利用反向遗传学构建正链RNA病毒变异体

摘要

本方案描述了一种通过结合使用易错PCR合成全长突变RNA和反向遗传学技术，在丙型肝炎病毒基因组中引入可控遗传多样性的方法。该方法提供了一个表型筛选模型，可用于长达10 kb的正义链RNA病毒基因组研究。

摘要

缺乏一种便捷的方法来迭代生成多样化的全长病毒变异体，阻碍了RNA病毒定向进化研究的进展。通过整合全长RNA基因组的易错PCR与反向遗传学技术，可诱导全基因组范围的随机替换突变。我们已开发出一种利用该技术合成多样化文库的方法，以鉴定具有特定表型的病毒突变体。该方法称为全长突变RNA合成法（FL-MRS），具有以下优势：（i）可通过高效的一次性易错PCR构建大规模文库；（ii）通过调节DNA聚合酶的保真度，可构建具有不同遗传多样性水平的文库组；（iii）生成的全长PCR产物可直接作为突变RNA合成的模板；（iv）可生成RNA，将其作为未筛选的输入池递送至宿主细胞，用于筛选具有目标表型的病毒突变体。我们通过反向遗传学方法发现，FL-MRS是一种可靠工具，可用于研究丙型肝炎病毒JFH1分离株生命周期各阶段的病毒定向进化。该技术似乎是一种不可替代的工具，可用于实施定向进化，以深入理解正链RNA病毒的适应性、复制机制、病毒基因在致病性及抗病毒耐药性中的作用。

引言

正向遗传筛选从感兴趣的病毒表型开始，随后通过测序其基因组并与原始毒株进行比较，尝试鉴定导致该表型的突变位点。相比之下，反向遗传筛选则是先在目标基因中引入随机突变，再观察所产生的表型¹。在反向遗传学方法中，体外诱变（in vitro mutagenesis）是最常用的技术，用于构建变异体文库，进而筛选感兴趣的表型。目前已报道多种可用于RNA病毒全基因组随机诱变的遗传工具，包括易错PCR（ep-PCR）^2,3、环状聚合酶延伸⁴以及Mu转座子插入诱变^5,6,7。后两种方法产生的文库序列多样性有限，且容易引入较大的插入或缺失，这对病毒而言具有高度致死性，严重限制了感染性病毒变异体的获得。

易错PCR（ep-PCR）是一种广为人知且功能强大的诱变技术，广泛应用于蛋白质工程中，用于产生突变酶，以筛选具有理想特性的表型，例如增强的热稳定性、底物特异性和催化活性^8,9

方案

注意：本实验所用的 JFH1 野生型（WT）毒株由日本国立感染症研究所的 Takaji Wakita 惠赠。人肝癌细胞系 Huh7.5 由洛克菲勒大学的 Charles Rice 惠赠。图 1 展示了本方法的示意图。

1. 利用易错PCR对JFH1进行全基因组替代突变

1. 为了进行表观突变PCR（ep-PCR），请准备四组实验的预混液，所用引物为J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACGTTGTAAAACGACGGC-3' 和 J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC-3'（图1A），以及文中所述的反应组分 表1 不含pJFH1质粒模板（从JFH1株分离的质粒）。
2. 将主混合液分装至四个试管中，分别向各管加入100 ng、50 ng、25 ng和10 ng的模板，并将反应总体积调整至50 µL。采用如下循环条件： 表 2 扩增一个包含T7启动子和全长HCV基因组的9736碱基对（bp）片段（图2).
   注意：ep-PCR 产物必须包含 T7 启动子序列，以促进后续操作 体外 ....

结果

可依据所述方案生成并筛选大量全长HCV变异体，以获得特定的耐药表型 图1全基因组突变文库使用克隆型pJFH1以递减的量（100–10 ng）合成，如图所示 图2. ep-PCR 产物（突变文库）的平均得率范围为 3.8–12.5 ng/µL. 图3 显示从克隆型 pJFH1 和代表性突变文库（ML50，使用 50 ng 克隆型 pJFH1 制备）合成的病毒转录本。克隆型 pJFH1 通过线性化处理 XbaI 消化，而ML50则直接用于 体外 转录反应。如图所示，在ep-PCR反应中，随着输入的pJFH1减少，突变文库（突变病毒RNA）中的突变比例增加。 图 4使用50 ng模板（克隆型pJFH1）合成的ML50每复制10,000个碱基对含有4个突变，而使用25 ng模板合成的ML25则含有9个突变。在克隆型pJFH1测序的核苷酸范围内未发现突变。与克隆型JFH1病毒.......

讨论

在本研究中，我们详细介绍了一种简单且快速的荧光微卫星重复序列分析（FL-MRS）流程，该流程整合了错误倾向性PCR（ep-PCR）¹⁸ 以及用于合成HCV全基因组文库的反向遗传学方法，这些文库可在细胞培养系统中用于产生具有复制能力的变异体，以筛选耐药表型。使用低保真度的Taq DNA聚合酶是ep-PCR的前提条件，可在全长病毒基因组的PCR扩增过程中引入碱基替换。我们测试了多种低保真度Taq DNA聚合酶，并发现Platinum Taq DNA聚合酶可产生约10 kb大小的ep-PCR产物，且产量较高（数据未显示）。我们建议使用固定的热循环次数，并通过调整模板输入量来控制全基因组文库中的突变比例。由于FL-MRS以错误的全基因组作为全长病毒RNA的模板，因此引物组的精心设计至关重要，以确保RNA合成反应生成特定长度的病毒转录本：（i）正向引物必须位于cDNA克隆T7启动子上游约50个核苷酸处，以促进T7聚合酶与ep-PCR产物的结合；（ii）反向引物序列必须终止于病毒基因组3'端，以利于转录过程中的终止脱离 体外 RNA合成

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1 kb plus DNA 标准品	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml 离心管	Tarsons	500010
15 ml 离心管	Tarsons	546021
35 mm 细胞培养皿	Tarsons	960010
50 ml 离心管	Tarsons	546041
乙酸	Merck	A6283
琼脂糖	HiMedia	MB080
琼脂糖凝胶电泳装置	BioRad	1704406
II 级生物安全柜	ESCO	AC2 4S
牛血清白蛋白	HiMedia	MB083
离心机	Eppendorf	5424-R
CFX Connect 实时荧光定量 PCR 检测系统	BioRad	1855201
90 mm 克隆平板	Tarson	460091
CO2 培养箱	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri 微体积分光光度计	Titertek-Berthold	11050140
DAB 底物 试剂盒	Abcam	ab94665
dATP 溶液	NEB	N0440S
脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液套装	NEB	N0446
焦碳酸二乙酯（DEPC）	SRL chemical	46791
二甲基亚砜（DMSO）	HiMedia	MB058
DMEM 高糖培养基	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA 四钠盐二水合物	HiMedia	GRM4918
溴化乙锭	Amresco	X328
胎牛血清	Gibco	26140079
甲醛	Fishser Scientific	12755
凝胶成像系统	ALPHA IMAGER
山羊抗小鼠 IgG（H+L）二抗，HRP 标记	Thermo Fisher	A16066
30% 过氧化氢	Merck	107209
倒置显微镜	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB 肉汤	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	转染试剂
机械移液器套装	Eppendorf	3120000909
甲醇	Merck	106009
0.2–10 µl 微量吸头	Tarsons	521000
10–100 µl 微量吸头	Tarsons	521010
200–1000 µl 微量吸头	Tarsons	521020
MOPS 缓冲液	GeNei	3601805001730
非必需氨基酸（NEAA）	Gibco	11140050
One Shot TOP10 化学感受态 E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	最低必需培养基
0.2 ml PCR 管	Tarsons	510051
青霉素/链霉素	Gibco	15070063
pGEM-T Easy 载体系统	Promega	A1360	T 载体 DNA
磷酸盐缓冲液（PBS）	HiMedia	TI1099
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
移液器控制器	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA 聚合酶	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		统计分析软件
QIAamp 病毒 RNA 小量提取试剂盒	Qiagen	52904	病毒提取试剂盒
QIAprep Spin 小量提取试剂盒	Qiagen	27106
QIAquick PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28104	cokum 纯化试剂盒
RNeasy 小量提取试剂盒	QIAGEN	74104	RNA 纯化试剂盒
25 ml 血清移液管	Thermo Fisher	170357N
5 ml 血清移液管	Thermo Fisher	170355N
10 ml 血清移液管	Thermo Fisher	170356N
单链 RNA 标准品 0.2–10 kb	Merck	R7020
脱脂奶粉	HiMedia	M530
0.1 M 叠氮化钠溶液	Merck	8591
SuperScript III 逆转录酶	Invitrogen	18080044	逆转录酶
T100 梯度 PCR 仪	BioRad	1861096
T175 细胞培养瓶	Tarsons	159910
T25 细胞培养瓶	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express 大规模 RNA 生产系统	Promega	P1320	大规模 RNA 生产系统
T75 细胞培养瓶	Tarsons	950050
Taq DNA 聚合酶	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 一步法试剂盒	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 一步法 试剂盒	Thermo Fisher	4392653	商用 qRT-PCR 试剂盒
TOPO-XL--2 完整 PCR 克隆试剂盒	Thermo Fisher	K8050-10	长片段 PCR 产物克隆试剂盒
Tris 碱	HiMedia	TC072
胰蛋白酶-EDTA 溶液	HiMedia	TCL007
吐温 20	HiMedia	MB067
真空浓缩仪	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
水浴锅	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S