Summary
Este protocolo descreve como um sistema de cultura celular tridimensional pode ser usado para modelar, tratar e analisar modificações de cromatina em um estado quase fisiológico.
Abstract
Culturas planas de células mamíferas são uma abordagem in vitro amplamente utilizada para a compreensão da fisiologia celular, mas este sistema é limitado na modelagem de tecidos sólidos devido à replicação celular não naturalmente rápida. Isso é particularmente desafiador quando modela cromatina madura, já que células de replicação rápida estão frequentemente envolvidas na replicação do DNA e têm uma população poliploide heterogênea. Apresentado abaixo é um fluxo de trabalho para modelar, tratar e analisar modificações quiescentes de cromatina usando um sistema de cultura celular tridimensional (3D). Usando este protocolo, as linhas celulares de carcinoma hepatocelular são cultivadas como esferoides 3D reprodutíveis em uma incubadora que fornece difusão ativa de nutrientes e baixas forças de salto. O tratamento com butirato de sódio e succinato de sódio induziu um aumento na acetilação de histona e succinilation, respectivamente. Aumentos nos níveis de acetilação de histona e succiniltação estão associados a um estado de cromatina mais aberto. Os spheróides são então coletados para isolamento de núcleos celulares, dos quais as proteínas histonas são extraídas para a análise de suas modificações pós-translacionais. A análise de histona é realizada através de cromatografia líquida acoplado on-line com espectrometria de massa tandem, seguido por um pipeline computacional interno. Finalmente, exemplos de representação de dados para investigar a frequência e ocorrência de marcas de histona combinatória são mostrados.
Introduction
Desde o final do séculoXIX, os sistemas de cultura celular têm sido usados como modelo para estudar o crescimento e o desenvolvimento de células fora do corpo humano 1,2. Seu uso também foi ampliado para estudar como os tecidos e órgãos funcionam em contextos saudáveis e doentes 1,3. As células de suspensão (por exemplo, as células sanguíneas) crescem em placas de Petri ou frascos de forma perfeita e intercambiável, pois não se reúnem em estruturas tridimensionais (3D) in vivo. Células derivadas de órgãos sólidos podem crescer em sistemas de cultura bidimensional (2D) ou 3D. Na cultura 2D, as células são cultivadas em uma monocamada que adere a uma superfície plana 2,4. Os sistemas de cultura celular 2D são caracterizados pelo crescimento exponencial e um tempo de duplicação rápida, tipicamente de 24h a poucos dias5. Células em sistemas 3D crescem para formar interações intrincadas células-células modelando conglomerados semelhantes a tecidos mais de perto, e são caracterizadas por sua capacidade de alcançar um equilíbrio dinâmico onde seu tempo de duplicação pode chegar a 1 mês ou mais5.
Apresentado neste artigo é uma metodologia inovadora para cultivar esferoides 3D em sistemas de cultura celular rotativa que simulam a gravidade reduzida6. Este é um derivado simplificado de um sistema de cultura celular introduzido pela NASA na década de 19907. Essa abordagem minimiza as forças de shearing, que ocorrem em métodos existentes, como frascos giratórios, e aumenta a reprodutibilidade esferoide6. Além disso, o bioreator rotativo aumenta a difusão ativa de nutrientes, minimizando a formação necrótica que ocorre em sistemas como a cultura de células de queda pendurada onde a troca de mídia é impraticável6. Dessa forma, as células crescem em sua maioria sem serem perturbadas, permitindo a formação de características estruturais e fisiológicas associadas às células que crescem no tecido. Os hepatócitos C3A (HepG2/C3A) cultivaram dessa forma não só as organelas ultraestruturais, mas também produziram quantidades de ATP, quinase adenila, ureia e colesterol comparáveis aos níveis observados in vivo 1,2. Além disso, as células cultivadas em sistemas de cultura celular 2D vs.3D exibem diferentes padrões de expressão genética8. A análise da expressão genética dos hepatócitos C3A cultivadas como esferoides 3D mostrou que essas células expressavam uma ampla gama de proteínas específicas do fígado, bem como genes envolvidos em caminhos-chave que regulam a função hepática8. Publicações anteriores demonstraram as diferenças entre os proteomes de células em crescimento exponencial na cultura 2D versus células em equilíbrio dinâmico nas culturas esferoides 3D5. Essas diferenças incluem o metabolismo celular, que por sua vez afeta a estrutura, função e fisiologia da célula5. O proteome das células cultivadas na cultura 2D foi mais enriquecido em proteínas envolvidas na replicação celular, enquanto o proteome de esferoides 3D foi mais enriquecido na funcionalidade hepática5.
A taxa de replicação mais lenta das células cultivadas como esferoides 3D modela com mais precisão fenômenos específicos associados ao estado de cromatina e modificações (por exemplo, recorte de histona9). O recorte de histona é uma modificação pós-translacional irreversível (PTM) que causa decote proteolítico de parte da cauda do terminal de histone. Enquanto sua função biológica ainda está em discussão 10,11,12,13, é claro que sua presença em células primárias e tecido hepático é modelada por células HepG2/C3A cultivadas como esferoides, mas não como células planas 9. Isso é crítico, pois o estado da cromatina e as modificações regulam a leitura de DNA principalmente através da modulação da acessibilidade aos genes e, portanto, sua expressão14. Os PTMs histonos ou influenciam diretamente o estado cromatina afetando a carga líquida dos nucleosmosos onde os histones são montados, ou indiretamente recrutando escritores, leitores e borrachas14. Centenas de PTMs histone foram identificados até o momento15, reforçando a hipótese de que a cromatina hospeda um "código histona" usado pela célula para interpretar o DNA16. No entanto, a identificação de uma miríade de combinações de PTM15, e a descoberta de que combinações de PTMs histone frequentemente têm funções biológicas diferentes de PTMs presentes isoladamente (por exemplo, Fischle, et al.17), destaca que mais trabalho é necessário para descriptografar o "código histona".
Atualmente, a análise histone PTM é baseada em técnicas que utilizam anticorpos (por exemplo, manchas ocidentais, imunofluorescência ou imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento [ChIP-seq]) ou espectrometria de massa (MS). As técnicas baseadas em anticorpos têm alta sensibilidade e podem fornecer informações detalhadas sobre a localização em todo o genoma de marcas de histona, mas são frequentemente limitadas no estudo de PTMs raros ou PTMs presentes em combinações 18,19,20. A ESM é mais adequada para identificação e quantificação de proteínas únicas e coexistindo, em particular proteínas histonas 18,19,20. Por essas razões, este e vários outros laboratórios otimizaram o pipeline de MS para a análise de peptídeos de histona (ms de baixo para cima), caudas de histona intactas (MS médio-para baixo) e proteínas histonas de comprimento completo (MS de cima para baixo) 21,22,23.
Detalhado abaixo está um fluxo de trabalho para o crescimento de spheroids HepG2/C3A e prepará-los para análise de peptídeos histone (bottom-up MS) via cromatografia nano-líquida, juntamente com espectrometria de massa tandem (nLC-MS/MS). Uma cultura celular 2D foi cultivada e as células foram colhidas e transferidas para um bioreator onde começariam a formar esferoides (Figura 1). Após 18 dias na cultura, os esferoides foram tratados com butirato de sódio ou succinato de sódio para aumentar as abundâncias relativas de acetilação de histona e succinilation. Notavelmente, culturas 3D podem ser tratadas com compostos genotóxicos, bem como seus equivalentes de cultura plana; de fato, publicações recentes destacam que a resposta toxicológica das células na cultura 3D é mais semelhante aos tecidos primários do que aqueles na cultura plana 2D 24,25. As células foram então coletadas em pontos de tempo especificados e o isolamento nuclear foi realizado. Em seguida, as histonas foram extraídas e derivadas com anidrido propionônico antes e depois da digestão da trippsina de acordo com um protocolo desenvolvido pela primeira vez por Garcia et al.26. Este procedimento gera peptídeos de tamanho adequado para separação on-line com cromatografia de fase inversa (C18) e detecção com ESM. Finalmente, os peptídeos histonas foram identificados e quantificados, e os dados gerados foram representados de múltiplas formas para uma interpretação biológica mais completa.
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Protocol
1. Preparação de tampões e reagentes
- Mídia de crescimento celular (para células HepG2/C3A): Adicionar soro bovino fetal (FBS) (10% v/v), aminoácidos não essenciais (1% v/v), suplemento l-glutamina (1% v/v) e penicilina/estreptomicina (0,5% v/v) ao Médio De Águia Modificada de Dulbecco (DMEM, contendo glicose de 4,5 g/L). A mídia de crescimento é armazenada a 4 °C por uma máxima de 2 semanas.
- Solução de butirato de sódio de 200 mM (NaBut): Para preparar 10 mL, resuspenda 220,18 mgs de NaBut em 10 mL de ddH2O. Armazene 1 mL aliquots a -20 °C. Antes do tratamento celular, filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,45 mm e adicione 1 mL da solução filtrada a 9 mL de mídia de crescimento celular para uma concentração de trabalho de 20 mM.
- Solução de succinato de sódio de 100 mM (NaSuc): Para preparar 10 mL, resuspenda 162,05 mg de NaSuc em 10 mL de ddH2O. Armazene 1 mL aliquots a -20 °C. Antes do tratamento celular, filtre a solução usando um filtro de seringa de 0,45 mm e adicione 1 mL da solução filtrada a 9 mL de mídia de crescimento celular para uma concentração de trabalho de 10 mM.
- Frio 0,2 M H2SO4: Para preparar 1 L, adicione 10 mL de H2SO4 a 990 mL de água de grau HPLC. Armazenar a 4 °C.
- Acetona fria + ácido clorídrico de 0,1% (HCl): Adicione HCl concentrado (0,1% v/v) à acetona. Armazenar a 4 °C.
- Solução 100 mM NH4HCO3 , pH 8.0: Para preparar 1 L, resuspend 7,91 g de NH4HCO3 em 1 L de água hplc. Armazene 50 mL a -20 °C.
- Solução de ácido trifluoroacético (TFA) de 0,1%: Adicione TFA concentrado (0,1% v/v) à água de grau HPLC. Armazenar a 4 °C.
- Solução de acetonitrila/0,1% TFA de 60%: Adicione acetonitrilo de grau HPLC (60% v/v) à água de grau HPLC. Em seguida, adicione TFA concentrado (0,1% v/v) a esta solução. Armazenar a 4 °C.
- Acetonitrila de grau HPLC de 2% + ácido fórmico de 0,1%: Adicione acetonitrila de grau HPLC (2% v/v) à água de grau HPLC. Em seguida, adicione ácido fórmico concentrado (0,1% v/v) a esta solução.
- Acetonitrilo de grau HPLC de 80% + ácido fórmico de 0,1%: Adicione acetonitrilo de grau HPLC (80% v/v) à água de grau HPLC. Em seguida, adicione ácido fórmico concentrado (0,1% v/v) a esta solução.
2. Preparação do sistema de cultura 3D
NOTA: Diferentes células, primárias ou imortalizadas, possuem diferentes propriedades culturais, de modo que a formação de esferoides pode diferir entre os tipos de células. Este protocolo foi estabelecido para a formação de spheroid HepG2/C3A utilizando bioreatores e um inovador sistema de cultura celular 3D.
- Usando mídia de crescimento padrão, as células crescem como uma monocamada até que sejam 80% confluentes.
- Lave as células com HBSS (5 mL para um frasco de 75 cm2 ) e incuba as células com 5 mL de 0,05% de trippsina-EDTA diluídas em HBSS (diluição de 1:2) por 5 min a 37 oC com 5% de CO2.
- Verifique o desprendimento celular sob um microscópio e neutralize a trippsina adicionando 3 mL de soro bovino fetal (FBS) ou mídia de crescimento (contendo 5%-10% FBS).
- Conte o número de células e dilua a suspensão celular para obter 1 x 106 células em um volume máximo de 1,5 mL.
- Equilibre uma placa inferior redonda de 24 poços (contendo vários micro-poços por poço) lavando os poços com 0,5 mL de mídia de crescimento. Centrifugar a placa por 5 min a 3.000 x g para remover bolhas de ar da superfície do poço.
- Transfira a suspensão da célula para a placa e centrífuga por 3 min a 120 x g.
- Incubar a placa por 24 h a 37 oC com 5% de CO2 para formação de esferoide. Enquanto isso, equilibre o bioreator preenchendo a câmara de umidade com 25 mL de água estéril e a câmara celular com 9 mL de mídia de crescimento.
- Incubar o bioreator, girando na incubadora de clinostat, por 24 h a 37 oC com 5% de CO2.
3. Crescimento de esferoides em bioreatores
NOTA: Para preservar a estrutura dos esferoides, pontas largas de furo são usadas para manusear as estruturas 3D.
- Desprender spheroids da placa de fixação ultra-baixa, pipetando suavemente para cima e para baixo com pontas de furo de 1 mL de largura e transferir para um prato tratado com cultura de tecido.
- Lave a placa com 0,5 mL de mídia de crescimento pré-aquecida e transfira para o mesmo prato.
- Avalie a qualidade dos esferoides por microscopia e selecione esferoides suficientemente formados. Spheroids de boa qualidade têm tamanho uniforme, compactação e arredondamento.
- Transfira esferoides para bioreatores equilibrados cheios de 5 mL de nova mídia de crescimento. Depois de transferir os esferoides, preencha completamente o bioreator com novas mídias de crescimento.
- Coloque o bioreator na incubadora de clinostat e ajuste a velocidade de rotação para 10-11 rpm.
- Troque a mídia de crescimento a cada 2-3 dias, removendo 10 mL de mídia antiga e substituindo-a por 10 mL de mídia fresca.
- Ajuste a velocidade de rotação de acordo com o crescimento esferoide, aumentando à medida que os esferoides crescem em tamanho e número.
- Após 18 dias na cultura, os esferoides estão prontos para tratamento e/ou coleta
4. Tratamento e coleta de sferóides
NOTA: Neste protocolo, os esferoides HepG2/C3A são tratados com butirato de sódio (NaBut) e succinato de sódio (NaSuc) para avaliar os níveis de aspatas de histona contendo acetilação e succiniltação, respectivamente.
- Prepare a mídia de crescimento com a concentração de trabalho adequada do composto (por exemplo, 20 mM de NaBut ou 10 mM NaSuc). Troque a mídia no bioreator com a mídia tratada.
NOTA: Para estabelecer uma condição de controle, colete eferóides suficientes para experimentos antes de adicionar o tratamento ou designar um bioreator para esferoides não tratados. - Coletar esferoides para análise proteômica após tempo suficiente de tratamento (por exemplo, 48 h a 1 semana para tratamento naSuc ou 48-72 h para tratamento naBut).
NOTA: Para extração de histona usando este protocolo, foram coletados seis a oito esferoides contendo aproximadamente 1 x106 células.- Remova 3-5 mL de mídia do bioreator através da porta superior.
- Abra a porta frontal e use uma ponta de furo de 1 mL de largura para remover esferoides e coloque-os em tubos de microcentrifuuge.
- Centrifugar os esferoides a 100 x g por 5 min e descartar mídia.
NOTA: A mídia no bioreator pode ser alterada e o bioreator pode ser devolvido à incubadora para tempo adicional de tratamento ou recuperação. - Lave os esferoides com 200 μL de HBSS para remover o FBS. Centrifugar a 100 x g por 5 min e remover o supernatante.
NOTA: Os spheroids podem ser armazenados a -80 oC até o processamento.
5. Extração de histona
NOTA: Os muitos resíduos básicos de aminoácidos presentes nas histonas permitem que eles interajam de perto com o DNA, que tem uma espinha dorsal de ácido fosfórico. Como as histonas são algumas das proteínas mais básicas do núcleo, quando são extraídas com ácido sulfúrico gelado (0,2 M H2SO4) há contaminação mínima. As proteínas não histonas precipitarão em ácido forte. O ácido tricloroacético altamente concentrado (TCA) diluído a uma concentração final de 33% é usado depois para precipitar as histonas do ácido sulfúrico. Guarde todas as amostras, tubos e reagentes no gelo para toda a extração de histona.
- Adicione cinco volumes (~100 μL) de frio 0,2 M H2SO4 à pelota celular (~10-20 μL), e pipeta para cima e para baixo para interromper a pelota e soltar histonas.
- Incubar tubos por até 4h em rotação constante ou tremendo a 4 oC.
NOTA: Para amostras resuspended que têm um volume superior a 500 μL, uma incubação de 2 h é suficiente para extrair histonas (a incubação mais longa pode resultar na extração de outras proteínas nucleares básicas). Para amostras resuspended com um volume inferior a 200 μL, é necessária uma incubação de 4 h para um melhor rendimento. - Centrifugar a 3.400 x g por 5 min a 4 °C. Colete supernante em um novo tubo e descarte a pelota mais tarde.
- Adicione TCA concentrado a frio de tal forma que compõe um final de 25%-33% v/v (por exemplo, 40-60 μL de TCA frio: 120 μL de supernanato) e misture invertendo o tubo algumas vezes.
- Incubar tubos por pelo menos 1h em rotação constante ou tremendo a 4 oC.
NOTA: Para tamanhos menores de pelotas iniciais, recomenda-se uma incubação durante a noite. - Centrifugar a 3.400 x g por 5 min a 4 oC. Descarte o supernatante por pipetação. Aspirar o supernante cuidadosamente; não toque nas laterais do tubo ou da pelota.
NOTA: Os tons depositam tanto nas laterais quanto na parte inferior do tubo. A pelota insolúvel branca formada na parte inferior do tubo contém principalmente proteínas não histonas e outras biomoléculas. - Lave o tubo (paredes e pelotas) com acetona fria + 0,1% HCl usando uma pipeta Pasteur de vidro (~500 μL/tubo).
- Centrifugar a 3.400 x g por 5 min a 4 oC. Descarte o supernatante invertendo o tubo.
- Lave o tubo (paredes e pelotas) com acetona 100% fria usando uma pipeta pasteur de vidro (~500 μL/tubo). Centrifugar a 3.400 x g por 5 min a 4 oC.
- Descarte o supernatante lançando o tubo e a pipeta para fora do acetona restante. Abra a tampa e seque a amostra no banco por ~20 min.
- Proceda à propionitilação ou armazene amostras em -80 oC até o uso.
6. Primeira rodada de derivatização
NOTA: O uso de trippsina para digerir proteínas histonas leva a peptídeos excessivamente pequenos que são difíceis de identificar usando configurações tradicionais de proteômica. Por essa razão, o anidrido propiônico é usado para derivatizar quimicamente os grupos ɛ-amino de resíduos de ilise de irósina não modificada e monometil. Isso restringe a proteólise de trypsina aos resíduos de arginina terminal C. Para amostras em placas de 96 poços, recomenda-se o uso de pipetas multicanais e reservatórios para captação de reagentes (Figura 2A). A derivatização também é realizada após a digestão para rotular o N-termini livre dos peptídeos que aumentam a hidrofóbicidade do peptídeo e, portanto, a retenção cromatográfica de fase invertida.
- Resuspend amostras em 20 μL de acetonitrilo de 15%-20% em 100 mM de bicarbonato de amônio (pH 8.0). Vórtice para 15 s, e depois gire para baixo a 1.000 x g para 30 s.
- Se houver oito ou mais amostras, transfira cada amostra resuspended em uma placa de 96 poços.
NOTA: Se as amostras não tiverem sido transferidas para uma placa de 96 poços, uma pipeta de canal único pode ser usada nas etapas 6.3-6.7, 7.1-7.5 e 8.1-8.5. - Sob o capô, adicione 2 μL de anidrido propiônico usando uma pipeta multicanal. Misture por pipetting para cima e para baixo 5x.
- Adicione rapidamente 10 μL de hidróxido de amônio usando uma pipeta multicanal. Misture por pipetting para cima e para baixo 5x.
NOTA: O ácido propiônico é um produto da reação entre o anidrido propiônico e as aminas livres dos peptídeos e pode diminuir o pH amostral. o pH 8 pode ser restabelecido adicionando hidróxido de amônio à amostra a uma razão de 1:5 (v/v). - Certifique-se de que o pH é 8 usando papel de teste pH. Se o pH < 8, ajuste adicionando 1 μL de hidróxido de amônio. Se o pH > 8, ajuste adicionando 1 μL de ácido fórmico ou acético. Quando o pH > 10, é possível rotular outros resíduos de aminoácidos com pKa mais alto.
- Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
- Repetir as etapas 6.3-6.6. Uma rodada dupla de propionação de histona garante uma eficiência de reação quase completa.
- Placa seca no vácuo de velocidade até que todos os poços estejam completamente secos (~9 h).
- Proceda à digestão de trypsin ou armazene amostras a -80 oC até o uso.
7. Digestão de histona
NOTA: As histonas são digeridas em peptídeos usando trippsina, que corta no lado carboxyl de resíduos de arginina e de liseina. No entanto, uma vez que a propionilização modifica os resíduos de lise, apenas os resíduos de arginina são cortados (Figura 2B).
- Prepare a solução de trippsina (25 ng/μL em 50 mM NH4HCO3, pH 8.0). Adicione 20 μL de trippsina (500 ng) a cada amostra.
- Para preparar a solução 50 mM NH4HCO3, diluir a solução NH 4 HCO3 de 1:1 v/v com água de grau HPLC de 100 mM NH1:1 v com água de grau HPLC.
- Certifique-se de que o pH é 8 usando papel de teste pH. Se o pH < 8, ajuste adicionando 1 μL de hidróxido de amônio. Se o pH > 8, ajuste adicionando 1 μL de ácido fórmico ou acético.
- Digerir à temperatura ambiente durante a noite ou incubar a 37 oC por 6-8 h.
- Se possível, verifique o pH após ~3h de digestão, pois pode ter diminuído. Se o pH < 8, ajuste adicionando 1 μL de hidróxido de amônio.
- Adicione uma solução adicional de 5 μL de 50 ng/μL trypsin (250 ng) e continue a digestão.
- Proceda para a segunda rodada de propionação ou armazene amostras a -80 oC até o uso.
8. Derivatização do peptídeo N-termini
NOTA: A propionilação de peptídeos histônicos em seu N-terminus melhora a retenção dos peptídeos mais curtos por cromatografia líquida de fase invertida (por exemplo, aminoácidos 3-8 de histona H3), à medida que o grupo propionil aumenta a hidrofóbica peptídea.
- Sob o capô, adicione 2 μL de anidrido propiônico usando a pipeta multicanal. Misture por pipetting para cima e para baixo 5x.
- Adicione rapidamente 10 μL de hidróxido de amônio usando a pipeta multicanal. Misture por pipetting para cima e para baixo 5x.
NOTA: O ácido propiônico é um produto da reação entre anidrido propiônico e aminas livres de peptídeos, podendo diminuir o pH amostral. o pH 8 pode ser restabelecido adicionando hidróxido de amônio à amostra a uma razão de 1:5 (v/v). - Certifique-se de que o pH é 8 usando papel de teste pH. Se o pH < 8, ajuste adicionando 1 μL de hidróxido de amônio. Se o pH > 8, ajuste adicionando 1 μL de ácido fórmico ou acético. Quando o pH > 10, é possível rotular outros resíduos de aminoácidos com pKa mais alto.
- Incubar em temperatura ambiente por 10 minutos.
- Repetir as etapas 8.1-8.4. Uma rodada dupla de propionação de histona garante uma eficiência de reação quase completa.
- Placa seca no vácuo de velocidade até que todos os poços estejam completamente secos (~9 h).
- Proceda para a etapa de desalar ou armazene amostras a -80 oC até o uso.
9. Desalting e limpeza de amostras
NOTA: Os sais presentes na amostra interferem na análise da espectrometria de massa. Os sais também são ionizados durante o eletrospray e podem suprimir sinais de peptídeos. Sais podem formar adutos iônicos em peptídeos, o que faz com que o peptídeo aduto tenha uma massa diferente. Isso reduz a intensidade do sinal do peptídeo e evita a identificação e quantificação adequadas. A configuração para desalado é ilustrada na Figura 2C.
- Comece a misturar a resina HLB (50 mg/mL em 100% acetonitrilo) em uma placa de agitação magnética.
- Certifique-se de que há uma placa de coleta de 96 poços colocada sob a placa de filtro de polipropileno de 96 poços para coletar o fluxo..
- Adicione 70 μL de suspensão HLB por poço à placa do filtro. Ligue suavemente o vácuo para evitar respingos. Descarte o fluxo.
- Lave a resina com 100 μL de 0,1% de TFA. Ligue suavemente o vácuo para evitar respingos. Descarte o fluxo.
- Resuspend cada amostra em 100 μL de 0,1% TFA. Verifique o pH; deve ser ~2-3.
- Coloque cada amostra em cada poço. Ligue o vácuo suavemente para evitar respingos. Descarte o fluxo.
- Lave com 100 μL 0,1% TFA. Ligue o vácuo suavemente para evitar respingos. Descarte o fluxo.
- Substitua a placa de coleta por uma nova placa de coleta de 96 poços.
- Adicione 60 μL de acetonitrilo/0,1% TFA por poço. Ligue o vácuo suavemente para evitar respingos. Colete o fluxo e seque em um vácuo de velocidade.
- Proceda para LC-MS/MS ou armazene amostras a -80 oC até o uso.
10. Análise de peptídeos de histona via cromatografia líquida aliada à espectrometria de massa
- Prepare as fases móveis para executar na cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC). Fase Móvel A (MPA): acetonitrilo de grau HPLC de 2% + ácido fórmico de 0,1%. Fase Móvel B (MPB): acetonitrilo de grau HPLC de 80% + ácido fórmico de 0,1%.
- Programar o método HPLC da seguinte forma: (1) 4%-34% MPB acima de 30 min; (2) 34%-90% MPB acima de 5 min; e (3) isocrática 90% MPB por 5 min. Use as seguintes propriedades de coluna recomendadas: C18 3 μm material de embalagem, 75 μm de diâmetro interno, 20-25 cm de comprimento. Defina a taxa de fluxo para 250-300 nL/min para nano-colunas com diâmetro interno de 75 μm.
- No caso de o HPLC não ser programado para automatizar o equilíbrio da coluna antes do carregamento da amostra, inclua (4) 90%-4% MPB ao longo de 1 min e (5) MPB isocrático acima de 10 minutos.
- Programe o método de aquisição de MS.
- Certifique-se de que o instrumento realize uma varredura de MS completa no início de cada ciclo de serviço. Recomenda-se instrumentação de alta resolução (por exemplo, analisadores orbitrap ou time-of-flight) devido à precisão de massa que pode ser utilizada durante a extração do sinal. No entanto, a instrumentação de baixa resolução também pode ser utilizada como descrito anteriormente27,28.
- Certifique-se de que a varredura completa de MS seja seguida por 16 eventos de varredura MS/MS, cada um com uma largura de isolamento de 50 m/z, abrangendo a faixa m/z de 300-1100. Por exemplo, a primeira varredura deve isolar sinais a 300-350 m/z, o segundo a 350-400 m/z, etc. Se possível, a aquisição de exames de MS/MS em alta resolução também, mas a menor resolução em relação à varredura completa de MS é suficiente (devido às massas menores de íons fragmentado em comparação com íons intactos).
- O método HPLC gerará sinais cromatográficos com larguras máximas de ~3-40 s; para garantir a quantificação adequada do sinal, certifique-se de que o espectrômetro de massa realize pelo menos 10 ciclos de trabalho por pico cromatográfico (ou seja, um ciclo de serviço de 3 s ou mais rápido).
- Se usar um analisador de massa estilo trapping (orbitrap, ion trap), certifique-se de que o limite de tempo de injeção de íons esteja definido para <200 ms; para outros analisadores (quadrupole, tempo de voo), isso não é um problema devido ao seu tempo de varredura mais rápido. Um teste preliminar pode ser necessário.
NOTA: Mais detalhes sobre os métodos de EM para análise de peptídeos de histona podem ser encontrados nas seguintes referências 27,28,29.
- Amostra de resuspend em 10 μL de MPA, que corresponde a ~1 μg/μL de amostra de histona digerida. A quantidade exata de carregamento não é crítica (também não trivial de avaliar) se todas as amostras do lote são carregadas usando diluições e volumes semelhantes.
- Carregue 1 μL de amostra na coluna HPLC.
- Execute o método LC-MS/MS programado nas etapas 10.1-10.3.
11. Análise de dados
- Importe os arquivos de dados brutos ms em software projetado para executar a integração de área de pico.
NOTA: O EpiProfile30,31 é usado no presente estudo e é geralmente recomendado, pois é otimizado para a extração confiável da área de pico de peptídeos histonas conhecidos. No entanto, outros softwares disponíveis livremente para cromatografia de íons extraídos, como o Skyline32,33, são adequados. - Calcule a abundância relativa de um peptídeo (un)modificado como a área de um único peptídeo dividido pela área total do peptídeo em todas as suas formas modificadas. Softwares como EpiProfile 30,31 já contêm bibliotecas de peptídeos para extração de sinal. Caso contrário, gere uma biblioteca de peptídeos de interesse manualmente ou via identificação de peptídeos usando dutos de proteômica de rotina.
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Representative Results
Neste protocolo, os esferoides HepG2/C3A foram tratados com 20 mM NaBut e 10 mM NaSuc, ambos áfetou os níveis globais de PTMs histone (Figura 3A). Os PTMs de histone foram então identificados e quantificados no nível único de resíduos via aquisição de MS/MS (Figura 3B).
Quando as amostras são executadas em réplicas, a análise estatística pode ser realizada para avaliar o enriquecimento da mudança de dobra de um PTM entre as amostras, bem como a reprodutibilidade da observação. Os dados mostrados demonstram que os peptídeos modificados com acetilações são enriquecidos em esferoides tratados com NaBut vs. control (Figura 3C), enquanto as amostras tratadas com NaSuc têm uma maior abundância relativa de peptídeos histonas modificadas com succiilação de lysina (Figura 3D). Esses cálculos foram feitos em um programa de planilhas conforme detalhado em publicaçãoseparada 34. Um aumento global de uma determinada modificação de histona pode ser melhor representado em gráficos de radar, onde observar uma maior abundância global de uma determinada modificação torna-se mais intuitivo, mesmo mantendo informações detalhadas sobre os locais de modificação analisados (Figura 3E,F).
Este protocolo gera um peptídeo a partir de resíduos de aminoácidos histone H3 9-17, que incluem os resíduos frequentemente modificados K9, S10 e K14. Os dados mostrados indicam que o tratamento com NaBut aumenta os níveis de H3K14ac, mas apenas em histones co-modificados com H3K9me2 e não H3K9me3 (Figura 4A). A frequência de coexistência entre duas modificações pode ser representada de forma mais intuitiva como um gráfico de anel, onde os nós representam modificações individuais, enquanto a espessura das linhas de conectore representa a frequência de coexistência entre os dois PTMs (Figura 4B). Às vezes, a frequência de coexistência não é afetada, mas os dados representados como parcelas de barras podem ser enganosos. Por exemplo, os dados representados na Figura 4A indicam que a combinação H3K9me2K14ac é mais abundante no tratamento NaBut do que no controle. Isso é correto, mas essa combinação dada é a mais frequente, independentemente do tratamento. A Figura 4B mostra claramente que H3K9me2K14ac e H3K9me3K14ac são os padrões combinatórios mais frequentes, independentemente do tratamento (espessura da linha), mas que os níveis globais de H3K14ac (nó) são o que realmente está mudando no experimento.
Este protocolo gera um peptídeo a partir de resíduos histone H4 4-17, que inclui resíduos modificáveis nas posições K5, K8, K12 e K16 (principalmente por acetilações). Ao comparar o controle e o tratamento nabut, é possível observar um aumento nas combinações de acetilações representando dados como, por exemplo, nuvens de palavras (Figura 4C). Esta representação destaca claramente que a versão não modificada do histone H4 é mais abundante na amostra de controle, enquanto os esferoides tratados com NaBut são enriquecidos em proteoformas histonas duplamente, triplas e quadruplicamente acetiladas H4. No entanto, as nuvens de palavras são limitadas na exibição de valores exatos; a abundância relativa de um código histono deve ser desarmada pelo tamanho do texto, que pode ser subestimado incorretamente. Portanto, diagramas de Venn ou equivalentes mais modernos, como a representaçãoUpSetR 35, podem ser usados para mostrar a quantificação exata dos PTMs de histona co-existentes (Figura 4D,E). Os dados mostraram mais uma vez que combinações selecionadas de acetilações no histona H4 são relativamente mais abundantes no tratamento NaBut em comparação com o controle.
Figura 1: Fluxo de trabalho para análise de peptídeos de histona de esferoides 3D. As células HepG2/C3A são cultivadas pela primeira vez na cultura 2D até atingirem 80% de confluência. As células são então transferidas para um bioreator equilibrado e colocadas dentro da incubadora de clinostat, onde irão girar a 10-11 rpm para formar esferoides. Após 18 dias, os esferoides são tratados com NaBut de 20 mM ou 10 mM NaSuc e são colhidos após seus pontos de tempo correspondentes. Os núcleos são isolados das células e a extração de histona é realizada com 0,2 M H2SO4. A derivatização de histona é então realizada com anidrido propionic antes e depois da digestão da trippsina para garantir a retenção dos peptídeos curtos resultantes por cromatografia líquida. As amostras são dessaladas e depois executadas usando o método LC-MS/MS mencionado na etapa 10, e os dados resultantes são analisados conforme descrito na etapa 11. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Configuração para propionylation e passos de dessalgação. (A) A propionylation é realizada em um capô de fumaça e todos os componentes são dispostos para que os passos possam ser executados em rápida sucessão. (B) Esquema da primeira rodada de propionylação, digestão de trippsina e segunda rodada de propionação na cauda de histona H3.1. (C) A desalvação é realizada no banco usando um coletor de vácuo de 96 poços e uma placa de filtro de polipropileno de 96 poços. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação de modificações de histona individual. (A) Gráfico de barra mostrando a abundância relativa de modificações de histona global comum no controle e tratado (20 mM NaBut ou 10 mM NaSuc) HepG2/C3A spheroids. (B) Gráfico de barra mostrando a abundância de PTMs de histótono único que ocorrem em resíduos 9-17 de peptídeos histona H3 (KSTGGKAPR) em controle e tratados (20 mM NaBut ou 10 mM NaSuc) HepG2/C3A spheroids. (C,D) Gráficos vulcâneis mostrando a mudança de dobra e o significado da expressão diferencial dos PTMs de peptídeos histonas após o tratamento com 20 mM NaBut (C) ou 10 mM NaSuc (D). Os pontos azuis e verdes destacados representam resíduos acetilados e succinylatados, respectivamente. (E,F) Gráficos de radar mostrando a abundância de acetilação de peptídeo de histona única (E) ou succinilation (F) após o tratamento com 20 mM NaBut ou 10 mM NaSuc, respectivamente, em comparação com o controle. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Representação de modificações de histona co-existentes. (A) Gráfico de barra mostrando a abundância de PTMs de histona combinatória que ocorrem em resíduos 9-17 de histone H3 (KSTGGKAPR) em controle e tratado (20 mM NaBut ou 10 mM NaSuc) HepG2/C3A spheroids. (B) Gráficos de anéis que mostram a relação entre PTMs de histona combinatória em resíduos 9-17 de histone H3 (KSTGGKAPR) em controle e tratados (20 mM NaBut) HepG2/C3A spheroids. A intensidade da cor do nó corresponde à abundância de um único PTM dentro de seu grupo de tratamento, enquanto a espessura da linha corresponde à frequência de co-ocorrência de PTM. (C) Nuvens de palavras mostrando a frequência de PTMs de histona combinatória em resíduos de histone H4 em controle e tratados (20 mM NaBut) HepG2/C3A spheroids. O tamanho do texto corresponde à abundância do PTM combinatório especificado. (D,E) Diagrama de Venn representando a frequência de modificações co-existentes em resíduos de peptídeos histona H4 4-17 em controle e 20 mM NaBut amostras tratadas. Os dados são exibidos usando o ShinyApp UpSetR35. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela Suplementar 1: Lista de peptídeos detectados usando este protocolo. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
A análise dos PTMs histone é fundamentalmente diferente do típico pipeline de análise de proteômica. A maioria dos PTMs histone ainda tem funções biológicas enigmáticas; como resultado, anotações como Gene Ontology ou bancos de dados de caminhos não estão disponíveis. Existem vários recursos que associam modificações de histona à enzima responsável por sua catálise ou proteínas que contenham domínios que ligam esses PTMs (por exemplo, HISTome36). Além disso, é possível especular sobre o estado geral da cromatina quando os níveis globais de PTMs de histone são regulados. Por exemplo, um aumento global da acetilação de histona ou outras aciclações como a succinilation é normalmente associado com a des condensação de cromatina37,38.
A análise de MS fornece informações mais detalhadas sobre essas modificações, como sua localização exata na sequência de aminoácidos. Neste protocolo, a aquisição de MS/MS é usada para identificar e quantificar PTMs histone, que podem ser críticos para interpretação biológica. Por exemplo, a trimetilação na lysina 4 de histone H3 (H3K4me3) é enriquecida em promotores de genes39 transcritos ativamente, enquanto a mesma modificação nos benchmarks de lysina 9 (H3K9me3) é constitutiva heterocromatina40. Modificações de histona estão sendo utilizadas como biomarcadores em doenças específicas; como tal, a análise de histona pode ser usada para estudar a patologia da doença, além da resposta ao tratamento (por exemplo, com drogas epigenéticas)41,42.
É mais desafiador representar visualmente interações entre múltiplos PTMs em oposição a PTMs únicos. Embora gráficos existentes, como gráficos de anel, possam mostrar a frequência de coexistência de dois PTMs, eles não podem representar a frequência de coexistência entre mais de dois PTMs de cada vez, uma vez que isso exigiria uma representação tridimensional da rede. Por essa razão, outras representações poderiam ser mais apropriadas para destacar mudanças nos códigos histonas quando três ou mais PTMs são considerados. Em geral, a diversificação da representação de dados oferece maiores chances de observar mudanças significativas entre as amostras. Este protocolo apresenta exemplos de diferentes ilustrações para exibir regulamentos de PTMs histone e PTMs co-existentes.
Embora este protocolo gere peptídeos histônicos relativamente pequenos devido à digestão de trippsina (aproximadamente 4-20 aminoácidos), peptídeos selecionados contêm múltiplos resíduos modificáveis. A análise desses peptídeos permite a quantificação das frequências de coexistência de PTMs, o que poderia revelar informações importantes sobre quais marcas de histona combinatórias são reguladas em um determinado conjunto de dados. Notavelmente, não há etapas durante a preparação da amostra onde a quantificação das histonas é realizada. Existem quatro razões para isso: (1) a trippsina tem uma ampla gama de atividades e pode ser usada em uma ampla gama de enzimas para proporções de amostra (1:10-1:200). Mesmo quando o rendimento experimental das histonas extraídas difere do esperado, problemas com digestão não foram encontrados usando este protocolo. (2) Este protocolo destina-se a quantidades minúsculas de material, onde a quantificação de histona pode ser difícil de realizar devido à falta de sensibilidade. (3) Usando uma concentração constante de trippsina, independentemente da quantidade de material histona, podemos usar peptídeos trippticos (como autolisar trippsina) para avaliar o desempenho da cromatografia. Pequenas variações no rendimento da amostra serão normalizadas pelo software de análise de dados (etapa 11), que usa todos os sinais (não)modificados para um determinado peptídeo como denominador durante o processo de normalização. (4) Finalmente, a subestimação dramática da quantidade de material inicial pode criar problemas de sobrecarga da coluna cromatográfica nanoLC. No entanto, a realização da etapa de dessacoção, conforme indicado neste protocolo, impede que essa questão ocorra. Em caso de quantidades excessivas de material inicial (por exemplo, >100 μg), o limite da capacidade da resina de desalagem será excedido, e qualquer amostra em excesso será lavada durante a etapa de carregamento.
É importante notar que nem todos os peptídeos detectados por esta análise foram destacados na Figura 3 e Figura 4. Além disso, nem todas as modificações de histona são detectáveis usando esses métodos específicos de preparação e aquisição de amostras. A Tabela Suplementar 1 é fornecida para listar todos os sinais de peptídeos extraídos usando o gasoduto descrito. Algumas modificações bem conhecidas não estão listadas na tabela, pois a preparação da amostra descrita não é adequada para sua detecção. Exemplos notáveis são peptídeos ubiquídeos da histona H2A e H2B, e fosforilação de histone H2A. X (um marcador geral de dano de DNA). Isso porque a propionitilação dos peptídeos associados a esses PTMs leva a peptídeos excessivamente longos, que não são adequados para cromatografia C18 e o método de detecção de EM descrito. Outras modificações presentes na literatura, mas não presentes na Tabela Suplementar 1 , são modificações de abundância muito baixas (atualmente só detectáveis utilizando ES após estratégias de enriquecimento, como imunoprecipitação ou tratamento celular específico), como lactilação43 ou sorotonilation44. Modificações histonas com mudanças de massa imprevisíveis causadas pela polimerização ou vinculação covalente heterogênea à sequência de histona também não são consideradas (por exemplo, poli-ADP-ribosylation45 e glicação46). Além disso, este protocolo usa NaSuc e NaBut para tratar spheroids HepG2/C3A, mas pode ser modificado para uso com outras drogas/modificadores epigenéticos e tipos de cultura celular 2D/3D.
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Disclosures
Os autores não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O laboratório Sidoli agradece a Leucemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics award), Deerfield (prêmio Xseed), Relay Therapeutics, Merck, e o NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
| 0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
| 10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
| 10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
| 10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
| 1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
| 18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
| 200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
| 2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
| 24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
| 75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
| 96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
| Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
| Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
| Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
| ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
| Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
| Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
| Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
| Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
| HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
| Ice | N/A | N/A | |
| MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
| Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
| Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
| Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
| pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
| Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
| Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
| Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
| Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
| Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
| Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
| Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
| Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
| Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
| SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
| SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
| Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
| Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
| Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
| Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
| Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
| Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
| Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
| Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |
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