Valutazione dell'efficienza fotosintetica nei mutanti fotorespiratori mediante analisi di fluorescenza clorofilliana
Summary
Descriviamo un approccio per misurare i cambiamenti nell’efficienza fotosintetica nelle piante dopo il trattamento con bassa CO2 utilizzando la fluorescenza della clorofilla.
Abstract
La fotosintesi e la fotorespirazione rappresentano i maggiori flussi di carbonio nel metabolismo primario delle piante e sono necessari per la sopravvivenza delle piante. Molti degli enzimi e dei geni importanti per la fotosintesi e la fotorespirazione sono stati ben studiati per decenni, ma alcuni aspetti di questi percorsi biochimici e la loro diafonia con diversi processi subcellulari non sono ancora completamente compresi. Gran parte del lavoro che ha identificato i geni e le proteine importanti nel metabolismo delle piante è stato condotto in ambienti altamente controllati che potrebbero non rappresentare al meglio come funzionano la fotosintesi e la fotorespirazione in ambienti naturali e agricoli. Considerando che lo stress abiotico si traduce in una ridotta efficienza fotosintetica, è necessario lo sviluppo di uno schermo ad alto rendimento in grado di monitorare sia lo stress abiotico che il suo impatto sulla fotosintesi.
Pertanto, abbiamo sviluppato un metodo relativamente veloce per lo screening di cambiamenti indotti da stress abiotico all’efficienza fotosintetica in grado di identificare geni non caratterizzati con ruoli nella fotorespirazione utilizzando l’analisi della fluorescenza clorofilliana e lo screening a bassa CO2 . Questo articolo descrive un metodo per studiare i cambiamenti nell’efficienza fotosintetica nei mutanti knockout del DNA trasferito (T-DNA) in Arabidopsis thaliana. Lo stesso metodo può essere utilizzato per lo screening dei mutanti indotti dal metansolfonato di etile (EMS) o per lo screening dei soppressori. L’utilizzo di questo metodo può identificare i candidati geni per ulteriori studi sul metabolismo primario delle piante e sulle risposte allo stress abiotico. I dati di questo metodo possono fornire informazioni sulla funzione genica che potrebbe non essere riconosciuta fino all’esposizione a ambienti di stress aumentati.
Introduction
Le condizioni di stress abiotico comunemente osservate nei campi degli agricoltori possono avere un impatto negativo sui raccolti riducendo l’efficienza fotosintetica. Condizioni ambientali dannose come ondate di calore, cambiamenti climatici, siccità e salinità del suolo possono causare stress abiotici che alterano la disponibilità di CO2 e riducono la risposta di una pianta a stress luminosi elevati. I due maggiori flussi di carbonio terrestri sono la fotosintesi e la fotorespirazione, che sono essenziali per la crescita delle piante e la resa delle colture. Molte delle importanti proteine ed enzimi coinvolti in questi processi sono stati caratterizzati in condizioni di laboratorio e identificati al livello genetico1. Sebbene siano stati fatti molti progressi nella comprensione della fotosintesi e della fotorespirazione, molti passaggi, incluso il trasporto tra organelli vegetali, rimangono non caratterizzati 2,3.
La fotorespirazione, il secondo più grande flusso di carbonio nelle piante dopo la fotosintesi, inizia quando l’enzima Rubisco fissa l’ossigeno invece dell’anidride carbonica al ribulosio 1,5 bisfosfato (RuBP), generando il composto inibitorio 2-fosfoglicolato (2PG)1. Per minimizzare gli effetti inibitori del 2PG e riciclare il carbonio precedentemente fissato, le piante C3 hanno sviluppato il processo multi-organellare della fotorespirazione. La fotorespirazione converte due molecole di 2PG in una molecola di 3-fosfoglicerato (3PGA), che può rientrare nel ciclo di fissazione del carbonio C31. Pertanto, la fotorespirazione converte solo il 75% del carbonio precedentemente fissato dalla generazione di 2PG e consuma ATP nel processo. Di conseguenza, il processo di fotorespirazione è un significativo trascinamento del 10% -50% sul processo fotosintetico, a seconda della disponibilità di acqua e delle temperature della stagione di crescita4.
Gli enzimi coinvolti nella fotorespirazione sono stati un’area di ricerca per decenni, ma solo un piccolo numero di proteine di trasporto sono state caratterizzate a livello genetico, anche se almeno 25 fasi di trasporto sono coinvolte nel processo 5,6,7. Le due proteine di trasporto direttamente coinvolte nel movimento del carbonio generato nel processo di fotorespirazione sono il trasportatore plastidico glicolato/glicerato PLGG1 e il trasportatore di sodio degli acidi biliari BASS6, entrambi coinvolti nell’esportazione di glicolato dal cloroplasto 5,6.
Sotto ambiente [CO2], Rubisco fissa una molecola di ossigeno a RuBP circa il 20% delle volte1. Quando le piante sono soggette a bassi [CO 2], i tassi di fotorespirazione aumentano, rendendo basso [CO2] un ambiente ideale per testare i mutanti che possono essere importanti sotto elevato stress fotorespiratorio. Il test di ulteriori linee di T-DNA della proteina di trasporto putativo del cloroplasto sotto bassa CO2 per 24 ore e la misurazione delle modifiche alla fluorescenza della clorofilla hanno portato all’identificazione di linee vegetali bass6-1 che hanno dimostrato unfenotipo mutante 5 della fotorespirazione. Un’ulteriore caratterizzazione ha dimostrato che BASS6 è un trasportatore di glicolato nella membrana interna del cloroplasto.
Questo articolo descrive in dettaglio un protocollo simile a quello inizialmente utilizzato per identificare BASS6 come trasportatore della fotorespirazione, che proveniva da una lista di proteine di trasporto putative situate all’interno della membrana del cloroplasto8 Questo protocollo può essere utilizzato in un esperimento ad alto rendimento che caratterizza i mutanti del T-DNA di Arabidopsis o le piante mutanti generate da EMS come un modo per identificare geni importanti per mantenere l’efficienza fotosintetica sotto una serie di stress abiotici come il calore, elevato stress luminoso, siccità e disponibilità di CO2 . Lo screening dei mutanti delle piante mediante fluorescenza clorofilliana è stato utilizzato in passato per identificare rapidamente geni importanti per il metabolismo primario9. Con ben il 30% del genoma di Arabidopsis contenente geni che codificano per proteine di funzione sconosciuta o scarsamente caratterizzata, l’analisi indotta dallo stress dell’efficienza fotosintetica potrebbe fornire informazioni sulle funzioni molecolari non osservate in condizioni controllate nelle piante mutanti10. L’obiettivo di questo metodo è identificare i mutanti della via fotorespiratoria utilizzando uno screening a bassa CO2 . Presentiamo un metodo per identificare i mutanti che interrompono la fotorespirazione dopo l’esposizione a basse emissioni di CO2. Un vantaggio di questo metodo è che si tratta di uno screening ad alto rendimento per piantine che può essere eseguito in un periodo di tempo relativamente breve. Le sezioni del protocollo video forniscono dettagli sulla preparazione e sterilizzazione delle sementi, sulla crescita delle piante e sul trattamento a bassa CO2 , sulla configurazione del sistema di imaging a fluorescenza, sulla misurazione della resa quantica dei campioni trattati, sui risultati rappresentativi e sulle conclusioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi sperimentali descritti in questo documento presentano alcuni vantaggi e limitazioni. Un vantaggio è che questo metodo può schermare molte piantine di piante, anche se devono essere prese alcune precauzioni per prevenire la contaminazione della piastra del supporto vegetale durante il processo di placcatura e crescita. Pertanto, è fondamentale sigillare le piastre di Arabidopsis con nastro chirurgico. Un altro vantaggio di questo esperimento è che ha un periodo di stress fotorespiratorio più breve di 12 ore …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata finanziata dal Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
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