Summary

Omvänd genetik för att konstruera RNA-virusvarianter med positiv känsla

Published: June 09, 2022
doi:

Summary

Protokollet beskriver en metod för att introducera kontrollerbar genetisk mångfald i hepatit C-virusets genom att kombinera fullängdsmutant RNA-syntes med hjälp av felbenägen PCR och omvänd genetik. Metoden ger en modell för fenotypselektion och kan användas för 10 kb långa RNA-virusgenom.

Abstract

Bristen på en bekväm metod för iterativ generering av olika virala varianter i full längd har försvårat studiet av riktad evolution i RNA-virus. Genom att integrera en fullständig PCR i RNA-genomet och omvänd genetik kan slumpmässig substitutionsmutagenes induceras. Vi har utvecklat en metod som använder denna teknik för att syntetisera olika bibliotek för att identifiera virala mutanter med fenotyper av intresse. Denna metod, som kallas fullängdsmutant RNA-syntes (FL-MRS), erbjuder följande fördelar: (i) förmågan att skapa ett stort bibliotek via en mycket effektiv enstegs felbenägen PCR; ii) förmågan att skapa grupper av bibliotek med olika nivåer av genetisk mångfald genom att manipulera DNA-polymerasets trohet, iii) Skapande av en fullängds-PCR-produkt som direkt kan tjäna som mall för mutant RNA-syntes. och (iv) förmågan att skapa RNA som kan levereras in i värdceller som en icke-selekterad ingångspool för att screena för virala mutanter av den önskade fenotypen. Vi har funnit, med hjälp av en omvänd genetisk metod, att FL-MRS är ett tillförlitligt verktyg för att studera virusriktad evolution i alla stadier i livscykeln för hepatit C-viruset, JFH1-isolatet. Denna teknik verkar vara ett ovärderligt verktyg för att använda riktad evolution för att förstå anpassning, replikation och rollen av virala gener i patogenes och antiviral resistens i positiva RNA-virus.

Introduction

Framåtriktad genetisk screening börjar med en viral fenotyp av intresse och försöker sedan, genom att sekvensera dess genom och jämföra den med den ursprungliga stammens, identifiera den eller de mutationer som orsakar den fenotypen. I omvända genetiska screeningar introduceras däremot slumpmässiga mutationer i en målgen, följt av en undersökning av den resulterande fenotypen1. För den omvända genetiken är mutagenes in vitro den mest använda tekniken för att skapa en pool av varianter som sedan screenas för fenotyper av intresse. Olika genetiska verktyg har rapporterats för att uppnå genomomfattande slumpmässig mutagenes av RNA-virus, inklusive felbenägen PCR (ep-PCR)2,3, cirkulär polymerasförlängning4 och Mu-transposoninsättningsmutagenes 5,6,7. De två senare metoderna ger bibliotek med begränsad sekvensdiversitet och är benägna att introducera stora insättningar och raderingar, vilket är mycket dödligt för virus och allvarligt begränsar återhämtningen av infektiösa virusvarianter.

ep-PCR är en välkänd kraftfull mutagenesteknik som ofta används inom proteinteknik för att generera muterade enzymer för val av fenotyper med önskade egenskaper, såsom förbättrad termisk stabilitet, substratspecificitet och katalytisk aktivitet 8,9,10. Denna teknik är lätt att utföra eftersom den kräver enkel utrustning, inte involverar tråkiga manipulationer, använder kommersiellt tillgängliga reagenser och är snabb; Dessutom genererar det bibliotek av hög kvalitet.

Här utvecklade vi en ny metod för fullängdsmutant RNA-syntes (FL-MRS) för att generera kompletta genom av hepatit C-virus (HCV) genom att integrera ep-PCR, som inducerar slumpmässig genomomfattande substitutionsmutagenes och omvänd genetik. Till och med en enda nukleotidinsättning eller nukleotidradering är mycket skadlig för RNA-virus med positiv känsla ([+]ssRNA); därför är PCR-baserad substitutionsmutagenes den föredragna metoden för iterativ generering av stora, olika bibliotek av fullständiga (+)ss-RNA-virusgenom med god viabilitet.

FL-MRS är ett enkelt tillvägagångssätt som kan tillämpas på alla RNA-virus med positiv känsla med en genomlängd på ~10 kb genom genom den noggranna utformningen av en primeruppsättning som binder till den virala cDNA-klonen. pJFH1 är en infektiös cDNA-klon som kodar för HCV genotyp 2a och kan rekapitulera alla steg i virusets livscykel. Genom att använda FL-MRS-metoden demonstrerade vi syntesen av slumpmässigt mutagena helgenombibliotek (mutantbibliotek [MLs]) för att producera replikationskompetenta JFH1-varianter för vilka det inte fanns någon tidigare kunskap om de egenskaper som är associerade med mutationer. Vid exponering för ett antiviralt medel övervann några av virusvarianterna snabbt läkemedelstrycket med den önskade fenotypiska förändringen. Med hjälp av det protokoll som beskrivs här kan en uppsjö av virusvarianter genereras, vilket skapar möjligheter att studera evolutionen av (+)ssRNA-virus.

Protocol

OBS: JFH1-stammen (WT) som används här var en vänlig gåva från Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Den mänskliga hepatomcellinjen, Huh7.5, var en vänlig gåva från Charles Rice, Rockefeller University. En schematisk bild av metoden visas i figur 1. 1. Genomomfattande substitutionsmutagenes av JFH1 med hjälp av felbenägen PCR För att utföra ep-PCR, förbered masterblandningen för fyra uppsättningar expe…

Representative Results

En uppsjö av HCV-varianter i full längd kan genereras och screenas för läkemedelsresistenta fenotyper av intresse enligt de procedurer som beskrivs i figur 1. Helgenommutantbibliotek syntetiserades med klonal-pJFH1 i minskande mängder (100-10 ng), som visas i figur 2. Den genomsnittliga avkastningen av ep-PCR-produkter (mutantbibliotek) varierade mellan 3,8 och 12,5 ng/μL. Figur 3 visar de virala transkripten syntetiserade fr?…

Discussion

I denna studie har vi beskrivit en enkel och snabb FL-MRS-procedur som integrerar ep-PCR18 och omvänd genetik för att syntetisera HCV-helgenombibliotek, som sedan kan användas i ett cellodlingssystem för att generera replikationskompetenta varianter för screening av läkemedelsresistenta fenotyper. Användningen av Taq DNA-polymeras med låg trohet är en förutsättning för ep-PCR som möjliggör inkorporering av substitutioner under PCR-amplifiering av ett viralt genom i full längd. Vi te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansieringsstöd (anslagsnummer BT/PR10906/MED/29/860/2014) för denna studie tillhandahölls av Department of Biotechnology, Government of India.

Materials

1 kb plus DNA ladder  Thermo Fisher 10787018
1.5 ml centrifuge tube Tarsons 500010
15 ml centrifuge tube Tarsons 546021
35 mm cell culture dish  Tarsons 960010
50 ml centrifuge tube Tarsons 546041
Acetic acid Merck A6283
Agarose  HiMedia MB080
Agrose gel electrophoresis unit BioRad 1704406
Biosafety Cabinet, ClassII ESCO AC2 4S
Bovine serum albumin HiMedia MB083
Centrifuge  Eppendorf 5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System BioRad 1855201
Cloning plates 90 mm  Tarson 460091
CO2 Incubator  New Brunswick Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer Titertek-Berthold 11050140
DAB Substrate Kit  Abcam ab94665
dATP Solution NEB N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set NEB N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)  SRL chemical 46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO) HiMedia MB058
DMEM high glucose Lonza BE12-604F
EcoR1-HF NEB R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate HiMedia GRM4918
Ethidium Bromide Amresco X328
Fetal bovine serum  Gibco 26140079
Formaldehyde  Fishser Scientific 12755
Gel Documentation System ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP Thermo Fisher A16066
Hydrogen peroxide 30% Merck 107209
Inverted microscope Nickon  ECLIPSE Ts2
LB broth  HiMedia M1245
Lipofectamine 2000  Thermo Fisher 116680270 transfection reagent
Mechanical Pipette Set Eppendorf   3120000909
Methanol Merck 106009
Micro Tips 0.2-10 µl  Tarsons 521000
Micro Tips 10 – 100 µl  Tarsons 521010
Micro Tips 200-1000 µl  Tarsons 521020
MOPS buffer  GeNei 3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA) Gibco 11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli Invitrogen C404010 E.coli DH5α
Opti-MEM Gibco 1105-021 minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml Tarsons 510051
Pencillin/streptomycin  Gibco 15070063
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360 T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS) HiMedia TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0530S
Pibrentasvir Cayman Chemical 27546
Pipette controller  Gilson  F110120
Platinum Taq DNA Polymerase  Thermo 10966034
Prism GraphPad statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit  Qiagen 52904 viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN 28104 cokum purification kit
RNeasy Mini Kit  QIAGEN 74104 RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml Thermo Fisher 170357N
Serological Pipettes 5 ml Thermo Fisher 170355N
Serological Pipettes10 ml Thermo Fisher 170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb Merck R7020
Skim milk  HiMedia M530
Sodium azide 0.1 M solution Merck 8591
SuperScript III Reverse Transcriptase  Invitrogen 18080044 reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
T175 cell culture flask  Tarsons 159910
T25 cell culture flask  Tarsons 950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System  Promega P1320  Large Scale RNA Production System 
T75 cell culture flask  Tarsons 950050
Taq DNA Polymerase Genetix Biotech (Puregene) PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit Thermo Fisher 4392653 commercial qRT-PCR kit 
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit Thermo Fisher K8050-10 kit for cloning of long-PCR product 
Tris base HiMedia TC072
Trypsin-EDTA solution HiMedia TCL007
Tween 20 HiMedia MB067
Vacuum Concentrator  Eppendorf, Concentrator Plus 100248
Water bath  GRANT JBN-18
Xba1 NEB R0145S

References

  1. Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
  2. Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
  3. Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
  4. Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
  5. Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
  6. Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -. J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
  7. Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
  8. Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
  9. Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
  10. Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
  11. Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
  12. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
  13. Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
  14. Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
  15. Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
  16. Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
  17. Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
  18. Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).

Play Video

Cite This Article
Soni, S., Agarwal, S., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Reverse Genetics to Engineer Positive-Sense RNA Virus Variants. J. Vis. Exp. (184), e63685, doi:10.3791/63685 (2022).

View Video