Detta protokoll beskriver hur ett tredimensionellt cellodlingssystem kan användas för att modellera, behandla och analysera kromatinmodifieringar i ett nästan fysiologiskt tillstånd.
Platta kulturer av däggdjursceller är en allmänt använd in vitro-metod för att förstå cellfysiologi, men detta system är begränsat vid modellering av fasta vävnader på grund av onaturligt snabb cellreplikation. Detta är särskilt utmanande vid modellering av moget kromatin, eftersom snabbreplikerande celler ofta är involverade i DNA-replikation och har en heterogen polyploid population. Nedan presenteras ett arbetsflöde för modellering, behandling och analys av vilande kromatinmodifieringar med hjälp av ett tredimensionellt (3D) cellodlingssystem. Med hjälp av detta protokoll odlas hepatocellulära karcinomcellinjer som reproducerbara 3D-sfäroider i en inkubator som ger aktiv näringsdiffusion och låga skjuvkrafter. Behandling med natriumsmörjat och natriumsuccinat inducerade en ökning av histonacetylering respektive bärnstensbehandling. Ökningar av nivåer av histonacetylering och succinylering är förknippade med ett mer öppet kromatintillstånd. Sfäroider samlas sedan in för isolering av cellkärnor, från vilka histonproteiner extraheras för analys av deras post-translationella modifieringar. Histonanalys utförs via vätskekromatografi kopplad online med tandemmasspektrometri, följt av en intern beräkningspipeline. Slutligen visas exempel på datarepresentation för att undersöka frekvensen och förekomsten av kombinatoriska histonmärken.
Sedan slutet av 1800-talet har cellodlingssystem använts som en modell för att studera tillväxt och utveckling av celler utanför människokroppen 1,2. Deras användning har också utvidgats till att studera hur vävnader och organ fungerar i både friska och sjuka sammanhang 1,3. Suspensionsceller (t.ex. blodceller) växer i petriskålar eller kolvar sömlöst och omväxlande eftersom de inte monteras i tredimensionella (3D) strukturer in vivo. Celler som härrör från fasta organ kan växa i antingen tvådimensionella (2D) eller 3D-odlingssystem. I 2D-odling odlas celler i ett monolager som fäster vid en plan yta 2,4. 2D-cellodlingssystem kännetecknas av exponentiell tillväxt och en snabb fördubblingstid, vanligtvis 24 timmar till några dagar5. Celler i 3D-system växer för att bilda invecklade cell-cellinteraktioner som modellerar vävnadsliknande konglomerat närmare, och de kännetecknas av deras förmåga att nå en dynamisk jämvikt där deras fördubblingstid kan nå 1 månad eller längre5.
Presenteras i denna uppsats är en innovativ metod för att odla 3D-sfäroider i roterande cellodlingssystem som simulerar minskad gravitation6. Detta är ett förenklat derivat av ett cellodlingssystem som introducerades av NASA på 1990-talet7. Detta tillvägagångssätt minimerar skjuvkrafterna, som förekommer i befintliga metoder som spinnkolvar, och ökar sfäroidreproducerbarheten6. Dessutom ökar den roterande bioreaktorn aktiv näringsdiffusion, vilket minimerar nekrotisk bildning som uppstår i system som hängande droppcellkultur där medieutbytet är opraktiskt6. På detta sätt växer cellerna mestadels ostörda, vilket möjliggör bildandet av strukturella och fysiologiska egenskaper associerade med celler som växer i vävnad. C3A-hepatocyter (HepG2 / C3A) odlade på detta sätt hade inte bara ultrastrukturella organeller utan producerade också mängder ATP, adenylatkinas, urea och kolesterol jämförbara med nivåer som observerats in vivo 1,2. Dessutom uppvisar celler som odlas i 2D vs.3D cellodlingssystem olika genuttrycksmönster8. Genuttrycksanalys av C3A-hepatocyter odlade som 3D-sfäroider visade att dessa celler uttryckte ett brett spektrum av leverspecifika proteiner, liksom gener som är involverade i viktiga vägar som reglerar leverfunktionen8. Tidigare publikationer visade skillnaderna mellan proteom hos exponentiellt växande celler i 2D-odling jämfört med celler vid dynamisk jämvikt i 3D-sfäroidkulturer5. Dessa skillnader inkluderar cellulär metabolism, vilket i sin tur påverkar cellens struktur, funktion och fysiologi5. Proteomet hos celler som odlades i 2D-odling var mer berikat i proteiner som var involverade i cellreplikation, medan proteomet av 3D-sfäroider var mer berikat ileverfunktionalitet 5.
Den långsammare replikationshastigheten hos celler som odlas som 3D-sfäroider modellerar mer exakt specifika fenomen associerade med kromatintillstånd och modifieringar (t.ex. histonklippning9). Histonklippning är en irreversibel histon post-translationell modifiering (PTM) som orsakar proteolytisk klyvning av en del av histonens N-terminala svans. Medan dess biologiska funktion fortfarande diskuteras 10,11,12,13, är det uppenbart att dess närvaro i primära celler och levervävnad modelleras av HepG2 / C3A-celler odlade som sfäroider, men inte som platta celler 9. Detta är kritiskt, eftersom kromatintillstånd och modifieringar reglerar DNA-avläsning mestadels genom att modulera tillgängligheten till gener och därmed deras uttryck14. Histon-PTM påverkar antingen kromatintillståndet direkt genom att påverka nettoladdningen av nukleosomerna där histoner monteras, eller indirekt genom att rekrytera kromatinförfattare, läsare och suddgummin14. Hundratals histon-PTM har hittills identifierats15, vilket förstärker hypotesen att kromatin är värd för en “histonkod” som används av cellen för att tolka DNA16. Identifieringen av en myriad av PTM-kombinationer15, och upptäckten att kombinationer av histon-PTM ofta har olika biologiska funktioner från PTM som finns isolerat (t.ex. Fischle, et al.17), belyser dock att mer arbete krävs för att dekryptera “histonkoden”.
För närvarande är histon PTM-analys antingen baserad på tekniker som använder antikroppar (t.ex. western blots, immunofluorescens eller kromatinimmunutfällning följt av sekvensering [ChIP-seq]) eller masspektrometri (MS). Antikroppsbaserade tekniker har hög känslighet och kan ge detaljerad information om genomomfattande lokalisering av histonmärken men är ofta begränsade när det gäller att studera sällsynta PTM eller PTM som finns i kombinationer 18,19,20. MS är mer lämpad för hög genomströmning och opartisk identifiering och kvantifiering av enskilda och samexisterande proteinmodifieringar, särskilt histonproteiner 18,19,20. Av dessa skäl har detta och flera andra laboratorier optimerat MS-pipelinen för analys av histonpeptider (bottom-up MS), intakta histonsvansar (mellanliggande MS) och histonproteiner i full längd (top-down MS)21,22,23.
Nedan beskrivs ett arbetsflöde för odling av HepG2/C3A-sfäroider och förberedelse av dem för histonpeptidanalys (bottom-up MS) via nanovätskekromatografi, kopplad online med tandemmasspektrometri (nLC-MS/MS). En 2D-cellodling odlades och cellerna skördades och överfördes till en bioreaktor där de skulle börja bilda sfäroider (Figur 1). Efter 18 dagar i odling behandlades sfäroider med natriumsufyrat eller natriumsuccinat för att öka de relativa överflöden av histonacetylering och succinylering. I synnerhet kan 3D-kulturer behandlas med genotoxiska föreningar lika bra som deras platta kulturekvivalenter; Faktum är att de senaste publikationerna belyser att det toxikologiska svaret hos celler i 3D-odling liknar primära vävnader än de i 2D-platt kultur24,25. Celler samlades sedan in vid angivna tidpunkter och kärnisolering utfördes. Därefter extraherades histoner och derivatiserades med propionsyraanhydrid före och efter trypsinsmältning enligt ett protokoll som först utvecklades av Garcia et al.26. Denna procedur genererar peptider av lämplig storlek för online-separation med omvänd faskromatografi (C18) och detektion med MS. Slutligen identifierades och kvantifierades histonpeptider, och de genererade data representerades på flera sätt för en mer fullständig biologisk tolkning.
Analysen av histon-PTM skiljer sig fundamentalt från den typiska proteomikanalyspipelinen. De flesta histon-PTM har fortfarande gåtfulla biologiska funktioner; Som ett resultat är anteckningar som genontologi eller pathway databaser inte tillgängliga. Det finns flera resurser som associerar histonmodifieringar med enzymet som är ansvarigt för deras katalys eller proteiner som innehåller domäner som binder dessa PTM (t.ex. HISTome36). Det är också möjligt att spekulera i kromatinets öve…
The authors have nothing to disclose.
Sidoli-laboratoriet erkänner tacksamt Leukemia Research Foundation (Hollis Brownstein New Investigator Research Grant), AFAR (Sagol Network GerOmics Award), Deerfield (Xseed Award), Relay Therapeutics, Merck och NIH Office of the Director (1S10OD030286-01).
0.05% trypsin-EDTA solution | Gibco | 25300054 | |
0.5-20 µL pipet tips | BRAND | 13-889-172 (Fisher Scientific) | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | Bio-Rad | 2239480 | |
10 µL multi-channel pipette | BRAND | BR7059000 (Millipore Sigma) | |
10 mL syringe | Henke Sass Wolf | 14-817-31 (Fisher Scientific) | Luer lock tip, graduated to 12 mL |
10, 20, 200, and 1000 µL single-channel pipettes | Eppendorf | 14-285-904 (Fisher Scientific) | |
1000 µL pipet tips | Rainin | 30389164 | |
18 G syringe needle | Air-Tite | 14-817-100 (Fisher Scientific) | 3" length, 0.05" diameter |
200 µL multi-channel pipette | Corning | 4082 | |
2-200 µL pipet tips | BRAND | Z740118 (Millipore Sigma) | |
24-well ultra-low attachment microplate | Corning | 07-200-602 | |
75 cm2 U-shaped cell culture flask | Corning | 461464U | Untreated, with vent cap |
96-well skirted plate | Axygen | PCR-96-FS-C (Corning) | |
Acetone | Fisher Scientific | A949-1 | Acetone should be used cold |
Ammonium bicarbonate (NH4HCO3) | Sigma-Aldrich | A6141-25G | |
Ammonium hydroxide solution | Fisher Scientific | AC423300250 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
ClinoReactor | CelVivo | 10004-12 | Bioreactor for 3D cell culture |
ClinoStar | CelVivo | N/A | Clinostat CO2 incubator for 3D cell culture |
Control unit | CelVivo | N/A | Tablet for ClinoStar settings |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | 17-205-CV | 1X solution with 4.5 g/L glucose and sodium pyruvate, without L-glutamine and phenol red |
Fetal bovine serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
Formic acid | Thermo Scientific | 28905 | |
Fume hood | Mott | N/A | Model 7121000 |
Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | 9", cotton-plugged, borosilicate glass, non-sterile |
Glutagro supplement | Corning | 25-015-CI | 200 mM L-ananyl-L-glutamine |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | 1X solution without calcium, magnesium, and phenol red |
HPLC grade acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | |
HPLC grade water | Fisher Scientific | W6-1 | |
Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A481-212 | |
Ice | N/A | N/A | |
MEM non-essential amino acids | Corning | 25-025-CI | 100X solution |
Oasis HLB resin | Waters | 186007549 | Hydrophilic-Lipophilic-Balanced (HLB) Resin with 30µm particle size |
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBHQ | High resolution mass spectrometer |
Oro-Flex I polypropylene filter plate | Orochem | OF1100 | 96-well polypropylene filter plate w/ 10 µM PE frit |
Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | 100X solution |
pH paper | Hydrion | Z111848 (Sigma-Aldrich) | 0-13 pH test paper |
Pipette gun | Eppendorf | Z666467 (Millipore Sigma) | |
Polymicro capillary | Molex | 50-110-7740 (Fisher Scientific) | Flexible fused silica capillary tubing with polymide coating, 75 µM ID x 363 µM OD |
Polystyrene 10 mL serological pipets, sterile | Fisher Scientific | 1367549 | |
Propionic anhydride | Sigma-Aldrich | 240311-50G | |
Refrigerated centrifuge | Thermo Scientific | 75-217-420 | |
Reprosil-Pur resin | MSWIL | R13.AQ.0003 | 120 Å pore size, C18-AQ phase, 3 µM bead size |
Rotator | Clay Adams | 25477 (American Laboratory Trading) | Nutator Mixer 1105 |
Sequencing grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
Sodium butyrate | Thermo Scientific | A11079 | |
Sodium succinate dibasic | Sigma-Aldrich | 14160-100G | |
SpeedVac vacuum concentrator (1.5 mL microcentrifuge tubes) | Savant | 20249 (American Laboratory Trading) | |
SpeedVac vacuum concentrator (96-well) | Thermo Scientific | 15308325 | Savant SPD1010 |
Sterile hood | Thermo Scientific | 1375 | Class II, Type A2 |
Sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | 02-004-375 | Baker Analyzed ACS reagent |
Tissue-culture treated 100 mm x 20 mm dish | Fisher Scientific | 08-772-23 | |
Trichloroacetic acid (TCA) | Thermo Scientific | AC421451000 | Resuspend 100% w/v in HPLC grade water |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Fisher Scientific | PI28904 | Sequencing grade |
Vacuum manifold 96-well | Millipore | MAVM0960R | |
Vortex | Sigma-Aldrich | Z258415 | |
Water bath | Fisher Scientific | FSGPD10 | |
Wide bore pipet tips 1000 µL | Axygen | 14-222-703 (Fisher Scientific) | |
Wide bore pipet tips 200 µL | Axygen | 14-222-730 (Fisher Scientific) |