Summary
여기에서는 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성을 감지하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 정확하며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.
Abstract
박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 매우 중요합니다. 박테리아 운동성은 많은 병원성 종의 침입 및/또는 보급에 매우 중요합니다. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 산소, pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 성장과 박테리아 편모의 발현에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 운동성을 감소시키거나 심지어 운동성을 상실하여 박테리아 운동성에 대한 부정확한 평가를 초래할 수 있습니다. 살아있는 박테리아의 세포 내 탈수소효소에 의한 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)의 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성 검출을 위해 전통적인 반고체 한천에 TTC를 첨가했습니다. 그 결과 박테리아 운동성 검출을 위한 이 TTC 반고체 한천 방법이 간단하고 작동하기 쉬우며 크고 값비싼 기구가 필요하지 않다는 것을 보여주었습니다. 그 결과, 0.3% 한천으로 제조된 반고체 배지에서 가장 높은 운동성이 관찰되는 것으로 나타났다. 기존의 반고체 매체와 비교하여 결과를 평가하기 쉽고 정확합니다.
Introduction
박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 중요한 역할을 합니다1. 박테리아 운동성은 병원성과 밀접한 관련이 있으며, 숙주 세포의 초기 감염 동안 박테리아 집락화에 필요하다2. 생물막 형성은 박테리아 운동성과 밀접한 관련이 있으며, 박테리아는 운동성을 통해 고체 배지의 표면에 부착됩니다. 박테리아의 운동성은 오랫동안 생물막 형성과 양의 상관관계가 있는 것으로 여겨져 왔습니다. 생물막으로 인한 높은 수준의 박테리아 약물 내성은 인체 건강에 위협이되는 지속적인 감염을 유발할 수 있습니다 3,4,5. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 박테리아 운동성 검사는 주로 살아있는 상태에서 다양한 형태의 박테리아의 운동성을 검사하는 데 사용되며, 이는 편모의 유무를 간접적으로 결정할 수 있으므로 박테리아 식별에 중요한 역할을 합니다.
박테리아의 운동성을 감지하는 직간접적인 방법이 있다6. 편모를 가진 박테리아는 운동성을 나타내기 때문에 편모의 유무를 감지하여 박테리아가 운동성인지 여부를 간접적으로 검출할 수 있습니다. 예를 들어, 전자 현미경 및 편모 염색에 의해 간접적으로 운동성을 감지하여 박테리아가 운동성이 있음을 나타낼 수 있습니다. 서스펜션 드롭 및 반고체 펑크 방법과 같은 직접적인 방법으로 감지하는 것도 가능합니다.
세균 운동성을 감지하기 위해 학부 미생물학 실험실에서 일반적으로 사용되는 반고체 천자 방법은 세균 성장 방향에 따라 0.4-0.8% 한천을 함유한 반고체 한천 배지에 박테리아를 천자 내로 접종합니다. 박테리아가 펑크 라인을 따라 자라서 주변으로 퍼지면 구름 모양 (브러시 같은) 성장 흔적이 나타나 편모의 존재와 운동성을 나타냅니다. 펑크 라인 성장 흔적이 없으면 박테리아는 편모도 운동성도 없습니다.
그러나이 방법은 박테리아가 무색이고 투명하며 편모 활성은 살아있는 박테리아 및 기타 요인의 생리적 특성과 한천의 농도 및 시험관의 작은 직경에 의해 영향을받는 단점이 있습니다. 또한, 호기성 박테리아는 한천 표면에서의 성장에만 적합하여 박테리아 운동성 관찰에 영향을 미칩니다. 따라서이 실험을 개선하기 위해 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) (무색)를 배지에 첨가하여 TTC 7,8,9,10의 적색 생성물 형성을 촉매하기 위해 세포 내 탈수소 효소를 사용하는 현재의 직접 천자 방법보다 박테리아 운동성을 결정하는 더 신뢰할 수 있고 직관적 인 방법을 확립했습니다.
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Protocol
1. 반고체 배지의 제조
- 전통적인 반고체 한천
- 기본 성분11을 사용하여 박테리아 운동성 시험 배지 레시피에 따라 전통적인 반고체 한천을 준비한다. 충분한 증류수에 트립토오스 10g, NaCl 15g, 한천 4g을 녹이고 pH를 7.2 ± 0.2로 조정하고 최종 부피를 1,000mL로 구성합니다.
- 한천을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브하고 3cm 높이의 반고체 배지로 10mL 시험관에 분주합니다.
- TTC를 사용한 전통적인 반고체 한천
- 종래의 반고체 배지를 오토클레이빙한 후 50°C로 냉각하고 100mL의 배지에 멸균된 1% TTC 용액 5mL를 넣고 혼합한 후 10mL 시험관에 분주하여 3cm 높이의 반고체 배지를 형성합니다.
2. 박테리아 균주
참고: 대장균, 녹농균, 살모넬라종, 비브리오종, 폐렴간균 및 에어로모나스 하이드로필라를 포함한 80개의 균주를 수생 환경에서 분리하고 자동 박테리아 식별 기기(재료 표 참조)를 사용하여 식별했습니다(표 1). 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(재료 표 참조)은 음성 비운동성 대조군으로 사용되었습니다. 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)(재료 표 참조)을 양성 대조군 균주로 사용했습니다.
- 운동성 분석에 사용할 테스트 박테리아 균주를 식별합니다.
- 음성 비운동성 대조군 및 운동성 양성 대조군 균주를 포함합니다.
3. TTC 강화 박테리아 운동성 관찰
- 한천 플레이트에서 테스트 박테리아의 단일 콜로니를 선택하고 접종 바늘을 사용하여 구멍을 뚫어 위의 두 반고체 배지(단계 1.1.2 및 1.2.1)에 접종합니다.
- 튜브를 37°C에서 24-48시간 동안 배양하여 결과를 관찰하였다.
- 성장 상태 관찰: 펑크 라인만 빨간색인 경우 박테리아를 운동성이 없는(-) 특성화합니다. 붉은 색이 천공선12를 따라 바깥쪽으로 가볍게 퍼지면 박테리아를 운동성(+)으로 특성화합니다.
4. 다양한 한천 농도가 박테리아 운동성에 미치는 영향
- 0.3%, 0.5%, 0.8% 한천을 함유하는 반고체 배지를 준비하고, 상기와 같이 천자에 의해 접종한다. 배양 24-48 시간 후에 결과를 관찰하십시오.
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Representative Results
운동성 검출을 위해 표준 균주와 분리된 균주 모두 비교하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 편모가 없기 때문에 황색포도상구균과 폐렴간균은 전통적인 배지와 TTC 반고체 배지 모두에서 접종된 라인을 따라서만 성장했습니다. 대조적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)은 TTC 반고체 배지 상에서 24시간 동안 배양한 후 접종된 라인 주위의 모든 방향에서 성장을 보였다. 이는 48시간 배양 후에 더욱 분명해졌습니다(그림 1). 박테리아는 전통적인 반고체 배지에서 모든 방향으로 성장했지만 접종 라인의 바깥쪽에 박테리아 수가 적기 때문에 TTC 배지보다 시각화하기가 훨씬 더 어려웠습니다.
그림 1: TTC 반고체 배지를 사용한 운동성 테스트 결과. 왼쪽은 황색포도상구균, 오른쪽은 대장균입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 거르다 | 0.4% 한천을 함유한 반고체 배지 | 0.4% 한천 및 0.005% TTC를 갖는 반고체 배지 | |||
| 24 시간 | 48시간 | 24 시간 | 48시간 | ||
| 녹농균(P. aeruginosa) ATCC27853 시리즈 | + | + | + | + | |
| 대장균 ATCC25922 시리즈 | + | + | + | + | |
| S. 티피 뮤리움 ATCC14028 시리즈 | + | + | + | + | |
| S. 아우레우스 ATCC25923 시리즈 | - | - | - | - | |
| 대장균 (15) | 12 | 14 | 13 | 14 | |
| 살모넬라 종 (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| A. 친수성 (20) | 18 | 20 | 20 | 20 | |
| 비브리오 종 (8) | 7 | 8 | 8 | 8 | |
| 녹농균 (24) | 18 | 20 | 22 | 23 | |
| K. 폐렴 (5) | -5 | -5 | -5 | -5 | |
| 숫자는 양성 균주(+)와 음성 얼룩(-)의 수를 나타냅니다. | |||||
표 1: 박테리아 운동성 비교.
그림 2: 다양한 한천 농도에서 대장균 운동성 활성 관찰. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 0.3 %, 0.5 %, 0.8 % 한천. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
박테리아 운동성에 대한 한천 농도의 영향은 그림 2에 나와 있습니다. 우리는 0.3% 한천으로 제조된 반고체 배지에서 가장 높은 운동성이 관찰되었음을 발견했습니다. 튜브의 중간 색상은 거의 완전히 빨간색으로 변했습니다. 대조적으로, 적색 확산 면적은 감소하고, 한천 농도가 증가함에 따라 확산이 연장되었다.
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Discussion
반고체 배지 방법에 의한 박테리아 운동성의 검출은 많은 요인에 의해 영향을 받는다13,14. 산소(한천 표면의 호기성, 반고체 배지가 있는 튜브 바닥의 비호기성), pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 편모의 생존력에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 운동성 감소 또는 운동성 상실로 이어질 수 있다15. 또한, 일부 점액형 박테리아는 이들의 운동성이 podoconjugates의 생성에 의해 영향을 받을 수 있다.
반고체 배지에 TTC를 첨가하면 운동성 관찰에 도움이 됩니다. 원동력을 가진 발효 박테리아는 배양 후 펑크 라인을 따라 모든 방향으로 자랄 수 있습니다. 따라서 펑크 라인 주변의 매체가 빨간색으로 변합니다. 원동력을 가진 비발효성 박테리아는 배지 하부의 산소 함량이 낮습니다. 따라서 이러한 박테리아는 잘 자라지 않아 배지의 상층만 빨간색입니다. 원동력이 없는 세균은 접종선에서만 자랄 수 있고, 천자선만 빨갛게 보입니다.
TTC-반고체 배지로 박테리아 운동성을 검출할 때 배양 시간이 길수록 특히 한천 농도가 낮을수록 결과가 더 명확해집니다. 결과를 해석하기 어려운 경우 배양 시간을 적절하게 연장해야 합니다. 이것은 반고체 배지의 한천 농도, 박테리아의 수 및 운동성과 관련이 있을 수 있다16. 또한, 이 방법은 대장 균과 녹농균의 일부 균 주가 기존의 반고체 한천 배지에서 자랄 수 없었고 TTC 반고체 한천 배지에서 배지 표면에 희미한 붉은 색만 나타났음을 밝혀냈습니다. 이것은 운동성에 영향을 미치는 그러한 균주에 의한 캡슐의 생산 때문일 수 있습니다17. 이 현상은 캡슐 때문에 Neisseria meningitidis18 에서도 발생합니다. 결론적으로, TTC를 함유한 발색 반고체 배지를 이용한 박테리아 운동성 검출은 박테리아 요인이 검사 결과에 미치는 영향을 줄이고 결과를 육안으로 더 쉽게 관찰할 수 있도록 합니다. 높은 검출률의 장점은 박테리아 운동성을 검출하기 위한 기존의 반고체 배지를 대체할 수 있는 효과적인 방법입니다.
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Disclosures
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발(PAPD) 및 중국 약학 대학의 교육 개혁 연구 프로젝트(2019XJYB18)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
References
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