Summary
Ici, nous présentons un protocole pour détecter la motilité bactérienne basée sur une réaction de couleur. Les principaux avantages de cette méthode sont qu’elle est facile à évaluer et plus précise, et ne nécessite pas d’équipement spécialisé.
Abstract
La motilité bactérienne est cruciale pour la pathogénicité bactérienne, la formation de biofilms et la résistance aux médicaments. La motilité bactérienne est cruciale pour l’invasion et/ou la dissémination de nombreuses espèces pathogènes. Par conséquent, il est important de détecter la motilité bactérienne. Les conditions de croissance bactérienne, telles que l’oxygène, le pH et la température, peuvent affecter la croissance bactérienne et l’expression des flagelles bactériens. Cela peut entraîner une réduction de la motilité ou même une perte de motilité, ce qui entraîne une évaluation inexacte de la motilité bactérienne. Sur la base de la réaction de couleur du chlorure de 2,3,5-triphényle tétrazolium (TTC) par les déshydrogénases intracellulaires de bactéries vivantes, le TTC a été ajouté à la gélose semi-solide traditionnelle pour la détection de la motilité bactérienne. Les résultats ont montré que cette méthode de gélose semi-solide TTC pour la détection de la motilité bactérienne est simple, facile à utiliser et n’implique pas de gros instruments coûteux. Les résultats ont également montré que la motilité la plus élevée a été observée en milieu semi-solide préparé avec de la gélose à 0,3%. Par rapport au milieu semi-solide traditionnel, les résultats sont plus faciles à évaluer et plus précis.
Introduction
La motilité bactérienne joue un rôle essentiel dans la pathogénicité bactérienne, la formation de biofilms et la résistance aux médicaments1. La motilité bactérienne est étroitement associée à la pathogénicité et est nécessaire à la colonisation bactérienne lors de l’infection précoce des cellules hôtes2. La formation de biofilm est étroitement liée à la motilité bactérienne, où les bactéries adhèrent à la surface des milieux solides par motilité. La motilité bactérienne a longtemps été considérée comme positivement corrélée à la formation de biofilm. Un degré élevé de résistance bactérienne aux médicaments dû au biofilm peut entraîner des infections persistantes qui constituent une menace pour la santé humaine 3,4,5. Par conséquent, il est important de détecter la motilité bactérienne. Le test de motilité bactérienne est principalement utilisé pour examiner la motilité de différentes formes de bactéries à l’état vivant, ce qui peut déterminer indirectement la présence ou l’absence de flagelles et, par conséquent, joue un rôle important dans l’identification des bactéries.
Il existe des méthodes directes et indirectes pour détecter la motilité bactérienne6. Comme les bactéries avec flagelles montrent la motilité, il est possible de détecter si les bactéries sont mobiles indirectement en détectant la présence ou l’absence de flagelles. Par exemple, il est possible de détecter la motilité indirectement par microscopie électronique et coloration flagellaire pour indiquer que les bactéries sont mobiles. Il est également possible de détecter par des méthodes directes, telles que la chute de suspension et les méthodes de ponction semi-solide.
La méthode de ponction semi-solide couramment utilisée dans les laboratoires de microbiologie de premier cycle pour détecter la motilité bactérienne inocule les bactéries dans la ponction dans le milieu gélose semi-solide contenant 0,4 à 0,8% d’agar, selon la direction de la croissance bactérienne. Si les bactéries se développent le long de la ligne de ponction pour se propager, des traces de croissance en forme de nuage (en forme de brosse) apparaissent, indiquant la présence de flagelles et, par conséquent, la motilité. S’il n’y a pas de traces de croissance de la ligne de ponction, la bactérie n’est ni flagellée ni mobile.
Cependant, cette méthode a ses inconvénients: les bactéries sont incolores et transparentes, l’activité flagellaire est affectée par les caractéristiques physiologiques des bactéries vivantes et d’autres facteurs, ainsi que par la concentration de gélose et le petit diamètre du tube à essai. De plus, les bactéries aérobies ne conviennent qu’à la croissance sur la surface de la gélose, ce qui affecte l’observation de la motilité bactérienne. Par conséquent, pour améliorer cette expérience, du chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) (incolore) a été ajouté au milieu afin d’établir une méthode plus fiable et intuitive de détermination de la motilité bactérienne que la méthode actuelle de ponction directe utilisant des déshydrogénases intracellulaires pour catalyser la formation d’un produit rouge de TTC 7,8,9,10.
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Protocol
1. Préparation du milieu semi-solide
- Gélose semi-solide traditionnelle
- Préparer la gélose semi-solide traditionnelle selon la recette du milieu d’essai de motilité bactérienne en utilisant les ingrédients de base11. Dissoudre 10 g de tryptose, 15 g de NaCl, 4 g de gélose dans suffisamment d’eau distillée, ajuster le pH à 7,2 ± 0,2 et compléter le volume final à 1 000 mL.
- Autoclaver la gélose à 121 °C pendant 20 min et la distribuer dans des tubes à essai de 10 mL en milieu semi-solide de 3 cm de hauteur.
- Gélose semi-solide traditionnelle avec TTC
- Après avoir autoclavé le milieu semi-solide conventionnel, refroidissez-le à 50 °C, ajoutez 5 mL de solution stérile à 1 % de TTC à 100 mL de milieu, mélangez-le et distribuez-le dans des tubes à essai de 10 ml pour former un milieu semi-solide de 3 cm de haut.
2. Souches bactériennes
REMARQUE : Quatre-vingts souches ont été isolées du milieu aquatique et identifiées à l’aide d’un instrument automatisé d’identification des bactéries (voir le tableau des matières), y compris Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Vibrio spp., Klebsiella pneumoniae et Aeromonas hydrophila (tableau 1). Staphylococcus aureus (voir le tableau des matériaux) a été utilisé comme témoin négatif non mobile; Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Salmonella typhimurium (voir le tableau des matières) ont été utilisées comme souches témoins positives.
- Identifier les souches bactériennes à utiliser pour l’analyse de la motilité.
- Inclure les témoins négatifs non mobiles et les souches témoins positives mobiles.
3. Observation de la motilité bactérienne améliorée par le TTC
- Prélever des colonies individuelles de bactéries d’essai dans des boîtes de gélose et les inoculer dans les deux milieux semi-solides ci-dessus (étapes 1.1.2 et 1.2.1) par perforation à l’aide d’aiguilles d’inoculation.
- Culture des tubes à 37 °C dans l’incubateur pendant 24-48 h pour observer les résultats.
- Observez l’état de croissance : caractérisez la bactérie comme non mobile (-) si seule la ligne de ponction est rouge. Caractériser la bactérie comme mobile (+) si la couleur rouge se propage légèrement vers l’extérieur le long de la ligne de ponction12.
4. Effet de différentes concentrations de gélose sur la motilité bactérienne
- Préparer des milieux semi-solides contenant 0,3 %, 0,5 % et 0,8 % de gélose et les inoculer par perforation, comme décrit ci-dessus. Observez les résultats après 24-48 h d’incubation.
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Representative Results
Les souches standard et les souches isolées ont été comparées pour la détection de la motilité, et les résultats sont présentés dans le tableau 1. En raison de l’absence de flagelles, Staphylococcus aureus et Klebsiella pneumoniae ne se sont développés que le long de la ligne inoculée sur des milieux semi-solides traditionnels et TTC. En revanche, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli et Salmonella typhimurium ont montré une croissance dans toutes les directions autour de la lignée inoculée après culture pendant 24 heures sur milieu semi-solide TTC. C’était encore plus évident après une culture de 48 h (Figure 1). Bien que les bactéries se soient développées dans toutes les directions dans le milieu semi-solide traditionnel, il était beaucoup plus difficile à visualiser que dans le milieu TTC en raison du petit nombre de bactéries sur le côté externe de la ligne inoculée.
Figure 1 : Résultats des essais de motilité en milieu semi-solide TTC. Staphylococcus aureus à gauche, Escherichia coli à droite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Filtrer | Milieu semi-solide avec gélose à 0,4 % | Milieu semi-solide avec 0,4 % de gélose et 0,005 % TTC | |||
| 24 h | 48 h | 24 h | 48 h | ||
| P. aeruginosa ATCC27853 | + | + | + | + | |
| E. coli ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S. typhimurium ATCC14028 | + | + | + | + | |
| S. aureus ATCC25923 | - | - | - | - | |
| E. coli (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| Salmonella spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. hydrophila (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| Vibrio spp. (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| P. aeruginosa (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. pneumoniae (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| Les chiffres indiquent le nombre de souches positives (+) et de taches négatives (-). | |||||
Tableau 1 : Comparaison de la motilité bactérienne.
Figure 2 : Observation de l’activité motiltique d’Escherichia coli à différentes concentrations de gélose De gauche à droite : 0,3 %, 0,5 %, gélose à 0,8 %. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’influence de la concentration de gélose sur la motilité bactérienne est illustrée à la figure 2. Nous avons constaté que la motilité la plus élevée a été observée en milieu semi-solide préparé avec de la gélose à 0,3%. La couleur moyenne dans le tube est devenue presque entièrement rouge. En revanche, la zone de diffusion rouge a diminué et la diffusion a été prolongée avec l’augmentation de la concentration de gélose.
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Discussion
La détection de la motilité bactérienne par la méthode en milieu semi-solide est affectée par de nombreux facteurs13,14. Les conditions de croissance bactérienne, telles que l’oxygène (aérobie sur la surface de la gélose, non aérobie au fond du tube avec le milieu semi-solide), le pH et la température, peuvent affecter la viabilité des flagelles bactériens, ce qui peut entraîner une motilité réduite ou même une perte de motilité15. De plus, certaines bactéries de type mucus comme leur motilité peuvent être affectées par la production de podoconjugués.
L’ajout de TTC au milieu semi-solide aide à l’observation de la motilité. Les bactéries fermentatives ayant une force motrice peuvent se développer dans toutes les directions le long de la ligne de ponction après l’incubation. Par conséquent, le milieu autour de la ligne de ponction devient rouge. Les bactéries non fermentatives à force motrice ont une faible teneur en oxygène dans la partie inférieure du milieu. Par conséquent, ces bactéries se développent mal, de sorte que seule la couche supérieure du milieu est rouge. Les bactéries sans force motrice ne peuvent se développer que sur la ligne d’inoculation, et seule la ligne de ponction apparaît rouge.
Lors de la détection de la motilité bactérienne avec un milieu semi-solide TTC, plus le temps de culture est long, plus les résultats sont évidents, en particulier avec des concentrations de gélose plus faibles. Si le résultat est difficile à interpréter, le temps de culture devrait être prolongé de manière appropriée. Ceci peut être lié à la concentration en gélose du milieu semi-solide, au nombre de bactéries et à leur motilité16. De plus, cette méthode a révélé que certaines souches d’E. coli et de P. aeruginosa ne pouvaient pas se développer sur un milieu de gélose semi-solide conventionnel et ne présentaient qu’une légère couleur rouge à la surface du milieu sur milieu de gélose semi-solide TTC. Cela peut être dû à la production de capsules par de telles souches, ce qui affecte leur motilité17. Ce phénomène se produit également chez Neisseria meningitidis18 en raison de sa capsule. En conclusion, la détection de la motilité bactérienne à l’aide d’un milieu semi-solide chromogène contenant du TTC réduit l’influence des facteurs bactériens sur les résultats des tests et rend les résultats plus faciles à observer à l’œil nu. L’avantage d’un taux de détection élevé en fait une méthode efficace qui peut remplacer le milieu semi-solide traditionnel pour détecter la motilité bactérienne.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par le développement de programmes académiques prioritaires des établissements d’enseignement supérieur du Jiangsu (PAPD) et le projet de recherche sur la réforme de l’enseignement de l’Université pharmaceutique de Chine (2019XJYB18).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D.
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria - A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), in Chinese 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , Morton Publishing Company. Colorado. (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W.
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , Detroit. (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
