הערכת היעילות הפוטוסינתטית במוטנטים פוטו-טראומטיים על ידי ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל

Summary

אנו מתארים גישה למדידת שינויים ביעילות הפוטוסינתטית בצמחים לאחר טיפול ב-CO₂ נמוך באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל.

Abstract

פוטוסינתזה ופוטו-רספירציה מייצגות את שטפי הפחמן הגדולים ביותר בחילוף החומרים הראשוני של הצמחים, והן נחוצות להישרדות הצמח. רבים מהאנזימים והגנים החשובים לפוטוסינתזה ולפוטו-רספירציה נחקרו היטב במשך עשרות שנים, אך היבטים מסוימים של המסלולים הביוכימיים האלה וההצלבה שלהם עם כמה תהליכים תת-תאיים עדיין אינם מובנים במלואם. חלק גדול מהעבודה שזיהתה את הגנים והחלבונים החשובים בחילוף החומרים בצמחים נערך בסביבות מבוקרות מאוד שאולי אינן מייצגות בצורה הטובה ביותר את האופן שבו פוטוסינתזה ופוטו-נשימה מתפקדות בסביבות טבעיות וחקלאיות. בהתחשב בכך שעקה אביוטית גורמת ליעילות פוטוסינתטית לקויה, יש צורך בפיתוח מסך בעל תפוקה גבוהה שיכול לנטר הן עקה אביוטית והן אחר השפעתה על הפוטוסינתזה.

לכן, פיתחנו שיטה מהירה יחסית לסינון שינויים הנגרמים על-ידי עקה אביוטית ביעילות הפוטוסינתטית, שיכולים לזהות גנים לא אופייניים עם תפקידים בפוטורספירציה באמצעות ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל ובדיקת CO₂ נמוכה. מאמר זה מתאר שיטה לחקר שינויים ביעילות הפוטוסינתטית במוטנטים של דנ"א מועבר (T-DNA) ב-Arabidopsis thaliana. ניתן להשתמש באותה שיטה לסינון מוטנטים המושרים על ידי אתיל מתנסולפונט (EMS) או להקרנה מדכאת. שימוש בשיטה זו יכול לזהות מועמדים לגנים למחקר נוסף בחילוף החומרים הראשוני של הצמח ובתגובות עקה אביוטיות. נתונים משיטה זו יכולים לספק תובנה לגבי תפקוד גנים שאולי לא ניתן לזהות עד לחשיפה לסביבות עקה מוגברות.

Introduction

תנאי עקה אביוטיים הנפוצים בשדות של חקלאים יכולים להשפיע לרעה על תנובת היבולים על ידי הפחתת היעילות הפוטוסינתטית. תנאים סביבתיים מזיקים כגון גלי חום, שינויי אקלים, בצורת ומליחות קרקע עלולים לגרום ללחצים אביוטיים שמשנים את זמינות ה-CO₂ ומפחיתים את תגובת הצמח לעקה גבוהה באור. שני שטפי הפחמן היבשתיים הגדולים ביותר הם פוטוסינתזה ופוטו-רסספירציה, החיוניים לצמיחת צמחים וליבולים. רבים מהחלבונים והאנזימים החשובים המעורבים בתהליכים אלה אופיינו בתנאי מעבדה וזוהו ברמה הגנטית¹. אף על פי שהושגה התקדמות רבה בהבנת הפוטוסינתזה והפוטו-רסספירציה, שלבים רבים, כולל מעבר בין אברוני צמחים, נותרים בלתי אופייניים ^2,3.

פוטו-רספירציה, שטף הפחמן השני בגודלו בצמחים לאחר הפוטוסינתזה, מתחילה כאשר האנזים רובסקו מתקן חמצן במקום פחמן דו-חמצני לריבולוז 1,5 ביספוספט (RuBP), ויוצר את התרכובת המעכבת 2-פוספוגליקולאט (2PG)¹. כדי למזער את ההשפעות המעכבות של 2PG ולמחזר את הפחמן שנקבע בעבר, צמחי C3 פיתחו את התהליך הרב-אורגנלרי של פוטו-רספירציה. פוטו-רספירציה ממירה שתי מולקולות של 2PG למולקולה אחת של 3-פוספוגליצראט (3PGA), שיכולה להיכנס מחדש למחזור קיבוע הפחמן C3¹. לפיכך, פוטו-רספירציה ממירה רק 75% מהפחמן שהיה קבוע בעבר מיצירת 2PG וצורכת ATP בתהליך. כתוצאה מכך, תהליך הפוטו-רספירציה הוא גרר משמעותי של 10%-50% על תהליך הפוטוסינתזה, תלוי בזמינות המים ובטמפרטורות בעונת הגידול⁴.

האנזימים המעורבים בפוטו-רספירציה היו מוקד מחקר במשך עשרות שנים, אך רק מספר קטן של חלבוני הובלה אופיינו ברמה הגנטית, למרות שלפחות 25 שלבי הובלה מעורבים בתהליך ^5,6,7. שני חלבוני ההובלה המעורבים ישירות בתנועת הפחמן שנוצר בתהליך הפוטו-רספירציה הם טרנספורטר גליקולאט/גליצריט פלסטידי PLGG1 וחומצת המרה נתרן סימפורטר BASS6, שניהם מעורבים בייצוא גליקולט מהכלורופלסט ^5,6.

תחת הסביבה [CO₂], רוביסקו מתקן מולקולת חמצן ל-RuBP בערך 20% מהזמן¹. כאשר צמחים נתונים לרמות נמוכות של [CO 2], שיעורי הפוטורספירציה עולים, מה שהופך את Low [CO₂] לסביבה אידיאלית לבדיקת מוטציות שעשויות להיות חשובות תחת עקה גבוהה של פוטו-רספירציה. בדיקת קווי T-DNA נוספים של חלבון הובלת כלורופלסט תחת CO₂ נמוך במשך 24 שעות ומדידת שינויים בכלורופיל פלואורסצנטי הובילו לזיהוי קווי צמחים של bass6-1 שהדגימו פנוטיפ מוטנטי של פוטו-רספירציה⁵. אפיון נוסף הראה כי BASS6 הוא טרנספורטר גליקולט בקרום הפנימי של הכלורופלסט.

מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול דומה למה ששימש בתחילה לזיהוי BASS6 כטרנספורטר פוטו-ספירציה, שהגיע מרשימה של חלבוני הובלה פוטטיביים הממוקמים בתוך קרום הכלורופלסט⁸ פרוטוקול זה יכול לשמש בניסוי בעל תפוקה גבוהה המאפיין מוטציות של Arabidopsis T-DNA או צמחים מוטנטיים שנוצרו על ידי EMS כדרך לזהות גנים החשובים לשמירה על יעילות פוטוסינתטית תחת מגוון של עקות אביוטיות כגון חום, מתח אור גבוה, בצורת וזמינות CO₂ . בדיקת מוטציות צמחיות באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל שימשה בעבר לזיהוי מהיר של גנים החשובים לחילוף חומרים ראשוני⁹. עם עד 30% מהגנום של Arabidopsis המכיל גנים המקודדים לחלבונים בעלי תפקוד לא ידוע או בעל מאפיינים גרועים, ניתוח המושרה על ידי עקה של יעילות פוטוסינתטית יכול לספק תובנה לגבי תפקודים מולקולריים שלא נצפו בתנאים מבוקרים בצמחים מוטנטיים¹⁰. מטרת שיטה זו היא לזהות מוטציות של המסלול הפוטו-רציונאלי באמצעות בדיקת CO₂ נמוכה. אנו מציגים שיטה לזיהוי מוטציות המשבשות את הפוטו-רספירציה לאחר חשיפה ל-CO₂ נמוך. יתרון של שיטה זו הוא שמדובר בסינון בתפוקה גבוהה עבור שתילים שניתן לעשות בפרק זמן קצר יחסית. פרקי פרוטוקול הווידאו מספקים פרטים על הכנה ועיקור זרעים, צמיחת צמחים וטיפול נמוך ב- CO₂ , תצורת מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית, מדידת התשואה הקוונטית של הדגימות המטופלות, תוצאות מייצגות ומסקנות.

Protocol

1. הכנת זרעים ועיקור

הערה: הכנת זרעים מורכבת מהטבעת זרעים ועיקור זרעים. חשוב לציין כי כל השלבים הללו יבוצעו במכסה מנוע זרימה למינרית כדי לשמור על תנאים סטריליים. כל החומרים, הריאגנטים ומדיות הגידול הדרושים חייבים להיות אוטומטיים (ראו טבלת החומרים).

1. ביבציה וריבוד זרעים
   הערה: קווי הזרעים שבהם נעשה שימוש הם plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) וסוג פראי (WT, Col-0).
   1. מחלקים את הזרעים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. טמיעים את הזרעים במים סטריליים במכסה מנוע זרימה למינרי ומרובדים ב-4 מעלות צלזיוס בחושך במשך יומיים.
2. עיקור זרעים
   1. בתנאים סטריליים, הכינו 10 מ"ל של תמיסת אקונומיקה 50% (v/v) והוסיפו כ-20 מיקרון של Tween 20. לעיקור זרעים, הסר מים מהזרעים המוטבעים, הוסף 1 מ"ל של תמיסת אקונומיקה לתוך צינורות microcentrifuge, ודגירה בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
   2. מוציאים את תמיסת האקונומיקה בעזרת פיפטה.
   3. שטפו את הזרעים ב-1 מ"ל מים סטריליים להחייאה. הסר את המים לאחר שהזרעים התיישבו לתחתית. חזור על שלב 1.6 ועל שלב 1.7 שבע פעמים.
   4. יש להשהות את הזרעים בתמיסת אגרוז סטרילית של 0.1%.
3. ציפוי זרעים
   1. הכינו נפח של 1 ליטר של Murashige & Skoog Basal Medium עם ויטמינים ו-1.0 גרם/ליטר של חומצה אתנוסולפונית (MS) 2-(N-morphonio)על ידי הוספת 5.43 גרם מהאבקה ל-500 מ"ל של מים מזוקקים. התאם את ה-pH בין 5.6 ל-5.8 באמצעות אשלגן הידרוקסיד (KOH). יש למלא עד 1 ליטר במים מזוקקים.
      1. יש לפצל את התמיסה הנוזלית ל-500 מ"ל ולהניח כל מחצית בבקבוקון בקוטר 1 ליטר המכיל מוט ערבוב מגנטי. הוסיפו 5 גרם אבקת אגר כדי לקבל תמיסת אגר עם 1% לכל בקבוקון.
      2. אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס ו 15 psi במשך 30 דקות; לאחר מכן, יש להניח בטמפרטורת החדר תוך כדי ערבוב איטי. כאשר מקורר, לשפוך 25 מ"ל של MS אגר לתוך צלחת פטרי מרובע. תנו לו להתמצק.
         הערה: צלחות בינוניות בסיסיות אלה של Murashige ו- Skoog מכילות 1% MS בינוני עם ויטמינים ו- 1% אגר לטיפוח המוטנטים הנבדקים.
   2. חותכים קצה פיפטה של 200 μL עם סכין גילוח. מקם זרע אחד במרכז הרשת המרובעת המיועדת לכל מוטציה או גנוטיפ של בדיקה (1 ס"מ² מרובע) של צלחת MS מרובעת (איור 1) באמצעות מיקרופיפטה של 200 μL.
      הערה: הרשת המרובעת בגודל 1 ס"מ על 1 ס"מ מסייעת לשמור על מרחק אחיד בין השתילים ולמנוע חפיפה, דבר שיהיה חשוב בהדמיה וניתוח פלואורסצנטיים מאוחרים יותר.
   3. לאחר שהזרעים מצופה, יש לעטוף בסרט כירורגי סביב המכסה כדי לאטום אותו, ולהניח אותו בתא הגידול בתנאים כמתואר להלן.

2. צמיחת צמחים וטיפול CO₂ נמוך

1. לגדל את הצמחים במשך 7-9 ימים ב 20 מעלות צלזיוס תחת מחזור אור של 8 שעות של 120 μmol·m−²s⁻¹ ו 16 שעות של חושך ב 18 °C. בדוק את הצמחים ביום השישי כדי לקבוע אם הם גדולים מספיק להדמיה. ביום השמיני לאחר הציפוי, חשפו את הצמחים ל-CO₂ נמוך.
2. טיפול ב-CO₂ נמוך
   1. לאחר 7-9 ימים, מקם ארבעה מתוך שמונת הלוחות מתנאי תא הגידול בסביבה לתנאים פוטו-טרנספוזיטיביים של 20 מעלות צלזיוס, רמות אור רציפות של 200 מיקרומול·m−2 s⁻¹, ו- CO₂ נמוך למשך ¹²שעות.
   2. בנה את מצב CO₂ נמוך באמצעות מיכל שקוף אטום עם 100 גרם של סיד סודה ממוקם בתחתית המיכל. מקמו את המיכל בתוך אותו תא גידול כמו הבקרה. יש לשמור על מפעלי הבקרה מתחת ל-120 μmol·m−2 s⁻¹ ב-CO_{2 סביבתי למשך} ¹²שעות.

3. הגדרת מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית

1. הניחו לוחית בדיקה (שהוכנה לפי סעיף 1 וסעיף 2) מרוכזת מתחת למצלמה במרחק קבוע במערכת ההדמיה הפלואורסצנטית.
2. בתוך תוכנת המכשיר, נווט אל חלון Live וסמן את התיבה Flashes כדי להפעיל הבזקי מדידה שאינם אקטיניים.
3. לחצו על הכלים ' זום ' ו'מיקוד' עד שתמונה מלאה וחדה נראית לעין. לשם כך, השתמשו בבמה או במדף כדי להתאים את המרחק בין הצמחים למצלמה. שמור על זום, מיקוד ומרחק קבועים מהמצלמה למשך כל הניסוי.
4. הגדר את הערך של El. Shutter ל- 0 וכוונן את הרגישות כדי לקבל אות פלואורסצנטי בטווח של 200-500 יחידות דיגיטליות.
   הערה: ערך תריס El. נמוך יותר (0-1) יבטיח שהבזקי המדידה לא יהיו אקטיניים, בעוד שערך גבוה יותר (2) ישפר את הרזולוציה של התמונה.
5. מקם מד אור באותו מיקום המשמש להתאמת הגדרות המצלמה.
6. בחלון חי, סמן את התיבה סופר כדי להתחיל פעימה רוויה הנמשכת 800 אלפיות השנייה. זכור לסמן את התיבה בכל פעם עבור דופק חדש.
7. השתמש במחוון כדי להתאים את אחוז ההספק היחסי של פולס העל עד שמד האור יקרא 6,000-8,000 μmol·m−²s⁻¹.

4. תכנן את תוכנית התשואה הקוונטית

1. ייבוא כלי הפעלה סטנדרטיים עבור מערכת ההדמיה.
   כלול את default.inc
   כלול אור.inc
   הערה: תחביר התוכנית המשמש לעיון בניסוי זה הוא עבור מערכת הדמיה של FluorCam.
2. הגדר את המשתנים הגלובליים הבאים בהתאם להגדרות התאורה שתצורתן נקבעה:
   תריס = 0
   רגישות = 40
   סופר = 65
3. כלול את שלב הזמן לרישום נתונים:
   TS = 20 אלפיות השנייה
4. אסוף את מדידת Fo על ידי דגימת פלואורסצנציה במצב מותאם כהה.
   F0duration = 2s;
   F0period = 200ms;
   הערה: F0duration מגדיר את טווח הזמן שבו נרשמת הפלואורסצנציה המותאמת לכהה. F0period מגדיר את מרווח הזמן שבו חוזרת על עצמה מדידת הפלואורסצנציה המותאמת לכהה.
5. הקלט את מדידות Fo בטבלאות נתונים.
   <0,F0period.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->מחסום, "startFo"
   =>מחסום,"endFo";
   כאשר < , > מייצג את קבוצת ערכי הפלואורסצנציה באינדקס לפי זמן; => מאחסן מדידות בקובץ מערכת; MFMSUB מייצג את כל מערך הנתונים של הניסוי; וצ'ק פוינט יוצרת תת-ערכה לנתונים של מדידות ספציפיות, כגון startFo.
6. אסוף ואחסן את מדידת Fm על ידי דגימת פלואורסצנציה לאחר פולס רווי.
   PulseDuration = 960ms; ##
   a1 = F0משך + 40 אלפיות השנייה
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>מחסום,"startFm"
   =>מחסום,"endFm"
   =>מחסום,"timeVisual";
   כאשר a1 ו - a2 הם משתנים לתיאום זמן הדגימה עם הדופק הרווי; a1 מייצג את זמן ההתחלה של מדידת Fm; ו-A2 מייצג את זמן נקודת האמצע של הדופק.

5. מדידת התפוקה הקוונטית של הדגימות המטופלות

1. מיד לאחר הטיפול, מכסים את הצלחות ברדיד אלומיניום למשך 15 דקות להסתגלות כהה. הסר את רדיד האלומיניום כדי למדוד את התפוקה הקוונטית של פוטוסיסטם II באמצעות פלואורומטר שעבר שינוי באמפליטודה של פולסים. לאחר מכן, הנח את צלחת השתיל ישירות מתחת למצלמה והפעל את פרוטוקול התפוקה הקוונטית שנמצא במאגר GitHub.
2. הורד את פרוטוקול quantum_yield מ- GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) או השתמש בתוכנית שתוכננה באופן דומה מסעיף 4. השתמש בתוכנת הפלואורומטר כדי לפתוח את קובץ התוכנית על ידי לחיצה על סמל התיקייה וניווט למיקום הקובץ.
3. הפעל את תוכנית התשואה הקוונטית על ידי לחיצה על סמל הברק האדום.
4. לאחר השלמת הפרוטוקול, נווט אל חלון הניתוח המקדים . חלקו את הצלחת לשתילים בודדים בעזרת כלי הבחירה לסימון כל הפיקסלים של כל שתיל בתמונת הלוחית. לחץ על אי-הכללת רקע כדי להסיר פיקסלים מסומנים ברקע, ולהשאיר רק את אזור השתיל.
5. לחץ על נתח כדי ליצור נתוני פלואורסצנציה עבור כל שתיל בתמונת הצלחת. התאם ידנית את טווח הערכים הפלואורסצנטיים כדי להציג ערכי מינימום ומקסימום עקביים בין כל הלוחות.
6. לחץ על ממוצע מספרי מהלשונית ניסוי | ייצוא | מספרית. בחר כל הנתונים ולפי עמודה ולחץ על אישור כדי ליצור קובץ טקסט המכיל מדידות QY עבור כל שתיל.

6. פתיחת קובץ הנתונים

1. פתח את קובץ הטקסט בגיליון אלקטרוני לניתוח. מבין הכותרות המציגות מספר שטח, גודל פיקסלים, Fm, Ft, Fq ו- QY, זהה את מספר השטח עבור גנוטיפ הליבה (WT או מוטנט בדיקה) ו- QYmax. בצע מבחן t זוגי ביחס לסוג פראי כדי לקבוע משמעות. נתונים מתפרשים כשונים באופן משמעותי כאשר ערכי p נמוכים מ- 0.05.

Representative Results

התוצאות מציגות תמונות לוח של תמונות גולמיות ופלואורסצנטיות מהקרנת סביבה ו-CO₂ נמוכה של WT ומוטציות בדיקה. כל צמח מסומן לפי מספר שטח, עם קריאות פלואורסצנטיות מתאימות הניתנות כ- QY. הנתונים מיוצאים כקובץ טקסט וניתן לפתוח אותם בגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח (ראה טבלה משלימה S1). קווים מוטנטיים plgg1-1 ו- abcb26 נבחרו כדי להדגים את הזיהוי החיובי והשלילי של גנים הקשורים ללחץ פוטו-טראומטי. PLGG1 מקודד עבור הטרנספורטר הראשון במסלול לאחר החמצון של RuBP⁶, בעוד ABCB26 נחשב לקודד עבור טרנספורטר אנטיגן שלא ידוע כי הוא מעורב בפוטורספירציה¹¹. יעילות ה-Fv/Fm QY המותאמת לחושך של WT ומוטנטים מוצגת באופן חזותי על ידי עלילות קופסה ושפם. כדי לבחון את ההפרש הסטטיסטי בין המוטנטים של WT למוטציות הבדיקה, נעשה שימוש במבחן t זוגי עם ערך p < 0.05. כאן, השתמשנו בקווים מוטנטיים פוטו-רציפים עם QY Fv/Fm מופחת כמוטנטים לבדיקה כדי לבדוק את היעילות של שיטת הסינון. התוצאות מראות כי למוטנטי הבדיקה יש יעילות QY נמוכה משמעותית מאשר WT. איור 3B מראה ירידה משמעותית ביחס בין פלואורסצנציה משתנה למקסימום (Fv/Fm) עבור plgg1-1 אך לא abcb26 ב-CO₂ נמוך. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם תפקידו של PLGG1 כטרנספורטר המעורב בפוטורספירציה, בעוד ש- abcb26 אינו מדגים פנוטיפ שונה מבקרת WT בתנאי CO₂ נמוכים. לפיכך, שיטת סינון זו יכולה לזהות מוטציות פוטו-טרנסמיטיביות באמצעות סינון CO₂ נמוך.

איור 1: דוגמה סכמטית של פריסת לוחות הזרעים. שני שכפולים טכניים מוצגים עם שישה זרעים הממוקמים בשורה. זרעי בקרת WT הממוקמים מעל זרעים מוטנטיים. קיצור: WT = סוג פראי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תמונות F_v/F_m מותאמות לחושך של שתילים בני 9 ימים. הבקרה מסוג פראי מושווית לקווים מוטנטיים של T-DNA בסביבה ו-CO₂ נמוך. סולם הצבעים מייצג את_{ה-F v}/F m הממוצע של כל שתיל. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. קיצורים: Fv/Fm = יחס של משתנה לפלואורסצנציה מקסימלית; WT = סוג פראי; plgg1-1 = טרנסלוקטור גליקולט/גליצריט פלסטי 1; abcb26 = קלטת כריכת ATP B26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: תצפיות פלואורסצנטיות. מדידות תפוקה קוונטית מקסימלית (Fv/Fm) שבוצעו על שתילים בתנאי סביבה (A) ו-(B) CO₂ נמוכים. הקופסאות מייצגות את הטווח שבין הרבעונים הפנימיים, הקווים בתוך הקופסאות מייצגים את החציוניים, והשפם מייצג את התצפיות המקסימליות והמינימליות. * מציין הבדל משמעותי בהתבסס על מבחן t זוגי ביחס ל- WT (n > 44, p < 0.05; טבלה משלימה S2). קיצורים: Fv/Fm = יחס של משתנה לפלואורסצנציה מקסימלית; WT = סוג פראי; plgg1-1 = טרנסלוקטור גליקולט/גליצריט פלסטי 1; abcb26 = קלטת כריכת ATP B26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה משלימה S1: נתונים פלואורסצנטיים שנאספו מכל צלחות השתילים ששימשו בניסוי. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S2: הסטטיסטיקה מדווחת מבדיקת t בין סוג הבר לבין שני הגנוטיפים המוטנטיים. מוטנטים נחשבים שונים באופן משמעותי מסוג פראי כאשר ערך ה-p נמוך מ-0.05. טבלה א' מייצגת בדיקות t המבוצעות על צמחים הגדלים ב-CO_{סביבתי 2}, ואילו טבלה ב' מייצגת בדיקות t המבוצעות על צמחים שגודלו ב-CO ₂ נמוך. t-Test: שני מדגמים בהנחה של שונות שווה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

לשיטות הניסוי המתוארות במאמר זה יש כמה יתרונות ומגבלות. יתרון אחד הוא ששיטה זו יכולה לסנן שתילי צמחים רבים, אם כי יש לנקוט באמצעי זהירות מסוימים כדי למנוע זיהום של צלחת המדיה הצמחית במהלך תהליך הציפוי והגידול. לכן, זה קריטי לאטום את לוחות Arabidopsis עם סרט כירורגי. יתרון נוסף של ניסוי זה הוא שיש לו תקופת לחץ קצרה יותר של 12 שעות בהשוואה לעבודה שפורסמה בעבר⁸. קיצור זמן הטיפול נועד להבחין טוב יותר בהבדלים ב-Fv/Fm בין ה-WT למוטנטים נבחרים. ייתכן שיהיה צורך לשנות את זמן הטיפול בהתאם לחומרת הפנוטיפ בזנים מוטנטיים ולרמת ה-CO₂ במערך הניסוי. מגבלה אחת, עם זאת, היא ששיטה זו דורשת שטח עלה גדול מספיק כדי שהפלואורומטר ימדוד וכדי שערכי Fv/Fm יחושבו אותו. התאמת זמן הגידול הראשוני של השתילים הנבדקים תבטיח שלתמונת הפלואורומטר יהיה שטח עלים מתאים למדידה עבור כל שתיל מבלי שהעלים יחפפו במהלך ההדמיה. יש לדמות את השתילים בעלים האמיתיים הראשונים כדי לשמור על גודל העלה וזוויות העלים אחידים. ניתן לשפר את רזולוציית התמונה על ידי הגדלת מהירות התריס והרגישות של המצלמה. פיקסלים שכנים יובחנו טוב יותר; עם זאת, הגברת הרגישות יותר מדי תחשוף יתר על המידה את המצלמה ותוביל למקסימום פלואורסצנטי כוזב. אופטימיזציה ופתרון בעיות עשויים להיות נחוצים כדי לאזן את ערכי הרזולוציה והפלואורסצנציה.

היכולת לסנן מוטנטים פוטוסינתטיים בהליך סטנדרטי היא חשובה. הוא יכול לאפשר שיטה עקבית בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי מוטציות של פוטו-רספירציה עם גנים בעלי עניין לפוטוסינתזה ולחילוף חומרים של פוטו-ספירספירציה. בסך הכל, בדיקת Fv/Fm בניתוח זה אורכת כ-30 שניות לצלחת שתילי צמחים, מה שמאפשר הקרנה של יותר מ-1,000 שתילים ביום. ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל מאפשר זיהוי של מוטנטים פוטו-טראומטיים באמצעות בדיקת CO₂ נמוכה, החשובה לשמירה על יעילות פוטו-נשימה. בהתחשב במספר הרב של טרנספורטרים לא ידועים שלפי התיאוריה נמצאים במסלול הפוטורספירציה³, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך במהירות את ההשפעה שיש לגנוטיפ על יעילות הפוטוסינתזה. בנוסף, פלואורומטרים יכולים למדוד היבטים אחרים של יעילות פוטוסינתטית כגון מרווה לא פוטוכימית ויעילות הפעלה של מערכת פוטו-סיסטם II. פרוטוקולים נוספים אלה אורכים זמן רב יותר לכל צלחת שתיל, אך ניתן להשתמש בהם לניתוח נוסף ורגיש יותר, בניגוד למסך מהיר זה של מוטנטים בעלי תפוקה גבוהה. שיטה זו אינה מוגבלת לערבידופסיס וניתן גם להתאים אותה לסינון מוטציות T-DNA במגוון תנאי עקה אביוטיים אחרים כגון טמפרטורות גבוהות ונמוכות, עקת אור גבוהה ותנאי בצורת כדי לזהות גנים החשובים לפוטוסינתזה ופוטו-ספירציה. כל שינוי נוסף יצטרך להיות מותאם על בסיס אישי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	VWR	10810-070	container for seed sterilization
agarose	VWR	9012-36-6	chemical used to suspend seeds for ease of plating
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_085232	arabidopsis seeds used as experimental group
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	SALK_053469C	parental arabidopsis seeds
Arabidopsis thaliana seeds (WT)	ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org	Col-0	arabidopsis wild type seeds used as a control group
bleach	clorox	generic bleach	chemical used to sterilize seeds
Carbolime absorbent	Medline products	S232-104-001	CO2 absorbent
Closed FluorCam	Photon Systems Instruments	FC 800-C	Fluorescence imager
FluoroCam FC 800-C	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence imager
FluoroCam7	Photon Systems Instruments	Closed FluorCam FC 800-C/1010-S	Fluorescence image analysis software
Gelzan (plant agar)	Phytotech labs	71010-52-1	chemical used to solidify MS media as plates
glass flask 1 L	Fisherbrand	FB5011000	container for making and autoclaving MS media
growth chamber	caron	7317-50-2	growth chamber used to grow plants
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS)	Phytotech labs	M5531	growth media for arabidopsis seedlings
potassium Hydroxide (KOH)	Phytotech labs	1310-58-3	make as 1 M solution for ph adjustment
spider lights	Mean Well Enterprises	XLG-100-H-AB	lights used in the light assay
Square Petri Dish with Grid, sterile	Simport Scientific	D21016	used to hold MS media for arabidopsis seedlings
surgical tape	3M	1530-1	tape used to seal plates
tween 20	biorad	9005-64-5	surfactant used to assist seed sterilization