Summary
在这里，我们提出了一种基于颜色反应检测细菌运动的方案。这种方法的主要优点是易于评估且更准确，并且不需要专门的设备。
Abstract
细菌运动性对细菌致病性、生物膜形成和耐药性至关重要。细菌运动对于许多致病物种的入侵和/或传播至关重要。因此，检测细菌运动非常重要。细菌生长条件，如氧气、pH和温度，会影响细菌的生长和细菌鞭毛的表达。这可能导致运动能力降低甚至失去运动能力，导致对细菌运动性的评估不准确。基于2，3，5-三苯基氯化四唑（TTC）与活细菌细胞内脱氢酶的显色反应，将TTC添加到传统的半固体琼脂中用于细菌运动检测。结果表明，该TTC半固体琼脂法检测细菌运动性简单，操作方便，不涉及大型且昂贵的仪器。结果还表明，在用0.3%琼脂制备的半固体培养基中观察到最高的运动性。与传统的半固体介质相比，结果更容易评估，也更准确。
Introduction
细菌运动在细菌致病性、生物膜形成和耐药性中起关键作用1。细菌运动性与致病性密切相关，是宿主细胞早期感染期间细菌定植所必需的2。生物膜的形成与细菌运动密切相关，细菌通过运动粘附在固体培养基的表面。长期以来，人们一直认为细菌运动与生物膜形成呈正相关。由于生物膜引起的高度细菌耐药性可导致对人类健康构成威胁的持续感染3，4，5。因此，检测细菌运动非常重要。细菌运动性测试主要用于检查不同形式细菌在生活状态下的运动性，可以间接确定鞭毛的存在与否，因此对细菌的鉴定具有重要作用。
有直接和间接的方法来检测细菌运动6。由于带有鞭毛的细菌表现出运动性，因此可以通过检测是否存在鞭毛来间接检测细菌是否具有运动性。例如，可以通过电子显微镜和鞭毛染色间接检测运动性，以表明细菌是运动的。也可以通过直接方法进行检测，例如悬浮液滴和半固体穿刺方法。
本科微生物学实验室常用的半固体穿刺法检测细菌运动性，根据细菌生长方向，将细菌接种到含有0.4-0.8%琼脂的半固体琼脂培养基中穿刺中。如果细菌沿着穿刺线生长到周围扩散，则会出现云状（刷状）生长痕迹，表明存在鞭毛，因此存在运动性。如果没有穿刺线生长痕迹，则细菌既不鞭毛也不运动。
然而，这种方法有其缺点：细菌无色透明，鞭毛活性受活细菌的生理特性和其他因素的影响，以及琼脂的浓度和试管的小直径。而且，需氧菌只适合在琼脂表面生长，影响细菌运动的观察。因此，为了改进该实验，将2，3，5-三苯基氯化四唑（TTC）（无色）添加到培养基中，以建立比目前使用细胞内脱氢酶催化形成TTC7，8，9，10红色产物的直接穿刺方法更可靠，更直观的细菌运动性测定方法。
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Protocol
1. 半固体培养基的制备
- 传统半固体琼脂
- 根据细菌运动测试培养基配方，使用基本成分制备传统的半固体琼脂11。将 10 g 色糖、15 g NaCl、4 g 琼脂溶解在足够的蒸馏水中，将 pH 值调节至 7.2 ± 0.2，并将最终体积补足至 1，000 mL。
- 将琼脂在121°C高压灭菌20分钟，并将其作为3cm高的半固体培养基分配到10mL试管中。
- 含TTC的传统半固体琼脂
- 将常规半固体培养基高压灭菌后，冷却至50°C，将5mL无菌1%TTC溶液加入100mL培养基中，混合，并将其分配到10 mL试管中，形成3cm高的半固体培养基。
2. 细菌菌株
注意：从水生环境中分离出80株菌株，并使用自动细菌鉴定仪器（见材料表）进行鉴定，包括大肠杆菌，铜绿假单胞菌，沙门氏菌属，弧菌属，肺炎克雷伯菌和嗜水气单胞菌（表1）。 金黄色葡萄球菌（见材料表）被用作阴性非运动对照;大肠杆菌、铜绿假单胞菌和鼠伤寒沙门氏菌（见材料表）用作阳性对照菌株。
- 确定用于运动分析的测试细菌菌株。
- 包括阴性非运动对照和运动阳性对照菌株。
3. TTC增强细菌运动观察
- 从琼脂平板中挑选测试细菌的单个菌落，并使用接种针穿刺将它们接种到上述两种半固体培养基中（步骤1.1.2和1.2.1）。
- 将管在培养箱中于37°C培养24-48小时以观察结果。
- 观察生长状态：如果只有穿刺线是红色的，则将细菌表征为非运动（-）。如果红色沿穿刺线12 向外轻微扩散，则将细菌表征为运动 （+）。
4. 不同琼脂浓度对细菌运动的影响
- 如上所述，制备含有0.3%，0.5%和0.8%琼脂的半固体培养基，并通过穿刺接种它们。孵育24-48小时后观察结果。
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Representative Results
比较标准菌株和分离菌株的运动检测，结果如 表1所示。由于没有鞭毛， 金黄色葡萄球菌 和 肺炎克雷伯菌 仅在传统和TTC半固体培养基上沿接种线生长。相比之下， 铜绿假单胞菌、 大肠杆菌 和 鼠伤寒沙门氏菌 在TTC半固体培养基上培养24 h后，在接种系周围各方向均显示生长。培养48小时后，这一点更加明显（图1）。尽管细菌在传统的半固体培养基中向各个方向生长，但由于接种线外侧的细菌数量很少，因此比在TTC培养基中更难可视化。
图 1：使用 TTC 半固体培养基的运动测试结果。 左边是金黄色葡萄球菌，右边是大肠杆菌。请点击此处查看此图的大图。
| 应变 | 含0.4%琼脂的半固体培养基 | 含0.4%琼脂和0.005%TTC的半固体培养基 | |||
| 24小时 | 48小时 | 24小时 | 48小时 | ||
| 铜绿假单胞菌 ATCC27853 | + | + | + | + | |
| 大肠杆菌 ATCC25922 | + | + | + | + | |
| 鼠伤寒沙门氏菌 空管14028 | + | + | + | + | |
| 金黄色葡萄球菌 ATCC25923 | - | - | - | - | |
| 大肠杆菌 （15） | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| 沙门氏菌 属 （8） | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. 亲水菌 （20） | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| 弧菌 属 （8） | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| 铜绿假单胞菌 （24） | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| 肺炎克雷伯菌 （5） | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| 数字表示阳性菌株（+）和阴性染色（-）的数量。 | |||||
表1：细菌运动的比较。
图2：观察不同琼脂浓度下大 肠杆菌 运动活性。 从左到右：0.3%，0.5%，0.8%琼脂。 请点击此处查看此图的大图。
琼脂浓度对细菌运动的影响如图 2所示。我们发现，在用0.3%琼脂制备的半固体培养基中观察到最高的运动性。管子中的中等颜色几乎完全变成了红色。相反，红色扩散面积减小，扩散随着琼脂浓度的增加而延长。
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Discussion
半固体培养基法细菌运动的检测受许多因素13，14的影响。细菌生长条件，例如氧气（琼脂表面有氧，半固体培养基在管底部无氧），pH和温度，会影响细菌鞭毛的活力，从而导致运动能力降低甚至运动力丧失15。此外，一些粘液型细菌作为其运动性会受到鬼臼结合物产生的影响。
将TTC添加到半固体介质中有助于观察运动性。具有动力的发酵菌在孵育后可以沿着穿刺线向各个方向生长。因此，穿刺线周围的介质变为红色。具有动力的非发酵细菌在培养基的下部含氧量低。因此，这些细菌生长不良，因此只有培养基的上层是红色的。没有动力的细菌只能在接种线上生长，只有穿刺线呈现红色。
当用TTC-半固体培养基检测细菌运动时，培养时间越长，结果越明显，特别是在琼脂浓度较低的情况下。如果结果难以解释，应适当延长培养时间。这可能与半固体培养基的琼脂浓度、细菌数量及其运动性有关16。此外，该方法表明，一些 大肠杆菌 和 铜绿假单胞菌 菌株在常规半固体琼脂培养基上无法生长，并且在TTC半固体琼脂培养基上仅显示淡红色。这可能是由于这种菌株产生胶囊，这影响了它们的运动性17。这种现象也发生在脑 膜炎奈瑟菌18 中，因为它的胶囊。总之，使用含有TTC的显色半固体培养基检测细菌运动性减少了细菌因素对测试结果的影响，并使结果更容易用肉眼观察。高检测率的优点使其成为一种有效的方法，可以取代传统的半固体培养基来检测细菌运动。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
本研究得到了江苏省高校优先学术项目开发（PAPD）和中国药科大学教学改革研究项目（2019XJYB18）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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