Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا للكشف عن الحركة البكتيرية بناء على تفاعل اللون. المزايا الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها سهلة التقييم وأكثر دقة ، ولا تتطلب معدات متخصصة.
Abstract
الحركة البكتيرية أمر بالغ الأهمية للإمراضية البكتيرية ، وتكوين الأغشية الحيوية ، ومقاومة الأدوية. الحركة البكتيرية أمر بالغ الأهمية لغزو و / أو نشر العديد من الأنواع المسببة للأمراض. لذلك ، من المهم الكشف عن الحركة البكتيرية. يمكن أن تؤثر ظروف نمو البكتيريا ، مثل الأكسجين ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة ، على نمو البكتيريا والتعبير عن السوط البكتيري. هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الحركة أو حتى فقدان الحركة ، مما يؤدي إلى تقييم غير دقيق للحركة البكتيرية. استنادا إلى تفاعل اللون لكلوريد 2،3،5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم (TTC) بواسطة نازعة الهيدروجين داخل الخلايا للبكتيريا الحية ، تمت إضافة TTC إلى أجار شبه صلب تقليدي للكشف عن الحركة البكتيرية. أظهرت النتائج أن طريقة أجار TTC شبه الصلبة للكشف عن الحركة البكتيرية بسيطة وسهلة التشغيل ولا تتضمن أدوات كبيرة ومكلفة. كما أظهرت النتائج أن أعلى حركة لوحظت في وسط شبه صلب محضر بنسبة 0.3٪ أجار. بالمقارنة مع الوسط شبه الصلب التقليدي ، فإن النتائج أسهل في التقييم وأكثر دقة.
Introduction
تلعب الحركة البكتيرية دورا مهما في الإمراضية البكتيرية ، وتكوين الأغشية الحيوية ، ومقاومة الأدوية1. ترتبط الحركة البكتيرية ارتباطا وثيقا بالإمراضية وهي ضرورية للاستعمار البكتيري أثناء العدوى المبكرة للخلايا المضيفة2. يرتبط تكوين الأغشية الحيوية ارتباطا وثيقا بالحركة البكتيرية ، حيث تلتصق البكتيريا بسطح الوسائط الصلبة من خلال الحركة. لطالما اعتبرت الحركة البكتيرية مرتبطة بشكل إيجابي بتكوين الأغشية الحيوية. يمكن أن تؤدي درجة عالية من مقاومة البكتيريا للأدوية بسبب الأغشية الحيوية إلى عدوى مستمرة تشكل تهديدا لصحة الإنسان3،4،5. لذلك ، من المهم الكشف عن الحركة البكتيرية. يستخدم اختبار الحركة البكتيرية بشكل أساسي لفحص حركة أشكال مختلفة من البكتيريا في الحالة الحية ، والتي يمكن أن تحدد بشكل غير مباشر وجود أو عدم وجود سوط ، وبالتالي ، لها دور مهم في تحديد البكتيريا.
هناك طرق مباشرة وغير مباشرة للكشف عن الحركة البكتيرية6. نظرا لأن البكتيريا ذات السوط تظهر حركتها ، فمن الممكن اكتشاف ما إذا كانت البكتيريا متحركة بشكل غير مباشر عن طريق اكتشاف وجود أو عدم وجود سوط. على سبيل المثال ، من الممكن اكتشاف الحركة بشكل غير مباشر عن طريق المجهر الإلكتروني وتلطيخ السوط للإشارة إلى أن البكتيريا متحركة. من الممكن أيضا اكتشافه بالطرق المباشرة ، مثل طرق إسقاط التعليق والبزل شبه الصلب.
طريقة البزل شبه الصلبة المستخدمة عادة في مختبرات الأحياء الدقيقة الجامعية للكشف عن الحركة البكتيرية تقوم بتلقيح البكتيريا في ثقب في وسط أجار شبه صلب يحتوي على 0.4-0.8٪ أجار ، وفقا لاتجاه نمو البكتيريا. إذا نمت البكتيريا على طول خط البزل لتنتشر حولها ، تظهر آثار نمو تشبه السحابة (تشبه الفرشاة) ، مما يشير إلى وجود سوط ، وبالتالي الحركة. إذا لم تكن هناك آثار لنمو خط البزل ، فإن البكتيريا ليست جلدية ولا متحركة.
ومع ذلك ، فإن هذه الطريقة لها عيوبها: البكتيريا عديمة اللون وشفافة ، ويتأثر النشاط السوطي بالخصائص الفسيولوجية للبكتيريا الحية وعوامل أخرى ، وتركيز أجار والقطر الصغير لأنبوب الاختبار. علاوة على ذلك ، فإن البكتيريا الهوائية مناسبة فقط للنمو على سطح أجار ، مما يؤثر على مراقبة الحركة البكتيرية. ومن ثم ، لتحسين هذه التجربة ، تمت إضافة 2،3،5-ثلاثي فينيل تترازوليوم كلوريد (TTC) (عديم اللون) إلى الوسط لإنشاء طريقة أكثر موثوقية وبديهية لتحديد حركية البكتيريا من طريقة البزل المباشر الحالية باستخدام نازعة الهيدروجين داخل الخلايا لتحفيز تكوين منتج أحمر من TTC7،8،9،10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد وسط شبه صلب
- أجار شبه صلب تقليدي
- تحضير الآجار شبه الصلب التقليدي وفقا لوصفة وسط اختبار حركية البكتيريا باستخدام المكونات الأساسية11. قم بإذابة 10 جم من التربتوز ، و 15 جم من كلوريد الصوديوم ، و 4 جم من أجار في كمية كافية من الماء المقطر ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.2 ± 0.2 ، وشكل الحجم النهائي إلى 1000 مل.
- الأوتوكلاف أجار عند 121 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ، ووزعه في أنابيب اختبار 10 مل كوسط شبه صلب بارتفاع 3 سم.
- أجار شبه صلب تقليدي مع TTC
- بعد تعقيم الوسط شبه الصلب التقليدي ، قم بتبريده إلى 50 درجة مئوية ، وأضف 5 مل من محلول TTC المعقم 1٪ إلى 100 مل من الوسط ، واخلطه ، ووزعه في أنابيب اختبار 10 مل لتشكيل وسط شبه صلب بارتفاع 3 سم.
2. السلالات البكتيرية
ملاحظة: تم عزل ثمانين سلالة من البيئة المائية وتحديدها باستخدام أداة آلية لتحديد البكتيريا (انظر جدول المواد)، بما في ذلك الإشريكية القولونية، والزائفة الزنجارية ( Salmonella spp.)، وضمة النيابة، والكلبسيلة الرئوية، وهيدروفيلا Aeromonas (الجدول 1). تم استخدام المكورات العنقودية الذهبية (انظر جدول المواد) كعنصر تحكم سلبي غير متحرك. تم استخدام الإشريكية القولونية والزائفة الزنجارية والسالمونيلا التيفية (انظر جدول المواد) كسلالات تحكم إيجابية.
- تحديد السلالات البكتيرية الاختبارية لاستخدامها في تحليل الحركة.
- قم بتضمين عناصر تحكم سلبية غير متحركة وسلالات تحكم إيجابية متحركة.
3. مراقبة الحركة البكتيرية المحسنة TTC
- اختر مستعمرات مفردة من بكتيريا الاختبار من ألواح الآجار وقم بتلقيحها في الوسطين شبه الصلبين أعلاه (الخطوتان 1.1.2 و 1.2.1) عن طريق الثقب باستخدام إبر التلقيح.
- استزرع الأنابيب عند 37 درجة مئوية في الحاضنة لمدة 24-48 ساعة لمراقبة النتائج.
- راقب حالة النمو: وصف البكتيريا بأنها غير متحركة (-) إذا كان خط البزل أحمر فقط. قم بتمييز البكتيريا على أنها متحركة (+) إذا انتشر اللون الأحمر قليلا للخارج على طول خط البزل12.
4. تأثير تركيزات الآجار المختلفة على الحركة البكتيرية
- تحضير وسائط شبه صلبة تحتوي على 0.3٪ و 0.5٪ و 0.8٪ أجار وتلقيحها عن طريق ثقب ، كما هو موضح أعلاه. مراقبة النتائج بعد 24-48 ساعة من الحضانة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تمت مقارنة كل من السلالات القياسية والسلالات المعزولة للكشف عن الحركة ، والنتائج موضحة في الجدول 1. بسبب عدم وجود سوط ، نمت المكورات العنقودية الذهبية والكلبسيلة الرئوية فقط على طول الخط الملقح على كل من الوسائط شبه الصلبة التقليدية و TTC. في المقابل ، أظهرت الزائفة الزنجارية والإشريكية القولونية والسالمونيلا التيفية نموا في جميع الاتجاهات حول الخط الملقح بعد الاستزراع لمدة 24 ساعة على وسط TTC شبه الصلب. كان هذا أكثر وضوحا بعد ثقافة 48 ساعة (الشكل 1). على الرغم من أن البكتيريا نمت في جميع الاتجاهات في الوسط شبه الصلب التقليدي ، إلا أنه كان من الصعب تصورها أكثر من وسط TTC بسبب قلة عدد البكتيريا في الجانب الخارجي من الخط الملقح.
الشكل 1: نتائج اختبار الحركة باستخدام وسط TTC شبه الصلب. المكورات العنقودية الذهبية على اليسار ، الإشريكية القولونية على اليمين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| وتر | وسط شبه صلب مع أجار 0.4٪ | وسط شبه صلب مع 0.4٪ أجار و 0.005٪ TTC | |||
| 24 ساعة | 48 ساعة | 24 ساعة | 48 ساعة | ||
| P. الزنجارية ATCC27853 | + | + | + | + | |
| الإشريكية القولونية اتك25922 | + | + | + | + | |
| المكورات التيفية ATCC14028 | + | + | + | + | |
| المكورات العنقودية الذهبية ATCC25923 | - | - | - | - | |
| الإشريكية القولونية (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| السالمونيلا النيابة. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| أ. هيدروفيلا (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| الضمة النيابة. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. الزنجارية (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| ك. الرئوية (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| تشير الأرقام إلى عدد السلالات الإيجابية (+) والبقع السلبية (-). | |||||
الجدول 1: مقارنة حركية البكتيريا.
الشكل 2: ملاحظة نشاط حركة الإشريكية القولونية عند تركيزات مختلفة من الآجار. من اليسار إلى اليمين: 0.3٪ ، 0.5٪ ، 0.8٪ أجار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يوضح الشكل 2 تأثير تركيز الآجار على الحركة البكتيرية. وجدنا أن أعلى حركة لوحظت في وسط شبه صلب محضر بنسبة 0.3٪ أجار. تحول اللون المتوسط في الأنبوب إلى اللون الأحمر بالكامل تقريبا. في المقابل ، انخفضت مساحة الانتشار الأحمر ، واستمر الانتشار مع زيادة تركيز أجار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتأثر اكتشاف الحركة البكتيرية بطريقة الوسط شبه الصلب بالعديد من العوامل13,14. يمكن أن تؤثر ظروف نمو البكتيريا ، مثل الأكسجين (الهوائية على سطح أجار ، غير الهوائية في الجزء السفلي من الأنبوب مع الوسط شبه الصلب) ، ودرجة الحموضة ، ودرجة الحرارة ، على صلاحية السوط البكتيري ، مما قد يؤدي إلى انخفاض الحركة أو حتى فقدان الحركة15. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن تتأثر بعض البكتيريا من نوع المخاط حيث أن حركتها بإنتاج podoconjugates.
تساعد إضافة TTC إلى الوسط شبه الصلب على مراقبة الحركة. يمكن أن تنمو البكتيريا المخمرة ذات القوة المحركة في جميع الاتجاهات على طول خط البزل بعد الحضانة. ومن ثم، يصبح الوسط حول خط البزل أحمر. تحتوي البكتيريا غير المخمرة ذات القوة المحركة على نسبة منخفضة من الأكسجين في الجزء السفلي من الوسط. وبالتالي ، تنمو هذه البكتيريا بشكل سيئ ، بحيث تكون الطبقة العليا فقط من الوسط حمراء. يمكن للبكتيريا التي لا تتمتع بقوة دافعة أن تنمو فقط على خط التلقيح ، ويظهر خط البزل فقط باللون الأحمر.
عند اكتشاف الحركة البكتيرية باستخدام وسط TTC شبه الصلب ، كلما زاد وقت الاستزراع ، كانت النتائج أكثر وضوحا ، خاصة مع تركيزات الآجار المنخفضة. إذا كان من الصعب تفسير النتيجة ، فيجب تمديد وقت الثقافة بشكل مناسب. قد يكون هذا مرتبطا بتركيز أجار الوسط شبه الصلب ، وعدد البكتيريا ، وحركتها16. بالإضافة إلى ذلك ، كشفت هذه الطريقة أن بعض سلالات E. coli و P. aeruginosa لا يمكن أن تنمو حول وسط أجار شبه صلب تقليدي وأظهرت فقط لونا أحمر باهتا على سطح الوسط على وسط أجار شبه صلب TTC. قد يكون هذا بسبب إنتاج كبسولات بواسطة هذه السلالات ، مما يؤثر على حركتها17. تحدث هذه الظاهرة أيضا في النيسرية السحائية18 بسبب كبسولة. في الختام ، فإن الكشف عن الحركة البكتيرية باستخدام وسط شبه صلب كروموجيني يحتوي على TTC يقلل من تأثير العوامل البكتيرية على نتائج الاختبار ويجعل من السهل ملاحظة النتائج بالعين المجردة. ميزة معدل الكشف المرتفع تجعل هذه الطريقة فعالة يمكن أن تحل محل الوسط شبه الصلب التقليدي للكشف عن الحركة البكتيرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذه الدراسة من خلال تطوير البرنامج الأكاديمي ذي الأولوية لمؤسسات التعليم العالي في جيانغسو (PAPD) ومشروع أبحاث إصلاح التدريس بجامعة الصين الصيدلانية (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
