Summary
يتم تقديم بروتوكول لمعالجة قوقعة الجربيل لدى البالغين والمسنين عن طريق وضع العلامات المناعية على الهياكل المشبكية وخلايا الشعر ، وإخماد التألق الذاتي في الأنسجة القديمة ، وتشريح وتقدير طول القوقعة ، وتحديد نقاط الاشتباك العصبي في أكوام الصور التي تم الحصول عليها باستخدام التصوير البؤري.
Abstract
يفترض أن فقدان نقاط الاشتباك العصبي الشريطية التي تربط خلايا الشعر الداخلية والألياف العصبية السمعية القريبة هو أحد أسباب فقدان السمع المرتبط بالعمر. الطريقة الأكثر شيوعا للكشف عن فقدان نقاط الاشتباك العصبي الشريطية هي وضع العلامات المناعية لأنها تسمح بأخذ العينات الكمية من عدة مواقع تونوتوبية في قوقعة واحدة. ومع ذلك ، يتم دفن الهياكل ذات الأهمية في عمق القوقعة العظمية. تستخدم الجربلات كنموذج حيواني لفقدان السمع المرتبط بالعمر. هنا ، يتم وصف البروتوكولات الروتينية للتثبيت ، ووضع العلامات المناعية على حوامل القوقعة الصناعية الجربيل ، والتصوير البؤري ، وتحديد أعداد وأحجام المشبك الشريطي كميا. علاوة على ذلك ، يتم تسليط الضوء على التحديات الخاصة المرتبطة بالحصول على مواد جيدة من الأفراد المسنين القيمين.
يتم قتل الجربلات بالقتل الرحيم وإما أن يتم تأديلها عن طريق القلب والأوعية الدموية ، أو يتم تشريح الفقاعات الطبلية بعناية من الجمجمة. يتم فتح القوقعة في القمة والقاعدة ونقلها مباشرة إلى المثبت. بغض النظر عن الطريقة الأولية ، يتم تثبيت القوقعة بعد ذلك ثم إزالة الكلس. ثم يتم تصنيف الأنسجة بأجسام مضادة أولية ضد الهياكل والخلايا الشعرية قبل وبعد المشبكي. بعد ذلك ، يتم احتضان القوقعة بأجسام مضادة ثانوية موسومة بالتألق تكون محددة ضد الأجسام المضادة الأولية الخاصة بكل منها. ثم يتم التعامل مع قوقعة الأذن من الجربلات المسنة باستخدام مبرد التألق الذاتي لتقليل التألق الخلفي الكبير عادة لأنسجة الحيوانات الأكبر سنا.
أخيرا ، يتم تشريح القوقعة إلى 6-11 جزءا. يتم إعادة بناء طول القوقعة الصناعية بالكامل بحيث يمكن تحديد مواقع قوقعة صناعية محددة بشكل موثوق بين الأفراد. تساعد مكدسات الصور البؤرية ، التي يتم الحصول عليها بالتتابع ، على تصور خلايا الشعر ونقاط الاشتباك العصبي في المواقع المختارة. يتم فك المكدسات متحدة البؤرة ، ويتم حساب نقاط الاشتباك العصبي إما يدويا باستخدام ImageJ ، أو يتم إجراء تحديد كمي أكثر شمولا للهياكل المشبكية باستخدام إجراءات تحليل الصور المكتوبة خصيصا في Matlab.
Introduction
فقدان السمع المرتبط بالعمر هو واحد من أكثر الأمراض انتشارا في العالم التي تؤثر على أكثر من ثلث سكان العالم الذين تتراوح أعمارهم بين 65 سنة وما فوق1. لا تزال الأسباب الكامنة وراء ذلك قيد النقاش ويجري التحقيق فيها بنشاط ولكنها قد تشمل فقدان نقاط الاشتباك العصبي المتخصصة التي تربط خلايا الشعر الداخلية (IHCs) بالألياف العصبية السمعيةالقريبة 2. تتكون هذه المشابك الشريطية من بنية ما قبل المشبكي تحتوي على حويصلات مملوءة بغلوتامات الناقل العصبي المربوطة بها ، بالإضافة إلى مستقبلات الغلوتامات α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA)بعد المشبكي 3,4,5. في الجربيل ، ~ 20 من الألياف العصبية السمعية القريبة الاتصال واحد IHC 6,7,8. وتعارض الألياف الموجودة على المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التي تواجه الموديولوس الشرائط المشبكية الكبيرة، في حين أن الألياف المتصلة على جانب العمود من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية تواجه شرائط متشابكة صغيرة (أي في القطط9، والجربلات7، وخنازير غينيا10، والفئران3،11،12،13،14). علاوة على ذلك ، في الجربيل ، يرتبط حجم الشرائط قبل المشبكي وبقع الغلوتامات ما بعد المشبكي ارتباطا إيجابيا 7,14. الألياف التي تعارض الشرائط الكبيرة على الجانب المعياري من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية صغيرة في العيار ولها معدلات عفوية منخفضة وعتبات عالية15. هناك أدلة على أن الألياف ذات المعدل التلقائي المنخفض أكثر عرضة للتعرض للضوضاء10 والأدوية السامة للأذن 16 من الألياف منخفضة العتبة عالية العفوية ، والتي تقع على جانب العمود من IHCs15.
فقدان نقاط الاشتباك العصبي الشريطية هو أقرب حدث تنكسي في فقدان السمع العصبي المرتبط بالعمر القوقعي ، في حين أن فقدان الخلايا العقدية الحلزونية وأليافها العصبية السمعية المرتبطة بها يتخلف عن17,18. تشمل الارتباطات الكهروفسيولوجية تسجيلات استجابات جذع الدماغ السمعية17 وإمكانات العمل المركب8 ؛ ومع ذلك ، فإن هذه لا تعكس التفاصيل الدقيقة لفقدان المشبك العصبي ، لأن الألياف ذات المعدل التلقائي المنخفض لا تساهم في هذه التدابير16. المقاييس الكهروفسيولوجية الكهربية الواعدة هي المؤشر العصبي المشتق من جهد الكتلة19 والاستجابة الزمنية المحيطة بالتحفيز20. ومع ذلك ، لا يمكن الاعتماد عليها إلا إذا لم يكن لدى الحيوان أمراض قوقعة الأذن الأخرى ، بخلاف فقدان الألياف العصبية السمعية ، والتي تؤثر على نشاط الألياف العصبية السمعية المتبقية8. علاوة على ذلك ، لم تكن العتبات التي تم تقييمها سلوكيا في الجربيل مرتبطة بأرقام المشبك21. لذلك ، لا يمكن الاعتماد على القياس الكمي لنقاط الاشتباك العصبي الشريطية الباقية على قيد الحياة ، وبالتالي ، فإن عدد الألياف العصبية السمعية الوظيفية لا يمكن تحقيقه إلا من خلال الفحص المباشر لأنسجة القوقعة الصناعية.
الجربيل المنغولي (Meriones unguiculatus) هو نموذج حيواني مناسب لدراسة فقدان السمع المرتبط بالعمر. له عمر افتراضي قصير ، ولديه سمع منخفض التردد مشابه للبشر ، وسهل الصيانة ، ويظهر أوجه تشابه مع الأمراض البشرية المتعلقة بفقدان السمع المرتبط بالعمر2،22،23،24. تعتبر الجربلات مسنة عندما تصل إلى 36 شهرا من العمر ، وهو ما يقرب من نهاية متوسط عمرهاالافتراضي 22. الأهم من ذلك ، تم إثبات فقدان مرتبط بالعمر من نقاط الاشتباك العصبي الشريطية في الجربلات التي تم تربيتها وعمرها في بيئات هادئة 8,21.
هنا ، يتم تقديم بروتوكول للتسمية المناعية ، وتشريح ، وتحليل القوقعة من الجربلات من مختلف الأعمار ، من الشباب إلى كبار السن. يتم استخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد مكونات ما قبل المشبك (CtBP2) ، وبقع مستقبلات الغلوتامات بعد المشبكية (GluA2) ، و IHCs (myoVIIa). يتم تطبيق مبرد التألق الذاتي الذي يقلل من الخلفية في القوقعة القديمة ويترك إشارة التألق سليمة. علاوة على ذلك ، يتم إعطاء وصف لكيفية تشريح القوقعة لفحص كل من الظهارة الحسية والأوعية الدموية stria. يتم قياس طول القوقعة الصناعية لتمكين اختيار مواقع القوقعة الصناعية المتميزة التي تتوافق مع أفضل الترددات المحددة25. يتم إجراء القياس الكمي لأرقام المشبك باستخدام البرنامج المتاح مجانا ImageJ26. يتم إجراء تقدير كمي إضافي لأحجام ومواقع المشبك داخل HC الفردي باستخدام برنامج مخصص مكتوب في Matlab. لا يتم توفير هذا البرنامج للجمهور ، حيث يفتقر المؤلفون إلى الموارد اللازمة لتوفير الوثائق المهنية والدعم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات والإجراءات من قبل السلطات المختصة في ولاية سكسونيا السفلى ، ألمانيا ، مع أرقام التصاريح AZ 33.19-42502-04-15/1828 و 33.19-42502-04-15/1990. هذا البروتوكول مخصص للجربيلات المنغولية (M. unguiculatus) من كلا الجنسين. يشير الشباب البالغين إلى عمر 3-12 شهرا ، في حين يعتبر الجربوع في سن 36 شهرا فما فوق. عندما لا يذكر خلاف ذلك ، يمكن تحضير المخازن المؤقتة والمحاليل وتخزينها في الثلاجة لمدة تصل إلى عدة أشهر (4-8 درجات مئوية). قبل الاستخدام ، تأكد من أن المخازن المؤقتة والحلول لم تترسب.
1. التثبيت وجمع الأعضاء
ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة فقط إلى القوقعة ، فمن المستحسن تنفيذ إجراء أبسط إلى حد ما للتثبيت عن طريق الغمر. ومع ذلك ، إذا كانت هناك حاجة أيضا إلى دماغ محفوظ جيدا ، فإن التروية عبر القلب هي الخيار الوحيد. المثبت في كلتا الحالتين هو 4٪ بارافورمالديهايد (PFA) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يجب أن يكون هذا طازجا ولكن يمكن تخزينه مجمدا حتى الاستخدام. استخدم الأليكوتات ~ 300 مل لتروية عبر القلب أو ~ 50-100 مل لكل قوقعة للتثبيت عن طريق الغمر.
تحذير: PFA مادة خطرة. التعامل معها وفقا لإجراءات السلامة المخبرية العامة.
- التثبيت عن طريق التروية عبر القلب
- اغسل إعداد التروية حتى تصبح الأنابيب خالية من أي فقاعات هواء. املأ أنابيب التروية ب PBS التي تحتوي على الهيبارين (0.2 مل في 100 مل من PBS) لمنع تخثر الدم. أوقف التدفق بمجرد ملء الأنابيب ب PBS وإفراغ زجاجة تخزين السوائل للتو ؛ صب 200 مل من PFA المذاب فيه.
ملاحظة: الإعداد جاهز الآن للحيوان. PBS المتبقية في الأنابيب كافية لطرد الدم وسوف يتبعها تلقائيا المثبت بمجرد استئناف التدفق. - تأكد من وجود نظام لجمع النفايات لتدفق PFA إلى الخارج. استخدم قنية طازجة (19 جم) واحصل على مقص كبير ، ملقط (مع طرف مسطح) ، مرقئ ، مشرط أو قنية حادة ، وحصيرة مطاطية مع دبابيس في متناول اليد.
- القتل الرحيم للجربيل بجرعة زائدة داخل الصفاق من البنتوباربيتال (160 ملغ / مل ، 0.3 مل لكل ، نطاق وزن الجسم: 50-120 جم). ضع الحيوان مرة أخرى في قفصه. عندما يبدأ توقف التنفس بحيث يصبح التنفس غير منتظم مع فترات من 30 ثانية أو أكثر ، ضع الجربيل على ظهره على الحصيرة المطاطية وقم بإصلاح كل من الكفوف الأمامية والمخلب الخلفي مع دبابيس (اترك مخلبا خلفيا واحدا حرا للتحرك للحصول على حكم أفضل على نجاح التروية ؛ انظر الملاحظة بعد الخطوة 1.1.7).
- لفتح التجويف الصدري ، ارفع الجلد فوق القص بالملقط واقطع الجلد حوالي 0.5 سم أسفل القص بالمقص حتى تصبح العملية البيضاء اللون xiphoideus مرئية. امسك القص في العملية xiphoideus مع ملقط وقطع على طول الحجاب الحاجز للحصول على رؤية جيدة في التجويف الصدري. قطع الأضلاع أفقيا على كلا الجانبين حتى يكون هناك وصول جيد إلى القلب. تأكد من أن زاوية المقص متوازية ومسطحة بالنسبة لجسم الجربيل لتجنب تلف الأعضاء ، وبالتالي ضمان نظام الدورة الدموية المغلق.
- قم بتثبيت مرقأ على القص ، وارفع القفص الصدري ، وضع المرقأة على كتف الجربيل دون وضع المرقأة على أي أجزاء من الجسم لتجنب منع تدفق الدم.
- افتح تدفق السائل قليلا حتى تتدفق قطرة واحدة من PBS من القنية (19 جم) كل 2 ثانية تقريبا. امسك القلب بالملقط وحوله قليلا إلى اليسار بحيث يمكن رؤية البطين الأيسر بوضوح. أدخل القنية في البطين الأيسر بزاوية تتجنب اختراق الحاجز. امسك الإبرة في مكانها إما باليد أو بمرقئ آخر.
ملاحظة: يمكن تمييز البطينين الأيسر والأيمن من خلال درجات ألوانهما المختلفة. يبدو البطين الأيسر أخف لونا من بقية أنسجة القلب. - قم بزيادة ضغط تدفق السوائل ببطء وافتح الأذين الأيمن إما بمقص ناعم أو مشرط أو قنية أخرى. افتح تدفق السائل أكثر حتى يتم ملاحظة ما يقرب من 2-3 قطرات / ثانية في غرفة التنقيط ، أو قم بتعيين تدفق قدره 4 مل / دقيقة للمضخة. بمجرد تثبيت القلب ، تأكد من بقاء قنية التروية في مكانها دون أن يتم تثبيتها أكثر من ذلك.
ملاحظة: علامات التروية الناجحة هي تقلصات العضلات البطيئة ، وتصلب الرقبة والأطراف ، والكبد يصبح شاحبا ، والرئتين الوردية. علامة التروية غير الناجحة هي تبييض الرئتين ، مما يشير إلى أن الدورة الدموية الرئوية منتشرة بسبب ثقب الحاجز. - في حالة التروية غير الناجحة ، حاول تحريك القنية إلى أعلى ، إلى الشريان الأورطي ، وتثبيتها في مكانها باستخدام مرقئ.
- قطع رأس الجربيل. قم بإزالة الفقاعات وقطع عظامها وكسرها كما هو موضح في الخطوة 1.2.2.
ملاحظة: إذا لم يكن النسيج ثابتا بما فيه الكفاية ، فسوف تزيح الظهارة الحسية من عضو Corti أثناء التشريح. - إذا لم تظهر التروية أي علامات على التثبيت في غضون 5-10 دقائق ، فقم بإجهاضها واتبع الإجراء أدناه على الفور للتثبيت عن طريق الغمر. لذلك ، عالج القوقعة كما في الخطوة 1.2.2 وقم بتثبيت الأنسجة في حوالي 50-80 مل من PFA بنسبة 4٪ في حاويات غطاء لولبي لمدة 1-2 أيام على شاكر ثنائي الأبعاد عند 8 درجات مئوية.
ملاحظة: نظرا لأنه قد يكون من الصعب في نهاية المطاف تقييم جودة التثبيت أثناء التروية، فمن المستحسن نشر القوقعة بشكل روتيني كما هو موضح.
- اغسل إعداد التروية حتى تصبح الأنابيب خالية من أي فقاعات هواء. املأ أنابيب التروية ب PBS التي تحتوي على الهيبارين (0.2 مل في 100 مل من PBS) لمنع تخثر الدم. أوقف التدفق بمجرد ملء الأنابيب ب PBS وإفراغ زجاجة تخزين السوائل للتو ؛ صب 200 مل من PFA المذاب فيه.
- التثبيت عن طريق غمر الأنسجة
- القتل الرحيم للجربلات بجرعة زائدة داخل الصفاق من البنتوباربيتال (160 ملغ / مل ، 0.3 مل لكل ، نطاق وزن الجسم: 50-120 جم). عندما يتوقف الجربيل عن التنفس ، اقطع رأس الحيوان.
- قم بإزالة الفقاعات وقطع وكسر عظامها بالمقص والملقط ، على التوالي ، للوصول إلى القوقعة. قم بإزالة قنوات maellus و incus والقنوات نصف الدائرية. قم بعمل ثقوب صغيرة في القمة وفي المنعطف القاعدي عن طريق خدش عظم القوقعة بعناية باستخدام ملقط. انقل الفقاعات على الفور إلى فائض من المثبت البارد (50 مل على الأقل) وقم بإصلاح الأنسجة في البرد (4-8 درجة مئوية) تحت إثارة لطيفة (2D-shaker [100 دورة في الدقيقة]) لمدة يومين.
ملاحظة: بعد إصلاح الأنسجة ، يمكن معالجة القوقعة على الفور أو تخزينها في PBS مع 0.05٪ من أزيد الصوديوم. تحذير: أزيد الصوديوم سام. لاحظ أن طول التخزين قد يؤثر سلبا على جودة التلطيخ. وقد أشارت تجارب محدودة إلى أن تلطيخ المناعة بدا أضعف بعد 2 سنوات من تخزين الأنسجة في أزيد الصوديوم.
2. إعداد الأنسجة ووضع العلامات المناعية
- قم بإذابة مسحوق حمض الإيثيلين ديامين رباعي أسيتيك (EDTA) في PBS لإنتاج محلول 0.5 M عند درجة الحموضة 8. لهذا ، ضع دورقا على مقلب مغناطيسي ، واملأه بما يقرب من نصف الكمية الإجمالية ل PBS ، وأضف الكمية المناسبة من مسحوق EDTA ، مما يؤدي إلى تعليق حمضي. أضف بعناية محلول هيدروكسيد الصوديوم المركز (NaOH) أثناء مراقبة الرقم الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني. املأ PBS إلى الحجم النهائي المطلوب وقم بتصفية المحلول لمنع التلوث الميكروبي.
ملاحظة: لن يذوب مسحوق EDTA تماما إلا بعد وصول التعليق إلى قيمة حموضة محايدة. - لإزالة الكلس ، انقل القوقعة إلى 80 مل من 0.5 M EDTA في PBS. احتضان الأنسجة في البرد (4-8 درجة مئوية) تحت إثارة لطيفة على 2D-shaker (100 دورة في الدقيقة) لمدة يومين.
ملاحظة: بعد خطوة إزالة الكلس ، يمكن تخزين الأنسجة في PBS لعدة أيام تصل إلى 3 أسابيع قبل المتابعة مع خطوات المعالجة المتبقية. بالنسبة للأجسام المضادة التي تضع علامة على الأوعية الدموية stria ، ينصح بقطع القوقعة إلى النصف على طول محور modiolar في هذه المرحلة (أي قبل التلطيخ المناعي) لضمان الوصول الموحد للأجسام المضادة إلى أهدافها. هذا يعتمد على الأجسام المضادة ولا ينطبق على الأجسام المضادة المستخدمة هنا لتسمية الهياكل المتشابكة و IHCs. استخدم قطعة من شفرة الحلاقة القابلة للكسر وحامل شفرة (كما هو موضح في الخطوة 4.2) للقطع. - نفذ الخطوات التالية (حتى الخطوة 3.2) في أنبوبي تفاعل آمنين الختم مل (2 مل). إذا كانت قطعة الأنسجة كبيرة جدا بحيث لا يمكن وضعها داخل الأنبوب ، فقم بقص الأنسجة الزائدة بالمقص. لتحسين اختراق الأجسام المضادة ، قم أولا باختراق الأنسجة في 1 مل من 1٪ triton (Triton X-100) في PBS على 2D-shaker (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. اغسل المنديل 3x بسعة 1 مل من 0.2٪ triton (Triton X-100) في PBS على شاكر 2D (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لكل منهما.
- لمنع المستضدات غير المحددة ، احتضن القوقعة في 1 مل من محلول الحجب (3٪ ألبومين مصل البقر [BSA] ، 0.2٪ تريتون ، في PBS) على 2D-shaker (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: يمكن إعداد حل الحظر مقدما ولكن يجب ألا يزيد عمره عن 10 أيام تقريبا. - تمييع الأجسام المضادة الأولية التالية طازجة في نفس أليكوت محلول الحظر: anti-myoVIIa (myosin VIIa) لتسمية IHCs (أرنب IgG متعدد النسيلة) ، مخفف 1:400 ؛ مضاد ل CtBP2 (بروتين ربط C-terminal 2) لتسمية شرائط ما قبل المشبكي (ماوس IgG1 أحادي النسيلة) ، مخفف 1:400 ؛ ومضاد GluA2 لتسمية بقع مستقبلات ما بعد المشبكي (IgG2a ماوس أحادي النسيلة) ، مخفف 1:200. تأكد من تغطية القوقعة بالكامل بمحلول الأجسام المضادة (عادة 0.4 مل) واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- بعد ذلك ، اغسل المنديل 5x باستخدام 0.2٪ triton في PBS على شاكر 2D (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لكل منهما. اختر الأجسام المضادة الثانوية لتتناسب مع الأنواع المضيفة لنظيراتها الأولية ومرة أخرى تخفيفها طازجا في 3٪ BSA ، 0.2٪ triton ، في PBS: الماعز المضاد للفأر (IgG1) - Alexa fluorophore (AF) 488 ، المخفف 1: 1000 ؛ الماعز المضادة للفأر (IgG2a)-AF568 ، المخفف 1:500 ؛ والحمار المضادة للأرانب-AF647 (IgG)، المخفف 1:1000. لف الأنبوب بورق الألومنيوم لمنع تبييض التألق. احتضان القوقعة في 0.4 مل من محلول الأجسام المضادة الثانوية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
ملاحظة: أشارت تجارب محدودة إلى أن حضانة أنسجة القوقعة الصناعية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة باستخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية أدت إلى تلطيخ مناعي أكثر إشراقا من اتباع إجراء الحضانة الأكثر شيوعا مع درجات حرارة أقل وفترات أقصر. - اغسل القوقعة 2x مع 1 مل من 0.2٪ تريتون في PBS لمدة 5 دقائق لكل منها و 3x مع PBS لمدة 5 دقائق لكل منها على 2D-shaker (100 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: بعد خطوات الغسيل هذه ، يمكن أن تبقى القوقعة في PBS في الثلاجة عند ~ 4 درجة مئوية لعدة أيام.
3. العلاج مع التبريد التألق الذاتي (اختياري)
ملاحظة: تظهر القوقعة من الجربوع في منتصف العمر والشيخوخة تألقا ذاتيا في الخلفية. في أنسجة البالغين الشباب ، ليس من الضروري العلاج باستخدام مبرد التألق الذاتي. من الممكن ، من حيث المبدأ ، تطبيق مبرد التألق الذاتي قبل إجراء التلطيخ المناعي ، والذي يتجنب بعد ذلك أي انخفاض غير مقصود في تألق الأجسام المضادة المطلوب. ومع ذلك ، وفقا لورقة بيانات الشركة المصنعة ، فإن استخدام المنظفات (مثل Triton X-100 في البروتوكول الحالي) لم يعد ممكنا لأنها تزيل المبرد من الأنسجة.
- قطع القوقعة إلى نصفين تحت المجهر المجسم، كما هو موضح في الخطوة 4.2.
- امزج مبرد التألق الذاتي مع الإيثانول بنسبة 70٪ للحصول على محلول 5٪ واحتضن القوقعة في هذا المحلول على شاكر 2D في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. اغسل القوقعة 3x مع 1 مل من PBS على شاكر 2D في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لكل منهما.
تنبيه: إن مبرد التألق الذاتي خطير وضار. ارتداء قفازات عند التعامل مع هذه المادة.
4. تشريح الغرامة النهائية
- تشريح القوقعة تحت المجهر المجسم. املأ طبق بتري متعدد الستايور وغطائه ب PBS واحتفظ بملقطين ناعمين ومقص زنبركي من فاناس وحامل شفرة حلاقة وشفرة حلاقة قابلة للكسر في متناول يديك. كسر القطع من شفرة الحلاقة للحصول على سطح قطع من ~ 2-4 مم اعتمادا على خطوة التشريح. قم بإعداد شريحة مجهرية عن طريق وضع ثلاث قطرات من وسط التركيب على التوالي.
ملاحظة: سطح القطع لشفرة الحلاقة يتلاشى بسرعة. يجب استبدال الشفرة بعد تشريح وتركيب كل قطعة ثانية تقريبا من القوقعة. - إذا لم يتم ذلك بالفعل في الخطوة 3.1 ، فقم أولا بقطع القوقعة إلى نصفين على طول modiolus تحت المجهر المجسم. لهذا ، ضع قطعة من شفرة الحلاقة أطول من الطول الملفوف للقوقعة في حامل شفرة. ضع القوقعة في طبق بتري واقطع الأنسجة الزائدة بقطعة شفرة الحلاقة. امسك القوقعة في مكانها باستخدام ملقط ناعم وقطعها إلى نصفين على طول الموديولوس.
- ابدأ بنصف واحد ، ولكن اترك النصف الآخر في طبق بتري أيضا. ثبت بعناية نصف قوقعة الأذن باستخدام ملقط بحيث تكون حافة القطع متجهة لأعلى. استخدم مقص زنبركي ناعم لقطع عظم القوقعة فوق الهليكوتريما ، وتغطية القمة.
- لبدء فصل قطع القوقعة الصناعية ، اعزل المنعطف الأوسط عن طريق القطع بالمقص من خلال modiolus والعصب السمعي ، أعلى (scala vestibuli) وأسفل (scala tympani).
- قطع من خلال عظم القوقعة الصناعية الذي يغطي الأوعية الدموية داخل القناة القوقعية. قم بإجراء قطعتين على جانبي عظم القوقعة الصناعية فوق عضو كورتي وعلى طول الأوعية الدموية المخططة واستخدم شفرة الحلاقة لفصل قطع القوقعة الصناعية في النهاية.
ملاحظة: يمكن رؤية الأوعية الدموية ستريا بسهولة كشريط داكن. قطع على طول الأوعية الدموية ستريا يترك عضو كورتي سليمة. - اختياري: لجمع الأوعية الدموية stria ، قطع بعناية بين عضو Corti و stria vascularis لفصل الاثنين. اترك المخطط الوعائي متصلا بالرباط الحلزوني (المتصل بالعظم الذي يغطي السطح الخارجي للقوقعة) وقم بإزالة العظم غير المكلس باستخدام الملقط. ضع القطعة مع جانب ستريا لأعلى على شريحة المجهر في قطرة من وسط التركيب.
ملاحظة: إذا كانت القطعة المجمعة منحنية بقوة كبيرة، فقد يكون من الضروري تقسيمها إلى قطع أصغر حتى تكون مسطحة بما يكفي للتركيب على الشريحة. - انقل قطع القوقعة الصناعية إلى الغطاء المملوء ب PBS لطبق بتري متعدد الستايورول، مما يضمن أن حوامل القوقعة الصناعية بأكملها مسطحة قدر الإمكان على الشريحة. قم بإزالة الأنسجة الزائدة، مثل أجزاء من الرباط الحلزوني على الجانب الأبنوي وأجزاء من الطرف الحلزوني على الجانب العصبي. قم بإزالة الغشاء التكتوري بعناية باستخدام ملقط فائق الدقة.
- ضع قطع القوقعة الصناعية على الشريحة في قطرة من وسط التركيب. ضع حوامل القوقعة الصناعية بالكامل مع توجيه عضو Corti لأعلى على الشريحة لتجنب حجب IHCs في المسار البصري للتصوير. ابحث عن غزو الطرف الحلزوني على مقربة من IHCs ، والذي يمكن رؤيته عن طريق تحويل قطعة القوقعة الصناعية إلى المستوى السهمي لتحديد الجانب إلى الوجه لأعلى.
ملاحظة: لإعادة بناء القوقعة الكاملة رقميا من قطعها الفردية أثناء المعالجة الإضافية، يوصى بشدة بتوثيق الرسومات التخطيطية للقطع وتدوين المعالم. علاوة على ذلك ، يجب ترتيب القطع بشكل مثالي بالترتيب الصحيح على الشريحة. - كرر الخطوات من 4.3 إلى 4.8 حتى يتم نقل القوقعة بأكملها إلى شريحة المجهر. إذا لزم الأمر ، أضف المزيد من وسط التركيب ، وقم بتغطية الشريحة ، وأغلق الغطاء في مكانه باستخدام طلاء أظافر أسود مطلي حول الحواف. اتركه يجف في الظلام في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتخزين الشريحة في الظلام عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: حتى لو فقدت أجزاء من الظهارة الحسية نفسها عن طريق الخطأ، فمن المهم مع ذلك تركيب ما تبقى من قطعة القوقعة الصناعية لتقدير الطول الصحيح.
5. قياس طول القوقعة الصناعية
- قم بقياس طول القوقعة من الصور الساطعة لقطعها باستخدام نظام المجهر فوق الفلوري والبرامج المرتبطة به. احفظ الصور منخفضة التكبير (عدسة 4x) من كل قطعة قوقعة صناعية واستخدم أداة قياس lasso الخاصة ببرنامج المجهر لرسم خط على طول صف IHCs في كل صورة من الصور. احسب الطول الإجمالي بإضافة أطوال جميع القطع.
ملاحظة: عندما تكون أجزاء من الظهارة الحسية مفقودة داخل قطعة قوقعة صناعية، قم باستجواب الخط. - لتحديد مواقع القوقعة الصناعية التي يجب تحليلها في قوقعة واحدة، احسب المسافات المقابلة لها من القمة باستخدام المعادلة التي قدمها مولر25. ضع علامة على هذه المواقع ، على سبيل المثال ، على نسخة مطبوعة من قطع القوقعة الصناعية.
6. الحصول على الصورة باستخدام المجهر البؤري
- استخدم مجهرا متحد البؤرة مع هدف غمر الزيت 40x (الفتحة العددية 1.3) والزيت المناسب للتصوير عالي الدقة.
ملاحظة: إذا كان المجهر البؤري يحتوي على مسار ضوء مقلوب، فيجب وضع الشريحة رأسا على عقب. في هذه الحالة ، امنح العينة حوالي 30 دقيقة لتغرق وتستقر بثبات على الغطاء قبل البدء في الفحص النهائي. بدلا من ذلك ، استخدم وسيطا متصاعدا سائلا طوال مدة التشريح ولكنه يتصلب لاحقا وفي نفس الوقت يحافظ على التألق. - تنشيط الليزر المناسب: يتم استخدام اثنين من ليزر أشباه الموصلات التي يتم ضخها بصريا بأطوال موجية λ = 488 نانومتر و λ = 522 نانومتر ، وليزر الصمام الثنائي بطول موجي λ = 638 نانومتر في هذا البروتوكول. اختر نطاق انبعاث علامات التألق (AF488: 499-542 نانومتر، AF568: 582-621 نانومتر، AF647: 666-776 نانومتر). عندما يقوم الكاشف الهجين بحساب الفوتونات الصادرة ، ضع خط الليزر على بعد 10 نانومتر على الأقل من منحنى الانبعاثات.
ملاحظة: من المهم إجراء فحوصات أولية باستخدام أنسجة ذات تسمية واحدة للتأكد من أن عرض النطاق الترددي للكاشف المختار يفصل قنوات الألوان بشكل نظيف (أي لا يؤدي إلى تداخل القنوات). تتداخل موجات الراديو مع الكاشف الهجين ، مما يؤدي إلى الحد الأقصى لعدد الفوتونات ، وبالتالي تسبب خطوط اصطناعية في المكدس. لذلك ، تجنب استخدام الهاتف المحمول بالقرب من المجهر. - قم بتكبير الأنسجة حتى تمتد الصورة إلى 10 IHCs. اختر دقة الصورة وفقا لأخذ عينات Nyquist ، والتي عادة ما تكون ~ 40-60 نانومتر / بكسل. اضبط حجم الخطوة في اتجاه z على 0.3 ميكرومتر وسرعة التصوير على 400-700 هرتز.
ملاحظة: يعد كل من هذين الإعدادين (حجم الخطوة وسرعة التصوير) تنازلات بين استخدام معلمات التصوير المثلى وتوفير وقت المسح الضوئي. - قم بإجراء أخذ عينات ثنائية الاتجاه لتقصير وقت التصوير. تجميع الإطار لقناة 488 نانومتر و 638 نانومتر 3x وقناة 522 نانومتر 6x ؛ بالإضافة إلى ذلك ، متوسط الخطوط 3x لكل قناة. اختر بداية المكدس ونهايته في البعد z.
- اضبط الكسب على 100 عند استخدام الكاشف الهجين (وضع العد) لتجنب انخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء. اضبط طاقة الليزر بحيث لا يتم تشبع أي بكسل في المنطقة ذات الأهمية ولكن الهياكل تغطي في الغالب نطاق 8 بت كامل. ابدأ بقوة ليزر منخفضة تبلغ 0.5٪ وقم بزيادتها حتى تصبح الهياكل مرئية.
ملاحظة: عادة ما يحتاج التلطيخ الجيد إلى طاقة ليزر تتراوح بين 0.1٪ و 5٪. - استخدم برنامج فك الالتفاف للمعالجة اللاحقة لمكدسات الصور لإزالة الهالة الضبابية حول هياكل الفلورسنت الصغيرة باستخدام دالة انتشار النقاط النظرية. استخدم الإعدادات نفسها لكل مكدس داخل تجربة. احفظ الصور غير المعقدة .tif أو .ics.
ملاحظة: لا تستفيد تسمية myoVIIa (IHCs) من إزالة الالتفاف وقد يتم حذفها لتوفير الوقت. يستخدم البرنامج البيانات الوصفية لملفات الصور. ومع ذلك ، يجب تحديد العديد من المعلمات مثل مسار الضوء أو وسط التضمين أو وسط الغمر.
7. القياس الكمي للمشابك
- افتح نسخة من المكدسات غير المعقدة في برنامج ImageJ الذي يمكن الوصول إليه بحرية باستخدام المكون الإضافي Biovoxxel الإضافي ، والذي يتوفر أيضا على موقعه على الويب.
- اضبط ألوان القنوات الفردية عن طريق تقسيم القنوات (الصورة | | الألوان تقسيم القنوات) والدمج (| الصورة | الألوان دمج القنوات) مرة أخرى ، مع تعيين ألوان مختلفة. تحويل الصورة إلى مكدس RGB (| الصورة | الألوان قم بالتكديس إلى RGB) واضبط السطوع والتباين (الصورة | ضبط | | السطوع/التباين إما تلقائي أو شريط تمرير فيما يتعلق بالحد الأقصى) ، إذا لزم الأمر ، بحيث تكون الهياكل قبل وبعد المشبكي وتسمية المدينة العالمية للخدمات الإنسانية متميزة بشكل ممتع عن الخلفية.
- اختر خمس شهادات IHC وقم بتصنيفها باستخدام أداة النص (IHC1-IHC5) بالنقر فوق الموقع المطلوب داخل المكدس. افتح مدير عائد الاستثمار (تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار)؛ قم بتنشيط خانة الاختيار تسميات لتسمية النقاط برقم. قم بتكبير المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التي تهمك.
- استخدم أداة النقطة/النقاط المتعددة في وضع النقاط المتعددة (انقر بزر الماوس الأيمن على الأداة للاختيار بين وضع النقطة أو النقطة المتعددة). انقر فوق مشبك شريطي وظيفي (أي شريط ما قبل المشبكي في تجاور وثيق مع رقعة الغلوتامات ما بعد المشبكي) أثناء التمرير عبر البعد z.
ملاحظة: استنادا إلى مقدار التداخل واللون المختار لكل قناة، تظهر البيكسلات المشتركة بلون مختلط. عادة ما يكون التمييز بين نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية الفردية بسيطا لأنها بعيدة بما فيه الكفاية عن بعضها البعض. - عند تحديد جميع هياكل الاهتمام، انقر فوق إضافة على واجهة المستخدم الرسومية لمدير عائد الاستثمار. انقر على الاسم التعسفي واختر إعادة تسمية.
ملاحظة: تظل تسميات النقاط باقية خلال كافة مستويات المكدس عند تحديد خانة الاختيار إظهار الكل في قائمة خيارات أداة النقطة (انقر نقرا مزدوجا فوق أيقونة أداة النقطة )، مما يساعد على تجنب حساب نفس المشبك الشريطي عدة مرات. - عند اختيار المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التالية للعد، تجنب إضافة الأعداد عن غير قصد عن طريق ضبط الصورة لعرض المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التالية بالكامل باستخدام الأداة اليدوية. قم بالتغيير من أداة متعددة النقاط إلى أداة نقطة لتجنب إضافة المزيد من النقاط إلى البيانات المخزنة مسبقا. انقر على هيكل الاهتمام داخل المدينة العالمية للخدمات الإنسانية التالية وقم بالتغيير مرة أخرى إلى أداة متعددة النقاط. كرر الخطوات من 7.4 إلى 7.5 حتى يتم تقييم جميع المدن العالمية للخدمات الإنسانية ذات الاهتمام.
- لحفظ البيانات ، انقر فوق مجموعة بيانات في مدير عائد الاستثمار ثم عند القياس. انتظر حتى تظهر نافذة جديدة تسرد نقاط البيانات المقاسة. احفظ هذه القائمة كملف جدول بيانات (ملف | حفظ باسم). احفظ الصورة عن طريق تنشيط إظهار الكل في مدير عائد الاستثمار. انقر فوق Flatten لإضافة تسميات النقاط بشكل دائم إلى المكدس. عند إغلاق مكدس الصور، وافق على حفظ التغييرات.
8. تحليل حجم المشبك وموقعه على خلية الشعر
ملاحظة: استخدم المؤلفون إجراء مبرمجا خصيصا يعتمد على Matlab. وبما أنه غير متاح للجمهور، فإنه يرد هنا بعبارات عامة فقط (انظر أيضا7). يرجى الاتصال بالمؤلف المقابل إذا كنت مهتما باستخدامه. يتوقع الإجراء مكدس صور ثلاثي العلامات (IHCs ، ما قبل وبعد المشبكي) بتنسيق TIFF كمدخلات ، ويوجه المستخدم خلال خطوات التحليل المختلفة عبر واجهة رسومية ، ويوفر مخرجات واسعة النطاق للنتائج بتنسيق جدول بيانات.
- تطبيع موضع الهياكل المتشابكة إلى نظام إحداثي 3D محدد بمدى المدينة العالمية للخدمات الإنسانية الفردية على محور العمود المتوسط والمحور القوقعي القاعدي ومحور المدينة العالمية للخدمات الإنسانية من الأعلى (الصفيحة الجلدية) إلى الأسفل (القطب المشبكي).
ملاحظة: يتم توفير أحجام العناصر المشبكية (قبل وبعد المشبك العصبي، والحجم المشترك للمشابك الوظيفية) في μm 3 وتطبيعها إلى القيمة الوسيطة3 المعنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم حصاد القوقعة إما بعد تروية القلب والأوعية الدموية مع تثبيت الحيوان بأكمله أو تشريحها بسرعة بعد القتل الرحيم للحيوان وإصلاح الغمر. وباستخدام الطريقة الأخيرة، ظلت ال IHCs في مكانها أثناء التشريح، في حين أنه في حالات التروية غير الناجحة وبالتالي الأنسجة غير الثابتة بما فيه الكفاية، غالبا ما يتم تدمير الظهارة الحسية. لاحظ أن المؤلفين واجهوا حالات كان فيها تثبيت القوقعة بعد التروية عبر القلب غير كاف بينما كان تثبيت الدماغ لا يزال كافيا. لا يزال من الممكن إنقاذ الأنسجة الناتجة عن التروية السفلية عن طريق فتح ثقوب في قمة القوقعة الصناعية وقاعدتها وتثبيت القوقعة عن طريق الغمر في PFA بنسبة 4٪ لمدة 2 أيام.
تم تحديد طول القوقعة بأكملها وفقا ل Müller25 لتقييم IHCs ونقاط الاشتباك العصبي الخاصة بها في مواقع قوقعة محددة ، أي ما يعادل الترددات المميزة المميزة (الجدول 1). لهذا ، تم حساب مواقع القوقعة الصناعية المطلوبة كنسب مئوية من طول الغشاء القاعدي من قاعدة القوقعة الصناعية. كان متوسط طول القوقعة الصناعية البالغ 13 قوقعة من الجربلات البالغة من الشباب 11.3 ملم (النطاق الربيعي: 11.02-11.52 ملم). كان متوسط طول القوقعة الصناعية البالغ 24 قوقعة من الجربلات القديمة 11.5 ملم (المدى الربيعي: 11.24-11.73 ملم). لم يكن هناك فرق كبير بين طول قوقعة الأذن الشابة والمسنين (Mann-Whitney U-test: U = -1.62, p = 0.105); وكان الوسيط العام 11.48 ملم. قد يجادل المرء بأن هذا الاختلاف في طول القوقعة الفردية كان صغيرا وأن استخدام مواضع الطول الثابتة (بالملليمتر) كاف. ومع ذلك ، فإن دالة تردد المكان غير خطية. لذلك، يؤدي الانحراف عن متوسط الطول إلى حدوث خطأ أكبر في مواقع القوقعة الصناعية القاعدية مقارنة بمواقع القوقعة الصناعية القمية الأكثر نسبيا. على سبيل المثال، بالنسبة لموقع القوقعة الصناعية المكافئ لتردد 1 كيلو هرتز، محسوب على أساس متوسط طول القوقعة الصناعية (أي 11.48 مم)، تراوح التردد المقابل من 1.16 كيلو هرتز إلى 0.91 كيلو هرتز لأقصر (10.36 مم) وأطول قوقعة (12.28 مم) في هذه العينة، على التوالي. وبالنسبة للتردد الموجود أساسا (32 kHz مثلا)، كان نطاق التردد يتراوح بين 51.62 kHz و 23.97 kHz، بالنسبة لأقصر وأطول قوقعة الأذن، على التوالي. لذلك ، ينصح بحساب المواقع الفردية على كل قوقعة ، خاصة عند فحص مواقع القوقعة الصناعية القاعدية.
ويصور الشكل 1 إسقاطات البعد Z القصوى للكثافة للقوقعة من شاب بالغ (10 أشهر، الشكل 1 ألف) وجربيل مسن (38 شهرا، الشكل 1 ب)، وهما مثالان على التسميات المناعية المثالية. في الصورة التي تصور قوقعة الجربيل البالغة ، فإن IHCs التي تحمل علامة myoVIIa ، والتي تظهر هنا باللون الأزرق ، تتناقض بشكل حاد مع الخلفية السوداء. لذلك ، يمكن اكتشاف IHCs الفردية بسهولة. الهياكل قبل وبعد المشبكي مرئية بوضوح كعناصر خضراء وحمراء ، على التوالي. ومن المفترض أنها تشكل مشبكا وظيفيا كلما كانت في تجاور وثيق (الشكل 1أ ، ب). نادرا ما كانت هناك هياكل ما قبل المشبكي غير المقترنة (شرائط يتيمة) واضحة في قوقعة الجربيل القديمة. تمت معالجة القوقعة من الجربيل القديم (الشكل 1B) باستخدام كوينشر التألق الذاتي. يبدو أن علامة IHC أضعف ، على الرغم من أن قوة الليزر المستخدمة في هذه العينة كانت أعلى بثلاث مرات من تلك المستخدمة في القوقعة من الجربيل الصغير البالغين. ومع ذلك، لا تزال المدينة العالمية للخدمات الإنسانية متميزة عن الخلفية. الهياكل قبل وبعد المشبكي مرئية بوضوح ، وكانت قوة الليزر المستخدمة لكل من هاتين القناتين مماثلة أو حتى أقل من تلك المستخدمة لعينة الشباب البالغين. عادة ما تظهر الأنسجة من الحيوانات المسنة إشارة فلورسنت غير محددة المظهر. لذلك ، فإن الفرق الرئيسي في البروتوكول الخاص بالشباب البالغين والمواد المسنة هو العلاج باستخدام كوينشر التألق الذاتي. لاحظ أن هذا تم بعد تلطيخ المناعة بالأجسام المضادة الموسومة بالفلور وقد يؤثر أيضا ، من حيث المبدأ ، على تسمية الأجسام المضادة المقصودة. ومع ذلك، فإن العلاج قلل بشكل فعال من التألق الدخيل من أصل غير محدد، مع ترك إشارة كافية للتسمية المحددة للهياكل ذات الأهمية (قارن الشكل 1 باء مع الشكل 2 ب). ومع ذلك ، أشارت النتائج الأولية إلى أنه في الأوعية الدموية المخططة ، لم يظهر التألق الدخيل في عينات من الجربلات المسنة.
ويوضح الشكل 2 أمثلة على المكدسات التي تمت معالجتها دون المستوى الأمثل. ويصور الشكل 2 ألف الإسقاط Z ذي الكثافة القصوى لكومة من جربيل قديم (36 شهرا)، حيث لم يتم مسح الطائرات الإنسانية العالمية، التي كانت أيضا إما منحنية أو ممزقة بشكل غير طبيعي، بكاملها. ونتيجة لذلك، فإن الأقطاب القمية والقاعدية فقط للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية مرئية في هذا الفحص. ولا يمكن استبعاد وجود المزيد من نقاط الاشتباك العصبي في الجزء الأوسط المفقود من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية، وبالتالي، لا يمكن إجراء تحليل موثوق به. وبالتالي ، من الأهمية بمكان أن يتم مسح جميع IHCs التي تم تقييمها بالكامل في المكدس البؤري. ويبين الشكل 2 باء الإسقاط Z الأقصى للكثافة لمكدس تم أخذ عينات منه في جربيل مسن (38 شهرا). التألق من أصل غير واضح مرتفع حيث لم يتم استخدام مبرد التألق الذاتي في هذه الحالة. ومع ذلك ، اقتصر التألق الدخيل إلى حد كبير على القناة (الحمراء) المرتبطة بتسمية GluA2 ، وهو أمر نموذجي تماما. في مثل هذه الحالات ، قد لا يزال من الممكن حساب نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية إذا كانت تسمية CtBP2 للشرائط نظيفة ومحددة نسبيا. ويصور الشكل 2 جيم الإسقاط Z ذي الكثافة القصوى لكومة تم الحصول عليها من جربيل مسن (42 شهرا). وهنا، لا يمكن تخصيص نقاط الاشتباك العصبي لفرادى المراكز العالمية للخدمات الإنسانية لأن هذه المراكز قد تفككت إلى حد كبير؛ في الواقع، من الصعب التأكد من عدد المدن العالمية للخدمات الإنسانية الممثلة. في المثال الموضح في الشكل 3A ، تم استخدام هاتف محمول بالقرب من المجهر البؤري أثناء الفحص. الخطوط مرئية في القناة الزرقاء (ملصق IHC). لحسن الحظ ، في هذه الحالة ، لم يؤثر هذا على القنوات المتشابكة وأثر فقط على الجزء العلوي من IHCs ، وبالتالي ، كان التحليل لا يزال قابلا للتطبيق.
يعرض الشكل 3 إسقاطات z ذات كثافة قصوى للمكدسات المأخوذة من نفس القطعة من القوقعة من جربيل شاب بالغ ، تم الحصول عليه لمدة 3 أشهر (الشكل 3A ، A') و 29.5 شهرا (الشكل 3B ، B') بعد تلطيخ المناعة. ولكي تظل الصور قابلة للمقارنة، لم يتم التقاطها من نفس الموقع بالضبط (الذي ربما عانى من التبييض من المسح السابق) ولكن من نفس قطعة القوقعة الصناعية. بالنسبة للفحص الذي تم إجراؤه في وقت لاحق ، كان لا بد من زيادة طاقة الليزر ~ 2 إلى 3 أضعاف. ومع ذلك ، فإن الهياكل المصنفة لا تزال واضحة. وقد انخفضت نسبة الإشارة إلى الضوضاء، لا سيما في القنوات التي تعرض هياكل ما بعد المشبكي والمدينة العالمية للخدمات الإنسانية، في حين أن القناة التي تحمل الملصق ما قبل المشبكي كانت أقل تأثرا. لا يزال من الممكن تحديد كمية نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية لكل مدينة عالمية للخدمات الإنسانية.
ويوضح الشكل 4 النتائج النموذجية لتحليل حجم المشبك العصبي وموقعه على المدينة العالمية للخدمات الإنسانية، باستخدام المكدس البؤري الموضح في الشكل 1A. يتم عرض IHCs المعرفة بشكل فردي بيانيا كعمليات إعادة بناء للشبكة بألوان مختلفة ، مع أو بدون نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية (المعرفة من خلال التوطين المشترك للتسميات قبل وبعد المشبكية ) المخصصة لكل منها. يمكن تدوير هذه الشاشة بحرية في 3D للحصول على زوايا عرض مختلفة (الشكل 4A ، B). ويمكن أيضا تحديد المدن العالمية للخدمات الإنسانية للعرض الرسومي (الشكل 4B). يتم إنتاج مجموعة كبيرة ومتنوعة من الرسوم البيانية للبيانات ، توضح الجوانب المختلفة لتوزيع الأحجام المتشابكة داخل نظام الإحداثيات المتمحور حول المدينة العالمية للخدمات الإنسانية (أمثلة في الشكل 4C-E). تتوفر أيضا البيانات الكمية الخام لكل مدينة عالمية للخدمات الإنسانية وكل عنصر متشابك كجداول بيانات يمكن بعد ذلك ، على سبيل المثال ، دمجها عبر عدة مكدسات متحدة البؤرة لمزيد من التحليل الإحصائي.
الشكل 1: أمثلة على القوقعة التي تمت معالجتها بنجاح. الإسقاطات z-Aspiration القصوى للمكدسات البؤرية من (A) جربيل شاب بالغ (10 أشهر) ، تم الحصول عليه في موقع قوقعة صناعية يتوافق مع 1 kHz ، و (B) جربيل مسن (38 شهرا ، اللوحة B) ، تم الحصول عليه في موقع قوقعة صناعية يعادل 500 هرتز. وتم تصنيف بقع الغلوتامات بعد المشبكي مع مضاد GluA2 (أحمر). تم علاج قوقعة الجربيل المسن باستخدام مبرد التألق الذاتي بعد تلطيخ المناعة. وللتوضيح، يشار إلى الخطوط العريضة للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية بخطوط متقطعة. تعرض اللوحتان (A') و (B') توسيعا للمساحات التي حددتها المربعات في القوقعة المقابلة من اللوحتين (A) و (B). تشير رؤوس الأسهم الصفراء إلى نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية. خضعت القنوات التي تعرض الهياكل قبل وبعد المشبكي (ولكن ليس قناة المدينة العالمية للخدمات الإنسانية) للتفكيك. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (A,B), 1 ميكرومتر (A',B'). الاختصارات: IHC = خلية الشعر الداخلية; myoVIIa = الميوسين السابع ؛ CtBP2 = بروتين ربط C-terminal 2 ؛ GluA2 = مستقبلات الغلوتامات الأيونية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أمثلة على القوقعة المعالجة دون المستوى الأمثل. إسقاطات z ذات الكثافة القصوى للمكدسات متحدة البؤرة التي كانت معالجتها دون المستوى الأمثل، من الجربلات التي كان عمرها (A) 36 شهرا و (B، C) 38 شهرا ومن مواقع القوقعة الصناعية المقابلة ل 16 kHz و 8 kHz و 32 kHz، على التوالي. تم دمج الجربلات التي اشتقت منها القوقعة في الألواح (A) و (C) عبر القلب ، بالإضافة إلى ذلك تم تثبيت القوقعة من اللوحة (C) لمدة 3 أيام في PFA بنسبة 4٪. كانت القوقعة من (B) ثابتة الغمر في 4٪ PFA لمدة 2 أيام. عولجت القوقعة من (A) و (C) باستخدام مكواة التألق الذاتي. تم تلطيخ IHCs بجسم مضاد ضد myoVIIa (أزرق) ، وتم وضع علامة على شرائط ما قبل المشبكي بمضاد CtBP2 (أخضر) ، وتم وضع علامات على بقع الغلوتامات بعد المشبكي بمضاد GluA2 (أحمر). تم تفكيك جميع القنوات. تم تعديل السطوع والتباين بشكل أكبر بعد الفحص البؤري. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الاختصارات: PFA = بارافورمالديهايد; IHC = خلية الشعر الداخلية; myoVIIa = الميوسين السابع ؛ CtBP2 = بروتين ربط C-terminal 2 ؛ GluA2 = مستقبلات الغلوتامات الأيونية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: استقرار التسمية المناعية بعد التخزين لفترات طويلة. إسقاطات z ذات كثافة قصوى للمكدسات البؤرية من جربيل شاب بالغ (10 أشهر) ، مأخوذة في موقع القوقعة الصناعية 16 كيلو هرتز ، (A) بعد 3 أشهر من التلطيخ و (B) في موقع قوقعة صناعية قاعدية أكثر قليلا على نفس قطعة القوقعة الصناعية بعد 29.5 شهرا من التلطيخ. تم تثبيت القوقعة الصناعية في 4٪ PFA لمدة 2 أيام. للتوضيح ، يقوم (A') و (B') بتكبير عدد قليل من نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية فقط من المناطق المشار إليها بالمربعات في (A) و (B) ، على التوالي. تم تلطيخ IHCs بجسم مضاد ضد myoVIIa (أزرق) ، وتم وضع علامة على شرائط ما قبل المشبكي بمضاد CtBP2 (أخضر) ، وتم وضع علامات على بقع الغلوتامات بعد المشبكي بمضاد GluA2 (أحمر). كانت طاقة الليزر لقنوات المدينة العالمية للخدمات الإنسانية 1.3٪ و 3٪ ، للقنوات قبل المشبكية 0.4٪ و 1.1٪ ، وبالنسبة للقنوات ما بعد المشبكية 1.1٪ و 2٪ في (A) و (B) ، على التوالي. لاحظ أنه في (A) ، تظهر خطوط زرقاء في الجزء العلوي من IHCs ، والتي تنتج عن استخدام هاتف محمول بالقرب من المجهر البؤري. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر (A ، B) ، 1 ميكرومتر (A '، B'). الاختصارات: PFA = بارافورمالديهايد; IHC = خلية الشعر الداخلية; myoVIIa = الميوسين السابع ؛ CtBP2 = بروتين ربط C-terminal 2 ؛ GluA2 = مستقبلات الغلوتامات الأيونية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية للقياس الكمي لحجم المشبك العصبي . (أ) عشر IHCs تظهر على أنها عمليات إعادة بناء شبكة مختلفة الألوان استنادا إلى التسمية المناعية myoVIIa. يتم عرض نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية المرتبطة بها ، والتي يتم تعريفها بواسطة عناصر CtBP2 (خضراء) وعناصر تحمل علامة GluA2 (حمراء) ، مع IHCs ، وكذلك بشكل منفصل أدناه ، من أجل الوضوح. لاحظ أنه تم اختيار زاوية الرؤية لتكون عمودية على المحور الطويل للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية وبالتالي تختلف عن الصورة البؤرية الأصلية (الشكل 1A). (ب) تم تحديد إحدى المدن العالمية للخدمات الإنسانية وعرضها بزاوية 90 درجة. تم تعريف الطائرة السوداء يدويا من قبل المستخدم وقسمت المدينة العالمية للخدمات الإنسانية على طول محورها المعياري العمودي. (ج) مخطط فقاعة يوضح موقع جميع نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية في هذا المكدس البؤري ، بالنسبة إلى المحاور الثلاثة العادية للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية الخاصة بكل منها. حجم الرموز يتناسب مع حجم العنصر قبل المشبكي. لاحظ أنه تم اختيار زاوية الرؤية لتكون مشابهة للوحة (B). (د) مخطط صندوقي للأحجام العادية للعناصر المتشابكة ، بشكل منفصل لشركاء ما قبل المشبكي (مربعات 2 اليسرى) وما بعد المشبكي (مربعات 2 اليمنى) للمشابك الوظيفية ويتم فصلها بشكل أكبر وفقا لموقعها في نصف المعيارية أو العمود من المدينة العالمية للخدمات الإنسانية الخاصة بها (ألوان مختلفة). تمثل المربعات النطاقات الربيعية، مع الإشارة إلى الوسيطات بالخطوط. تشير الشعيرات المتقطعة إلى 1.5 ضعف النطاق الربيعي ، وتشير الصلبان إلى القيم النائية أبعد من ذلك. (ه) مخطط مبعثر للأحجام العادية للشركاء قبل المشبك العصبي مقابل ما بعد المشبك الوظيفي. تشير الرموز المختلفة إلى الموضع في نصف المعياري أو العمود في المدينة العالمية للخدمات الإنسانية الخاصة بكل منها. الاختصارات: IHC = خلية الشعر الداخلية; myoVIIa = الميوسين السابع ؛ CtBP2 = بروتين ربط C-terminal 2 ؛ GluA2 = مستقبلات الغلوتامات الأيونية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1: المسافات من القمة التي تعادل الترددات المستهدفة المحددة في القوقعة ذات الأطوال المختلفة. تم حساب أفضل الترددات المكافئة بناء على المعادلة التي قدمها مولر25. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
باستخدام الطريقة الموضحة في هذا البروتوكول ، من الممكن وضع علامة مناعية على IHCs والهياكل المشبكية في القوقعة من الجربلات الشابة والمسنين ، وتحديد نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية المفترضة عن طريق التوطين المشترك للعناصر قبل وبعد المشبكي ، وتخصيصها إلى IHCs الفردية ، وتحديد عددها وحجمها وموقعها. كما وصفت الأجسام المضادة المستخدمة في هذا النهج خلايا الشعر الخارجية (OHCs; myoVIIa) وشرائطها قبل المشبكي. وعلاوة على ذلك، فإن البديل القابل للتطبيق لوضع العلامات المناعية لكل من IHCs و OHCs هو الجسم المضاد ضد otoferlin، حيث تبدو OHCs أكثر خفوتا بكثير من IHCs.
يمكن إجراء التروية باستخدام إعدادين مختلفين. 1) نظام خط بالتنقيط الذي تغذيه الجاذبية حيث يتم تعليق زجاجة واحدة تغذي خط التنقيط التجاري على عجلة بكرة على ارتفاع حوالي 1.5 متر فوق الحيوان. يتم إدخال السوائل على التوالي بعد خفض الزجاجة ، وهي مفتوحة في الأعلى. 2) نظام يستخدم مضخة تمعجية رقمية متغيرة السرعة ، مع أنبوب رفيع وطويل مفتوح في أحد طرفيه لاستيعاب السائل وإبرة يمكن توصيلها بسهولة في الطرف الآخر. كلاهما يعمل بشكل جيد على قدم المساواة ، ولن يتم تفصيل الاختلافات الدقيقة هنا. ومع ذلك ، يوصي المؤلفون على وجه التحديد بطاولة عمل على غرار المسودة السفلية ، مع الحيوان على منصة مثقوبة والأبخرة المنبعثة أدناه. وهذا يتيح الوصول الجيد إلى المنطقة الجراحية دون المساس بوظيفة العادم (على عكس العمل في خزانة دخان مفتوحة).
التثبيت السليم للأنسجة له أهمية حاسمة ، وإلا فإن الظهارة الحسية سوف تنفصل وتتفكك أثناء التشريح. في الجربيل ، من الضروري التعرض لفترات أطول للمثبت أكثر من الاستخدام الشائع (على سبيل المثال ، للفئران 17،27،13 أو خنازير غينيا 28). الطريقة المفضلة للجربلات هي الاستخراج السريع للقوقعة بعد وفاة الحيوان وتثبيت الغمر لمدة 1.5 يوم على الأقل. إذا كان يفضل تروية القلب والأوعية الدموية ، فمن الأهمية بمكان أن يبدأ التثبيت في غضون بضع دقائق ويستمر بشكل جيد. نظرا لأنه قد يكون من الصعب في نهاية المطاف تقييم جودة التثبيت أثناء التروية ، فمن المستحسن نشر القوقعة بشكل روتيني كما هو موضح.
من المهم الامتثال لخطوات الغسيل ، حيث تكون خطوة الغسيل الأخيرة (الخطوة 2.7) هي الأكثر أهمية. إذا لم يتم غسلها بشكل كاف ، تكون الأنسجة لزجة وتلتزم بأدوات التشريح ، مما يجعل التشريح صعبا. يوصى أيضا باستخدام مبرد التألق الذاتي في القوقعة التي يتم حصادها من الجربلات القديمة لتقليل التألق غير المحدد. قد ينشأ التألق الذاتي من ليبوفوسين ، وهو شائع في الأنسجة من الحيوانات المسنة29،30،31 ، ويبدو أنه متحمس على نطاق واسع وكذلك ينبعث على نطاق واسع. عند الإثارة بطول موجي في طيف الأشعة فوق البنفسجية (λ = 364 نانومتر) ، يكون للليبوفوسكين نطاق انبعاث واسع (λ = 400-700 نانومتر ، بحد أقصى عند ~λ = 568 نانومتر)32. في أنسجة عضلة القلب البشرية ، يكون ليبوفوسكين مرئيا بإثارة λ = 555 نانومتر وانبعاث λ = 605 نانومتر33. وبالمثل ، في IHCs من الجربلات ، لاحظ المؤلفون زيادة في التألق غير المحدد بشكل بارز في القناة المستخدمة للجسم المضاد AF568 ، مما يشير إلى التألق الذاتي من حبيبات ليبوفوسكين. وبالتالي ، فإن التوصية العامة عند العمل مع الأنسجة من الحيوانات هي استخدام عرض النطاق الترددي للإثارة حوالي 550-600 نانومتر للحصول على أقل علامة مناعية حرجة.
لا يمكن قياس الطول الكلي للقوقعة الصناعية والتحديد الصحيح لمواضع قوقعة الأذن المحددة إلا إذا تم الحفاظ على طولها بالكامل. إذا فقدت أجزاء من الظهارة الحسية في التشريح ، فمن المستحسن الاستمرار في تركيب الجزء المتبقي أو حتى قطعة العقدة الحلزونية فقط ، والاحتفاظ بملاحظات مفصلة. ثم من الممكن عادة تقدير القسم المفقود بدقة معقولة. إذا تم الحفاظ على الأجزاء القمية من القوقعة بالكامل، ولكن النهاية القاعدية مفقودة، فقد يكون من الممكن تحديد مواقع قوقعة معينة في الجزء القمي عن طريق حساب المواضع بناء على متوسط طول القوقعة الصناعية ضمن مجموعة الجربيل المستخدمة لأن الانحراف عن القيمة الحقيقية صغير.
أحد القيود المهمة على القياس الكمي لحجم المشبك هو أن الأحجام المطلقة الناتجة غير قابلة للمقارنة عبر مكدسات متحدة البؤرة مختلفة. الخطوة الحاسمة التي تحدد الأحجام الناتجة من العناصر المشبكية هي اختيار عتبة الكثافة للكشف الأولي. ومع ذلك ، يتم اختيار عتبة الكثافة هذه بشكل شخصي من قبل المستخدم في البروتوكول الحالي والعديد من الآخرين3،27،34. علاوة على ذلك ، يعتمد سطوع التألق المناعي في الصورة البؤرية على العديد من العوامل ، والتي يصعب توحيدها عبر العينات ، مثل سمك الأنسجة ، واتجاه الأنسجة بالنسبة للمسار البصري ، ومدة التعرض لليزر ، وإعدادات البؤرة الدقيقة وإزالة الالتفاف. تتفاقم كل هذه المحاذير إذا تم الحصول على مواد نادرة على مدى فترة زمنية طويلة ، كما هو الحال بالنسبة للجربلات القديمة. وهذا يعني معا أنه من الصعب جدا استبعاد التحيزات في البيانات المجمعة، وأفضل سيناريو هو مجموعة بيانات ذات تباين كبير. لذلك يوصى بتطبيع الأحجام المتشابكة بشكل روتيني إلى الحجم المتوسط المعني للمكدس البؤري الفردي، كما قدمه ليبرمان وآخرون.3. الجانب السلبي الواضح هو أن الأحجام المتشابكة لا يمكن مقارنتها إلا داخل مجموعة صور معينة ، على سبيل المثال ، بين مواقع مختلفة على المدينة العالمية للخدمات الإنسانية ولكن ليس بين مواقع قوقعة الأذن المختلفة أو أعمار العينات.
يسمح وضع العلامات المزدوجة للهياكل قبل وبعد المشبكي ومتطلبات التوطين المشترك بتقدير أكثر موثوقية لعدد نقاط الاشتباك العصبي الوظيفية من استخدام أي من العلامتين وحدهما. إذا كان هناك ملصق واحد فقط ممكن ، فمن المستحسن استخدام مضاد CtBP2 قبل المشبكي ، إلى جانب AF488 أو علامات الفلورسنت مع تفاصيل الطول الموجي المماثلة ، لسببين. أولا ، يبدو أن الشرائط اليتيمة ، أي العناصر المصنفة CtBP2 بدون تسمية ما بعد المشبكية المترجمة ، نادرة17 ، وأكد المؤلفون ذلك للجربلات القديمة. وبالتالي ، فإن الخطأ الذي تم إدخاله من خلال عدم القدرة على التحقق من التوطين المشترك مع شريك ما بعد المشبكي صغير. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أن هذا يصبح مشكلة أكثر أهمية عند فحص الأذنين المعرضة للضوضاء (على سبيل المثال ، 28). ثانيا، في الحالات التي تحتوي على إشارة تألق عالية ذات أصل غير واضح، تؤثر الضوضاء عادة على القناة باستخدام طول موجي للإثارة يبلغ حوالي 568 نانومتر إلى أقصى حد (على سبيل المثال في الشكل 2B، الذي يمثل علامة GluA2). على الأقل جزء من هذه الضوضاء قد يكون ، في الأنسجة من الحيوانات المسنة ، التألق الذاتي ليبوفوسكين. وبالتالي ، لزيادة فرصة الحصول على ملصق نظيف وواحد مضاد ل CtBP2 ، ينصح بتجنب قناة الطول الموجي هذه. وأخيرا، تبين أنه مع ظروف التخزين الباردة والمظلمة المناسبة، فإن وضع العلامات المناعية المستخدمة هنا يكون مستقرا على مدى فترات طويلة من الزمن، تصل إلى 2.5 سنة على الأقل (الشكل 3B)، مما يجعل من الممكن إعادة تقييم الأنسجة القيمة، مثل الجربلات القديمة.
أصبح التحديد الكمي لعدد المشبك البيني التابع للمدينة العالمية للخدمات الإنسانية مقياسا مهما لتقييم حالة الجهاز السمعي المحيطي في العديد من السياقات، من بينها فقدان السمع المرتبط بالعمر. هناك العديد من البروتوكولات المنشورة الآن (على سبيل المثال ، الجربلات 21 ، والفئران 17،13 ، وخنازير غينيا10،28 ، والبشر35). الطريقة الموضحة هنا ، في تفاصيلها ، خاصة بالجربيل الصغير والمسنين ولكن تم اشتقاق بعض التوصيات العامة التي قد تكون مفيدة في أنواع أخرى أيضا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان.
Acknowledgments
يعترف المؤلفون بليشون تشانغ للمساعدة في إنشاء الطريقة ووحدة خدمة الفحص المجهري الفلوري ، جامعة كارل فون أوسيتسكي في أولدنبورغ ، لاستخدام مرافق التصوير. تم تمويل هذا البحث من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG، مؤسسة الأبحاث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز الألمانية -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
