Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse
Summary
We beschrijven een benadering om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in planten te meten na behandeling met lage CO2 met behulp van chlorofylfluorescentie.
Abstract
Fotosynthese en fotorespiratie vertegenwoordigen de grootste koolstoffluxen in het primaire metabolisme van planten en zijn noodzakelijk voor het overleven van planten. Veel van de enzymen en genen die belangrijk zijn voor fotosynthese en fotorespiratie zijn al tientallen jaren goed bestudeerd, maar sommige aspecten van deze biochemische routes en hun kruisverwijzing met verschillende subcellulaire processen zijn nog niet volledig begrepen. Veel van het werk dat de genen en eiwitten heeft geïdentificeerd die belangrijk zijn in het plantenmetabolisme, is uitgevoerd in sterk gecontroleerde omgevingen die mogelijk niet het beste weergeven hoe fotosynthese en fotorespiratie functioneren onder natuurlijke en landbouwomgevingen. Gezien het feit dat abiotische stress resulteert in verminderde fotosynthetische efficiëntie, is de ontwikkeling van een high-throughput scherm dat zowel abiotische stress als de impact ervan op fotosynthese kan monitoren noodzakelijk.
Daarom hebben we een relatief snelle methode ontwikkeld om te screenen op abiotische stress-geïnduceerde veranderingen in fotosynthetische efficiëntie die niet-gekarakteriseerde genen met rollen in fotorespiratie kunnen identificeren met behulp van chlorofylfluorescentieanalyse en lage CO2-screening . Dit artikel beschrijft een methode om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in overgedragen DNA (T-DNA) knock-out mutanten in Arabidopsis thaliana te bestuderen. Dezelfde methode kan worden gebruikt voor het screenen van door ethylmethaansulfonaat (EMS) geïnduceerde mutanten of suppressorscreening. Het gebruik van deze methode kan genkandidaten identificeren voor verder onderzoek in het primaire metabolisme van planten en abiotische stressreacties. Gegevens van deze methode kunnen inzicht geven in de genfunctie die mogelijk niet wordt herkend tot blootstelling aan verhoogde stressomgevingen.
Introduction
Abiotische stressomstandigheden die vaak worden gezien op de velden van boeren kunnen de gewasopbrengsten negatief beïnvloeden door de fotosynthetische efficiëntie te verminderen. Schadelijke omgevingsomstandigheden zoals hittegolven, klimaatverandering, droogte en zoutgehalte van de bodem kunnen abiotische stress veroorzaken die de beschikbaarheid van CO2 verandert en de reactie van een plant op hoge lichtstress vermindert. De twee grootste terrestrische koolstoffluxen zijn fotosynthese en fotorespiratie, die essentieel zijn voor plantengroei en gewasopbrengsten. Veel van de belangrijke eiwitten en enzymen die betrokken zijn bij deze processen zijn gekarakteriseerd onder laboratoriumomstandigheden en geïdentificeerd op genetisch niveau1. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van fotosynthese en fotorespiratie, blijven veel stappen, waaronder transport tussen plantenorganellen, onkarakteristiek 2,3.
Fotorespiratie, de op een na grootste koolstofflux in planten na fotosynthese, begint wanneer het enzym Rubisco zuurstof in plaats van koolstofdioxide fixeert op ribulose 1,5 bisfosfaat (RuBP), waardoor de remmende verbinding 2-fosfoglycolaat (2PG)1 wordt gegenereerd. Om de remmende effecten van 2PG te minimaliseren en de voorheen vaste koolstof te recyclen, hebben C3-planten het multi-organellaire proces van fotorespiratie ontwikkeld. Fotorespiratie zet twee moleculen van 2PG om in één molecuul 3-fosfoglyceraat (3PGA), dat opnieuw in de C3-koolstoffixatiecyclus kan komen1. Fotorespiratie converteert dus slechts 75% van de eerder vaste koolstof van de generatie van 2PG en verbruikt ATP in het proces. Als gevolg hiervan is het proces van fotorespiratie een aanzienlijke weerstand van 10% -50% op het fotosynthetische proces, afhankelijk van de beschikbaarheid van water en de temperaturen van het groeiseizoen4.
De enzymen die betrokken zijn bij fotorespiratie zijn al tientallen jaren een onderzoeksgebied, maar slechts een klein aantal transporteiwitten is op genetisch niveau gekarakteriseerd, hoewel er ten minste 25 transportstappen betrokken zijn bij het proces 5,6,7. De twee transporteiwitten die direct betrokken zijn bij de beweging van koolstof die wordt gegenereerd in het fotorespiratieproces zijn de plastadische glycolaat/glyceraattransporter PLGG1 en de galzuurnatriumsymporter BASS6, die beide betrokken zijn bij de export van glycolaat uit de chloroplast 5,6.
Onder omgevingstemperatuur [CO2] fixeert Rubisco ongeveer 20% van de tijd een zuurstofmolecuul aan RuBP1. Wanneer planten worden blootgesteld aan lage [CO2], nemen de fotorespiratiesnelheden toe, waardoor lage [CO2] een ideale omgeving is om te testen op mutanten die belangrijk kunnen zijn onder verhoogde fotorespiratiestress. Het testen van aanvullende vermeende chloroplast transport eiwit T-DNA lijnen onder lage CO2 gedurende 24 uur en het meten van veranderingen in chlorofyl fluorescentie leidde tot de identificatie van bass6-1 plantenlijnen die een fotorespiratie mutant fenotype5 aantoonden. Verdere karakterisering toonde aan dat BASS6 een glycolaattransporter is in het binnenmembraan van de chloroplast.
Dit artikel beschrijft in detail een protocol dat vergelijkbaar is met wat aanvankelijk werd gebruikt om BASS6 te identificeren als een fotorespiratietransporter, die afkomstig was van een lijst met vermeende transporteiwitten in het chloroplastmembraan8 Dit protocol kan worden gebruikt in een high-throughput experiment dat Arabidopsis T-DNA-mutanten of EMS-gegenereerde mutante planten karakteriseert als een manier om genen te identificeren die belangrijk zijn voor het handhaven van fotosynthetische efficiëntie onder een reeks abiotische stress zoals hitte, hoge lichtstress, droogte en CO2-beschikbaarheid . Het screenen van plantenmutanten met behulp van chlorofylfluorescentie is in het verleden gebruikt om snel genen te identificeren die belangrijk zijn voor het primaire metabolisme9. Met maar liefst 30% van het Arabidopsis-genoom dat genen bevat die coderen voor eiwitten met een onbekende of slecht gekarakteriseerde functie, zou stress-geïnduceerde analyse van fotosynthetische efficiëntie inzicht kunnen geven in moleculaire functies die niet onder gecontroleerde omstandigheden in mutante planten worden waargenomen10. Het doel van deze methode is om mutanten van de fotorespiratoire route te identificeren met behulp van een lage CO2-screening . We presenteren een methode om mutanten te identificeren die de fotorespiratie verstoren na blootstelling aan lage CO2. Een voordeel van deze methode is dat het een high-throughput screening is voor zaailingen die in een relatief korte tijd kan worden gedaan. De secties van het videoprotocol geven details over zaadvoorbereiding en sterilisatie, plantengroei en lage CO2-behandeling , de configuratie van het fluorescentiebeeldvormingssysteem, de meting van de kwantumopbrengst van de behandelde monsters, representatieve resultaten en conclusies.
Protocol
Representative Results
Discussion
De experimentele methoden die in dit artikel worden beschreven, hebben enkele voordelen en beperkingen. Een voordeel is dat deze methode veel plantenzaailingen kan screenen, hoewel enkele voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om besmetting van de plantmediaplaat tijdens het beplatings- en groeiproces te voorkomen. Daarom is het van cruciaal belang om de Arabidopsis-platen af te dichten met chirurgische tape. Een ander voordeel van dit experiment is dat het een kortere fotorespiratoire stressperiode van 12 uur heeft …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd gefinancierd door de Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
