Summary
ここでは、呈色反応に基づいて細菌の運動性を検出するためのプロトコルを提示します。この方法の主な利点は、評価が容易で精度が高く、特殊な機器を必要としないことです。
Abstract
細菌の運動性は、細菌の病原性、バイオフィルム形成、および薬剤耐性にとって非常に重要です。細菌の運動性は、多くの病原性種の侵入および/または拡散にとって非常に重要です。したがって、細菌の運動性を検出することが重要です。酸素、pH、温度などの細菌の増殖条件は、細菌の増殖と細菌べん毛の発現に影響を与える可能性があります。これは、運動性の低下または運動性の喪失につながり、細菌の運動性の不正確な評価をもたらす可能性があります。生細菌の細胞内デヒドロゲナーゼによる2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)の呈色反応に基づいて、TTCを細菌の運動性検出のために従来の半固体寒天に添加しました。その結果、このTTC半固体寒天法は、細菌の運動性を検出するための簡便で操作が容易であり、大型で高価な機器を必要としないことが示されました。結果はまた、0.3%寒天で調製された半固体培地で最も高い運動が観察されることを示した。従来の半固体培地と比較して、結果は評価が容易で正確です。
Introduction
細菌の運動性は、細菌の病原性、バイオフィルム形成、および薬剤耐性において重要な役割を果たします1。細菌の運動性は病原性と密接に関連しており、宿主細胞の早期感染中の細菌のコロニー形成に必要です2。バイオフィルムの形成は細菌の運動性と密接に関連しており、細菌は運動性を介して固体培地の表面に付着します。細菌の運動性は、バイオフィルム形成と正の相関があると長い間考えられてきました。バイオフィルムによる高度の細菌薬剤耐性は、人間の健康を脅かす持続感染につながる可能性があります3,4,5。したがって、細菌の運動性を検出することが重要です。細菌の運動性試験は、主に生きている状態にあるさまざまな形態の細菌の運動性を調べるために使用され、べん毛の有無を間接的に決定できるため、細菌の同定に重要な役割を果たします。
細菌の運動性を検出するための直接的および間接的な方法があります6。べん毛を有する細菌は運動性を示すため、べん毛の有無を検出することで間接的に細菌が運動性であるかどうかを検出することができる。例えば、細菌が運動性であることを示すために電子顕微鏡観察およびべん毛染色によって間接的に運動性を検出することができる。また、懸濁液落下法や半固体穿刺法などの直接法による検出も可能です。
細菌の運動性を検出するために学部微生物学研究室で一般的に使用される半固体穿刺法は、細菌の増殖の方向に応じて、0.4〜0.8%寒天を含む半固体寒天培地の穿刺に細菌を接種します。細菌が穿刺線に沿って増殖して周囲に広がると、雲のような(ブラシのような)成長痕跡が現れ、べん毛の存在、したがって運動性を示します。穿刺線の成長痕跡がない場合、細菌は鞭毛も運動性もありません。
しかしながら、この方法はその欠点を有する:細菌は無色透明であり、べん毛活性は生きている細菌の生理学的特性および他の要因、ならびに寒天の濃度および試験管の小径によって影響を受ける。さらに、好気性細菌は寒天表面での増殖にのみ適しており、細菌の運動性の観察に影響を与えます。したがって、この実験を改善するために、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド(TTC)(無色)を培地に添加して、TTC 7,8,9,10の赤色生成物の形成を触媒する細胞内デヒドロゲナーゼを使用する現在の直接穿刺法よりも、細菌の運動性を決定するより信頼性が高く直感的な方法を確立しました。
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Protocol
1.半固体培地の調製
- 従来の半固体寒天
- 基本成分11を使用して、細菌運動性試験培地レシピに従って伝統的な半固体寒天を調製する。トリプトース10 g、NaCl15 g、寒天4 gを十分な蒸留水に溶解し、pHを7.2±0.2に調整し、最終容量を1,000 mLにします。
- 寒天を121°Cで20分間オートクレーブし、高さ3cmの半固体培地として10mLの試験管に分注します。
- TTCを含む従来の半固体寒天
- 従来の半固体培地をオートクレーブした後、50°Cに冷却し、100mLの培地に5mLの滅菌1%TTC溶液を加えて混合し、10mLの試験管に分注して高さ3cmの半固体培地を形成します。
2.細菌株
注:水生環境から80株を分離し、大腸菌、緑膿菌、サルモネラ属菌、ビブリオ属菌、肺炎桿菌、およびアエロモナス親水性菌を含む自動細菌識別装置(資料表を参照)を使用して同定しました(表1)。黄色ブドウ球菌(材料の表を参照)は、負の非運動性対照として使用されました。大腸菌、緑膿菌、およびネズミチフス菌(材料表参照)をポジティブコントロール株として使用しました。
- 運動性分析に使用する試験細菌株を特定します。
- 負の非運動性対照および運動性陽性対照株を含める。
3. TTC増強細菌運動性観察
- 寒天プレートから被験菌の単一コロニーを選び、接種針を用いた穿刺により、上記の2つの半固体培地(ステップ1.1.2および1.2.1)に接種します。
- チューブをインキュベーター内で37°Cで24〜48時間培養し、結果を観察した。
- 成長状態を観察する:穿刺線だけが赤の場合は、細菌を非運動性(-)として特徴付けます。赤色が穿刺線12に沿ってわずかに外側に広がる場合、細菌を運動性(+)として特徴付ける。
4. 寒天濃度の違いが細菌の運動に及ぼす影響
- 0.3%、0.5%、0.8%の寒天を含む半固体培地を調製し、上記のように穿刺して接種する。インキュベーションの24-48時間後に結果を観察してください。
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Representative Results
運動性検出のために標準株と単離株の両方を比較し、結果を表1に示した。べん毛がないため、黄色ブドウ球菌と肺炎桿菌は、従来の培地とTTC半固体培地の両方で接種された線に沿ってのみ成長しました。一方,緑膿菌,大腸菌,ネズミチフス菌はTTC半固体培地で24時間培養した後,接種ライン付近で全方向に増殖を示した。これは、48時間培養後にさらに明らかになりました(図1)。従来の半固体培地では細菌が四方八方に増殖したが、接種ラインの外側の細菌数が少ないため、TTC培地よりも可視化がはるかに困難であった。
図1:TTC半固体培地を用いた運動性試験結果。 左側が黄色ブドウ球菌、右側が大腸菌。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 濾す | 0.4%寒天を含む半固体培地 | 0.4%寒天および0.005%TTCを含む半固体培地 | |||
| 24時間 | 48時間 | 24時間 | 48時間 | ||
| 緑膿菌 ATCC27853 | + | + | + | + | |
| 大腸菌 ATCC25922 | + | + | + | + | |
| S.チフィムリウム ATCC14028 | + | + | + | + | |
| 黄色ブドウ球菌 ATCC25923 | - | - | - | - | |
| 大腸菌 (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| サルモネラ属菌 (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A.親水性 (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| ビブリオ 属 (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| 緑膿菌 (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| 肺炎桿菌 (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| 数字は、陽性の菌株(+)と負の染色(-)の数を示します。 | |||||
表1:細菌の運動性の比較。
図2:異なる寒天濃度での 大腸菌 の運動活性の観察。 左から右へ:0.3%、0.5%、0.8%寒天。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
細菌の運動性に対する寒天濃度の影響を 図2に示します。我々は、0.3%寒天で調製した半固体培地で最も高い運動が観察されることを見出した。チューブ内のミディアムカラーはほぼ完全に赤に変わりました。一方,赤色拡散面積は減少し,寒天濃度の増加とともに拡散は長引いた。
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Discussion
半固体培地法による細菌の運動性の検出は、多くの要因の影響を受けます13,14。酸素(寒天表面での好気性、半固体培地を含むチューブの底部での非好気性)、pH、温度などの細菌増殖条件は、細菌のべん毛の生存率に影響を与える可能性があり、運動性の低下または運動性の喪失につながる可能性があります15。さらに、それらの運動性としてのいくつかの粘液型細菌は、ポドコンジュゲートの産生によって影響を受ける可能性がある。
半固体培地へのTTCの添加は、運動性の観察に役立つ。原動力を持つ発酵細菌は、インキュベーション後に穿刺線に沿ってあらゆる方向に成長する可能性があります。したがって、穿刺線の周りの媒体は赤くなります。原動力を有する非発酵性細菌は、培地下部の酸素含有量が低い。したがって、これらの細菌は増殖が乏しいため、培地の上層のみが赤くなります。原動力のない細菌は接種ライン上でしか増殖できず、穿刺ラインのみが赤く見えます。
TTC半固体培地で細菌の運動性を検出する場合、培養時間が長いほど、特に寒天濃度が低い場合の結果はより明白になります。結果の解釈が困難な場合は、培養時間を適切に延長する必要があります。これは、半固体培地の寒天濃度、菌数、およびそれらの運動性16に関係している可能性があります。また、この方法では、大腸 菌 や緑 膿 菌の一部の菌株は、従来の半固体寒天培地では生育できず、培地表面にかすかな赤色しか見られないことが明らかになりました。これは、そのような株によるカプセルの産生による可能性があり、それはそれらの運動性に影響を及ぼす17。この現象は、そのカプセルのために 髄膜炎菌18 でも発生します。結論として、TTCを含む発色半固体培地を用いた細菌の運動性の検出は、試験結果に対する細菌因子の影響を低減し、肉眼で結果を観察しやすくする。高い検出率の利点により、これは細菌の運動性を検出するための従来の半固体培地を置き換えることができる効果的な方法になります。
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Disclosures
著者は開示する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
この研究は、江蘇省高等教育機関の優先学術プログラム開発(PAPD)および中国薬科大学の教育改革研究プロジェクト(2019XJYB18)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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