Summary
我们描述了一种使用叶绿素荧光测量低CO2 处理后植物光合效率变化的方法。
Abstract
光合作用和光呼吸是植物初级代谢中最大的碳通量，是植物生存所必需的。几十年来，许多对光合作用和光呼吸很重要的酶和基因已经得到了很好的研究，但这些生化途径的某些方面及其与几个亚细胞过程的串扰尚未完全了解。许多确定植物代谢中重要基因和蛋白质的工作都是在高度受控的环境中进行的，这些环境可能无法最好地代表自然和农业环境中的光合作用和光呼吸功能。考虑到非生物胁迫导致光合作用效率受损，有必要开发一种可以监测非生物胁迫及其对光合作用影响的高通量屏幕。
因此，我们开发了一种相对快速的方法来筛选非生物胁迫诱导的光合效率变化，该方法可以使用叶绿素荧光分析和低CO2 筛选来识别在光呼吸中起作用的未表征基因。本文描述了一种研究 拟南芥中转移的DNA（T-DNA）敲除突变体光合效率变化的方法。相同的方法可用于筛选甲磺酸乙酯（EMS）诱导的突变体或抑制因子筛选。利用该方法可以鉴定候选基因，以进一步研究植物初级代谢和非生物胁迫反应。来自这种方法的数据可以深入了解基因功能，直到暴露于增加的压力环境之前可能无法识别。
Introduction
农民田间常见的非生物胁迫条件会降低光合效率，从而对作物产量产生负面影响。热浪、气候变化、干旱和土壤盐度等有害环境条件会导致非生物胁迫，从而改变 CO2 的可用性并降低植物对高光胁迫的反应。两个最大的陆地碳通量是光合作用和光呼吸，这对植物生长和作物产量至关重要。参与这些过程的许多重要蛋白质和酶已在实验室条件下进行了表征，并在遗传水平上进行了鉴定1。尽管在了解光合作用和光呼吸方面取得了很大进展，但许多步骤，包括植物细胞器之间的运输，仍未表征2，3。
光呼吸是植物中仅次于光合作用的第二大碳通量，当Rubisco酶将氧气而不是二氧化碳固定到核酮糖1，5二磷酸（RuBP）上，产生抑制性化合物2-磷酸乙醇酸酯（2PG）1时开始。为了尽量减少2PG的抑制作用并回收先前固定的碳，C3植物已经进化出光呼吸的多器官过程。光呼吸将两个2PG分子转化为一个3-磷酸甘油酸（3PGA）分子，可以重新进入C3固碳循环1。因此，光呼吸仅从2PG的产生中转换了先前固定碳的75%，并在此过程中消耗了ATP。因此，光呼吸过程对光合作用过程有10%-50%的显着拖累，具体取决于水分的可用性和生长季节的温度4。
几十年来，参与光呼吸的酶一直是研究重点领域，但只有少数转运蛋白在遗传水平上被表征，尽管该过程至少涉及25个转运步骤5，6，7。直接参与光呼吸过程中产生的碳运动的两种转运蛋白是乙醇酸质体/甘油酸酯转运蛋白PLGG1和胆汁酸钠共转运蛋白BASS6，两者都参与从叶绿体5，6输出乙醇酸。
在环境温度[CO2]下，Rubisco将氧分子固定在RuBP上的时间约为20%1。当植物受到低[CO 2]时，光呼吸速率增加，使低[CO2]成为测试突变体的理想环境，这些突变体在升高的光呼吸胁迫下可能很重要。在低CO2下测试其他假定的叶绿体转运蛋白T-DNA系24小时并测量叶绿素荧光的变化导致鉴定出显示光呼吸突变表型5的bass6-1植物系。进一步表征表明BASS6是叶绿体内膜中的乙醇酸酯转运蛋白。
本文详细描述了一种类似于最初用于将BASS6鉴定为光呼吸转运蛋白的方案，该方案来自位于叶绿体膜内的 假定转运蛋白列表8该协议可用于表征拟南芥T-DNA突变体或EMS生成的突变植物的高通量实验，作为鉴定在一系列非生物胁迫（例如热）下维持光合作用效率的重要基因的一种方式， 高光胁迫、干旱和 CO2 可用性。过去曾使用叶绿素荧光筛选植物突变体来快速鉴定对初级代谢很重要的基因9。由于多达30%的拟南芥基因组包含编码功能未知或表征不佳的蛋白质的基因，胁迫诱导的光合效率分析可以提供在突变植物受控条件下未观察到的分子功能的见解10。该方法的目标是使用低CO2 筛选来鉴定光呼吸途径的突变体。我们提出了一种方法来识别暴露于低CO2后破坏光呼吸的突变体。这种方法的一个优点是，它是可以在相对较短的时间内完成的幼苗的高通量筛选。视频协议部分详细介绍了种子制备和灭菌、植物生长和低 CO2 处理、荧光成像系统的配置、处理样品的量子产率测量、代表性结果和结论。
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Protocol
1. 种子制备和灭菌
注意：种子制备包括种子吸收和种子灭菌。重要的是要注意，所有这些步骤都将在层流罩中进行，以保持无菌条件。所有必要的材料、试剂和生长培养基必须高压灭菌（参见 材料表）。
- 种子吸收和分层
注意：使用的种子系是 plgg1-1 （salk_053463）， abcb26 （salk_085232）和野生型（WT，Col-0）。- 将种子分配到 1.5 mL 微量离心管中。将种子在层流罩中的无菌水中吸收，并在4°C下在黑暗中分层2天。
- 种子灭菌
- 在无菌条件下，制备 10 mL 的 50% （v/v） 漂白剂溶液，并加入约 20 μL 吐温 20。对于种子灭菌，从吸收的种子中除去水，将1mL漂白剂溶液加入微量离心管中，并在室温下孵育5分钟。
- 用移液管取出漂白剂溶液。
- 用 1 mL 无菌水冲洗种子以重悬。种子沉降到底部后取出水。重复步骤 1.6 和步骤 1.7 七次。
- 将种子重悬于无菌0.1%琼脂糖溶液中。
- 种子镀层
- 将 5.43 g 粉末加入 500 mL 蒸馏水中，制成 1 L 体积的含有维生素的 Murashige & Skoog 基础培养基和 1.0 g/L 的 2-（N-吗啉基）乙磺酸 （MS）。使用氢氧化钾 （KOH） 将 pH 值调节在 5.6 至 5.8 之间。使用蒸馏水填充至1升。
- 将液体溶液分成500mL，并将每一半放入装有磁力搅拌棒的1L烧瓶中。加入5g琼脂粉，每个烧瓶获得1%琼脂w / v溶液。
- 在121°C和15psi下高压灭菌30分钟;然后，置于室温下，同时缓慢搅拌。冷却后，将 25 mL MS 琼脂倒入方形培养皿中。让它凝固。
注意：这些Murashige&Skoog基础培养基板含有1%含有维生素的MS培养基和1%琼脂，用于培养测试突变体。
- 用剃须刀片切割 200 μL 移液器吸头。使用 200 μL 微量移液器，将一颗种子放在方形 MS 板（图 1）的每个测试突变体或基因型（1 cm2 正方形）的指定方形网格的中心。
注意：1 cm x 1 cm方形网格有助于保持幼苗之间的均匀距离并避免重叠，这在以后的荧光成像和分析中非常重要。 - 种子铺好后，用手术胶带缠绕盖子以密封，并在下述条件下将其放入生长室中。
- 将 5.43 g 粉末加入 500 mL 蒸馏水中，制成 1 L 体积的含有维生素的 Murashige & Skoog 基础培养基和 1.0 g/L 的 2-（N-吗啉基）乙磺酸 （MS）。使用氢氧化钾 （KOH） 将 pH 值调节在 5.6 至 5.8 之间。使用蒸馏水填充至1升。
2. 植物生长和低CO2 处理
- 在120μmol·m−2s−1 的8小时光循环和18°C的黑暗16小时下，在20°C下生长7-9天。 在第6天检查植物，以确定它们是否足够大以进行成像。在电镀后第 8 天，将植物暴露在低CO 2 下。
- 低CO 2 处理
- 7-9天后，将来自环境生长室条件的八个板中的四个放入20°C的光呼吸条件下，连续光照水平为200μmol·m−2 s-1，低CO2为12小时。
- 使用密封的透明容器构建低CO2条件，容器底部放置100克苏打石灰。将容器放在与对照相同的生长室内。将对照植物保持在环境CO2中120μmol·m−2 s−1下12h。
3. 配置荧光成像系统
- 在荧光成像系统中以固定距离将测试板（根据第1节和第2节制备）放在相机下方的固定距离处。
- 在仪器软件中，导航到 实时窗口 并选中 闪烁 框以打开非光化测量闪光。
- 单击 缩放 和 对焦 工具，直到看到完整而清晰的图像。为此，使用舞台或架子来调整植物和相机之间的距离。在整个实验中，保持变焦、焦点和与相机的距离恒定。
- 将 El. 快门 的值设置为 0 并调整 灵敏度 以获得 200-500 数字单位范围内的荧光信号。
注意：较低的El.快门值（0-1）将确保测量闪光是非光化的，而较高的值（2）将提高图像的分辨率。 - 将测光表放在用于调整相机设置的相同位置。
- 在 实时窗口中，选中 超级 框以启动持续 800 毫秒的饱和脉冲。请记住每次选中该框以获取新的脉冲。
- 使用滑块调整 超级脉冲的相对功率百分比 ，直到测光表读数为 6，000-8 ，000 μmol·m−2s−1。
4. 设计量子良率计划
- 导入成像系统的标准操作工具。
包括默认.inc
包括光.inc
注意：本实验中用于参考的程序语法适用于FluorCam成像系统。 - 根据配置的光源设置定义以下全局变量：
快门 = 0
灵敏度 = 40
超级 = 65 - 包括记录数据的时间步长：
TS = 20ms - 通过在暗适应状态下采样荧光来收集Fo测量值。
F0持续时间 = 2 秒;
F0周期 = 200ms;
注意： F0持续时间 定义了记录暗适应荧光的时间范围。 F0period 定义了重复暗适应荧光测量的时间间隔。 - 将Fo测量值记录到数据表中。
<0，F0周期..F0持续时间>=>mfmsub
<0s>->检查点，“startFo”=>检查点，“endFo”;
其中 <，> 表示按时间索引的一组荧光值;=> 将测量值存储在系统文件中; MFMSUB 表示实验的整个数据集;检查 点 为特定度量（如 startFo）的数据创建一个子集。 - 通过在饱和脉冲后对荧光进行采样来收集和存储 Fm 测量值。
脉冲持续时间=960毫秒;##
a1=F0持续时间 + 40ms
a2 = a1 + 480ms;=>卫星脉冲（脉冲持续时间）; =>mfmsub =>mfmsub; =>检查点，“startFm” =>检查点，“endFm” =>checkpoint，“timeVisual”;
其中 a1 和 a2 是将采样时间与饱和脉冲协调的变量; a1 表示 Fm 测量的开始时间; a2 表示脉冲的中点时间。
5. 测量处理样品的量子产率
- 处理后，立即用铝箔覆盖板15分钟以进行黑暗适应。取下箔片，用脉冲振幅修正荧光计测量光系统 II 的量子产率。然后，将幼苗板直接放在相机下方，并运行 GitHub 存储库中的量子产量协议。
- 从 GitHub 下载 quantum_yield 协议 （https://github.com/South-lab/fluorescent-screen） 或使用第 4 节中类似设计的程序。使用荧光计的软件通过单击文件夹图标并导航到文件位置来打开程序文件。
- 通过单击 红色闪电图标运行量子产量程序。
- 方案完成后，导航到 预分析 窗口。使用 选择工具 将板划分为单个幼苗，以突出显示板图像上每个幼苗的所有像素。单击 背景排除 以删除任何突出显示的背景像素，仅保留幼苗区域。
- 单击 “分析 ”以生成平板图像上每个幼苗的荧光数据。手动调整荧光值范围，以在所有板之间显示一致的最小值和最大值。
- 单击“实验|”选项卡中的“数字平均值”出口|数字。选择“所有数据和按列”，然后单击“确定”以生成包含每个幼苗的 QY 测量值的文本文件。
6. 打开数据文件
- 在电子表格中打开文本文件进行分析。在显示区域编号、像素大小、Fm、Ft、Fq 和 QY 的标题中，标识核心基因型（WT 或测试突变体）和 QYmax 的区域编号。对野生类型执行成对 t 检验以确定显著性。当 p 值低于 0.05 时，数据被解释为显著差异。
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Representative Results
结果显示了来自WT和测试突变体的环境和低CO2筛选的原始和荧光图像的板图像。每个幼苗按面积编号标记，相应的荧光读数为QY。数据导出为文本文件，可以在电子表格中打开进行分析（请参阅补充表S1）。选择突变系plgg1-1和abcb26来证明与光呼吸应激相关的基因的阳性和阴性鉴定。PLGG1编码RuBP6氧合后通路中的第一个转运蛋白，而ABCB26被认为编码未知参与光呼吸11的抗原转运蛋白。WT和突变体的暗适应Fv/Fm QY效率通过箱形图和晶须图可视化。为了检验WT和测试突变体之间的统计差异，使用了成对t检验，p值<0.05。在这里，我们使用QY Fv/Fm降低的光呼吸突变株系作为测试突变体来检查筛选方法的效率。结果表明，测试突变体的QY效率显著低于WT。 图3B显示了在低CO2下plgg1-1的可变与最大荧光（Fv/Fm）比值显着降低，但abcb26没有降低。该结果与PLGG1作为参与光呼吸的转运蛋白的作用一致，而abcb26在低CO2条件下没有表现出与WT对照不同的表型。因此，这种筛选方法可以使用低CO2筛选来识别光呼吸突变体。
图 1：种子板布局的示例示意图。 显示了两个技术重复，连续放置六个种子。WT对照种子放置在突变种子上方。缩写：WT = 野生类型。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：9 天龄幼苗的深色适应 Fv/Fm 图像。 将野生型对照与环境和低CO2下的T-DNA突变系进行比较。色标表示每个幼苗的平均Fv / Fm 。比例尺 = 1 cm. 缩写： Fv/Fm = 可变荧光与最大荧光的比率;WT = 野生型; PLGG1-1 = 乙醇酸质体/甘油酸易位剂 1; abcb26 = ATP 结合盒 B26。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：荧光观察结果。 在 （A） 环境和 （B） 低 CO2 条件下对幼苗进行的最大量子产率 （Fv/Fm） 测量。方框表示内四分位数之间的范围，框内的线表示中位数，晶须表示最大值和最小观测值。* 表示基于成对 t 检验相对于 WT 的显著差异 （n > 44， p < 0.05; 补充表S2）。缩写：Fv/Fm = 可变荧光与最大荧光的比值;WT = 野生型; PLGG1-1 = 乙醇酸质体/甘油酸易位剂 1; abcb26 = ATP 结合盒 B26。 请点击此处查看此图的大图。
补充表S1：实验中使用的所有幼苗板的汇编荧光数据。请点击此处下载此文件。
补充表S2：从野生型和两种突变基因型之间的t检验报告统计数据。当 p 值低于 0.05 时，突变体被认为与野生型显著不同。表A表示在环境CO 2下生长的植物上进行的t检验，而表B表示对在低CO2下生长的植物进行的t检验。t检验：假设方差相等的两个样本。请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文概述的实验方法具有一些优点和局限性。一个优点是这种方法可以筛选许多植物幼苗，尽管必须采取一些预防措施以防止在电镀和生长过程中污染植物培养基板。因此，用手术胶带密封拟南芥板至关重要。该实验的另一个优点是，与先前发表的工作相比，它具有更短的12小时光呼吸应激期8。治疗时间的减少是为了更好地区分WT和选定突变体之间的Fv/Fm差异。治疗时间可能需要根据突变菌株中表型的严重程度和实验设置中CO2 的水平而变化。然而，一个限制是这种方法需要足够大的叶面积，以便荧光计进行测量并计算Fv/Fm值。调整测试幼苗的初始生长时间将确保荧光计成像仪有足够的叶面积来测量每个幼苗，而不会在成像过程中叶子重叠。幼苗必须在第一片真叶处成像，以保持叶子大小和叶角均匀。通过提高相机的快门速度和灵敏度，可以提高图像的分辨率。相邻像素将更好地区分;但是，过多地增加感光度会使相机过度曝光并导致错误的荧光最大值。可能需要进行优化和故障排除以平衡分辨率和荧光值。
在标准化程序中筛选光合突变体的能力很重要。它可以允许一种一致的高通量方法来鉴定具有光合作用和光呼吸代谢目标基因的光呼吸突变体。总体而言，在该分析中，Fv/Fm 的筛选每盘植物幼苗大约需要 30 秒，每天可以筛查 1，000 多株幼苗。叶绿素荧光分析允许使用低CO2 筛选来鉴定光呼吸突变体，这对于维持光呼吸效率非常重要。鉴于理论上在光呼吸途径3中存在大量未知转运蛋白，该方法可用于快速评估基因型对光合效率的影响。此外，荧光计可以测量光合效率的其他方面，例如非光化学猝灭和光系统II操作效率。这些额外的方案需要更长的时间，但可用于进一步和更灵敏的分析，而不是这种快速的高通量突变体筛选。该方法不仅限于拟南芥，还可以调整以在一系列其他非生物胁迫条件下筛选T-DNA突变体，例如高温和低温，高光胁迫和干旱条件，以鉴定对光合作用和光呼吸很重要的基因。任何其他修改都需要逐一进行优化。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益或利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由路易斯安那州董事会（AWD-AM210544）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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