Denne protokol skitserer, hvordan et tredimensionelt cellekultursystem kan bruges til at modellere, behandle og analysere kromatinmodifikationer i en næsten fysiologisk tilstand.
Flade kulturer af pattedyrceller er en meget anvendt in vitro-tilgang til forståelse af cellefysiologi, men dette system er begrænset til modellering af fast væv på grund af unaturligt hurtig cellereplikation. Dette er især udfordrende ved modellering af modent kromatin, da hurtigt replikerende celler ofte er involveret i DNA-replikation og har en heterogen polyploid population. Præsenteret nedenfor er en arbejdsgang til modellering, behandling og analyse af quiescent kromatinmodifikationer ved hjælp af et tredimensionelt (3D) cellekultursystem. Ved hjælp af denne protokol dyrkes hepatocellulære carcinomcellelinjer som reproducerbare 3D-sfæroider i en inkubator, der giver aktiv næringsdiffusion og lave forskydningskræfter. Behandling med natriumsmoyrat og natriumsuccinat inducerede en stigning i henholdsvis histonacetylering og succinylering. Stigninger i niveauer af histonacetylering og succinylering er forbundet med en mere åben kromatintilstand. Sfæroider indsamles derefter til isolering af cellekerner, hvorfra histonproteiner ekstraheres til analyse af deres posttranslationelle modifikationer. Histonanalyse udføres via væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri efterfulgt af en intern beregningsrørledning. Endelig vises eksempler på datarepræsentation for at undersøge hyppigheden og forekomsten af kombinatoriske histonmærker.
Siden slutningen af det 19. århundrede er cellekultursystemer blevet brugt som model til at studere vækst og udvikling af celler uden for menneskekroppen 1,2. Deres anvendelse er også blevet udvidet til at undersøge, hvordan væv og organer fungerer i både sunde og syge sammenhænge 1,3. Suspensionsceller (f.eks. blodlegemer) vokser i petriskåle eller kolber problemfrit og i flæng, da de ikke samles i tredimensionelle (3D) strukturer in vivo. Celler afledt af faste organer kan vokse i enten todimensionelle (2D) eller 3D-kultursystemer. I 2D-kultur dyrkes celler i et monolag, der klæber til en flad overflade 2,4. 2D-cellekultursystemer er kendetegnet ved eksponentiel vækst og en hurtig fordoblingstid, typisk 24 timer til et par dage5. Celler i 3D-systemer vokser til at danne indviklede celle-celle-interaktioner, der modellerer vævslignende konglomerater tættere, og de er kendetegnet ved deres evne til at nå en dynamisk ligevægt, hvor deres fordoblingstid kan nå 1 måned eller længere5.
Præsenteret i dette papir er en innovativ metode til at dyrke 3D-sfæroider i roterende cellekultursystemer, der simulerer reduceret tyngdekraft6. Dette er et forenklet derivat af et cellekultursystem introduceret af NASA i 1990’erne7. Denne fremgangsmåde minimerer forskydningskræfterne, som forekommer i eksisterende metoder som spindekolber, og øger sfæroidreproducerbarheden6. Derudover øger den roterende bioreaktor aktiv næringsdiffusion, hvilket minimerer nekrotisk dannelse, der forekommer i systemer som hængende dråbecellekultur, hvor medieudveksling er upraktisk6. På denne måde vokser cellerne for det meste uforstyrret, hvilket muliggør dannelse af strukturelle og fysiologiske egenskaber forbundet med celler, der vokser i væv. C3A-hepatocytter (HepG2 / C3A) dyrket på denne måde havde ikke kun ultrastrukturelle organeller, men producerede også mængder ATP, adenylatkinase, urinstof og kolesterol, der kunne sammenlignes med niveauer observeret in vivo 1,2. Derudover udviser celler dyrket i 2D vs.3D cellekultursystemer forskellige genekspressionsmønstre8. Genekspressionsanalyse af C3A-hepatocytter dyrket som 3D-sfæroider viste, at disse celler udtrykte en bred vifte af leverspecifikke proteiner såvel som gener involveret i nøgleveje, der regulerer leverfunktion8. Tidligere publikationer viste forskellene mellem proteomer af eksponentielt voksende celler i 2D-kultur vs. celler ved dynamisk ligevægt i 3D-sfæroidkulturer5. Disse forskelle omfatter cellulær metabolisme, som igen påvirker strukturen, funktionen og fysiologien af cellen5. Proteomet af celler dyrket i 2D-kultur var mere beriget i proteiner involveret i cellereplikation, mens proteomet af 3D-sfæroider var mere beriget i leverfunktionalitet5.
Den langsommere replikationshastighed for celler, der dyrkes som 3D-sfæroider, modellerer mere præcist specifikke fænomener forbundet med kromatintilstand og modifikationer (f.eks.Histonklipning 9). Histonklipning er en irreversibel histon post-translationel modifikation (PTM), der forårsager proteolytisk spaltning af en del af histon N-terminal halen. Mens dens biologiske funktion stadig diskuteres 10,11,12,13, er det klart, at dets tilstedeværelse i primære celler og levervæv er modelleret af HepG2 / C3A-celler dyrket som sfæroider, men ikke som flade celler 9. Dette er kritisk, da kromatintilstand og modifikationer regulerer DNA-udlæsning for det meste ved at modulere tilgængeligheden til gener og dermed deresekspression 14. Histon PTM’er påvirker enten kromatintilstanden direkte ved at påvirke nettoladningen af nukleosomerne, hvor histoner samles, eller indirekte ved at rekruttere kromatinforfattere, læsere og viskelædere14. Hundredvis af histon PTM’er er blevet identificeret til dato15, hvilket forstærker hypotesen om, at kromatin er vært for en “histonkode”, der bruges af cellen til at fortolke DNA16. Identifikationen af et utal af PTM-kombinationer15 og opdagelsen af, at kombinationer af histon-PTM’er ofte har forskellige biologiske funktioner fra PTM’er, der er til stede isoleret (f.eks. Fischle, et al.17), understreger imidlertid, at der kræves mere arbejde for at dekryptere “histonkoden”.
I øjeblikket er histon PTM-analyse enten baseret på teknikker, der anvender antistoffer (f.eks. Western blots, immunofluorescens eller kromatinimmunfældning efterfulgt af sekventering [ChIP-seq]) eller massespektrometri (MS). Antistofbaserede teknikker har høj følsomhed og kan give detaljerede oplysninger om den genom-brede lokalisering af histonmærker, men er ofte begrænset til at studere sjældne PTM’er eller PTM’er til stede i kombinationer 18,19,20. MS er mere velegnet til høj gennemstrømning og upartisk identifikation og kvantificering af enkelt- og sameksekserende proteinmodifikationer, navnlig histonproteiner 18,19,20. Af disse grunde har dette og flere andre laboratorier optimeret MS-rørledningen til analyse af histonpeptider (bottom-up MS), intakte histonhaler (mid-down MS) og histonproteiner i fuld længde (top-down MS)21,22,23.
Detaljeret nedenfor er en arbejdsgang til dyrkning af HepG2 / C3A-sfæroider og forberedelse af dem til histonpeptidanalyse (bottom-up MS) via nano-væskekromatografi kombineret online med tandemmassespektrometri (nLC-MS / MS). En 2D-cellekultur blev dyrket, og cellerne blev høstet og overført til en bioreaktor, hvor de ville begynde at danne sfæroider (figur 1). Efter 18 dage i kultur blev sfæroider behandlet med natriumsmolyrat eller natriumsuccinat for at øge de relative mængder histonacetylering og kortfattethed. Især kan 3D-kulturer behandles med genotoksiske forbindelser lige så godt som deres flade kulturækvivalenter; Faktisk fremhæver nylige publikationer, at toksikologiresponsen fra celler i 3D-kultur ligner mere primært væv end dem i 2D flad kultur24,25. Celler blev derefter indsamlet på bestemte tidspunkter, og nuklear isolering blev udført. Derefter blev histoner ekstraheret og afledt med propionisk anhydrid før og efter trypsinfordøjelse i henhold til en protokol, der først blev udviklet af Garcia et al.26. Denne procedure genererer peptider af en passende størrelse til online adskillelse med omvendt fasekromatografi (C18) og detektion med MS. Endelig blev histonpeptider identificeret og kvantificeret, og de genererede data blev repræsenteret på flere måder for en mere fuldstændig biologisk fortolkning.
Analysen af histon PTM’er er fundamentalt forskellig fra den typiske proteomics-analysepipeline. De fleste histon PTM’er har stadig gådefulde biologiske funktioner; som følge heraf er kommentarer såsom gen ontologi eller pathway databaser ikke tilgængelige. Der findes flere ressourcer, der forbinder histonmodifikationer med enzymet, der er ansvarligt for deres katalyse eller proteiner, der indeholder domæner, der binder disse PTM’er (f.eks. HISTome36). Det er også muligt at spekulere i kroma…
The authors have nothing to disclose.
Sidoli-laboratoriet anerkender taknemmeligt Leukæmi Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics-prisen), Deerfield (Xseed-prisen), Relay Therapeutics, Merck og NIH-kontoret for direktøren (1S10OD030286-01).
0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
Ice | N/A | N/A | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |