הערכת היעילות הפוטוסינתטית במוטנטים פוטו-טראומטיים על ידי ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל
Summary
אנו מתארים גישה למדידת שינויים ביעילות הפוטוסינתטית בצמחים לאחר טיפול ב-CO2 נמוך באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל.
Abstract
פוטוסינתזה ופוטו-רספירציה מייצגות את שטפי הפחמן הגדולים ביותר בחילוף החומרים הראשוני של הצמחים, והן נחוצות להישרדות הצמח. רבים מהאנזימים והגנים החשובים לפוטוסינתזה ולפוטו-רספירציה נחקרו היטב במשך עשרות שנים, אך היבטים מסוימים של המסלולים הביוכימיים האלה וההצלבה שלהם עם כמה תהליכים תת-תאיים עדיין אינם מובנים במלואם. חלק גדול מהעבודה שזיהתה את הגנים והחלבונים החשובים בחילוף החומרים בצמחים נערך בסביבות מבוקרות מאוד שאולי אינן מייצגות בצורה הטובה ביותר את האופן שבו פוטוסינתזה ופוטו-נשימה מתפקדות בסביבות טבעיות וחקלאיות. בהתחשב בכך שעקה אביוטית גורמת ליעילות פוטוסינתטית לקויה, יש צורך בפיתוח מסך בעל תפוקה גבוהה שיכול לנטר הן עקה אביוטית והן אחר השפעתה על הפוטוסינתזה.
לכן, פיתחנו שיטה מהירה יחסית לסינון שינויים הנגרמים על-ידי עקה אביוטית ביעילות הפוטוסינתטית, שיכולים לזהות גנים לא אופייניים עם תפקידים בפוטורספירציה באמצעות ניתוח פלואורסצנציה של כלורופיל ובדיקת CO2 נמוכה. מאמר זה מתאר שיטה לחקר שינויים ביעילות הפוטוסינתטית במוטנטים של דנ”א מועבר (T-DNA) ב-Arabidopsis thaliana. ניתן להשתמש באותה שיטה לסינון מוטנטים המושרים על ידי אתיל מתנסולפונט (EMS) או להקרנה מדכאת. שימוש בשיטה זו יכול לזהות מועמדים לגנים למחקר נוסף בחילוף החומרים הראשוני של הצמח ובתגובות עקה אביוטיות. נתונים משיטה זו יכולים לספק תובנה לגבי תפקוד גנים שאולי לא ניתן לזהות עד לחשיפה לסביבות עקה מוגברות.
Introduction
תנאי עקה אביוטיים הנפוצים בשדות של חקלאים יכולים להשפיע לרעה על תנובת היבולים על ידי הפחתת היעילות הפוטוסינתטית. תנאים סביבתיים מזיקים כגון גלי חום, שינויי אקלים, בצורת ומליחות קרקע עלולים לגרום ללחצים אביוטיים שמשנים את זמינות ה-CO2 ומפחיתים את תגובת הצמח לעקה גבוהה באור. שני שטפי הפחמן היבשתיים הגדולים ביותר הם פוטוסינתזה ופוטו-רסספירציה, החיוניים לצמיחת צמחים וליבולים. רבים מהחלבונים והאנזימים החשובים המעורבים בתהליכים אלה אופיינו בתנאי מעבדה וזוהו ברמה הגנטית1. אף על פי שהושגה התקדמות רבה בהבנת הפוטוסינתזה והפוטו-רסספירציה, שלבים רבים, כולל מעבר בין אברוני צמחים, נותרים בלתי אופייניים 2,3.
פוטו-רספירציה, שטף הפחמן השני בגודלו בצמחים לאחר הפוטוסינתזה, מתחילה כאשר האנזים רובסקו מתקן חמצן במקום פחמן דו-חמצני לריבולוז 1,5 ביספוספט (RuBP), ויוצר את התרכובת המעכבת 2-פוספוגליקולאט (2PG)1. כדי למזער את ההשפעות המעכבות של 2PG ולמחזר את הפחמן שנקבע בעבר, צמחי C3 פיתחו את התהליך הרב-אורגנלרי של פוטו-רספירציה. פוטו-רספירציה ממירה שתי מולקולות של 2PG למולקולה אחת של 3-פוספוגליצראט (3PGA), שיכולה להיכנס מחדש למחזור קיבוע הפחמן C31. לפיכך, פוטו-רספירציה ממירה רק 75% מהפחמן שהיה קבוע בעבר מיצירת 2PG וצורכת ATP בתהליך. כתוצאה מכך, תהליך הפוטו-רספירציה הוא גרר משמעותי של 10%-50% על תהליך הפוטוסינתזה, תלוי בזמינות המים ובטמפרטורות בעונת הגידול4.
האנזימים המעורבים בפוטו-רספירציה היו מוקד מחקר במשך עשרות שנים, אך רק מספר קטן של חלבוני הובלה אופיינו ברמה הגנטית, למרות שלפחות 25 שלבי הובלה מעורבים בתהליך 5,6,7. שני חלבוני ההובלה המעורבים ישירות בתנועת הפחמן שנוצר בתהליך הפוטו-רספירציה הם טרנספורטר גליקולאט/גליצריט פלסטידי PLGG1 וחומצת המרה נתרן סימפורטר BASS6, שניהם מעורבים בייצוא גליקולט מהכלורופלסט 5,6.
תחת הסביבה [CO2], רוביסקו מתקן מולקולת חמצן ל-RuBP בערך 20% מהזמן1. כאשר צמחים נתונים לרמות נמוכות של [CO 2], שיעורי הפוטורספירציה עולים, מה שהופך את Low [CO2] לסביבה אידיאלית לבדיקת מוטציות שעשויות להיות חשובות תחת עקה גבוהה של פוטו-רספירציה. בדיקת קווי T-DNA נוספים של חלבון הובלת כלורופלסט תחת CO2 נמוך במשך 24 שעות ומדידת שינויים בכלורופיל פלואורסצנטי הובילו לזיהוי קווי צמחים של bass6-1 שהדגימו פנוטיפ מוטנטי של פוטו-רספירציה5. אפיון נוסף הראה כי BASS6 הוא טרנספורטר גליקולט בקרום הפנימי של הכלורופלסט.
מאמר זה מתאר בפירוט פרוטוקול דומה למה ששימש בתחילה לזיהוי BASS6 כטרנספורטר פוטו-ספירציה, שהגיע מרשימה של חלבוני הובלה פוטטיביים הממוקמים בתוך קרום הכלורופלסט8 פרוטוקול זה יכול לשמש בניסוי בעל תפוקה גבוהה המאפיין מוטציות של Arabidopsis T-DNA או צמחים מוטנטיים שנוצרו על ידי EMS כדרך לזהות גנים החשובים לשמירה על יעילות פוטוסינתטית תחת מגוון של עקות אביוטיות כגון חום, מתח אור גבוה, בצורת וזמינות CO2 . בדיקת מוטציות צמחיות באמצעות פלואורסצנציה של כלורופיל שימשה בעבר לזיהוי מהיר של גנים החשובים לחילוף חומרים ראשוני9. עם עד 30% מהגנום של Arabidopsis המכיל גנים המקודדים לחלבונים בעלי תפקוד לא ידוע או בעל מאפיינים גרועים, ניתוח המושרה על ידי עקה של יעילות פוטוסינתטית יכול לספק תובנה לגבי תפקודים מולקולריים שלא נצפו בתנאים מבוקרים בצמחים מוטנטיים10. מטרת שיטה זו היא לזהות מוטציות של המסלול הפוטו-רציונאלי באמצעות בדיקת CO2 נמוכה. אנו מציגים שיטה לזיהוי מוטציות המשבשות את הפוטו-רספירציה לאחר חשיפה ל-CO2 נמוך. יתרון של שיטה זו הוא שמדובר בסינון בתפוקה גבוהה עבור שתילים שניתן לעשות בפרק זמן קצר יחסית. פרקי פרוטוקול הווידאו מספקים פרטים על הכנה ועיקור זרעים, צמיחת צמחים וטיפול נמוך ב- CO2 , תצורת מערכת ההדמיה הפלואורסצנטית, מדידת התשואה הקוונטית של הדגימות המטופלות, תוצאות מייצגות ומסקנות.
Protocol
Representative Results
Discussion
לשיטות הניסוי המתוארות במאמר זה יש כמה יתרונות ומגבלות. יתרון אחד הוא ששיטה זו יכולה לסנן שתילי צמחים רבים, אם כי יש לנקוט באמצעי זהירות מסוימים כדי למנוע זיהום של צלחת המדיה הצמחית במהלך תהליך הציפוי והגידול. לכן, זה קריטי לאטום את לוחות Arabidopsis עם סרט כירורגי. יתרון נוסף של ניסוי זה הוא שיש …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי מועצת המנהלים של לואיזיאנה (AWD-AM210544).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
| agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
| Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
| Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
| Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
| bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
| Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
| Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
| FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
| FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
| Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
| glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
| growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
| Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
| potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
| spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
| Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
| surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
| tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |
References
- Peterhansel, C., et al. Photorespiration. Arabidopsis Book. 8, 0130 (2010).
- Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration. Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).
- Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. Towards closing the remaining gaps in photorespiration–the essential but unexplored role of transport proteins. Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).
- Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. The costs of photorespiration to food production now and in the future. Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).
- South, P. F., et al. Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).
- Pick, T. R., et al. PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).
- Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism. Plants. 10 (5), 880 (2021).
- Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants. Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).
- Ogawa, T., Sonoike, K. Screening of mutants using chlorophyll fluorescence. Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).
- Kleffmann, T., et al. The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions. Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).
- Hempel, J. J. . Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana. , (2018).
