Summary
यहां, हम एक रंग प्रतिक्रिया के आधार पर जीवाणु गतिशीलता का पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस विधि के मुख्य लाभ यह हैं कि इसका मूल्यांकन करना आसान है और अधिक सटीक है, और विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है।
Abstract
बैक्टीरियल गतिशीलता बैक्टीरिया रोगजनकता, बायोफिल्म गठन और दवा प्रतिरोध के लिए महत्वपूर्ण है। कई रोगजनक प्रजातियों के आक्रमण और / या प्रसार के लिए जीवाणु गतिशीलता महत्वपूर्ण है। इसलिए, जीवाणु गतिशीलता का पता लगाना महत्वपूर्ण है। बैक्टीरियल विकास की स्थिति, जैसे ऑक्सीजन, पीएच और तापमान, बैक्टीरिया के विकास और बैक्टीरियल फ्लैगेला की अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते हैं। इससे गतिशीलता कम हो सकती है या गतिशीलता का नुकसान भी हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप जीवाणु गतिशीलता का गलत मूल्यांकन हो सकता है। जीवित बैक्टीरिया के इंट्रासेल्युलर डिहाइड्रोजनेज द्वारा 2,3,5-ट्राइफेनिल टेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) की रंग प्रतिक्रिया के आधार पर, टीटीसी को बैक्टीरिया की गतिशीलता का पता लगाने के लिए पारंपरिक सेमीसॉलिड एगर में जोड़ा गया था। परिणामों से पता चला है कि जीवाणु गतिशीलता का पता लगाने के लिए यह टीटीसी सेमीसॉलिड एगर विधि सरल, संचालित करने में आसान है, और इसमें बड़े और महंगे उपकरण शामिल नहीं हैं। परिणामों से यह भी पता चला है कि 0.3% एगर के साथ तैयार अर्धठोस माध्यम में उच्चतम गतिशीलता देखी गई थी। पारंपरिक अर्धठोस माध्यम की तुलना में, परिणाम मूल्यांकन करना आसान है और अधिक सटीक है।
Introduction
बैक्टीरियल गतिशीलता जीवाणु रोगजनकता, बायोफिल्म गठन और दवा प्रतिरोध 1 में महत्वपूर्ण भूमिकानिभाती है। बैक्टीरियल गतिशीलता रोगजनकता के साथ निकटता से जुड़ी हुई है और मेजबान कोशिकाओं के शुरुआती संक्रमण के दौरानजीवाणु उपनिवेशीकरण के लिए आवश्यक है। बायोफिल्म गठन जीवाणु गतिशीलता से निकटता से संबंधित है, जहां बैक्टीरिया गतिशीलता के माध्यम से ठोस मीडिया की सतह का पालन करते हैं। बैक्टीरियल गतिशीलता को लंबे समय से बायोफिल्म गठन के साथ सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध माना जाता है। बायोफिल्म के कारण जीवाणु दवा प्रतिरोध की एक उच्च डिग्री लगातार संक्रमण का कारण बन सकती है जो मानव स्वास्थ्य के लिए खतरा है 3,4,5. इसलिए, जीवाणु गतिशीलता का पता लगाना महत्वपूर्ण है। बैक्टीरियल गतिशीलता परीक्षण मुख्य रूप से जीवित अवस्था में बैक्टीरिया के विभिन्न रूपों की गतिशीलता की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, जो अप्रत्यक्ष रूप से फ्लैगेला की उपस्थिति या अनुपस्थिति को निर्धारित कर सकता है और इस प्रकार, बैक्टीरिया की पहचान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।
जीवाणु गतिशीलता का पता लगाने के लिए प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष तरीके हैं। चूंकि फ्लैगेला वाले बैक्टीरिया गतिशीलता दिखाते हैं, इसलिए फ्लैगेला की उपस्थिति या अनुपस्थिति का पता लगाकर यह पता लगाना संभव है कि बैक्टीरिया अप्रत्यक्ष रूप से मोटिव हैं या नहीं। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और फ्लैगेलर स्टेनिंग द्वारा अप्रत्यक्ष रूप से गतिशीलता का पता लगाना संभव है ताकि यह इंगित किया जा सके कि बैक्टीरिया मोटिव हैं। प्रत्यक्ष तरीकों से पता लगाना भी संभव है, जैसे निलंबन ड्रॉप और सेमीसॉलिड पंचर विधियां।
बैक्टीरियल गतिशीलता का पता लगाने के लिए आमतौर पर स्नातक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली सेमीसॉलिड पंचर विधि बैक्टीरिया के विकास की दिशा के अनुसार 0.4-0.8% एगर युक्त सेमीसॉलिड एगर माध्यम में बैक्टीरिया को पंचर में इंजेक्ट करती है। यदि बैक्टीरिया पंचर रेखा के साथ चारों ओर फैलने के लिए बढ़ते हैं, तो बादल जैसे (ब्रश जैसे) विकास के निशान दिखाई देते हैं, जो फ्लैगेला की उपस्थिति और इसलिए, गतिशीलता का संकेत देते हैं। यदि पंचर-लाइन विकास के निशान नहीं हैं, तो जीवाणु न तो फ्लैगेलेटेड है और न ही मोटिव है।
हालांकि, इस विधि की अपनी कमियां हैं: बैक्टीरिया रंगहीन और पारदर्शी होते हैं, फ्लैगलर गतिविधि जीवित बैक्टीरिया और अन्य कारकों की शारीरिक विशेषताओं और आगर की एकाग्रता और टेस्ट ट्यूब के छोटे व्यास से प्रभावित होती है। इसके अलावा, एरोबिक बैक्टीरिया केवल आगर की सतह पर विकास के लिए उपयुक्त हैं, जो बैक्टीरिया की गतिशीलता के अवलोकन को प्रभावित करते हैं। इसलिए, इस प्रयोग को बेहतर बनाने के लिए, टीटीसी 7,8,9,10 के लाल उत्पाद के गठन को उत्प्रेरित करने के लिए इंट्रासेल्युलर डिहाइड्रोजनेज का उपयोग करके वर्तमान प्रत्यक्ष-पंचर विधि की तुलना में जीवाणु गतिशीलता निर्धारित करने की अधिक विश्वसनीय और सहज विधि स्थापित करने के लिए माध्यम में 2,3,5-ट्राइफेनील्टेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) (रंगहीन) जोड़ा गया था।
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Protocol
1. अर्धठोस माध्यम की तैयारी
- पारंपरिक अर्धठोस आगार
- मूल सामग्री11 का उपयोग करके बैक्टीरियल गतिशीलता परीक्षण माध्यम नुस्खा के अनुसार पारंपरिक सेमीसॉलिड आगर तैयार करें। पर्याप्त आसुत जल में 10 ग्राम ट्रिप्टोज, 15 ग्राम एनएसीएल, 4 ग्राम आगर घोलें, पीएच को 7.2 ± 0.2 तक समायोजित करें, और अंतिम मात्रा को 1,000 एमएल तक बनाएं।
- 20 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आगर को ऑटोक्लेव करें, और इसे 3 सेमी उच्च अर्धठोस माध्यम के रूप में 10 एमएल टेस्ट ट्यूबों में वितरित करें।
- टीटीसी के साथ पारंपरिक अर्धठोस आगार
- पारंपरिक अर्धठोस माध्यम को ऑटोक्लेव करने के बाद, इसे 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें, 100 एमएल माध्यम में बाँझ 1% टीटीसी घोल के 5 एमएल जोड़ें, मिलाएं, और इसे 3 सेमी-उच्च अर्धठोस माध्यम बनाने के लिए 10 एमएल टेस्ट ट्यूबों में वितरित करें।
2. बैक्टीरियल उपभेदों
नोट: अस्सी उपभेदों को जलीय वातावरण से अलग किया गया था और एक स्वचालित बैक्टीरिया पहचान उपकरण ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके पहचाना गया था, जिसमें एस्चेरिचिया कोलाई, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, साल्मोनेला एसपीपी, विब्रियो एसपीपी, क्लेबसिएला निमोनिया और एरोमोनास हाइड्रोफिला (तालिका 1) शामिल हैं। स्टेफिलोकोकस ऑरियस ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग नकारात्मक नॉनमोटिल नियंत्रण के रूप में किया गया था; एस्चेरिचिया कोलाई, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, और साल्मोनेला टाइफिमुरियम ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण उपभेदों के रूप में किया गया था।
- गतिशीलता विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले परीक्षण जीवाणु उपभेदों की पहचान करें।
- नकारात्मक नॉनमोटिल नियंत्रण और मोटिव पॉजिटिव नियंत्रण उपभेदों को शामिल करें।
3. टीटीसी-एन्हांस्ड बैक्टीरियल गतिशीलता अवलोकन
- आगर प्लेटों से परीक्षण बैक्टीरिया की एकल कॉलोनियों को चुनें और उन्हें उपरोक्त दो अर्धठोस मीडिया (चरण 1.1.2 और 1.2.1) में टीका लगाकर सुइयों का उपयोग करके पंचर करें।
- परिणामों का निरीक्षण करने के लिए 24-48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को कल्चर करें।
- विकास की स्थिति का निरीक्षण करें: बैक्टीरिया को नॉनमोटिल (-) के रूप में चिह्नित करें यदि केवल पंचर रेखा लाल है। बैक्टीरिया को मोटिव (+) के रूप में चिह्नित करें यदि लाल रंग पंचर रेखा 12 के साथ हल्के से बाहर की ओरफैलता है।
4. जीवाणु गतिशीलता पर विभिन्न आगर सांद्रता का प्रभाव
- 0.3%, 0.5%, और 0.8% एगर युक्त सेमीसॉलिड मीडिया तैयार करें और उन्हें पंचर द्वारा टीका लगाएं, जैसा कि ऊपर वर्णित है। इनक्यूबेशन के 24-48 घंटे के बाद परिणामों का अवलोकन करें।
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Representative Results
गतिशीलता का पता लगाने के लिए मानक उपभेदों और पृथक उपभेदों दोनों की तुलना की गई थी, और परिणाम तालिका 1 में दिखाए गए हैं। फ्लैगेला की अनुपस्थिति के कारण, स्टेफिलोकोकस ऑरियस और क्लेबसिएला निमोनिया केवल पारंपरिक और टीटीसी अर्धठोस मीडिया दोनों पर टीका रेखा के साथ बढ़े। इसके विपरीत, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा, एस्चेरिचिया कोलाई और साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम ने टीटीसी सेमीसॉलिड माध्यम पर 24 घंटे तक खेती करने के बाद टीका रेखा के आसपास सभी दिशाओं में वृद्धि दिखाई। यह 48 घंटे की संस्कृति (चित्रा 1) के बाद और भी स्पष्ट था। यद्यपि बैक्टीरिया पारंपरिक अर्धठोस माध्यम में सभी दिशाओं में बढ़े, लेकिन टीका लाइन के बाहरी हिस्से में बैक्टीरिया की छोटी संख्या के कारण टीटीसी माध्यम की तुलना में कल्पना करना बहुत अधिक कठिन था।
चित्रा 1: टीटीसी सेमीसॉलिड माध्यम का उपयोग करके गतिशीलता परीक्षण के परिणाम। बाईं ओर स्टेफिलोकोकस ऑरियस, दाईं ओर एस्चेरिचिया कोलाई। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| मोच | 0.4% एगर के साथ अर्धठोस माध्यम | 0.4% आगर और 0.005% टीटीसी के साथ अर्धठोस माध्यम | |||
| 24 घंटे | 48 घंटे | 24 घंटे | 48 घंटे | ||
| पी. एरुगिनोसा ATCC27853 | + | + | + | + | |
| ई कोलाई ATCC25922 | + | + | + | + | |
| एस. टाइपिमुरियम ATCC14028 | + | + | + | + | |
| एस ऑरियस ATCC25923 | - | - | - | - | |
| ई कोलाई (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| साल्मोनेला एसपीपी (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| हाइड्रोफिला (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| विब्रियो एसपीपी (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| एरुगिनोसा (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| के. निमोनिया (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| संख्याएं सकारात्मक उपभेदों (+) और नकारात्मक दाग (-) की संख्या को इंगित करती हैं। | |||||
तालिका 1: जीवाणु गतिशीलता की तुलना।
चित्रा 2: विभिन्न एगर सांद्रता पर एस्चेरिचिया कोलाई गतिशीलता गतिविधि का अवलोकन। बाएं से दाएं: 0.3%, 0.5%, 0.8% एगर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
जीवाणु गतिशीलता पर आगर एकाग्रता का प्रभाव चित्र 2 में दिखाया गया है। हमने पाया कि 0.3% एगर के साथ तैयार अर्धठोस माध्यम में उच्चतम गतिशीलता देखी गई थी। ट्यूब में मध्यम रंग लगभग पूरी तरह से लाल हो गया। इसके विपरीत, लाल प्रसार का क्षेत्र कम हो गया, और बढ़ती आगर एकाग्रता के साथ प्रसार लंबे समय तक चला।
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Discussion
अर्धठोस माध्यम विधि द्वारा जीवाणु गतिशीलता का पता लगाना कईकारकों से प्रभावित होता है 13,14. बैक्टीरियल विकास की स्थिति, जैसे ऑक्सीजन (आगर की सतह पर एरोबिक, सेमीसॉलिड माध्यम के साथ ट्यूब के तल पर नॉनएरोबिक), पीएच, और तापमान, बैक्टीरियल फ्लैगेला की व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं, जिससे गतिशीलता कम हो सकती है या गतिशीलता का नुकसान भी हो सकताहै। इसके अलावा, कुछ बलगम-प्रकार के बैक्टीरिया अपनी गतिशीलता के रूप में पोडोकोन्जुगेट के उत्पादन से प्रभावित हो सकते हैं।
अर्धठोस माध्यम में टीटीसी को जोड़ने से गतिशीलता के अवलोकन में मदद मिलती है। प्रेरक शक्ति के साथ किण्वित बैक्टीरिया इनक्यूबेशन के बाद पंचर रेखा के साथ सभी दिशाओं में बढ़ सकते हैं। इसलिए, पंचर रेखा के चारों ओर का माध्यम लाल हो जाता है। मोटिव पावर वाले नॉनफर्मेंटेटिव बैक्टीरिया में माध्यम के निचले हिस्से में ऑक्सीजन की मात्रा कम होती है। इसलिए, ये बैक्टीरिया खराब रूप से बढ़ते हैं, जिससे माध्यम की केवल ऊपरी परत लाल होती है। मोटिव पावर के बिना बैक्टीरिया केवल टीकाकरण लाइन पर बढ़ सकते हैं, और केवल पंचर लाइन लाल दिखाई देती है।
टीटीसी-सेमीसॉलिड माध्यम के साथ जीवाणु गतिशीलता का पता लगाते समय, संस्कृति का समय जितना लंबा होता है, परिणाम उतने ही स्पष्ट होते हैं, खासकर कम एगर सांद्रता के साथ। यदि परिणाम की व्याख्या करना मुश्किल है, तो संस्कृति के समय को उचित रूप से बढ़ाया जाना चाहिए। यह अर्धठोस माध्यम की आगर एकाग्रता, बैक्टीरिया की संख्या और उनकी गतिशीलता16 से संबंधित हो सकता है। इसके अलावा, इस विधि से पता चला कि ई कोलाई और पी एरुगिनोसा के कुछ उपभेद पारंपरिक अर्धठोसल एगर माध्यम पर नहीं बढ़ सकते थे और टीटीसी सेमीसॉलिड एगर माध्यम पर माध्यम की सतह पर केवल एक धुंधला लाल रंग दिखाते थे। यह ऐसे उपभेदों द्वारा कैप्सूल के उत्पादन के कारण हो सकता है, जो उनकी गतिशीलता को प्रभावित करताहै। यह घटना नीसेरिया मेनिन्जाइटिस18 में भी इसके कैप्सूल के कारण होती है। निष्कर्ष में, टीटीसी युक्त क्रोमोजेनिक सेमीसॉलिड माध्यम का उपयोग करके जीवाणु गतिशीलता का पता लगाने से परीक्षण के परिणामों पर जीवाणु कारकों का प्रभाव कम हो जाता है और नग्न आंखों से परिणामों का निरीक्षण करना आसान हो जाता है। एक उच्च पहचान दर का लाभ इसे एक प्रभावी तरीका बनाता है जो बैक्टीरिया की गतिशीलता का पता लगाने के लिए पारंपरिक अर्धठोस माध्यम को बदल सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।
Acknowledgments
इस अध्ययन को जियांग्सू उच्च शिक्षा संस्थानों (पीएपीडी) के प्राथमिकता शैक्षणिक कार्यक्रम विकास और चीन फार्मास्युटिकल यूनिवर्सिटी (2019एक्सजेवाईबी 18) के शिक्षण सुधार अनुसंधान परियोजना द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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