom immunfældning eller specifik cellebehandling), såsom laktylering43 eller serotonylering44. Histonmodifikationer med uforudsigelige masseforskydninger forårsaget af polymerisation eller heterogen kovalent binding til histonsekvensen overvejes heller ikke (f.eks. Poly-ADP-ribosylering45 og glykation46). Derudover bruger denne protokol NaSuc og NaBut til behandling af HepG2 / C3A-sfæroider, men den kan modificeres til brug sammen med andre lægemidler / epigenetiske modifikatorer og 2D / 3D-cellekulturtyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Sidoli-laboratoriet anerkender taknemmeligt Leukæmi Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics-prisen), Deerfield (Xseed-prisen), Relay Therapeutics, Merck og NIH-kontoret for direktøren (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
References
- Kapalczynska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
- Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discovery Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
- Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 365-377 (2005).
- Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
- Wrzesinski, K., et al. The cultural divide: exponential growth in classical 2D and metabolic equilibrium in 3D environments. PLoS One. 9 (9), 106973 (2014).
- Wrzesinski, K., Fey, S. J. Metabolic reprogramming and the recovery of physiological functionality in 3D cultures in micro-bioreactors. Bioengineering (Basel). 5 (1), 22 (2018).
- Gonda, S. R., et al. Three-dimensional transgenic cell model to quantify genotoxic effects of space environment. Advances in Space Research. 27 (2), 421-430 (2001).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), 601-610 (2007).
- Tvardovskiy, A., et al. Top-down and middle-down protein analysis reveals that intact and clipped human histones differ in post-translational modification patterns. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (12), 3142-3153 (2015).
- Azad, G. K., et al. Modifying chromatin by histone tail clipping. Journal of Molecular Biology. 430 (18), 3051-3067 (2018).
- Kragesteen, B. K., Amit, I. Heads or tails: histone tail clipping regulates macrophage activity. Nature Immunology. 22 (6), 678-680 (2021).
- Dhaenens, M. Histone clipping: the punctuation in the histone code. EMBO Reports. 22 (8), 53440 (2021).
- Anderson, L. C., et al. Analyses of histone proteoforms using front-end electron transfer dissociation-enabled orbitrap instruments. Molecular and Cellular Proteomics. 15 (3), 975-988 (2016).
- Morgan, M. A. J., Shilatifard, A. Reevaluating the roles of histone-modifying enzymes and their associated chromatin modifications in transcriptional regulation. Nature Genetics. 52 (12), 1271-1281 (2020).
- Chan, J. C., Maze, I. Nothing is yet set in (hi)stone: novel post-translational modifications regulating chromatin function. Trends in Biochemical Sciences. 45 (10), 829-844 (2020).
- Jenuwein, T., Allis, C. D.
- Fischle, W., et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains. Genes and Development. 17 (15), 1870-1881 (2003).
- Onder, O., et al. Progress in epigenetic histone modification analysis by mass spectrometry for clinical investigations. Expert Review of Proteomics. 12 (5), 499-517 (2015).
- Sidoli, S., Cheng, L., Jensen, O. N. Proteomics in chromatin biology and epigenetics: Elucidation of post-translational modifications of histone proteins by mass spectrometry. Journal of Proteomics. 75 (12), 3419-3433 (2012).
- Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nature Structural and Molecular Biology. 18 (1), 91-93 (2011).
- Moradian, A., et al. The top-down, middle-down, and bottom-up mass spectrometry approaches for characterization of histone variants and their post-translational modifications. Proteomics. 14 (4-5), 489-497 (2014).
- Zheng, Y., Huang, X., Kelleher, N. L. Epiproteomics: quantitative analysis of histone marks and codes by mass spectrometry. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 142-150 (2016).
- Sidoli, S., Garcia, B. A. Middle-down proteomics: a still unexploited resource for chromatin biology. Expert Review of Proteomics. 14 (7), 617-626 (2017).
- Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255 (2021).
- Calitz, C., et al. Toxicity and anti-prolific properties of Xysmalobium undulatum water extract during short-term exposure to two-dimensional and three-dimensional spheroid cell cultures. Toxicology Mechanisms and Methods. 28 (9), 641-652 (2018).
- Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (4), 933-938 (2007).
- Sidoli, S., et al. Sequential window acquisition of all theoretical mass spectra (SWATH) analysis for characterization and quantification of histone post-translational modifications. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (9), 2420-2428 (2015).
- Sidoli, S., et al. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Analytical Chemistry. 87 (22), 11448-11454 (2015).
- Karch, K. R., Sidoli, S., Garcia, B. A. Identification and quantification of histone PTMs using high-resolution mass spectrometry. Methods in Enzymology. 574, 3-29 (2016).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile quantifies histone peptides with modifications by extracting retention time and intensity in high-resolution mass spectra. Molecular and Cellular Proteomics. 14 (6), 1696-1707 (2015).
- Yuan, Z. F., et al. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2533-2541 (2018).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
- Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
- Aguilan, J. T., Kulej, K., Sidoli, S. Guide for protein fold change and p-value calculation for non-experts in proteomics. Molecular Omics. 16 (6), 573-582 (2020).
- Lex, A., et al.
- Shah, S. G., et al. HISTome2: a database of histone proteins, modifiers for multiple organisms and epidrugs. Epigenetics and Chromatin. 13 (1), 31 (2020).
- Xie, Z., et al. Lysine succinylation and lysine malonylation in histones. Molecular and Cellular Proteomics. 11 (5), 100-107 (2012).
- Liu, J., et al. Histone succinylation and its function on the nucleosome. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (15), 7101-7109 (2021).
- Howe, F. S., et al. Is H3K4me3 instructive for transcription activation. Bioessays. 39 (1), 1-12 (2017).
- Nicetto, D., Zaret, K. S. Role of H3K9me3 heterochromatin in cell identity establishment and maintenance. Current Opinion in Genetics and Development. 55, 1-10 (2019).
- Wojcik, J. B., et al. Histone H3K27 dimethyl loss is highly specific for malignant peripheral nerve sheath tumor and distinguishes true PRC2 loss from isolated H3K27 trimethyl loss. Modern Pathology. 32 (10), 1434-1446 (2019).
- Sellers, W. R., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
- Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
- Farrelly, L. A., et al. Histone serotonylation is a permissive modification that enhances TFIID binding to H3K4me3. Nature. 567 (7749), 535-539 (2019).
- Chen, Q., et al. ADP-ribosylation of histone variant H2AX promotes base excision repair. The EMBO Journal. 40 (2), 104542 (2021).
- Zheng, Q., et al. Reversible histone glycation is associated with disease-related changes in chromatin architecture. Nature Communications. 10 (1), 1289 (2019).
