Evaluatie van fotosynthetische efficiëntie in fotorespiratoire mutanten door chlorofylfluorescentieanalyse

Summary

We beschrijven een benadering om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in planten te meten na behandeling met lage CO₂ met behulp van chlorofylfluorescentie.

Abstract

Fotosynthese en fotorespiratie vertegenwoordigen de grootste koolstoffluxen in het primaire metabolisme van planten en zijn noodzakelijk voor het overleven van planten. Veel van de enzymen en genen die belangrijk zijn voor fotosynthese en fotorespiratie zijn al tientallen jaren goed bestudeerd, maar sommige aspecten van deze biochemische routes en hun kruisverwijzing met verschillende subcellulaire processen zijn nog niet volledig begrepen. Veel van het werk dat de genen en eiwitten heeft geïdentificeerd die belangrijk zijn in het plantenmetabolisme, is uitgevoerd in sterk gecontroleerde omgevingen die mogelijk niet het beste weergeven hoe fotosynthese en fotorespiratie functioneren onder natuurlijke en landbouwomgevingen. Gezien het feit dat abiotische stress resulteert in verminderde fotosynthetische efficiëntie, is de ontwikkeling van een high-throughput scherm dat zowel abiotische stress als de impact ervan op fotosynthese kan monitoren noodzakelijk.

Daarom hebben we een relatief snelle methode ontwikkeld om te screenen op abiotische stress-geïnduceerde veranderingen in fotosynthetische efficiëntie die niet-gekarakteriseerde genen met rollen in fotorespiratie kunnen identificeren met behulp van chlorofylfluorescentieanalyse en lage CO_2-screening . Dit artikel beschrijft een methode om veranderingen in fotosynthetische efficiëntie in overgedragen DNA (T-DNA) knock-out mutanten in Arabidopsis thaliana te bestuderen. Dezelfde methode kan worden gebruikt voor het screenen van door ethylmethaansulfonaat (EMS) geïnduceerde mutanten of suppressorscreening. Het gebruik van deze methode kan genkandidaten identificeren voor verder onderzoek in het primaire metabolisme van planten en abiotische stressreacties. Gegevens van deze methode kunnen inzicht geven in de genfunctie die mogelijk niet wordt herkend tot blootstelling aan verhoogde stressomgevingen.

Introduction

Abiotische stressomstandigheden die vaak worden gezien op de velden van boeren kunnen de gewasopbrengsten negatief beïnvloeden door de fotosynthetische efficiëntie te verminderen. Schadelijke omgevingsomstandigheden zoals hittegolven, klimaatverandering, droogte en zoutgehalte van de bodem kunnen abiotische stress veroorzaken die de beschikbaarheid van CO₂ verandert en de reactie van een plant op hoge lichtstress vermindert. De twee grootste terrestrische koolstoffluxen zijn fotosynthese en fotorespiratie, die essentieel zijn voor plantengroei en gewasopbrengsten. Veel van de belangrijke eiwitten en enzymen die betrokken zijn bij deze processen zijn gekarakteriseerd onder laboratoriumomstandigheden en geïdentificeerd op genetisch niveau¹. Hoewel er veel vooruitgang is geboekt bij het begrijpen van fotosynthese en fotorespiratie, blijven veel stappen, waaronder transport tussen plantenorganellen, onkarakteristiek ^2,3.

Fotorespiratie, de op een na grootste koolstofflux in planten na fotosynthese, begint wanneer het enzym Rubisco zuurstof in plaats van koolstofdioxide fixeert op ribulose 1,5 bisfosfaat (RuBP), waardoor de remmende verbinding 2-fosfoglycolaat (2PG)^{1 wordt} gegenereerd. Om de remmende effecten van 2PG te minimaliseren en de voorheen vaste koolstof te recyclen, hebben C3-planten het multi-organellaire proces van fotorespiratie ontwikkeld. Fotorespiratie zet twee moleculen van 2PG om in één molecuul 3-fosfoglyceraat (3PGA), dat opnieuw in de C3-koolstoffixatiecyclus kan komen¹. Fotorespiratie converteert dus slechts 75% van de eerder vaste koolstof van de generatie van 2PG en verbruikt ATP in het proces. Als gevolg hiervan is het proces van fotorespiratie een aanzienlijke weerstand van 10% -50% op het fotosynthetische proces, afhankelijk van de beschikbaarheid van water en de temperaturen van het groeiseizoen⁴.

De enzymen die betrokken zijn bij fotorespiratie zijn al tientallen jaren een onderzoeksgebied, maar slechts een klein aantal transporteiwitten is op genetisch niveau gekarakteriseerd, hoewel er ten minste 25 transportstappen betrokken zijn bij het proces ^5,6,7. De twee transporteiwitten die direct betrokken zijn bij de beweging van koolstof die wordt gegenereerd in het fotorespiratieproces zijn de plastadische glycolaat/glyceraattransporter PLGG1 en de galzuurnatriumsymporter BASS6, die beide betrokken zijn bij de export van glycolaat uit de chloroplast ^5,6.

Onder omgevingstemperatuur [CO₂] fixeert Rubisco ongeveer 20% van de tijd een zuurstofmolecuul aan RuBP¹. Wanneer planten worden blootgesteld aan lage [CO₂], nemen de fotorespiratiesnelheden toe, waardoor lage [CO₂] een ideale omgeving is om te testen op mutanten die belangrijk kunnen zijn onder verhoogde fotorespiratiestress. Het testen van aanvullende vermeende chloroplast transport eiwit T-DNA lijnen onder lage CO₂ gedurende 24 uur en het meten van veranderingen in chlorofyl fluorescentie leidde tot de identificatie van bass6-1 plantenlijnen die een fotorespiratie mutant fenotype⁵ aantoonden. Verdere karakterisering toonde aan dat BASS6 een glycolaattransporter is in het binnenmembraan van de chloroplast.

Dit artikel beschrijft in detail een protocol dat vergelijkbaar is met wat aanvankelijk werd gebruikt om BASS6 te identificeren als een fotorespiratietransporter, die afkomstig was van een lijst met vermeende transporteiwitten in het chloroplastmembraan⁸ Dit protocol kan worden gebruikt in een high-throughput experiment dat Arabidopsis T-DNA-mutanten of EMS-gegenereerde mutante planten karakteriseert als een manier om genen te identificeren die belangrijk zijn voor het handhaven van fotosynthetische efficiëntie onder een reeks abiotische stress zoals hitte, hoge lichtstress, droogte en CO_{2-beschikbaarheid} . Het screenen van plantenmutanten met behulp van chlorofylfluorescentie is in het verleden gebruikt om snel genen te identificeren die belangrijk zijn voor het primaire metabolisme⁹. Met maar liefst 30% van het Arabidopsis-genoom dat genen bevat die coderen voor eiwitten met een onbekende of slecht gekarakteriseerde functie, zou stress-geïnduceerde analyse van fotosynthetische efficiëntie inzicht kunnen geven in moleculaire functies die niet onder gecontroleerde omstandigheden in mutante planten worden waargenomen¹⁰. Het doel van deze methode is om mutanten van de fotorespiratoire route te identificeren met behulp van een lage CO_2-screening . We presenteren een methode om mutanten te identificeren die de fotorespiratie verstoren na blootstelling aan lage CO₂. Een voordeel van deze methode is dat het een high-throughput screening is voor zaailingen die in een relatief korte tijd kan worden gedaan. De secties van het videoprotocol geven details over zaadvoorbereiding en sterilisatie, plantengroei en lage CO_{2-behandeling} , de configuratie van het fluorescentiebeeldvormingssysteem, de meting van de kwantumopbrengst van de behandelde monsters, representatieve resultaten en conclusies.

Protocol

1. Zaadbereiding en sterilisatie

OPMERKING: Zaadbereiding bestaat uit zaadindrinking en zaadsterilisatie. Het is belangrijk op te merken dat al deze stappen moeten worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te behouden. Alle benodigde materialen, reagentia en groeimedia moeten worden geautoclaveerd (zie de tabel met materialen).

1. Zaadimbibatie en stratificatie
   OPMERKING: De gebruikte zaadlijnen zijn plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) en wild type (WT, Col-0).
   1. Doseer de zaden in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Neem de zaden in steriel water in een laminaire stromingskap en stratificeer bij 4 °C in het donker gedurende 2 dagen.
2. Zaadsterilisatie
   1. Bereid onder steriele omstandigheden 10 ml 50% (v/v) bleekoplossing en voeg ongeveer 20 μL Tween 20 toe. Voor zaadsterilisatie, verwijder water uit de ingebakken zaden, voeg 1 ml bleekoplossing toe aan de microcentrifugebuizen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
   2. Verwijder de bleekoplossing met een pipet.
   3. Spoel de zaden af in 1 ml steriel water om te resuspenderen. Verwijder het water zodra de zaden op de bodem zijn neergedaald. Herhaal stap 1.6 en stap 1.7 zeven keer.
   4. Resuspendeer de zaden in steriele 0,1% agarose oplossing.
3. Zaadplating
   1. Maak een 1 L volume van Murashige & Skoog Basal Medium met vitamines en 1,0 g / L van 2-(N-morphonio) ethaansulfonzuur (MS) door 5,43 g van het poeder toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water. Pas de pH aan tussen 5,6 en 5,8 met kaliumhydroxide (KOH). Vul tot 1 L met gedestilleerd water.
      1. Splits de vloeibare oplossing in 500 ml en plaats elke helft in een kolf van 1 l met een magnetische roerstaaf. Voeg 5 g agarpoeder toe om voor elke kolf een 1% agar w/v-oplossing te verkrijgen.
      2. Autoclaaf bij 121 °C en 15 psi gedurende 30 minuten; plaats vervolgens op kamertemperatuur terwijl je langzaam roert. Giet bij het afkoelen 25 ml MS-agar in een vierkante petrischaal. Laat het stollen.
         OPMERKING: Deze Murashige &Skoog Basal Medium platen bevatten 1% MS medium met vitamines en 1% agar voor de teelt van de testmutanten.
   2. Snijd een pipetpunt van 200 μL met een scheermesje. Plaats één zaadje in het midden van het aangewezen vierkante raster voor elke testmutant of genotype (1 cm² vierkant) van een vierkante MS-plaat (figuur 1) met behulp van een micropipette van 200 μL.
      OPMERKING: Het vierkante raster van 1 cm x 1 cm helpt om een uniforme afstand tussen de zaailingen te houden en overlapping te voorkomen, wat belangrijk zal zijn bij latere fluorescentiebeeldvorming en -analyse.
   3. Zodra de zaden zijn verguld, wikkelt u met chirurgische tape rond het deksel om af te sluiten en plaatst u het in de groeikamer in omstandigheden zoals hieronder beschreven.

2. Plantengroei en co_2-arme behandeling

1. Laat de planten 7-9 dagen groeien bij 20 °C onder een lichtcyclus van 8 uur van 120 μmol·m⁻²s⁻¹ en 16 uur duisternis bij 18 °C. Controleer de planten op de 6e dag om te bepalen of ze groot genoeg zijn voor beeldvorming. Stel de planten op de 8e dag na de beplating bloot aan een laag CO_2-gehalte.
2. Co_2-arme behandeling
   1. Plaats na de 7-9 dagen vier van de acht platen uit de omgevingsgroeikamercondities in fotorespiratoire omstandigheden van 20 °C, continue lichtniveaus van 200 μmol·m⁻²s⁻¹ en lage CO₂ gedurende 12 uur.
   2. Construeer de CO_2-lage toestand met behulp van een luchtdichte transparante container met 100 g natronkalk op de bodem van de container. Plaats de container in dezelfde groeikamer als de controle. Houd de controle-installaties_gedurende 12 uur onder 120 μmol·m−²s⁻¹ in omgevings-CO 2.

3. Het fluorescentiebeeldvormingssysteem configureren

1. Plaats een testplaat (voorbereid volgens sectie 1 en sectie 2) gecentreerd onder de camera op een vaste afstand in het fluorescentiebeeldvormingssysteem.
2. Navigeer in de software van het instrument naar het Live Window en vink het vakje Knipperen aan om niet-actinische meetflitsen in te schakelen.
3. Klik op de gereedschappen Zoomen en Scherpstellen totdat een volledig en scherp beeld zichtbaar is. Gebruik hiervoor een podium of een plank om de afstand tussen de planten en de camera aan te passen. Houd de zoom, focus en afstand tot de camera constant gedurende het hele experiment.
4. Stel de waarde van El. Shutter in op 0 en pas de gevoeligheid aan om een fluorescerend signaal te krijgen in het bereik van 200-500 digitale eenheden.
   OPMERKING: Een lagere El. Sluiterwaarde (0-1) zorgt ervoor dat de meetflitsen niet-actinisch zijn, terwijl een hogere waarde (2) de resolutie van de afbeelding zal verbeteren.
5. Plaats een lichtmeter in dezelfde positie als waarmee de camera-instellingen worden aangepast.
6. Schakel in het livevenster het selectievakje Super in om een verzadigingspuls van 800 ms te starten. Vergeet niet om het vakje elke keer aan te vinken voor een nieuwe puls.
7. Gebruik de schuifregelaar om het percentage relatief vermogen voor de superpuls aan te passen totdat de lichtmeter 6.000-8.000 μmol·m⁻²s^{−1 aangeeft}.

4. Ontwerp het kwantumopbrengstprogramma

1. Importeer standaardbesturingssysteem voor het imagingsysteem.
   Standaard.inc opnemen
   Inclusief light.inc
   OPMERKING: De syntaxis van het programma die in dit experiment ter referentie wordt gebruikt, is voor een FluorCam-beeldvormingssysteem.
2. Definieer de volgende globale variabelen op basis van de geconfigureerde lichtinstellingen:
   Sluiter = 0
   Gevoeligheid = 40
   Super = 65
3. Neem de tijdstap op voor het vastleggen van gegevens:
   TS = 20 ms
4. Verzamel de Fo-meting door fluorescentie te bemonsteren in een aan het donker aangepaste toestand.
   F0duration = 2s;
   F0period = 200ms;
   OPMERKING: F0duration definieert het tijdsbereik waarover de aan het donker aangepaste fluorescentie wordt geregistreerd. F0period definieert het tijdsinterval waarover de donker-aangepaste fluorescentiemeting wordt herhaald.
5. Noteer de Fo-metingen in gegevenstabellen.
   <0,F0periode.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->checkpoint,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Indien < , vertegenwoordigt > de reeks fluorescentiewaarden die door de tijd zijn geïndexeerd; => slaat metingen op in een systeembestand; mfmsub vertegenwoordigt de volledige dataset voor het experiment; en checkpoint maakt een subset voor gegevens van specifieke metingen zoals startFo.
6. Verzamel en bewaar de Fm-meting door fluorescentie te bemonsteren na een verzadigde puls.
   PulseDuration = 960ms; ##
   a1 = F0duration + 40ms
   a2 = a1 + 480 ms;
   = >SatPulse (PulseDuration);
   = >mfmsub
   = >mfmsub;
   =>checkpoint,"startFm"
   = >checkpoint,"endFm"
   =>checkpoint,"timeVisual";
   Wanneer a1 en a2 variabelen zijn om de bemonsteringstijd te coördineren met de verzadigingspuls; a1 staat voor de begintijd van de Fm-meting; en a2 vertegenwoordigt de middelste tijd van de puls.

5. Meten van de kwantumopbrengst van de behandelde monsters

1. Direct na de behandeling bedek de platen met aluminiumfolie gedurende 15 minuten voor donkere aanpassing. Verwijder de folie om de kwantumopbrengst van fotosysteem II te meten met een pulsamplitude-gemodificeerde fluorometer. Plaats vervolgens de zaailingplaat direct onder de camera en voer het kwantumopbrengstprotocol uit dat te vinden is in de GitHub-repository.
2. Download het quantum_yield protocol van GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) of gebruik een vergelijkbaar ontworpen programma uit sectie 4. Gebruik de software van de fluorometer om het programmabestand te openen door op het mappictogram te klikken en naar de bestandslocatie te navigeren.
3. Voer het kwantumopbrengstprogramma uit door op het rode bliksempictogram te klikken.
4. Nadat het protocol is voltooid, navigeert u naar het preanalysevenster . Verdeel de plaat in afzonderlijke zaailingen met behulp van de selectiegereedschappen om alle pixels voor elke zaailing op de plaatafbeelding te markeren. Klik op Achtergronduitsluiting om gemarkeerde achtergrondpixels te verwijderen, zodat alleen het zaailinggebied overblijft.
5. Klik op Analyseren om fluorescentiegegevens te genereren voor elke zaailing op de plaatafbeelding. Pas het fluorescentiewaardebereik handmatig aan om consistente minimum- en maximumwaarden tussen alle platen weer te geven.
6. Klik op Numeriek-gemiddelde in het tabblad Experiment | | exporteren Numeriek. Selecteer Alle gegevens en per kolom en klik op OK om een tekstbestand met QY-metingen voor elke zaailing te genereren.

6. Het gegevensbestand openen

1. Open het tekstbestand in een spreadsheet voor analyse. Van de koppen met het gebiedsnummer, de grootte van pixels, Fm, Ft, Fq en QY, identificeert u het gebiedsnummer voor het kerngenotype (WT of testmutant) en QYmax. Voer een paarsgewijze t-test uit met betrekking tot wildtype om significantie te bepalen. Gegevens worden geïnterpreteerd als significant verschillend wanneer p-waarden lager zijn dan 0,05.

Representative Results

De resultaten tonen plaatbeelden van ruwe en fluorescentiebeelden van omgevings- en CO_2-screening van WT- en testmutanten. Elke plantlet wordt gelabeld op gebiedsnummer, met overeenkomstige fluorescentiemetingen gegeven als QY. De gegevens worden geëxporteerd als een tekstbestand en kunnen worden geopend in een spreadsheet voor analyse (zie Aanvullende tabel S1). Mutantenlijnen plgg1-1 en abcb26 werden geselecteerd om de positieve en negatieve identificatie van genen geassocieerd met fotorespiratoire stress aan te tonen. PLGG1 codeert voor de eerste transporter in de route na de oxygenatie van RuBP⁶, terwijl ABCB26 wordt verondersteld te coderen voor een antigeentransporter waarvan niet bekend is dat deze betrokken is bij fotorespiratie¹¹. De donker-aangepaste Fv/Fm QY-efficiënties van WT en mutanten worden gevisualiseerd door box- en whiskerplots. Om het statistische verschil tussen de WT en testmutanten te testen, werd een paarsgewijze t-test gebruikt met een p-waarde < 0,05. Hier gebruikten we fotorespiratoire mutantlijnen met verminderde QY Fv / Fm als testmutanten om de efficiëntie van de screeningsmethode te controleren. De resultaten tonen aan dat de testmutanten een significant lagere QY-efficiëntie hebben dan WT. Figuur 3B toont een significante vermindering van de verhouding tussen variabele en maximale fluorescentie (Fv/Fm) voor plgg1-1 , maar niet abcb26 bij lage CO₂. Dit resultaat komt overeen met de rol van PLGG1 als transporter die betrokken is bij fotorespiratie, terwijl abcb26 geen fenotype vertoont dat verschilt van de WT-controle onder lage CO_{2-omstandigheden} . Deze screeningsmethode kan dus fotorespiratoire mutanten identificeren met behulp van lage CO_2-screening .

Figuur 1: Voorbeeld schema van de lay-out van de zaadplaat. Twee technische replica's worden getoond met zes zaden op een rij geplaatst. WT-controlezaden geplaatst boven gemuteerde zaden. Afkorting: WT = wild type. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Donker aangepaste F_v/V_m beelden van 9 dagen oude zaailingen. De wild-type controle wordt vergeleken met T-DNA mutantlijnen bij omgevings- en lage CO_2-2. De kleurenschaal vertegenwoordigt de gemiddelde F_v/F_m van elke zaailing. Schaalbalk = 1 cm. Afkortingen: Fv/Fm = verhouding van variabele tot maximale fluorescentie; WT = wild type; plgg1-1 = plastidale glycolaat/glyceraattranslocator 1; ABCB26 = ATP-binding cassette B26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Fluorescentiewaarnemingen. Maximale kwantumopbrengst (Fv/Fm) metingen uitgevoerd op zaailingen bij (A) omgevings- en (B) lage CO_{2-omstandigheden} . De vakken vertegenwoordigen het bereik tussen de binnenste kwartielen, de lijnen binnen de vakken vertegenwoordigen de medianen en de snorharen vertegenwoordigen de maximale en minimale waarnemingen. * Geeft significant verschil aan op basis van een paarsgewijze t-test ten opzichte van WT (n > 44, p < 0,05; Aanvullende tabel S2). Afkortingen: Fv/Fm = verhouding van variabele tot maximale fluorescentie; WT = wild type; plgg1-1 = plastidale glycolaat/glyceraattranslocator 1; ABCB26 = ATP-binding cassette B26. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel S1: Samengestelde fluorescerende gegevens van alle zaailingplaten die in het experiment zijn gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Statistieken worden gerapporteerd van een t-test tussen wild type en beide mutante genotypen. Mutanten worden als significant verschillend van wild type beschouwd wanneer de p-waarde lager is dan 0,05. Tabel A vertegenwoordigt t-tests die zijn uitgevoerd op planten die zijn gekweekt in omgevings-CO₂, terwijl tabel B t-tests vertegenwoordigt die zijn uitgevoerd op planten die zijn gekweekt in een laag CO_2-gehalte. t-Test: twee-steekproef uitgaande van gelijke varianties. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De experimentele methoden die in dit artikel worden beschreven, hebben enkele voordelen en beperkingen. Een voordeel is dat deze methode veel plantenzaailingen kan screenen, hoewel enkele voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om besmetting van de plantmediaplaat tijdens het beplatings- en groeiproces te voorkomen. Daarom is het van cruciaal belang om de Arabidopsis-platen af te dichten met chirurgische tape. Een ander voordeel van dit experiment is dat het een kortere fotorespiratoire stressperiode van 12 uur heeft in vergelijking met het eerder gepubliceerde werk⁸. De verkorting van de behandelingstijd was om de verschillen in Fv/Fm tussen de WT en geselecteerde mutanten beter te onderscheiden. De behandelingstijd kan moeten worden gevarieerd, afhankelijk van de ernst van het fenotype in mutante stammen en het niveau van CO₂ in de experimentele opstelling. Een beperking is echter dat deze methode een bladoppervlak vereist dat groot genoeg is om de fluorometer te meten en om Fv/Fm-waarden te berekenen. Het aanpassen van de initiële groeitijd van geteste zaailingen zal ervoor zorgen dat de fluorometerbeeldcamera voldoende bladoppervlak heeft om voor elke zaailing te meten zonder dat de bladeren elkaar overlappen tijdens de beeldvorming. De zaailingen moeten bij de eerste echte bladeren worden afgebeeld om de bladgrootte en bladhoeken uniform te houden. De resolutie van het beeld kan worden verbeterd door de sluitertijd en gevoeligheid van de camera te verhogen. Naburige pixels zullen beter worden onderscheiden; het te veel verhogen van de gevoeligheid zal de camera echter overbelichten en leiden tot valse fluorescentiemaxima. Optimalisatie en probleemoplossing kunnen nodig zijn om de resolutie- en fluorescentiewaarden in evenwicht te brengen.

De mogelijkheid om te screenen op fotosynthetische mutanten in een gestandaardiseerde procedure is belangrijk. Het kan een consistente, high-throughput methode mogelijk maken om fotorespiratiemutanten te identificeren met genen die van belang zijn voor fotosynthese en fotorespiratiemetabolisme. Over het algemeen duurt de screening op Fv / Fm in deze analyse ongeveer 30 s per bord plantenzaailingen, waardoor de screening van meer dan 1.000 zaailingen per dag mogelijk is. Chlorofylfluorescentieanalyse maakt de identificatie van fotorespiratoire mutanten mogelijk met behulp van een lage CO_2-screening , wat belangrijk is voor het handhaven van de fotorespiratoire efficiëntie. Gezien het grote aantal onbekende transporters waarvan wordt getheoretiseerd dat ze zich in de fotorespiratieroute^{bevinden 3}, kan deze methode worden gebruikt om snel het effect van het genotype op de fotosynthetische efficiëntie te evalueren. Bovendien kunnen fluorometers andere aspecten van fotosynthetische efficiëntie meten, zoals niet-fotochemische blus- en fotosysteem II-bedrijfsefficiëntie. Deze aanvullende protocollen duren langer per zaailingplaat, maar kunnen worden gebruikt voor verdere en gevoeligere analyse in tegenstelling tot dit snelle high-throughput scherm van mutanten. Deze methode is niet beperkt tot Arabidopsis en kan ook worden aangepast om te screenen op T-DNA-mutanten in een reeks andere abiotische stressomstandigheden zoals hoge en lage temperaturen, hoge lichtstress en droogteomstandigheden om genen te identificeren die belangrijk zijn voor fotosynthese en fotorespiratie. Eventuele aanvullende wijzigingen moeten op individuele basis worden geoptimaliseerd.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization