يصف البروتوكول طريقة لإدخال التنوع الجيني الذي يمكن التحكم فيه في جينوم فيروس التهاب الكبد C من خلال الجمع بين تخليق الحمض النووي الريبي الطافر كامل الطول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ وعلم الوراثة العكسي. توفر الطريقة نموذجا لاختيار النمط الظاهري ويمكن استخدامها لجينومات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي التي يبلغ طولها 10 كيلوبايت.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
علم الوراثة العكسي لهندسة متغيرات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أدى عدم وجود طريقة ملائمة للتوليد التكراري للمتغيرات الفيروسية المتنوعة كاملة الطول إلى إعاقة دراسة التطور الموجه في فيروسات الحمض النووي الريبي. من خلال دمج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكامل المعرض لخطأ جينوم الحمض النووي الريبي وعلم الوراثة العكسي ، يمكن إحداث طفرات استبدال عشوائية على مستوى الجينوم. لقد طورنا طريقة باستخدام هذه التقنية لتجميع مكتبات متنوعة لتحديد الطفرات الفيروسية ذات الأنماط الظاهرية ذات الاهتمام. وتوفر هذه الطريقة، التي تسمى تخليق الحمض النووي الريبي الطافر الكامل الطول (FL-MRS)، المزايا التالية: (أ) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ج) القدرة على (ii) القدرة على إنشاء مجموعات من المكتبات بمستويات متفاوتة من التنوع الجيني عن طريق التلاعب بإخلاص بوليميراز الحمض النووي؛ (iii) إنشاء منتج PCR كامل الطول يمكن أن يكون بمثابة نموذج مباشر لتخليق الحمض النووي الريبي الطافر ؛ و (iv) القدرة على إنشاء الحمض النووي الريبي الذي يمكن تسليمه إلى الخلايا المضيفة كتجمع إدخال غير محدد لفحص الطفرات الفيروسية للنمط الظاهري المطلوب. لقد وجدنا ، باستخدام نهج الوراثة العكسية ، أن FL-MRS هي أداة موثوقة لدراسة التطور الموجه للفيروسات في جميع مراحل دورة حياة فيروس التهاب الكبد C ، عزل JFH1. يبدو أن هذه التقنية أداة لا تقدر بثمن لتوظيف التطور الموجه لفهم التكيف والتكرار ودور الجينات الفيروسية في التسبب في المرض والمقاومة المضادة للفيروسات في فيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي.
المقدمة
يبدأ الفحص الجيني الأمامي بنمط ظاهري فيروسي مثير للاهتمام ، ثم ، من خلال تسلسل جينومه ومقارنته بجينوم السلالة الأصلية ، يحاول تحديد الطفرة (الطفرات) التي تسبب هذا النمط الظاهري. في المقابل ، في الشاشات الجينية العكسية ، يتم إدخال طفرات عشوائية في الجين المستهدف ، يليها فحص النمط الظاهري (الأنماط الظاهرية) الناتج1. بالنسبة لنهج الوراثة العكسية ، فإن الطفرات في المختبر هي التقنية الأكثر استخداما لإنشاء مجموعة من المتغيرات التي يتم فحصها لاحقا بحثا عن الأنماط الظاهرية ذات الأهمية. تم الإبلاغ عن أدوات وراثية مختلفة لتحقيق طفرات عشوائية على مستوى الجينوم لفيروسات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ (ep-P....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: كانت سلالة JFH1 (WT) المستخدمة هنا هدية كريمة من تاكاجي واكيتا ، المعهد الوطني للأمراض المعدية. كان خط خلايا الورم الكبدي البشري ، Huh7.5 ، هدية لطيفة من تشارلز رايس ، جامعة روكفلر. يظهر رسم تخطيطي للطريقة في الشكل 1.
1. الطفرات البديلة على مستوى الجينوم ل JFH1 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ
- لإجراء ep-PCR ، قم بإعداد المزيج الرئيسي لأربع مجموعات من التجارب باستخدام الاشعال J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' و J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (الشكل 1A) ، جنبا إلى جنب مع مكونات التفاعل الموضحة في ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن إنشاء عدد كبير من متغيرات HCV كاملة الطول وفحصها بحثا عن الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية ذات الأهمية باتباع الإجراءات الموضحة في الشكل 1. تم تصنيع مكتبات الجينوم الطافرة الكاملة باستخدام clnal-pJFH1 بكميات متناقصة (100-10 نانوغرام) ، كما هو موضح في الشكل 2. تراوح متوسط إنتاجية منتجات ep-PCR (المكتبات الطافرة) بين 3.8-12.5 نانوغرام / ميكرولتر. يوضح الشكل 3 النسخ الفيروسية المركبة من pJFH1 النسيلي والمكتبة الطافرة التمثيلية (تم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة ، قمنا بتفصيل إجراء FL-MRS بسيط وسريع يدمج ep-PCR18 وعلم الوراثة العكسي لتوليف مكتبات الجينوم الكامل HCV ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في نظام زراعة الخلايا لتوليد متغيرات مختصة بالتكرار لفحص الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية. يعد استخدام Taq DNA polymerase منخفض الدقة شرطا أساسيا ل ep-PCR الذي يسمح بدمج البدائل أثناء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لجينوم فيروسي كامل الطول. اختبرنا العديد من بوليميراز Taq DNA منخفض الدقة ووجدنا أن بوليميراز الحمض النووي Platinum Taq أسفر عن منتج .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تقديم الدعم التمويلي (رقم المنحة BT / PR10906 / MED / 29/860/2014) لهذه الدراسة من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 كيلو بايت بالإضافة إلى سلم الحمض النووي | أنبوب الطرد | Fisher | |
| 1.5 مل | Tarsons | 500010 | |
| 15 مل أنبوب الطرد المركزي | Tarsons | 546021 | |
| 35 مم صحن ثقافة الخلية ؛ | Tarsons | 960010 | |
| 50 مل أنبوب الطرد المركزي | Tarsons | 546041 | |
| حمض الخليك | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| وحدة الرحلان الكهربائي لهلام Agrose | BioRad | 1704406 | |
| خزانة السلامة الحيوية ، ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| ألبومين مصل الأبقار HiMedia | MB083 | ||
| الطرد المركزي ؛ | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي | BioRad | 1855201 | |
| لوحات الاستنساخ 90 مم & nbsp; | Tarson | 460091 | |
| CO2 حاضنة | نيو برونزويك | غالاكسي 170R | |
| كوليبري مطياف حجم صغير | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB الركيزة المجموعة | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) مجموعة الحلول | NEB | N0446 | |
| ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) ؛ | SRL الكيميائية | 46791 | |
| ثنائي ميثيل كبريتات (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM نسبة عالية من الجلوكوز | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA رباعي الصوديوم ملح ثنائي هيدرات | هايميديا | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| مصل الأبقار الجنينية | Gibco | 26140079 | |
| الفورمالديهايد | هلام Fishser Scientific | 12755 | |
| ALPHA IMAGER | |||
| جسم مضاد ثانوي للماعز IgG (H + L) ، HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| بيروكسيد الهيدروجين 30٪ | Merck | 107209 | |
| مجهر مقلوب | Nickon | & nbsp ؛ كسوف Ts2 | |
| مرق رطل | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | كاشف التعداء |
| مجموعة الماصات الميكانيكية | Eppendorf ؛ | 3120000909 | |
| ميثانول | ميرك | 106009 | |
| مايكرو تيبس 0.2-10 & مايكرو ؛ l | Tarsons | 521000 | |
| مايكرو تيبس 10 - 100 & مايكرو ؛ l | Tarsons | 521010 | |
| مايكرو تيبس 200-1000 & l | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| طلقة واحدة TOP10 المختصة كيميائيا الإشريكية القولونية | Invitrogen | C404010 | الإشريكية القولونية DH5 & ألفا ; |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | متوسطة أساسية |
| بسيطة 0.2 مل | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin / streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector |
| DNA Fossil Buffer Saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| تحكم ماصة ؛ | جيلسون | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | برنامج التحليل الإحصائي | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | طقم عزل الفيروس Qiagen | 52904 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification | QIAGEN | 28104 | طقم تنقية الكوكوم |
| RNeasy Mini Kit ؛ | QIAGEN | 74104 | طقم تنظيف الحمض النووي الريبي |
| الماصات المصلية 25 مل | ثيرمو فيشر | 170357N | |
| ماصات مصلية 5 مل | ثيرمو فيشر | 170355N | |
| ماصات مصلية 10 مل | ثيرمو فيشر | 170356N | |
| الحمض النووي الريبي أحادية الخيط 0.2-10 كيلو بايت | ميرك | R7020 | |
| حليب خالي الدسم | HiMedia | M530 | |
| أزيد الصوديوم 0.1 متر حل | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | النسخ العكسي |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| قارورة ثقافة الخلية T175 | Tarsons | 159910 | |
| قارورة ثقافة الخلايا T25 | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express نظام إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق واسع | بروميجا | P1320 | نظام إنتاج الحمض النووي الريبي على نطاق واسع |
| قارورة ثقافة الخلايا T75 | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied | Biosystems 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT & nbsp ؛ 1-الخطوة كيت | ثيرمو فيشر | 4392653 | مجموعة qRT-PCR التجارية |
| TOPO-XL - 2 طقم استنساخ PCR كامل | Thermo Fisher | K8050-10 | Kit لاستنساخ منتج PCR طويل ؛ |
| Tris قاعدة | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA حل | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| مكثف فراغ | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| حمام مائي | جرانت | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
المراجع
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
