Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att detektera bakteriell rörlighet baserat på en färgreaktion. Viktiga fördelar med denna metod är att den är lätt att utvärdera och mer exakt och inte kräver specialutrustning.
Abstract
Bakteriell motilitet är avgörande för bakteriell patogenicitet, biofilmbildning och läkemedelsresistens. Bakteriell rörlighet är avgörande för invasion och / eller spridning av många patogena arter. Därför är det viktigt att upptäcka bakteriell rörlighet. Bakteriella tillväxtförhållanden, såsom syre, pH och temperatur, kan påverka bakterietillväxt och uttrycket av bakteriell flagella. Detta kan leda till minskad rörlighet eller till och med förlust av rörlighet, vilket resulterar i felaktig utvärdering av bakteriell motilitet. Baserat på färgreaktionen av 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) genom intracellulära dehydrogenaser av levande bakterier tillsattes TTC till traditionell halvfast agar för detektering av bakteriell motilitet. Resultaten visade att denna TTC semisolida agarmetod för detektion av bakteriell motilitet är enkel, lätt att använda och inte involverar stora och dyra instrument. Resultaten visade också att den högsta rörligheten observerades i halvfast medium framställt med 0,3% agar. Jämfört med det traditionella halvfasta mediet är resultaten lättare att utvärdera och mer exakta.
Introduction
Bakteriell motilitet spelar en avgörande roll för bakteriell patogenicitet, biofilmbildning och läkemedelsresistens1. Bakteriell motilitet är nära associerad med patogenicitet och är nödvändig för bakteriell kolonisering under tidig infektion av värdceller2. Biofilmbildning är nära besläktad med bakteriell motilitet, där bakterier fäster vid ytan av fasta medier genom rörlighet. Bakteriell motilitet har länge ansetts vara positivt korrelerad med biofilmbildning. En hög grad av bakteriell läkemedelsresistens på grund av biofilm kan leda till ihållande infektioner som utgör ett hot mot människors hälsa 3,4,5. Därför är det viktigt att upptäcka bakteriell rörlighet. Bakteriemotilitetstestet används huvudsakligen för att undersöka rörligheten hos olika former av bakterier i levande tillstånd, vilket indirekt kan bestämma närvaron eller frånvaron av flagella och därmed har en viktig roll vid identifieringen av bakterier.
Det finns direkta och indirekta metoder för att detektera bakteriell rörlighet6. Eftersom bakterier med flageller visar motilitet är det möjligt att upptäcka om bakterier är rörliga indirekt genom att detektera närvaron eller frånvaron av flageller. Det är till exempel möjligt att detektera motilitet indirekt genom elektronmikroskopi och flagellfärgning för att indikera att bakterier är rörliga. Det är också möjligt att detektera med direkta metoder, såsom suspensionsfall och halvfasta punkteringsmetoder.
Den semisolida punkteringsmetoden som vanligtvis används i mikrobiologiska laboratorier för att detektera bakteriell motilitet inokulerar bakterierna i punkteringen i det halvfasta agarmediet innehållande 0,4-0,8% agar, beroende på riktningen för bakterietillväxt. Om bakterierna växer längs punkteringslinjen för att sprida sig, visas molnliknande (borstliknande) tillväxtspår, vilket indikerar närvaron av flageller och därmed rörlighet. Om det inte finns några spår av punkteringslinjens tillväxt är bakterien varken flagellerad eller rörlig.
Denna metod har emellertid sina nackdelar: bakterierna är färglösa och transparenta, flagellaktiviteten påverkas av de levande bakteriernas fysiologiska egenskaper och andra faktorer samt koncentrationen av agar och provrörets lilla diameter. Dessutom är aeroba bakterier endast lämpliga för tillväxt på agarytan, vilket påverkar observationen av bakteriell rörlighet. För att förbättra detta experiment tillsattes därför 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC) (färglös) till mediet för att etablera en mer tillförlitlig och intuitiv metod för bestämning av bakteriell rörlighet än den nuvarande direktpunkteringsmetoden med användning av intracellulära dehydrogenaser för att katalysera bildandet av en röd produkt av TTC 7,8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av halvfast medium
- Traditionell halvfast agar
- Förbered den traditionella halvfasta agaren enligt receptet för bakteriemotilitetstestmedium med de grundläggande ingredienserna11. Lös 10 g tryptos, 15 g NaCl, 4 g agar i tillräckligt med destillerat vatten, justera pH till 7,2 ± 0,2 och fyll på den slutliga volymen till 1 000 ml.
- Autoklavera agaren vid 121 °C i 20 minuter och fördela den i 10 ml provrör som ett 3 cm högt halvfast medium.
- Traditionell halvfast agar med TTC
- Efter autoklavering av det konventionella halvfasta mediet, kyla det till 50 ° C, tillsätt 5 ml steril 1% TTC-lösning till 100 ml medium, blanda och fördela det i 10 ml provrör för att bilda ett 3 cm högt halvfast medium.
2. Bakteriestammar
OBS: Åttio stammar isolerades från vattenmiljön och identifierades med hjälp av ett automatiserat bakterieidentifieringsinstrument (se materialtabellen), inklusive Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae och Aeromonas hydrophila (tabell 1). Staphylococcus aureus (se materialtabellen) användes som en negativ icke-rörlig kontroll; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa och Salmonella typhimurium (se materialtabellen) användes som positiva kontrollstammar.
- Identifiera testbakteriestammar som ska användas för motilitetsanalys.
- Inkludera negativa icke-rörliga kontroller och rörliga positiva kontrollstammar.
3. TTC-förbättrad bakteriell motilitetsobservation
- Plocka enstaka kolonier av testbakterier från agarplattor och inokulera dem i ovanstående två halvfasta medier (steg 1.1.2 och 1.2.1) genom punktering med inokulerande nålar.
- Odla rören vid 37 °C i inkubatorn i 24-48 timmar för att observera resultaten.
- Observera tillväxttillståndet: karakterisera bakterierna som icke-rörliga (-) om endast punkteringslinjen är röd. Karakterisera bakterierna som rörliga (+) om den röda färgen sprider sig lätt utåt längs punkteringslinjen12.
4. Effekt av olika agarkoncentrationer på bakteriell rörlighet
- Förbered halvfasta medier innehållande 0,3%, 0,5% och 0,8% agar och inokulera dem genom punktering, som beskrivits ovan. Observera resultaten efter 24-48 timmars inkubation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Både standardstammar och isolerade stammar jämfördes för motilitetsdetektering, och resultaten visas i tabell 1. På grund av frånvaron av flagella växte Staphylococcus aureus och Klebsiella pneumoniae bara längs den inokulerade linjen på både traditionella och TTC semisolida medier. Däremot visade Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli och Salmonella typhimurium tillväxt i alla riktningar runt den inokulerade linjen efter odling i 24 timmar på TTC halvfast medium. Detta var ännu tydligare efter 48 timmars kultur (figur 1). Även om bakterierna växte i alla riktningar i det traditionella halvfasta mediet var det mycket svårare att visualisera än i TTC-medium på grund av det lilla antalet bakterier på utsidan av den inokulerade linjen.
Figur 1: Resultat från motilitetstest med halvfast TTC-medium. Staphylococcus aureus till vänster, Escherichia coli till höger. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Anstränga | Halvfast medium med 0,4% agar | Halvfast medium med 0,4% agar och 0,005% TTC | |||
| 24 timmar | 48 timmar | 24 timmar | 48 timmar | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Siffrorna anger antalet positiva stammar (+) och negativa fläckar (-). | |||||
Tabell 1: Jämförelse av bakteriell motilitet.
Figur 2: Observation av motilitetsaktivitet hos Escherichia coli vid olika agarkoncentrationer. Vänster till höger: 0,3%, 0,5%, 0,8% agar. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Påverkan av agarkoncentration på bakteriell rörlighet visas i figur 2. Vi fann att den högsta rörligheten observerades i halvfast medium framställt med 0,3% agar. Medelfärgen i röret blev nästan helt röd. Däremot minskade området med röd diffusion och diffusionen förlängdes med ökande agarkoncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detektionen av bakteriell rörlighet med den semifasta mediummetoden påverkas av många faktorer13,14. Bakteriella tillväxtförhållanden, såsom syre (aerob på agarytan, icke-aerob i botten av röret med det halvfasta mediet), pH och temperatur, kan påverka livskraften hos bakteriell flagella, vilket kan leda till minskad rörlighet eller till och med förlust av rörlighet15. Dessutom kan vissa bakterier av slemtyp som deras rörlighet påverkas av produktionen av podokonjugat.
Tillsatsen av TTC till det halvfasta mediet hjälper till att observera rörligheten. De fermentativa bakterierna med drivkraft kan växa i alla riktningar längs punkteringslinjen efter inkubation. Därför blir mediet runt punkteringslinjen rött. De icke-fermentativa bakterierna med drivkraft har låg syrehalt i den nedre delen av mediet. Därför växer dessa bakterier dåligt, så att endast det övre lagret av mediet är rött. Bakterier utan drivkraft kan bara växa på inokuleringslinjen, och endast punkteringslinjen verkar röd.
Vid detektering av bakteriell motilitet med TTC-halvfast medium, ju längre odlingstid, desto tydligare är resultaten, särskilt med lägre agarkoncentrationer. Om resultatet är svårt att tolka bör kulturtiden förlängas på lämpligt sätt. Detta kan vara relaterat till agarkoncentrationen hos det halvfasta mediet, antalet bakterier och deras rörlighet16. Dessutom avslöjade denna metod att vissa stammar av E. coli och P. aeruginosa inte kunde växa runt på konventionellt halvfast agarmedium och visade endast en svag röd färg på ytan av mediet på TTC semifast agarmedium. Detta kan bero på produktion av kapslar av sådana stammar, vilket påverkar deras rörlighet17. Detta fenomen förekommer också i Neisseria meningitidis18 på grund av dess kapsel. Sammanfattningsvis minskar detekteringen av bakteriell rörlighet med användning av ett kromogent halvfast medium innehållande TTC påverkan av bakteriella faktorer på testresultaten och gör resultaten lättare att observera med blotta ögat. Fördelen med en hög detektionsgrad gör detta till en effektiv metod som kan ersätta det traditionella halvfasta mediet för att detektera bakteriell rörlighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) och Teaching Reform Research Project of China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
