Summary
Protokollet beskriver en metod för att introducera kontrollerbar genetisk mångfald i hepatit C-virusets genom att kombinera fullängdsmutant RNA-syntes med hjälp av felbenägen PCR och omvänd genetik. Metoden ger en modell för fenotypselektion och kan användas för 10 kb långa RNA-virusgenom.
Abstract
Bristen på en bekväm metod för iterativ generering av olika virala varianter i full längd har försvårat studiet av riktad evolution i RNA-virus. Genom att integrera en fullständig PCR i RNA-genomet och omvänd genetik kan slumpmässig substitutionsmutagenes induceras. Vi har utvecklat en metod som använder denna teknik för att syntetisera olika bibliotek för att identifiera virala mutanter med fenotyper av intresse. Denna metod, som kallas fullängdsmutant RNA-syntes (FL-MRS), erbjuder följande fördelar: (i) förmågan att skapa ett stort bibliotek via en mycket effektiv enstegs felbenägen PCR; ii) förmågan att skapa grupper av bibliotek med olika nivåer av genetisk mångfald genom att manipulera DNA-polymerasets trohet, iii) Skapande av en fullängds-PCR-produkt som direkt kan tjäna som mall för mutant RNA-syntes. och (iv) förmågan att skapa RNA som kan levereras in i värdceller som en icke-selekterad ingångspool för att screena för virala mutanter av den önskade fenotypen. Vi har funnit, med hjälp av en omvänd genetisk metod, att FL-MRS är ett tillförlitligt verktyg för att studera virusriktad evolution i alla stadier i livscykeln för hepatit C-viruset, JFH1-isolatet. Denna teknik verkar vara ett ovärderligt verktyg för att använda riktad evolution för att förstå anpassning, replikation och rollen av virala gener i patogenes och antiviral resistens i positiva RNA-virus.
Introduction
Framåtriktad genetisk screening börjar med en viral fenotyp av intresse och försöker sedan, genom att sekvensera dess genom och jämföra den med den ursprungliga stammens, identifiera den eller de mutationer som orsakar den fenotypen. I omvända genetiska screeningar introduceras däremot slumpmässiga mutationer i en målgen, följt av en undersökning av den resulterande fenotypen1. För den omvända genetiken är mutagenes in vitro den mest använda tekniken för att skapa en pool av varianter som sedan screenas för fenotyper av intresse. Olika genetiska verktyg har rapporterats för att uppnå genomomfattande slumpmässig mutagenes av RNA-virus, inklusive felbenägen PCR (ep-PCR)2,3, cirkulär polymerasförlängning4 och Mu-transposoninsättningsmutagenes 5,6,7. De två senare metoderna ger bibliotek med begränsad sekvensdiversitet och är benägna att introducera stora insättningar och raderingar, vilket är mycket dödligt för virus och allvarligt begränsar återhämtningen av infektiösa virusvarianter.
ep-PCR är en välkänd kraftfull mutagenesteknik som ofta används inom proteinteknik för att generera muterade enzymer för val av fenotyper med önskade egenskaper, såsom förbättrad termisk stabilitet, substratspecificitet och katalytisk aktivitet 8,9,10. Denna teknik är lätt att utföra eftersom den kräver enkel utrustning, inte involverar tråkiga manipulationer, använder kommersiellt tillgängliga reagenser och är snabb; Dessutom genererar det bibliotek av hög kvalitet.
Här utvecklade vi en ny metod för fullängdsmutant RNA-syntes (FL-MRS) för att generera kompletta genom av hepatit C-virus (HCV) genom att integrera ep-PCR, som inducerar slumpmässig genomomfattande substitutionsmutagenes och omvänd genetik. Till och med en enda nukleotidinsättning eller nukleotidradering är mycket skadlig för RNA-virus med positiv känsla ([+]ssRNA); därför är PCR-baserad substitutionsmutagenes den föredragna metoden för iterativ generering av stora, olika bibliotek av fullständiga (+)ss-RNA-virusgenom med god viabilitet.
FL-MRS är ett enkelt tillvägagångssätt som kan tillämpas på alla RNA-virus med positiv känsla med en genomlängd på ~10 kb genom genom den noggranna utformningen av en primeruppsättning som binder till den virala cDNA-klonen. pJFH1 är en infektiös cDNA-klon som kodar för HCV genotyp 2a och kan rekapitulera alla steg i virusets livscykel. Genom att använda FL-MRS-metoden demonstrerade vi syntesen av slumpmässigt mutagena helgenombibliotek (mutantbibliotek [MLs]) för att producera replikationskompetenta JFH1-varianter för vilka det inte fanns någon tidigare kunskap om de egenskaper som är associerade med mutationer. Vid exponering för ett antiviralt medel övervann några av virusvarianterna snabbt läkemedelstrycket med den önskade fenotypiska förändringen. Med hjälp av det protokoll som beskrivs här kan en uppsjö av virusvarianter genereras, vilket skapar möjligheter att studera evolutionen av (+)ssRNA-virus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: JFH1-stammen (WT) som används här var en vänlig gåva från Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Den mänskliga hepatomcellinjen, Huh7.5, var en vänlig gåva från Charles Rice, Rockefeller University. En schematisk bild av metoden visas i figur 1.
1. Genomomfattande substitutionsmutagenes av JFH1 med hjälp av felbenägen PCR
- För att utföra ep-PCR, förbered masterblandningen för fyra uppsättningar experiment med primrarna J-For 5'-GTTTTCCCAGTCAGCACACGTTGTAAAACGACGGC-3' och J-Rev 5'-CATGATCTGCAGAGAGACCAGTTACGGCACTCTC -3' (figur 1A), tillsammans med de reaktionskomponenter som beskrivs i tabell 1 utan pJFH1-mallen (plasmid isolerad från JFH1-stammen).
- Fördela masterblandningen i fyra rör, tillsätt 100 ng, 50 ng, 25 ng och 10 ng av mallen i de enskilda rören och justera reaktionens totala volym till 50 μL. Tillämpa de cykelbetingelser som beskrivs i tabell 2 för att amplifiera ett 9736 basparfragment (bp) som består av T7-promotorn och HCV-genomet i full längd (figur 2).
Observera: Ep-PCR-produkten måste innehålla promotorsekvensen T7 för att underlätta transkription in vitro av virusgenomet. Därför måste den främre primern placeras uppströms T7-promotorn för den virala cDNA-klonen, och den omvända primersekvensen bör sluta vid 3'-änden av virusgenomet för att underlätta transkriptionsavrinning. Optimera varje komponent i ep-PCR-reaktionen inom det intervall som rekommenderas av tillverkaren av Taq DNA-polymeras för att uppnå amplifiering med hög avkastning. Förutom olika mallmängder kan obalanserade dNTP:er (särskilt låg dATP- och/eller dGTP-koncentration) också användas för att öka mångfalden i längden på virala genom från 6-8 kb långa3. - Uppskatta ep-PCR-produkten amplifierad genom att ladda lika stora volymer av PCR-produkterna (5 μL) och jämföra med kända mängder av 1 kilobas (kb) DNA-stege genom att köra en 0,8 % Tris-acetat-EDTA (TAE)-baserad agarosgelelektrofores11. Rena produkten med hjälp av en kolonnreningssats enligt tillverkarens anvisningar.
- Uppskatta koncentrationen av den renade produkten genom att mäta absorbansen vid 260 nm med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer12. Vakuumkoncentrera ep-PCR-produkten om det behövs för att uppnå en produktkoncentration ≥100 ng/μL.
OBS: Mer exakt uppskattning kan göras genom att ladda tvåfaldiga serieutspädningar av ep-PCR-produkten och jämföra deras intensitet med de kända mängderna av 1 kb DNA-stege.
2. Viral RNA-syntes
- Sätt upp en 40 μL-reaktion för att sönderdela 5 μg klonal-pJFH1 med 4 U XbaI-enzym vid 37 °C i 2 timmar, följt av kolonnrening och mätning av absorbansen vid 260 nm i en mikrovolymspektrofotometer12. Ställ in en 20 μl in vitro-transkriptionsreaktion av den kolonnrenade ep-PCR-produkten eller klonal-pJFH1 (WT) med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt storskaligt RNA-produktionssystem enligt tillverkarens instruktioner.
- Blanda cirka 1 μg renad ep-PCR-produkt (mutantbibliotek) eller XbaI-uppspjälkad klonal pJFH1 i ett 200 μl mikrocentrifugrör, 10 μl 2x buffert innehållande ribonukleotider och 2 μl T7-enzymblandning. Blanda alla komponenter och snurra ner komponenterna kort. Inkubera reaktionsblandningen vid 37 °C i 45 minuter, varefter 1 U RNasfritt DNas-enzym tillsätts och inkubationen vid 37 °C i 30 minuter (figur 1C).
- Rena in vitro-syntetiserat RNA med hjälp av ett RNA-saneringskit enligt tillverkarens instruktioner, eluera i 40 μL RNas- och DNasfritt vatten och uppskatta koncentrationen av det renade RNA:t genom att mäta absorbansen vid 260 nm med hjälp av en mikrovolymspektrofotometer12. Gör alikvoter efter behov (5 μg eller 2 μg) för att undvika frys-upptining och förvara dem vid −80 °C. Verifiera integriteten och storleken på de virala transkripten genom att använda 2 μg RNA för en MOPS-formaldehyd 0,8 % agarosgelelektrofores13 (figur 3).
3. Uppskattning av andelen mutationer i ep-PCR-produkter (mutantbibliotek)
OBS: I detta steg muterade andelen nukleotider genom subkloning av produkten som erhölls i steg 2. uppskattades visa fördelen med att använda ep-PCR för att skapa genetisk heterogenitet med hjälp av två fullständiga genommutantbibliotek (ML50 och ML25) och klonala pJFH1-härledda virala RNA. Andelen mutationer uppskattades i HCV NS5A-genen, som också var den fenotypiska avläsningsgenen (läkemedelsresistens) i denna studie.
- Ställ in en 20 μL cDNA-syntesreaktion genom att tillsätta cirka 1 μg av det virala RNA som syntetiserades i steg 2., 5 μM omvänd primer 5'-GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA-3', och 200 U omvänt transkriptas enligt tillverkarens rekommendationer.
- Med hjälp av cDNA amplifierar du ett 2571 bp-fragment som består av hela NS5A-genen. För att göra detta, förbered en reaktionsblandning som innehåller 0,5 μM för 5272F och 7848R primers (slutlig koncentration; Tabell 3), 1,5 mM MgCl2, 1x PCR-buffert och 1 U högupplöst Taq-polymeras i en total volym på 50 μL och kör en amplifieringscykel under de förhållanden som beskrivs i tabell 4.
- Kör produkten på en 0.8 % TAE-baserad agarosgel för att bekräfta produktstorleken på 2571 bp och rena sedan produkten med en kolonnreningssats enligt tillverkarens anvisningar. Eluera den kolonnrenade produkten i 40 μl sterilt vatten.
- För att lägga till ett 3' A överhäng till produkten, tillsätt 0,5 μM dATP och 1 U Taq DNA-polymeras med låg kvalitet och inkubera hela PCR-produkten vid 70 °C i 30 minuter tillsammans med 1x PCR-buffert och 1,5 mM MgCl2 (slutkoncentration). Rena blandningen med hjälp av en kolonnreningssats enligt tillverkarens anvisningar
OBS: Alternativt kan du ta bort den ~9,7 kb långa produkten från gelen från steg 1.4. och utföra kloning med hjälp av en kommersiellt tillgänglig sats för kloning av lång-PCR-produkt enligt tillverkarens instruktioner eller utföra NGS av ep-PCR-produkten med hjälp av en Illumina-plattform2. - Ställ in en ligeringsreaktion genom att tillsätta 5 μL 2x ligeringsbuffert, 50 ng av T-vektor-DNA, ungefär 3-faldigt molärt överskott av insats-DNA syntetiserat i steg 3.4., 3 Weiss-enheter av T4 DNA-ligas och nukleasfritt vatten till en total volym av 10 μL. Inkubera denna reaktion vid rumstemperatur i 3 timmar och tillsätt sedan 100 μL Escherichia coli DH5α med det ligerade DNA:t. värmechock cellerna vid 42 °C i 35 s (figur 1B).
- Tillsätt 1 ml Luria-Bertani (LB) medium (utan antibiotika) och inkubera försiktigt i 1 timme vid 37 °C för återhämtning. Centrifugera cellsuspensionen vid 13 800 x g, kassera supernatanten och återsuspendera i 200 μl färskt LB-medium.
- Platta 100 μL av de transformerade E. coli DH5α-cellerna på en LB-platta innehållande 50 μg/ml ampicillin och inkubera vid 37 °C i 16 timmar. Sätt upp minipreps av 25-30 samhällen i 5 ml LB-medium + 50 μg/ml ampicillin och odla över natten vid 37 °C.
- Nästa dag, extrahera plasmiderna med en plasmidreningssats enligt tillverkarens instruktioner och utför restriktionsenzymdigestion i 10 μL volym med 200 ng av de isolerade plasmiderna, 2 U EcoR1 och 1x restriktionsbuffert för alla kolonier.
- Efter inkubation av digestionsblandningarna vid 37 °C i 3 timmar, bestäm produkterna med 0,8 % TAE-baserad agarosgel för att bekräfta plasmid-DNA-insättning.
- Utför Sanger-sekvensering av plasmiderna hos 25 positiva kloner med M13 Forward, M13 reverse, 6208-SPF och 6748-SPF-primrar (tabell 3) för att bestämma andelen mutationer (uttryckt som andelen muterade nukleotider) i virus-RNA som härrör från biblioteken och klonal pJFH1 (figur 1B och figur 4).
4. Viral RNA-transfektion av Huh7.5-cellinjen
OBS: Använd RNase/DNase-fria vävnadsodlingsmaterial och arbeta i ett sterilt biosäkerhetsskåp av klass II. Arbeta i den rekommenderade inneslutningsanläggningen enligt organisationens riktlinjer för biosäkerhet.
- Bibehåll Huh7,5-celler genom inkubation i en 5 % CO 2 -inkubator vid 37 °C i en T75 cm2 vävnadsodlingskolv innehållande 15 ml komplett Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM) kompletterat med 10 % (vol/vol) fetalt bovint serum, penicillin (100 E/ml) och streptomycin (100 μg/ml; Figur 1D).
- Dela upp cellerna i förhållandet 1:3 när sammanflödet når 90 %. Tvätta cellerna med 1x förvärmd fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS; pH 7,4). Tillsätt 5 ml 1x trypsin-EDTA-lösning för att helt täcka celskiktet, snurra kolven försiktigt och inkubera sedan kolven vid 37 °C i 5 minuter.
OBS: Inkubationstiden kan variera; Inkubera cellerna tills celskiktet är helt avskilt från cellodlingskolvens yta. - Tillsätt 10 ml 1x förvärmd komplett DMEM, dispergera cellerna genom upprepad pipettering och samla upp cellsuspensionen i ett 15 ml eller 50 ml sterilt centrifugrör. Centrifugera cellsuspensionen vid 252 x g i 5 minuter vid rumstemperatur. Kassera supernatanten, återsuspendera cellpelleten i 6 ml komplett DMEM och inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 % CO2 .
- För kontinuerligt underhåll av naiva, transfekterade eller virusinfekterade Huh7.5-celler, upprepa steg 4.2. och steg 4.3.
- 1 dag före transfektion, dela cellerna enligt beskrivningen i steg 4.1.-4.3., räkna antalet livsdugliga celler med hjälp av en hemocytometer, frö Huh7.5-cellerna med en densitet av 0.6 x 106 i 35 mm skålar i 2 ml komplett DMEM och inkubera cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med 5 % CO2 .
- Följande dag bereds transkript-lipidkomplexet. För att göra detta, späd 10 μl transfektionsreagens i 50 μl minimalt essentiellt medium och späd separat 5 μg viralt transkript i 50 μl minimalt essentiellt medium.
- Inkubera båda blandningarna i rumstemperatur i 10 minuter och blanda dem sedan i ett enda sterilt mikrocentrifugrör och inkubera blandningen ytterligare i rumstemperatur i 30 minuter för att bilda transkript-lipidkomplexet.
- Efter 16 timmars cellinkubation, ta bort odlingsmediet från odlingsskålen, tvätta cellerna 2x med förvärmd 1x PBS och tillsätt 1.5 ml minimalt essentiellt medium. Tillsätt långsamt transkript-lipidkomplexet i skålen och snurra försiktigt med händerna för att säkerställa en jämn fördelning av komplexen.
- Inkubera cellerna i en 5% CO2 -inkubator vid 37 °C i 10 timmar. Ta sedan bort mediet, tvätta de transfekterade cellerna 2x med 1 ml förvärmd 1x PBS och tillsätt 2 ml komplett DMEM.
5. Produktion av virus
- Dela de transfekterade Huh7.5-cellerna varannan dag eller var 3:e dag när de når 90 % sammanflöde. Samla in virussupernatanter vid varje delning och förvara dem vid −80 °C för vidare analys.
- Vid varje delning ska virusets spridning övervakas med hjälp av en fokusbildande analys (FFA) enligt beskrivningen i steg 6.2. Skörda viruset tills virusspridningen når >80 % av de transfekterade cellerna (Figur 1D).
OBS: Dela de transfekterade cellerna i förhållandet 1:1 för de första passagerna för att rädda det maximala antalet virusvarianter. Virusspridningen saktar ner och livskraften minskar med ökande andelar mutationer i helgenom-ML2.
6. Kvantifiering av virustitrar
- Kvantifiering av viralt RNA
- Isolera virus-RNA från 140 μl odlingssupernatanter med hjälp av en virus-RNA-isoleringskit enligt tillverkarens anvisningar.
- Ställ in en 10 μL qRT-PCR-reaktion med hjälp av ett kommersiellt qRT-PCR-kit enligt tillverkarens instruktioner. Använd den främre primern R6-130-S17, den omvända primern R6-290-R19 (slutlig koncentration 0,2 μM vardera) och sonden R9-148-S21FT (slutlig koncentration 0,3 μM) för HCV-RNA-kvantifiering (tabell 3). Ställ in körförhållandena som 48 °C i 20 minuter, 95 °C i 10 minuter och sedan 45 cykler med 95 °C i 15 s och 60 °C i 1 min.
OBS: Sonden ska innehålla det fluorescerande reporterfärgämnet 6-karboxifluorescein (FAM) och släckningsfärgämnet 6-karboxitetrametyl-rhodamin (TAMRA) i 5'- respektive 3'-ändarna. - Kör reaktioner i en realtids-PCR-maskin. Ställ in negativa kontroller, dvs RNA extraherat från supernatanterna i skeninfekterade celler och nukleasfritt vatten samtidigt för att säkerställa frånvaron av korskontaminering.
- Generera parallellt en standardkurva med hjälp av ett 10-faldigt seriellt utspätt känt antal kopior av HCV-transkript (1 x 108 till 0) för kvantifiering av viralt RNA. Utför kvantifieringen i tre exemplar (figur 1D).
- Kvantifiering av infektilära virustiter med användning av 50 % vävnadskulturinfektiös dos (TCID50)
- Cirka 16 timmar före tillsats av viruset, platta 6,5 x 103 Huh7,5 celler/brunn i en platta med 96 brunnar och inkubera cellerna vid 37 °C i en 5 % CO2 inkubator.
- I ett skåp för biosäkerhet klass II ska 10-faldiga seriespädningar (1 ml vardera) utföras som täcker 1 x 10−1 till 1 x 10−6 spädningar (åtta spädningar) av det skördade viruset (erhålls när virusspridningen når >80 % av cellerna enligt beskrivningen i steg 5). Tillsätt 100 μL/brunn (med åtta replikat) av det utspädda viruset för att infektera Huh7,5-cellerna och förvara plattan i en inkubator vid 37 °C med 5 % CO2 i 3 dagar.
- Efter 3 dagar, tvätta de infekterade cellerna 3 gånger med 0,1 ml PBS varje gång, och fixera och permeabilisera cellerna med 0,1 ml iskall metanol vid −20 °C i 20 minuter. Tvätta brunnarna med 1x PBS 3x och sedan 1x med PBS-T (1x PBS/0,1 % [v/v] Tween-20).
- Efter att PBS-T avlägsnats, blockera cellerna i 30 minuter vid rumstemperatur med 0,1 ml 1 % bovint serumalbumin (BSA) innehållande 0,2 % skummjölk i PBST. Ta bort den blockerande lösningen och behandla cellerna i 5 minuter med 0,1 ml 3% H 2 O2beredd i 1x PBS.
- Återigen, tvätta cellerna 2x med 1x PBS och 1x med PBS-T, tillsätt sedan 50 μL/brunn anti-NS5A 9E10 mAb (1:10000, lager 1 mg/ml; en vänlig gåva från Charles Rice, The Rockefeller University) och inkubera i rumstemperatur i 1 timme. Tvätta brunnarna igen 3x med 1x PBS och 1x med PBS-T.
- Tillsätt 50 μL/brunn HRP-konjugerad sekundär IgG för get-antimus (1:4000), inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur och avlägsna sedan den obundna antikroppen genom att tvätta brunnarna med 0,1 ml 1x PBS.
- Tillsätt 30 μL DAB (diaminobenzidintetrahydroklorid) färgsubstrat och inkubera plattan med försiktig gungning i 10 minuter vid rumstemperatur. Substratet utvecklar en brun fällning på brunnens yta som indikerar HCV NS5A-antigen. Ta bort DAB-lösningen och tvätta brunnarna 2x med 1x PBS och 1x med destillerat vatten. Tillsätt 100 μL PBS som innehåller 0,03 % natriumazid.
- Undersök varje brunn under ett inverterat ljusmikroskop med ett 10x objektiv. Räkna antalet positiva brunnar. Om brunnen innehåller en eller flera NS5A-positiva celler är den positiv; om brunnen visar en frånvaro av NS5A-positiva celler är den negativ. Använd en Reed- och Münch-kalkylator för att uppskatta endpoint-utspädningen som infekterar 50 % av brunnarna (TCID50)14,15. En reciprok av den utspädning som krävs för att ge TCID50 är virusets infektionstiter (foci bildande enheter) per volymenhet.
OBS: Virusinfektionstitrarna varierar för olika mutantbibliotek.
7. Val av läkemedelsresistent virusvariant
- Lös upp pibrentasvir (PIB), en NS5A-hämmare, i 100 % DMSO till en koncentration av 1 mM och späd det ytterligare i komplett DMEM till en koncentration av 10 nM.
- För att bestämma den 50 % effektiva koncentrationen av PIB, så Huh7,5-celler med en densitet av 0,6 x 10 6/brunn i en 6-hålsplatta och inkubera cellerna vid 37 °C i en 5 % CO2 -inkubator. Efter 16 timmars cellinkubation tillsätts en virusdos av antingen ML50 eller klonalt JFH1-virus för att infektera 50 % av cellerna, och sedan, 12 timmar efter infektion (h p.i.), behandlas cellerna med en tvåfaldig spädningsserie av PIB från 0,5 till 100 pM. Mät FFA och kvantifiera FFU enligt steg 6.2. efter 3 dagars inkubation.
- Plotta dos-responskurvorna med hjälp av FFU-reduktionsanalysvärden i programvara för statistisk analys. Från den sigmoidala kurvan, erhåll den 50% effektiva koncentrationen (EC50; Figur 5).
OBS: Det effektiva koncentrationsintervallet kan variera beroende på klass, mellan HCV-antivirala medel i samma klass och beroende på mutantbiblioteket. - För experimentet, infektera naiva Huh7.5-celler vid 70 % sammanflöde med en ML50-virusdos (varianter härledda från ML50 RNA) för att infektera 50 % av cellerna i 12 timmar, och överför sedan de infekterade cellerna till 6-brunnsplattor 24 timmar efter infektion.
- Tillsätt 1x EC50 PIB (47,3 pM) till de infekterade cellerna efter 16 timmars celldelning. Gör detta efter varje celldelning under sex på varandra följande passager (18 dagar), följt av tre drogfria passagecykler, och övervaka virusspridning med hjälp av FFA enligt beskrivningen i steg 6.2. Uppskalning av FFA-reagenser enligt tillväxtområdet. Skörda virala supernatanter vid varje passage och förvara dem vid −80 °C fram till användning.
OBS: Virusspridning till mer än 50 % av cellerna under behandlingsuppföljning kan definieras som ett genombrott, och virusspridning under läkemedelsutsättningsperioden kan definieras som virusåterfall16. - Extrahera viralt RNA från supernatanten på dag 18, enligt beskrivningen i steg 6.1.1., och syntetisera sedan cDNA, som visas i steg 3.1. Amplifiera NS5A-genen med 5 μL 1:5 utspätt cDNA och de PCR-komponenter som beskrivs i steg 3.2. Följ sedan steg 3.3.-3.5. för att bestämma NS5A-läkemedelsresistensmutationer i 6-8 positiva bakterieplasmider med hjälp av NS5A-sekvenseringsprimrarna 6186F, 6862F och 6460R (tabell 3 och tabell 4).
OBS: Här i denna studie rapporterade vi substitutioner i NS5A av varianter som valts ut under PIB-behandling vid 1x EC50. Detta kommer att utesluta bidraget från andra substitutioner än NS5A i minskad känslighet för PIB.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En uppsjö av HCV-varianter i full längd kan genereras och screenas för läkemedelsresistenta fenotyper av intresse enligt de procedurer som beskrivs i figur 1. Helgenommutantbibliotek syntetiserades med klonal-pJFH1 i minskande mängder (100-10 ng), som visas i figur 2. Den genomsnittliga avkastningen av ep-PCR-produkter (mutantbibliotek) varierade mellan 3,8 och 12,5 ng/μL. Figur 3 visar de virala transkripten syntetiserade från klonal-pJFH1 och det representativa mutantbiblioteket (ML50 syntetiserade med 50 ng klonal-pJFH1). Klonal-pJFH1 linjäriserades via XbaI-nedbrytning , medan ML50 användes direkt i transkriptionsreaktionen in vitro . Andelen mutationer i mutantbibliotek (muterade virala RNA) ökade med minskande ingång pJFH1 i ep-PCR-reaktionen, vilket visas i figur 4. ML50 syntetiserad med 50 ng av mallen (klonal-pJFH1) hade 4 substitutioner per 10 000 bp kopierad, medan ML25 syntetiserad med 25 ng av mallen innehöll 9 substitutioner. Inga substitutioner inom antalet sekvenserade nukleotider hittades i klonal-pJFH1. ML50-virusvarianter var mindre känsliga (12,7 gånger) för pibrentasvir, en NS5A-hämmare, jämfört med klonalt JFH1-virus, vilket visas i figur 5. I tabell 5 identifieras NS5A-substitutioner i ML50-virusvarianter som valts ut mot 1x EC50 av behandling med pibrentasvir. Av de åtta NS5A-klonerna hade fyra en kombination av D7V+F28C, medan V8A+F28C och F36L förekom i en klon vardera. Dessa mutationer fanns vid N-terminalen i NS5A, som är känd för att hysa kliniskt relevanta NS5A-resistensmutationer17.
Figur 1: Schematisk bild av FL-MRS-strategin och val av läkemedelsresistent fenotyp. (A) Klonen pJFH1 cDNA (vildtyp) bär på ett virusgenom av genotyp 2a i full längd och en promotor för T7. Primern J-For är uppströms om T7-promotorn, och primern J-Rev är belägen i 3'-änden av HCV-genomet. (B) Klonal-pJFH1 mutagenes slumpmässigt med hjälp av felbenägen PCR för att konstruera genetiska variationer och för att skapa fullständiga genommutantbibliotek. Klonal-pJFH1 linjäriseras genom XbaI-nedbrytning. (C) Fullgenom-ep-PCR-produkter och linjäriserade klonala pJFH1 är mallarna för in vitro-transkription. Andelen mutationer i virus-RNA i ML och klonal-JFH1 bestämdes genom TA-subkloning av NS5A och Sanger-sekvensering av positiva TA-kloner. (D) Replikationskompetenta varianter som genererats efter muterad viral RNA-transfektion av Huh7.5-celler behandlades med pibrentasvir (en NS5A-hämmare) för urval av NS5A-resistenta fenotyper. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Agarosgelelektrofores av ep-PCR-produkter. HCV fullgenom-ep-PCR-produkter syntetiserade med varierande mallmängder (100 ng, 50 ng, 25 ng och 10 ng pJFH1) separerades med 0,8 % TAE-agarosgelelektrofores. Den förväntade storleken på ep-PCR-produkten är 9,7 kb. De separerade produkterna visualiserades genom etidiumbromidfärgning. Bana 1 är en DNA-stege på 1 kb; Körfält 6 är ingen mallkontroll (märkt som H2O). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: MOPS-formaldehyd-agarosgelelektrofores av virala transkript. Linjäriserat pJFH1 (Lane 2) och det mutantbibliotek som erhölls med 50 ng (ML50) av pJFH1 innehållande ep-PCR (Lane 3) användes som mallar för in vitro-transkriptionsreaktionen. Transkriptionernas integritet analyserades med hjälp av en MOPS-formaldehyd 0,8 % agarosgel färgad med etidiumbromid. Bana 1 är en RNA-stege på 1 kb. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Andel substitutioner i mutantbibliotek. NS5A-gener från RNA av klonal pJFH1, ML50 och ML25 amplifierades i högupplösta PCR, följt av tillsats av 3'A-överhäng, ligering av produkten med T-vektor och transformation av E. coli DH5α med den ligerade produkten. Omkring 40 000 nukleotider/bibliotek eller klonal-pJFH1 sekvenserades Sanger. En genomsnittlig andel mutationer per 10 000 bp som kopieras visas. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Uppskattning av EC50 för pibrentasvir jämfört med ML50-varianter. Huh7,5-celler infekterades med klonalt JFH1-virus eller ML50-varianter och behandlades med tvåfaldiga seriespädningar med början vid 100 pM pibrentasvir, följt av FFA efter 3 dagar. Sigmoidala dos-responskurvor med hjälp av FFU-reduktionsanalysvärden plottades i statistisk analysprogramvara för att uppskatta den effektiva koncentrationen på 50 %. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Komponenter för 50 μL | Erforderligt lagervärde | Slutlig koncentration/reaktion |
| 10x PCR-buffert | 5,0 μL | 1x |
| MgCl2 (50 mM) | 1,5 μL | 1,5 mM |
| KB-förlängare | 2,0 μL | - |
| dNTP (10 mM) | 1,0 μL | 0,2 mM |
| Primer framåt (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Omvänd primer (10 μM) | 1,0 μL | 0,2 μM |
| Taq DNA-polymeras (10 U/μL) | 0,5 μL (1:4 utspädd) | 1 U |
| Mall (pJFH1, 20 ng/μL) | 0,5 till 5,0 μL | 10 till 100 ng |
| Vatten | 32,5 till 37,5 μL | Justera för slutlig volym på 50 μL |
Tabell 1. Ep-PCR-komponenter för amplifiering av HCV-helgenom.
| Temperatur | Tid | Cykel(n) |
| 95 °C | 3 minuter | 1 |
| 95 °C | 30 sek | 30 |
| 60 °C | 25 sek | |
| 72 °C | 8 minuter | |
| 72 °C | 10 minuter | 1 |
| 4 °C | Hålla |
Tabell 2. Cykelförhållanden för ep-PCR av HCV-helgenom.
| Prövning | Abc-bok | Sekvens (5'-3') |
| Förstärkning av partiell NS4B-NS5A-partiell NS5B | 5272F | TGGCCCAAAGTGGAACAATTTTGG |
| 7848R | GGCCATTTTCTCGCAGACCCGGAC | |
| cDNA-syntes | 9464R | GTGTACCTAGTGTGTGCCGCTCTA |
| qRT-PCR | R9-148-S21FT (TaqMan-sond) | CTGCGGAACCGGTGAGTACAC |
| R6-130-S17 | CGGGAGAGCCATAGTGG | |
| R6-290-R19 | AGTACCACAAGGCCTTTCG | |
| Sekvenseringsprimers för att bestämma proportioner av mutationer i ep-PCR-produkter | 6208-SPF | CCCAACTACTTGGCTCTCTTAC |
| 6748-SPF | GACGGTGTGCAGATCCATAG | |
| NS5A-gensekvensering (och för att bestämma proportioner av mutationer i ep-PCR-produkter) | 6186F | CAACGCAGAACGAGACCTCATCCC |
| 6862F | GACCTTTCCTATCAATTGCTACAC | |
| 6460R | TGGGCACGGCCTGACTACAA |
Tabell 3. Primers och sekvenser som används i analyser.
| Temperatur | Tid | Cykel(n) |
| 95 °C | 4 minuter | 1 |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 68 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minuter | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 66 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minuter | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 64 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minuter | |
| 95 °C | 30 sek | 5 |
| 62 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minuter | |
| 95 °C | 30 sek | 10 |
| 60 °C | 30 sek | |
| 72 °C | 2 minuter | |
| 72 °C | 10 minuter | 1 |
| 4 °C | Hålla |
Tabell 4. Cykelförhållanden för NS5A-förstärkning.
| Ersättning(ar) | Lol Antal kloner (n=6) |
| D7V+F28C | 4 |
| V8A+F28C | 1 |
| F36L | 1 |
Tabell 5. Pibrentasvir-resistenssubstitutioner av NS5A.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna studie har vi beskrivit en enkel och snabb FL-MRS-procedur som integrerar ep-PCR18 och omvänd genetik för att syntetisera HCV-helgenombibliotek, som sedan kan användas i ett cellodlingssystem för att generera replikationskompetenta varianter för screening av läkemedelsresistenta fenotyper. Användningen av Taq DNA-polymeras med låg trohet är en förutsättning för ep-PCR som möjliggör inkorporering av substitutioner under PCR-amplifiering av ett viralt genom i full längd. Vi testade flera lågupplösta Taq DNA-polymeraser och fann att Platinum Taq DNA-polymeras gav en ep-PCR-produkt med en storlek på ~10 kb med hög avkastning (data visas inte). Vi rekommenderar att du använder ett fast antal termiska cykler och varierar mängden indatamallar för att kontrollera andelen mutationer i helgenombiblioteken. Eftersom FL-MRS använder felaktiga fullständiga genom som mallar för virala RNA i full längd, är en noggrann utformning av primeruppsättningen avgörande för att säkerställa att RNA-syntesreaktionen producerar virustranskript av definierad längd: (i) den framåtriktade primern måste vara placerad uppströms (~50 nukleotider) av T7-promotorn för cDNA-klonen för att underlätta T7-polymerasbindning till ep-PCR-produkten; och (ii) den omvända primersekvensen måste sluta vid 3'-änden av virusgenomet för att underlätta transkriptionsavrinning under in vitro-RNA-syntesen.
Metoden är dock relativt grov, och det finns ingen kontroll över att inkorporera erforderligt antal och typ av substitutioner i regioner av intresse i genomet. En stor fördel med FL-MRS är att de syntetiserade transkripten i full längd kan användas direkt för att transfektera celler, vilket gör tillvägagångssättet enkelt och effektivt för att generera en stor pool av virusvarianter. Cirkulär polymerasförlängning och mutagenesmetoder för införande av mu-transposon kräver däremot kloning av PCR-produkten och screening av transformanter före val av önskad fenotyp, vilket allvarligt begränsar mångfalden i poolen av mutanter. Även om vår metod kraftigt ökar chansen att få fram flera önskade fenotyper, krävs normalt utvärdering av enskilda virusvarianter vid screening.
Integrering av ep-PCR med omvänd virusgenetik gjorde det möjligt för oss att snabbt generera HCV-mutanter. Denna metod har potential att generera hundratals genetiskt modifierade virus, en bedrift som till synes inte är möjlig med de för närvarande tillgängliga in vitro-mutagenesteknikerna. Metoden som beskrivs här är lätt att anpassa till cDNA-kloner som bär på alla (+)ssRNA-virus som innehåller genom upp till ~10 kb långa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Finansieringsstöd (anslagsnummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) för denna studie tillhandahölls av Department of Biotechnology, Government of India.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 - 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL--2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U.
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R.
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
