Summary
En protokoll for behandling av unge voksne og aldrende gerbil cochlea ved å immunmerke de afferent synaptiske strukturer og hårceller, slukke autofluorescence i alderen vev, dissekere og estimere lengden på cochlea, og kvantifisere synapsene i bildestakker oppnådd med konfokal avbildning presenteres.
Abstract
Tapet av båndsynapser som forbinder indre hårceller og afferent auditive nervefibre antas å være en årsak til aldersrelatert hørselstap. Den vanligste metoden for å oppdage tap av båndsynapser er immunolabeling fordi det gir mulighet for kvantitativ prøvetaking fra flere tonotopiske steder i en individuell cochlea. Imidlertid er strukturene av interesse begravet dypt inne i den benete cochlea. Gerbils brukes som dyremodell for aldersrelatert hørselstap. Her beskrives rutinemessige protokoller for fiksering, immunolabeling av gerbil cochlear whole mounts, confocal imaging og kvantifisering av synapsetall og volumer på båndet. Videre fremheves de spesielle utfordringene knyttet til å skaffe godt materiale fra verdifulle aldrende individer.
Gerbils er euthanized og enten perfused kardiovaskulært, eller deres tympaniske bullae er forsiktig dissekert ut av skallen. Cochlea åpnes ved apex og base og overføres direkte til fikseringsmiddelet. Uavhengig av den opprinnelige metoden, blir cochlea postfixed og deretter avkalket. Vevet merkes deretter med primære antistoffer mot pre- og postsynaptiske strukturer og hårceller. Deretter inkuberes cochlea med sekundære fluorescensmerkede antistoffer som er spesifikke mot deres respektive primære. Cochlea av eldre gerbils blir deretter behandlet med en autofluorescence quencher for å redusere den typisk betydelige bakgrunnsfluorescensen av eldre dyrs vev.
Til slutt dissekeres cochlea i 6-11 segmenter. Hele cochlealengden rekonstrueres slik at spesifikke cochleasteder kan bestemmes pålitelig mellom individer. Confocal bilde stabler, anskaffet sekvensielt, bidra til å visualisere hårceller og synapser på de valgte stedene. De konfomiske stablene er dekonvolverte, og synapsene telles enten manuelt ved hjelp av ImageJ, eller mer omfattende kvantifisering av synaptiske strukturer utføres med bildeanalyseprosedyrer som er spesialskrevet i Matlab.
Introduction
Aldersrelatert hørselstap er en av verdens mest utbredte sykdommer som rammer mer enn en tredjedel av verdens befolkning i alderen 65 år og eldre1 år. De underliggende årsakene er fortsatt under debatt og aktivt undersøkes, men kan omfatte tap av spesialiserte synapser som forbinder indre hårceller (IHCer) med afferent auditive nervefibre2. Disse båndsynapsene består av en presynaptisk struktur som har vesicles fylt med nevrotransmitterglutamat bundet til den, samt postsynaptiske α-amino-3-hydroksy-5-metyl-4-isoxazolepropionic acid (AMPA) glutamatreseptorer 3,4,5. I gerbil, ~ 20 afferent auditive nervefibre kontakt en IHC 6,7,8. Fibre på IHC vendt mot modiolus er imot store synaptiske bånd, mens fibrene som forbinder på søylesiden av IHC står overfor små synaptiske bånd (dvs. hos katter9, gerbils7, marsvin10 og mus 3,11,12,13,14). Videre, i gerbil, er størrelsen på presynaptiske bånd og postsynaptiske glutamatplaster positivt korrelert 7,14. Fibre som er imot store bånd på modiolarsiden av IHC er små i kaliber og har lave spontane priser og høye terskler15. Det er bevis på at lav spontan hastighetsfibre er mer sårbare for støyeksponering10 og ototoksiske legemidler16 enn høy-spontane lavterskelfibre, som ligger på søylesiden av IHCer15.
Tapet av båndsynapser er den tidligste degenerative hendelsen i cochlea nevral aldersrelatert hørselstap, mens tapet av spiral ganglionceller og deres afferent auditive nervefibre henger etter17,18. Elektrofysiologiske korrelasjoner inkluderer opptak av auditive hjernestammeresponser17 og sammensatte virkningspotensialer8; Disse gjenspeiler imidlertid ikke finesser av synapsetap, siden lav spontane hastighetsfibre ikke bidrar til disse tiltakene16. Mer lovende elektrofysiologiske beregninger er den massepotensial-avledede nevrale indeksen19 og peristimulus tidsrespons20. Disse er imidlertid bare pålitelige hvis dyret ikke har andre cochleapatologier, utover auditivt nervefibertap, som påvirker aktiviteten til de resterende auditive nervefibrene8. Videre var atferdsvurderte terskler i gerbil ikke korrelert med synapsetall21. Derfor er pålitelig kvantifisering av overlevende båndsynapser og dermed antall funksjonelle hørselsnervefibre bare mulig ved direkte undersøkelse av cochleavevet.
Den mongolske gerbil (Meriones unguiculatus) er en egnet dyremodell for å studere aldersrelatert hørselstap. Den har en kort levetid, har lavfrekvent hørsel som ligner på mennesker, er lett å vedlikeholde og viser likheter med menneskelige patologier relatert til aldersrelatert hørselstap 2,22,23,24. Gerbils regnes som alderen når de når 36 måneder, som er nær slutten av deres gjennomsnittlige levetid22. Viktigst, et aldersrelatert tap av båndsynapser har blitt demonstrert hos gerbils oppdratt og alderen i stille omgivelser 8,21.
Her presenteres en protokoll for immunolabel, dissekering og analyse av cochlea fra gerbils i forskjellige aldre, fra unge voksne til eldre. Antistoffer rettet mot komponenter i presynapsen (CtBP2), postsynaptiske glutamatreseptorplaster (GluA2) og IHCer (myoVIIa) brukes. En autofluorescence quencher påføres som reduserer bakgrunnen i alderen cochlea og lar fluorescenssignalet være intakt. Videre er det gitt en beskrivelse av hvordan man dissekerer cochlea for å undersøke både sensorisk epitel og stria vaskulærris. Cochlealengden måles for å muliggjøre valg av distinkte cochlea-lokasjoner som tilsvarer spesifikke beste frekvenser25. Kvantifisering av synapsenumre utføres med den fritt tilgjengelige programvaren ImageJ26. Ytterligere kvantifisering av synapsevolumer og steder innenfor den enkelte HC utføres med programvare tilpasset skrevet i Matlab. Denne programvaren er ikke gjort offentlig tilgjengelig, da forfatterne mangler ressurser til å gi profesjonell dokumentasjon og støtte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller og prosedyrer ble godkjent av relevante myndigheter i Niedersachsen, Tyskland, med tillatelsesnummer AZ 33.19-42502-04-15/1828 og 33.19-42502-04-15/1990. Denne protokollen er for mongolske gerbils (M. unguiculatus) av begge kjønn. Ung voksen refererer til en alder av 3-12 måneder, mens gerbils anses å være 36 måneder og eldre. Når det ikke er oppgitt noe annet, kan buffere og løsninger tilberedes og lagres i kjøleskapet i opptil flere måneder (4-8 °C). Før bruk må du forsikre deg om at bufferne og løsningene ikke er utløst.
1. Fiksering og organsamling
MERK: Hvis bare cochlea er nødvendig, anbefales det å utføre den noe enklere prosedyren for fiksering ved nedsenking. Men hvis en godt bevart hjerne også er nødvendig, er transkardiale perfusjon det eneste alternativet. Fixative i begge tilfeller er 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufret saltvann (PBS). Dette skal være nylaget, men kan lagres frosset til bruk. Bruk aliquots på ~ 300 ml for en transkardial perfusjon eller ~ 50-100 ml per cochlea for fiksering ved nedsenking.
FORSIKTIG: PFA er et farlig stoff; håndtere det i henhold til generelle laboratoriesikkerhetsprosedyrer.
- Fiksering ved transkardiale perfusjon
- Skyll perfusjonsoppsettet til slangen er fri for luftbobler. Fyll perfusjonsslangen med PBS som inneholder heparin (0,2 ml i 100 ml PBS) for å forhindre blodpropp. Stopp strømmen når slangen er fylt med PBS og væskelagringsflasken nettopp er tømt; hell 200 ml tint PFA inn i den.
MERK: Oppsettet er nå klart for dyret. Den gjenværende PBS i slangen er tilstrekkelig til å skylle ut blodet og vil automatisk bli etterfulgt av fikseringsmiddelet når strømmen gjenopptas. - Sørg for at et avfallsoppsamlingssystem er på plass for utstrømning av PFA. Bruk en frisk kanyle (19 G) og ha stor saks, tang (med flatt spiss), hemostater, skalpell eller skarp kanyle, og en gummimatte med pinner hendig.
- Euthanize gerbil med en intraperitoneal overdose av pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml per dyr, kroppsvektsområde: 50-120 g). Sett dyret tilbake i buret. Når åndedrettsstans setter i slik at pusten blir uregelmessig med intervaller på 30 s eller lenger, legg gerbilen på ryggen på gummimatten og fest både forpoter og en bakpote med pinner (la en bakpote være fri til å bevege seg for bedre vurdering av perfusjonssuksess; se notat etter trinn 1.1.7).
- For å åpne thoracic hulrommet, løft huden over brystbenet med tang og kutt huden ca 0,5 cm under brystbenet med saks til den hvite fargede processus xiphoideus er synlig. Hold brystbenet ved processus xiphoideus med tang og kutt langs membranen for å få et godt syn inn i thoraxhulen. Klipp ribbenene sidelengs på begge sider til det er god tilgang til hjertet. Sørg for at saksens vinkel er parallell og flat i forhold til gerbilens kropp for å unngå skade på organer og dermed sikre et lukket sirkulasjonssystem.
- Klem en hemostat på brystbenet, løft ribbeina og legg hemostaten over gerbilens skulder uten å hvile hemostaten på kroppsdeler for å unngå å blokkere blodstrømmen.
- Åpne væskestrømmen litt til en dråpe PBS strømmer ut av kanylen (19 G) omtrent hver 2. Hold hjertet med tang og vri det litt til venstre slik at venstre ventrikel tydelig kan ses. Sett kanylene inn i venstre ventrikel i en vinkel som unngår å trenge inn i septumet. Hold nålen på plass enten for hånd eller med en annen hemostat.
MERK: Venstre og høyre ventrikler kan differensieres med sine forskjellige fargetoner; venstre ventrikel vises lettere i fargen enn resten av hjertevevet. - Øk trykket i væskestrømmen sakte og åpne riktig atrium enten med fin saks, en skalpell eller en annen kanyle. Åpne væskestrømmen ytterligere til ca. 2-3 dråper/s blir observert ved dryppkammeret, eller sett en strøm på 4 ml/min for pumpen. Når fiksering av hjertet setter inn, sørg for at perfusjonskanylen forblir på plass uten å bli holdt lenger.
MERK: Tegn på vellykket perfusjon er langsomme muskelsammentrekninger, stivning av nakke og ekstremiteter, leveren blir blek og rosenrøde lunger. Tegn på mislykket perfusjon er bleking av lungene, noe som indikerer at lungesirkulasjonen er perfundert på grunn av punktering av septumet. - Ved mislykket perfusjon, prøv å flytte kanylen lenger opp, inn i aorta, og klem den på plass med en hemostat.
- Decapitate gerbil. Fjern bullae og kutt og bryte bort beinet som beskrevet i trinn 1.2.2.
MERK: Hvis vevet ikke er tilstrekkelig fast, vil det sensoriske epitelet løsne fra Cortis organ under disseksjonen. - Hvis perfusjonen ikke viser tegn på fiksering innen 5-10 min, avbryter du den og følger umiddelbart prosedyren nedenfor for fiksering ved nedsenking. For det, behandle cochlea som i trinn 1.2.2 og etterfix vevet i ca 50-80 ml av 4% PFA i skruehettbeholdere i 1-2 dager på en 2D-shaker ved 8 °C.
MERK: Siden det kan være vanskelig å til slutt vurdere kvaliteten på fiksering under perfusjon, anbefales det å rutinemessig postfix cochlea som beskrevet.
- Skyll perfusjonsoppsettet til slangen er fri for luftbobler. Fyll perfusjonsslangen med PBS som inneholder heparin (0,2 ml i 100 ml PBS) for å forhindre blodpropp. Stopp strømmen når slangen er fylt med PBS og væskelagringsflasken nettopp er tømt; hell 200 ml tint PFA inn i den.
- Fiksering ved vevs nedsenking
- Euthanize gerbils med en intraperitoneal overdose av pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml per dyr, kroppsvektsområde: 50-120 g). Når gerbil har sluttet å puste, halshugge dyret.
- Fjern bullae og kutt og bryte bort beinet med henholdsvis saks og tang for å nå cochlea. Fjern maellus, incus og halvcirkelformede kanaler. Lag små hull på toppen og i basal sving ved å forsiktig skrape over cochleabenet med tang. Overfør umiddelbart bullae til et overskudd av kaldfiksativ (minst 50 ml) og fest vevet i kulde (4-8 °C) under skånsom agitasjon (2D-shaker [100 rpm]) i 2 dager.
MERK: Etter å ha fikset vevet, kan cochlea enten behandles umiddelbart eller lagres i PBS med 0,05% natriumazid. FORSIKTIG: Natriumazid er giftig. Vær oppmerksom på at lengden på lagringen kan påvirke kvaliteten på fargingen negativt. Begrensede studier har antydet at immunostainingen virket svakere etter 2 år med lagring av vevet i natriumazid.
2. Vevsforberedelse og immunisolering
- Løs opp etylendiamintetraketisk syre (EDTA) pulver i PBS for å produsere en 0,5 M oppløsning ved pH 8. For dette, plasser et beger på en magnetisk rører, fyll det med omtrent halvparten av den totale mengden PBS, og tilsett riktig mengde EDTA-pulver, noe som resulterer i en sur suspensjon. Tilsett forsiktig konsentrert natriumhydroksidoppløsning (NaOH) mens du overvåker pH med en pH-måler. Fyll på PBS til ønsket sluttvolum og filtrer løsningen for å forhindre mikrobiell forurensning.
MERK: EDTA-pulveret oppløses bare helt når suspensjonen har nådd en nøytral pH-verdi. - For avkalking, overfør cochlea til 80 ml 0,5 M EDTA i PBS. Inkuber vevet i kulde (4-8 °C) under mild agitasjon på 2D-shakeren (100 o/min) i 2 dager.
MERK: Etter avkalkingstrinnet kan vevet lagres i PBS i flere dager opptil 3 uker før det fortsetter med de gjenværende behandlingstrinnene. For antistoffer som merker stria vascularis, er det tilrådelig å kutte cochlea i halvparten langs modiolaraksen på dette tidspunktet (dvs. før immunoppfatning) for å sikre jevn tilgang av antistoffer til sine respektive mål. Dette er antistoffavhengig og gjelder ikke antistoffene som brukes her for å merke synaptiske strukturer og IHCer. Bruk et stykke brekkbart barberblad og en bladholder (som beskrevet i trinn 4.2) for kuttingen. - Utfør følgende trinn (opptil trinn 3.2) i 2 ml reaksjonsrør for sikker tetning. Hvis vevsstykket er for stort til å passe inne i røret, trim overflødig vev med saks. For å forbedre penetrasjonen av antistoffene, må du først permeabilisere vevet i 1 ml 1% triton (Triton X-100) i PBS på 2D-shaker (100 rpm) ved romtemperatur i 1 time. Vask vevet 3x med 1 ml 0,2% triton (Triton X-100) i PBS på 2D-shaker (100 rpm) ved romtemperatur i 5 min hver.
- For å blokkere ikke-spesifikke antigener, inkuber cochlea i 1 ml blokkeringsløsning (3% bovint serumalbumin [BSA], 0,2% triton, i PBS) på 2D-shaker (100 rpm) ved romtemperatur i 1 time.
MERK: Blokkeringsløsningen kan fremstilles på forhånd, men bør ikke være eldre enn ~10 dager. - Fortynn følgende primære antistoffer ferskt i samme aliquot av blokkeringsløsning: anti-myoVIIa (myosin VIIa) for å merke IHCer (IgG polyklonal kanin), fortynnet 1:400; anti-CtBP2 (C-terminal bindingsprotein 2) for å merke presynaptiske bånd (IgG1 monoklonal mus), fortynnet 1:400; og anti-GluA2 for å merke postsynaptiske reseptorplaster (IgG2a monoklonal mus), fortynnet 1:200. Pass på at cochlea er helt dekket med antistoffoppløsningen (vanligvis 0,4 ml) og inkuber dem ved 37 °C i 24 timer.
- Deretter vasker du vevet 5x med 0,2% triton i PBS på 2D-shaker (100 rpm) ved romtemperatur i 5 minutter hver. Velg sekundære antistoffer for å matche vertsartene til deres primære kolleger og igjen nyfortynne dem i 3% BSA, 0,2% triton, i PBS: geit antimus (IgG1)-Alexa fluorofor (AF) 488, fortynnet 1:1,000; geit antimus (IgG2a)-AF568, fortynnet 1:500; og esel anti-kanin-AF647 (IgG), fortynnet 1:1,000. Vikle røret i aluminiumsfolie for å forhindre bleking av fluorescensen. Inkuber cochlea i 0,4 ml sekundær-antistoffoppløsning ved 37 °C i 24 timer.
MERK: Begrensede studier har indikert at inkubasjon av cochleavev ved 37 °C i 24 timer med primære og sekundære antistoffer resulterte i lysere immunoppnåelse enn å følge den vanligste inkubasjonsprosedyren med lavere temperaturer og kortere varigheter. - Vask cochlea 2x med 1 ml 0,2% triton i PBS i 5 min hver og 3x med PBS i 5 minutter hver på 2D-shaker (100 rpm) ved romtemperatur.
MERK: Etter disse vasketrinnene kan cochlea forbli i PBS i kjøleskapet ved ~ 4 ° C i flere dager.
3. Behandling med autofluorescence quencher (valgfritt)
MERK: Cochlea fra middelaldrende og aldrende gerbils viser omfattende autofluorescens i bakgrunnen. I ung voksent vev er behandling med en autofluorescence quencher ikke nødvendig. Det er i prinsippet mulig å bruke autofluorescence quencher før immunstaining prosedyren, som deretter unngår utilsiktet reduksjon av ønsket antistoff fluorescens. Men ifølge produsentens datablad er bruk av vaskemidler (som Triton X-100 i den nåværende protokollen) ikke lenger mulig da de fjerner quencher fra vevet.
- Klipp cochleaen i to under et stereomikroskop, som beskrevet i trinn 4.2.
- Bland autofluorescence quencher med 70% etanol for å oppnå en 5% løsning og inkuber cochlea i denne løsningen på 2D-shaker ved romtemperatur i 1 min. Vask cochlea 3x med 1 ml PBS på 2D-shakeren ved romtemperatur i 5 minutter hver.
FORSIKTIG: Autofluorescence quencher er farlig og skadelig. Bruk hansker når du håndterer dette stoffet.
4. Endelig fin disseksjon
- Disseker cochlea under et stereomikroskop. Fyll en polystyrol Petri-tallerken og lokket med PBS og hold to fine tanger, Vannas vårsaks, en bladholder og en brukbar barberblade hendig. Bryt biter fra barberbladet for å få en skjæreflate på ~ 2-4 mm avhengig av disseksjonstrinnet. Forbered et mikroskopsklie ved å plassere tre dråper monteringsmedium på rad.
MERK: Skjæreflaten på barberbladet slites raskt av. Bladet må skiftes ut etter dissekering og montering ca. hvert sekund av cochleaen. - Hvis det ikke allerede er gjort i trinn 3.1, må du først kutte cochlea i to langs modiolus under et stereomikroskop. For dette, plasser et stykke barberblad lenger enn den spolede lengden på cochlea i en bladholder. Legg cochlea i Petri parabolen og kutt bort overflødig vev med stykke barberblad. Hold cochlea på plass med fine tang og kutt i halvparten langs modiolusen.
- Start med den ene halvdelen, men la den andre halvdelen i Petri-parabolen også. Fest cochleahalvdelen forsiktig med tang slik at skjærekanten vender oppover. Bruk fin vår saks for å kutte bort beinet av cochlea over helicotrema, dekker apex.
- For å begynne separasjonen av cochleastykkene, isoler midtsvingen ved å kutte med saks gjennom modiolus og auditiv nerve, over (scala vestibuli) og under (scala tympani).
- Skjær gjennom cochleabenet som dekker stria vaskulærris i cochleakanalen. Lag to kutt på begge sider av cochleabenet over Corti-organet og langs stria vaskulærris og bruk barberbladet til slutt å skille cochleastykkene.
MERK: Stria vascularis er lett synlig som en mørk stripe. Kutting langs stria vascularis forlater organet i Corti intakt. - Valgfritt: For å samle stria vaskulærris, kutt forsiktig mellom organet i Corti og stria vaskulærris for å skille de to. La stria vaskulærris koblet til spiral ligamentet (festet til beinet dekker den ytre overflaten av cochlea) og fjern dekalcified bein ved hjelp av tang. Plasser arb med striasiden opp på mikroskopet i en dråpe monteringsmedium.
MERK: Hvis det oppsamlede stykket er buet for sterkt, kan det være nødvendig å dele det i mindre deler for at det skal være flatt nok til montering på lysbildet. - Overfør cochleastykkene til det PBS-fylte lokket på polystyrole Petri-parabolen, og sørg for at cochlear hele brakettene ligger så flatt som mulig på lysbildet. Fjern overflødig vev, for eksempel deler av spiralbåndet på den abneurale siden og deler av spirallembussen på nevralsiden. Fjern forsiktig tectorialmembranen med super fine tang.
- Plasser cochleastykkene på gliden i en dråpe monteringsmedium. Plasser cochlear hele brakettene med organet Corti vendt opp på lysbildet for å unngå å skjule IHCene i den optiske banen for avbildning. Se etter invaginering av spirallembussen i nærheten av IHCene, som er synlig ved å flytte cochleastykket inn i sagittalplanet for å identifisere siden til ansikt oppover.
MERK: For å rekonstruere hele cochlea digitalt fra sine individuelle stykker under videre behandling, anbefales det sterkt å dokumentere skisser av brikkene og notere landemerker. Videre bør brikkene ideelt sett ordnes i riktig rekkefølge på lysbildet. - Gjenta trinn 4.3 til 4.8 til hele cochlea overføres til mikroskopet. Om nødvendig, legg til mer monteringsmedium, dekslerlip lysbildet, og forsegle dekslenelip på plass med svart neglelakk malt rundt kantene. La det tørke i mørket ved romtemperatur og oppbevar deretter gliden i mørket ved 4 °C.
MERK: Selv om deler av selve det sensoriske epitelet ved et uhell går tapt, er det viktig å likevel montere det som er igjen av cochleastykket for riktig lengdeestimering.
5. Måling av cochlealengde
- Mål lengden på cochlea fra brightfield-bilder av brikkene ved hjelp av et epi-fluorescensmikroskopsystem og tilhørende programvare. Lagre bilder med lav forstørrelse (4x linse) fra hvert cochlear-stykke, og bruk lassomålingsverktøyet til mikroskopprogramvaren til å tegne en linje langs raden med IHCer i hvert av bildene. Beregn den totale lengden ved å legge til lengdene på alle brikkene.
MERK: Når deler av det sensoriske epitelet mangler i et cochleastykke, interpolerer du linjen. - For å definere cochlea-lokasjonene som skal analyseres i en individuell cochlea, beregner du de tilsvarende avstandene fra toppen ved hjelp av ligningen gitt av Müller25. Merk disse stedene, for eksempel på en utskrift av cochlear-delene.
6. Bildeoppkjøp med et konfokalt mikroskop
- Bruk et konfokalt mikroskop med et 40x objektivt oljeinnlevelsesmål (numerisk blenderåpning 1.3) og riktig olje for høyoppløselig avbildning.
MERK: Hvis det konfiskeringsmikroskopet har en omvendt lysbane, må lysbildet plasseres opp-ned. I dette tilfellet, gi prøven ca 30 min til å synke og hvile stabilt på dekslene før du starter den endelige skanningen. Alternativt kan du bruke et monteringsmedium som er flytende gjennom hele disseksjonens varighet, men størkner senere og samtidig sparer fluorescensen. - Aktiver de aktuelle laserne: to optisk pumpede halvlederlasere med bølgelengder på λ = 488 nm og λ = 522 nm, og en diodelaser med en bølgelengde på λ = 638 nm brukes i denne protokollen. Velg utslippsområdet for fluorescensmerkene (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Når en hybriddetektor teller de frigjorte fotonene, plasserer du laserlinjen minst 10 nm unna utslippskurven.
MERK: Det er viktig å utføre foreløpige kontroller med enkeltmerket vev for å sikre at de valgte detektorbåndbreddene skiller fargekanalene rent (dvs. ikke fører til kanalkryssing). Radiobølger forstyrrer hybriddetektoren, noe som resulterer i maksimalt antall foton, og forårsaker dermed artefaktuelle striper i stabelen. Unngå derfor å bruke en mobiltelefon i nærheten av mikroskopet. - Zoom inn på vevet til bildet strekker seg over 10 IHCer. Velg oppløsningen på bildet i henhold til Nyquist-sampling, som vanligvis er ~ 40-60 nm / piksel. Sett trinnstørrelsen i z-retning til 0,3 μm og bildehastigheten til 400-700 Hz.
MERK: Begge disse innstillingene (trinnstørrelse og bildehastighet) er kompromisser mellom å bruke optimale bildeparametere og spare skannetid. - Utfør toveis prøvetaking for å forkorte bildetiden. Samle rammen for 488 nm og 638 nm kanal 3x og for 522 nm kanal 6x; I tillegg er gjennomsnittet av linjene 3x for hver kanal. Velg begynnelsen og slutten av stabelen i z-dimensjonen.
- Sett forsterkningen til 100 når du bruker hybriddetektoren (tellemodus) for å unngå redusert signal-til-støy-forhold. Still inn laserkraften slik at ingen piksel er mettet i interesseområdet, men strukturene dekker for det meste hele 8-biters rekkevidde. Start med en lav lasereffekt på 0,5% og øk den til strukturene er synlige.
MERK: God farging trenger vanligvis en lasereffekt mellom 0,1 % og 5 %. - Bruk dekonvolusjonsprogramvare for post hoc-behandling av bildestakkene for å fjerne uskarp haloen rundt små fluorescerende strukturer ved hjelp av en teoretisk punktspredningsfunksjon. Bruk de samme innstillingene for hver stakk i et eksperiment. Lagre de dekonvolverte bildene som .tif eller .ics.
MERK: MyoVIIa-etiketten (IHCer) drar ikke nytte av dekonvolusjon og kan utelates for å spare tid. Programvaren bruker metadata av bildefilene; Flere parametere, for eksempel lysbanen, innebyggingsmediet eller nedsenkningsmediet, må imidlertid angis.
7. Synapse kvantifisering
- Åpne en kopi av de dekonvolverte stablene i den fritt tilgjengelige programvaren ImageJ med den ekstra Biovoxxel-plugin, som også er tilgjengelig på nettstedet deres.
- Juster fargene på enkeltkanaler ved å dele kanalene (bilde | Farge | Delte kanaler) og fletting (bilde | Farge | Slå sammen kanaler) dem igjen, tilordne forskjellige farger. Konvertere bildet til en RGB-stakk (bilde | Farge | Stable til RGB) og juster lysstyrken og kontrasten (bilde | Juster | Lysstyrke/kontrast | enten Auto eller slider angående Maksimum), om nødvendig, slik at pre- og postsynaptiske strukturer og IHC-etiketten er behagelig forskjellig fra bakgrunnen.
- Velg fem IHCer og merk dem med tekstverktøyet (IHC1-IHC5) ved å klikke på ønsket sted i stabelen. Åpne ROI Manager (Analyser | Verktøy | ROI Manager); aktivere avmerkingsboksetikettene for å merke punktene med et tall. Zoom inn på IHC av interesse.
- Bruk punkt-/multipunktverktøyet i flerpunktsmodus (høyreklikk verktøyet for å velge mellom punkt- eller flerpunktsmodus). Klikk på en funksjonell båndsynapse (dvs. et presynaptisk bånd i nært sammenstilling til en postsynaptisk glutamatoppdatering) mens du blar gjennom z-dimensjonen.
MERK: Avhengig av overlappingsmengden og fargen som er valgt for hver kanal, vises de delte bildepunktene i blandet farge. Vanligvis er skillet mellom individuelle funksjonelle synapser enkelt fordi de er tilstrekkelig fjernt fra hverandre. - Når alle strukturene av interesse er merket av, klikker du på Legg til i ROI-lederens grafiske brukergrensesnitt. Klikk på det vilkårlige navnet og velg Gi nytt navn.
MERK: Punktetikettene holder seg fortsatt gjennom alle planene i stabelen når det er merket av for Vis alle i menyen for punktverktøyalternativer (dobbeltklikk på punktverktøyikonet ), noe som bidrar til å unngå å telle det samme båndet flere ganger. - Når du velger neste IHC som skal telles, bør du unngå å legge til tellinger ved en feiltakelse ved å justere bildet slik at det viser neste IHC fullstendig med håndverktøyet. Bytt fra verktøy med flere punkter til punkt for å unngå å legge til mer puncta i de tidligere lagrede dataene. Klikk på en struktur av interesse i neste IHC og bytt tilbake til multipunktverktøy. Gjenta trinn 7.4 til 7.5 til alle IHCene av interesse er evaluert.
- For å lagre data, klikk på et datasett i ROI-lederen og deretter på mål. Vent til et nytt vindu vises, og viser de målte datapunktene. Lagre denne listen som en regnearkfil (fil | Lagre som). Lagre bildet ved å aktivere Vis alle i ROI-behandling. Klikk Slå sammen for å legge til punktetikettene permanent i stabelen. Når du lukker bildestakken, må du godta å lagre endringene.
8. Analyse av synapsevolum og posisjon på hårcellen
MERK: Forfatterne brukte en spesialprogrammert prosedyre basert på Matlab. Siden det ikke er offentlig tilgjengelig, er det skissert her bare i brede termer (se også7). Ta kontakt med den tilsvarende forfatteren hvis du er interessert i å bruke den. Prosedyren forventer en trippelmerket (IHCer, pre- og postsynaptisk) bildestakk i TIFF-format som inndata, veileder brukeren gjennom de ulike analysetrinnene via et grafisk grensesnitt, og gir omfattende utdata av resultatene i regnearkformat.
- Normaliser posisjonen til de synaptiske strukturene til et 3D-koordinatsystem definert av den enkelte IHCs omfang på søyle-modiolaraksen og cochlear apikal-basalaksen og IHCs toppakse (kupeplate) til bunnaksen (synaptisk pol).
MERK: Volumene av synaptiske elementer (både pre- og postsynaptic, og det kombinerte volumet av funksjonelle synapser) leveres i μm3 og normaliseres til den respektive medianverdien3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cochlea ble enten høstet etter kardiovaskulær perfusjon med fiksering av hele dyret eller raskt dissekert etter euthanizing dyret og nedsenkningsfast. Med sistnevnte metode holdt IHCene seg på plass under disseksjonen, mens i tilfeller av mislykket perfusjon og dermed utilstrekkelig fast vev, ble det sensoriske epitelet ofte ødelagt. Legg merke til at forfatterne opplevde tilfeller der fiksering av cochlea etter transkardiell perfusjon ikke var tilstrekkelig mens fiksering av hjernen fortsatt var tilstrekkelig. Vev fra en dårligere perfusjon kan fortsatt reddes ved å åpne hull i cochlea apex og base og postfixing cochlea ved nedsenking i 4% PFA i 2 dager.
Lengdebestemmelse av hele cochlea ble utført i henhold til Müller25 for å evaluere IHCer og deres synapser ved spesifikke cochleaposisjoner, tilsvarende distinkte karakteristiske frekvenser (tabell 1). For dette ble de ønskede cochleaposisjonene beregnet som prosentandeler av basilarmembranlengde fra cochleabasen. Median cochlealengde på 13 cochlea fra unge voksne gerbils var 11,3 mm (interkvartil rekkevidde: 11,02-11,52 mm). Median cochlealengde på 24 cochlea fra alderen gerbils var 11,5 mm (interkvartil rekkevidde: 11,24-11,73 mm). Det var ingen signifikant forskjell mellom lengden på ung voksen og alderen cochlea (Mann-Whitney U-test: U = -1,62, p = 0,105); den totale medianen var 11,48 mm. Man kan hevde at denne variasjonen i lengden på den enkelte cochlea var liten og bruk av faste lengdeposisjoner (i mm) er tilstrekkelig. Stedsfrekvensfunksjonen er imidlertid ikke-lineær. Derfor forårsaker et avvik fra medianlengden en større feil for basale cochlea-lokasjoner enn for relativt mer apikale cochleasteder. For eksempel, for cochlea-plasseringen som tilsvarer en frekvens på 1 kHz, beregnet basert på median cochlealengde (dvs. 11,48 mm), varierte den tilsvarende frekvensen fra 1,16 kHz til 0,91 kHz for den korteste (10,36 mm) og den lengste cochlea (12,28 mm) i denne prøven. For en basally lokalisert frekvens (f.eks. 32 kHz) var frekvensområdet henholdsvis 51,62 kHz til 23,97 kHz, for den korteste og lengste cochlea. Derfor er det tilrådelig å beregne de enkelte stedene på hver cochlea, spesielt når du undersøker basale cochleasteder.
Figur 1 viser maksimal intensitet z-dimensjon projeksjoner av cochlea fra en ung voksen (10 måneder, figur 1A) og en alderen gerbil (38 måneder, figur 1B), som er eksempler på ideelle immunolabeler. På bildet som skildrer den unge voksne gerbilens cochlea, er de myoVIIa-merkede IHCene, her vist i blått, i skarp kontrast til den svarte bakgrunnen. Derfor er individuelle IHCer lett å oppdage. De pre- og postsynaptiske strukturene er tydelig synlige som henholdsvis grønne og røde elementer. De antas å danne en funksjonell synapse når de er i nær sammenstilling (figur 1A',B'). Det var sjelden uparrede presynaptiske strukturer (foreldreløse bånd) tydelig i cochlea av eldre gerbils. Cochlea fra den gamle gerbil (figur 1B) ble behandlet med autofluorescence quencher. IHC-etiketten virker svakere, selv om laserkraften som brukes i denne prøven var tre ganger høyere enn den som ble brukt til cochlea fra den unge voksne gerbil. Likevel er IHCene fortsatt forskjellige fra bakgrunnen. De pre- og postsynaptiske strukturene er tydelig synlige, og laserkraften som brukes til begge disse kanalene var lik eller til og med under den for den unge voksne prøven. Vev fra eldre dyr viste vanligvis betydelig mer ikke-spesifikk utseende fluorescerende signal. Derfor er hovedforskjellen i protokollen for ung voksen og alderen behandling med en autofluorescence quencher. Merk at dette ble utført etter immunstaining med fluorescensmerkede antistoffer og kan i prinsippet også påvirke den tiltenkte antistoffetiketten. Behandlingen reduserte imidlertid effektivt ekstern fluorescens av ikke-spesifikk opprinnelse, samtidig som det etterlot tilstrekkelig signal om den spesifikke etiketten til interessestrukturene (sammenlign figur 1B med figur 2B). Foreløpige resultater indikerte imidlertid at i stria vaskulærris manifesterte ekstern fluorescens ikke i prøver fra alderen gerbils.
Eksempler på stakker som ble deloptimalt behandlet, vises i figur 2. Figur 2A viser den maksimale z-projeksjonen av en stabel fra en gammel gerbil (36 måneder), der IHCene, som også enten var unaturlig bøyd eller revet fra hverandre, ikke ble skannet i sin helhet. Som et resultat er bare de apikale og basale polene til IHCer synlige i denne skanningen. Det kan ikke utelukkes at flere synapser var plassert i den manglende midtre delen av IHCene, og derfor er en pålitelig analyse ikke mulig. Dermed er det avgjørende at alle evaluerte IHCer skannes helt i den kondokale stabelen. Figur 2B viser maksimal intensitet z-projeksjon av en stabel samplet i en alderen gerbil (38 måneder). Fluorescensen av uklar opprinnelse er høy da autofluorescence quencher ikke ble brukt i dette tilfellet. Imidlertid var den fremmede fluorescensen i stor grad begrenset til den (røde) kanalen knyttet til GluA2-etiketten, noe som er ganske typisk. I slike tilfeller kan det fortsatt være mulig å telle funksjonelle synapser hvis CtBP2-etiketten på båndene er relativt ren og spesifikk. Figur 2C viser den maksimale z-projeksjonen av en stabel hentet fra en alderen gerbil (42 måneder). Her kan ikke synapsene tildeles individuelle IHCer da IHCene i stor grad ble oppløst; Faktisk er det vanskelig å være sikker på hvor mange IHCer som er representert. I eksemplet som vises i figur 3A, ble en mobiltelefon brukt i nærheten av det konfokale mikroskopet under skanningen. Striper er synlige i den blå kanalen (IHC-etikett). Heldigvis påvirket dette i dette tilfellet ikke de synaptiske kanalene og påvirket bare den øvre delen av IHCene, og dermed var en analyse fortsatt levedyktig.
Figur 3 viser z-projeksjoner med maksimal intensitet av stabler hentet fra samme stykke cochlea fra en ung voksen gerbil, oppnådd 3 måneder (figur 3A,A') og 29,5 måneder (figur 3B,B') etter immunstaining. For å forbli sammenlignbare, ble bildene ikke tatt fra nøyaktig samme sted (som kan ha lidd bleking fra forrige skanning), men fra samme cochlear stykke. For skanningen som ble tatt på det senere tidspunktet, måtte laserstrømmen økes ~ 2- til 3 ganger. Likevel er de merkede strukturene fortsatt klare. Signal-til-støy-forholdet hadde gått ned, spesielt i kanalene som viste postsynaptiske og IHC-strukturer, mens kanalen med den presynaptiske etiketten var mindre påvirket. Kvantifisering av funksjonelle synapser per IHC er fortsatt mulig.
Typiske resultater for analyse av synapsevolum og posisjon på IHC er illustrert i figur 4, ved hjelp av den konfiskede stakken vist i figur 1A. Individuelt definerte IHCer vises grafisk som rutenettrekonstruksjoner i forskjellige farger, med eller uten funksjonelle synapser (definert ved colokalisering av pre- og postsynaptiske etiketter) tildelt hver. Denne skjermen kan roteres fritt i 3D for å oppnå forskjellige visningsvinkler (figur 4A,B). IHCer kan også skilles ut for grafisk visning (figur 4B). Et stort utvalg av datagrafer, som illustrerer ulike aspekter ved fordelingen av synaptiske volumer i det IHC-sentrerte koordinatsystemet, produseres (eksempler i figur 4C-E). De rå kvantitative dataene for hver IHC og hvert synaptiske element er også tilgjengelige som regneark som deretter kan kombineres på tvers av flere konfiskeringer for videre statistisk analyse.
Figur 1: Eksempler på vellykket behandlet cochlea. Maksimal intensitet z-projeksjoner av konfokale stabler fra (A) en ung voksen gerbil (10 måneder), oppnådd på et cochleasted tilsvarende 1 kHz, og (B) en alderen gerbil (38 måneder, panel B), oppnådd på en cochlea plassering tilsvarende 500 Hz. IHCs ble farget med et antistoff mot myoVIIa (blå), presynaptiske bånd ble merket med anti-CtBP2 (grønn), postsynaptiske glutamatplaster ble merket med anti-GluA2 (rød). Cochlea av den aldrende gerbil ble behandlet med en autofluorescence quencher etter immunostaining. For klarhetstegn er IHCenes konturer indikert med stiplede linjer. Panelene (A') og (B)) viser en utvidelse av områdene som er skissert av rutene i den tilsvarende cochleaen fra paneler (A) og (B). Gule pilspisser peker på funksjonelle synapser. Kanalene som viste pre- og postsynaptiske strukturer (men ikke IHC-kanalen) gjennomgikk dekonvolusjon. Skalastenger = 10 μm (A, B), 1 μm (A',B'). Forkortelser: IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bindingsprotein 2; GluA2 = ionotropisk glutamatreseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Eksempler på suboptimalt bearbeidet cochlea. Maksimal intensitet z-projeksjoner av konfokale stabler som behandlingen var suboptimal, fra gerbils som var (A) 36 måneder og (B, C) 38 måneder gammel og fra cochlear steder tilsvarende henholdsvis 16 kHz, 8 kHz og 32 kHz. Gerbils hvorfra cochlea i paneler (A) og (C) ble avledet ble transkardielt perfundert, og cochlea fra panel (C) ble i tillegg postfixed i 3 dager i 4% PFA. Cochlea fra (B) var nedsenket i 4% PFA i 2 dager. Cochlea fra (A) og (C) ble behandlet med autofluorescence quencher. IHCer ble farget med et antistoff mot myoVIIa (blå), presynaptiske bånd ble merket med anti-CtBP2 (grønn), og postsynaptiske glutamatplaster ble merket med anti-GluA2 (rød). Alle kanaler ble dekonvolvert. Lysstyrken og kontrasten ble ytterligere justert etter den konfiskeringsskanningen. Skalastenger = 10 μm. Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bindingsprotein 2; GluA2 = ionotropisk glutamatreseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Stabilitet av immunmerke etter langvarig lagring. Maksimal intensitet z-projeksjoner av konfokale stabler fra en ung voksen gerbil (10 måneder), tatt på 16 kHz cochlea plassering, (A) 3 måneder etter farging og (B) på en litt mer basal cochlear plassering på samme cochlear stykke 29,5 måneder etter farging. Cochlea var nedsenkningsfast i 4% PFA i 2 dager. For klarhetsforklaring zoomer (A') og (B)) inn på bare noen få funksjonelle synapser fra områdene angitt av henholdsvis kvadratene i (A) og (B). IHCer ble farget med et antistoff mot myoVIIa (blå), presynaptiske bånd ble merket med anti-CtBP2 (grønn), og postsynaptiske glutamatplaster ble merket med anti-GluA2 (rød). Lasereffekten for IHC-kanalene var 1,3 % og 3 %, for de presynaptiske kanalene henholdsvis 0,4 % og 1,1 %, og for postsynaptiske kanaler henholdsvis 1,1 % og 2 % i (A) og (B). Merk at i (A) er blå striper synlige i den øvre delen av IHCene, som skyldes bruk av en mobiltelefon i nærheten av det konfokale mikroskopet. Skalastenger = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bindingsprotein 2; GluA2 = ionotropisk glutamatreseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av kvantifisering av synapsevolum. (A) Ti IHCer vist som forskjellige fargede rutenettrekonstruksjoner basert på myoVIIa immunolabel. Deres tilknyttede funksjonelle synapser, definert av colokaliserte CtBP2-(green) og GluA2-merkede elementer (rød), vises sammen med IHCene, og også separat nedenfor, for klarhet. Vær oppmerksom på at synsvinkelen ble valgt for å være vinkelrett på IHCenes lange akse og dermed avviker fra det opprinnelige konfokale bildet (figur 1A). (B) En av IHCene som er utpekt og vist rotert 90°. Det svarte planet ble manuelt definert av brukeren og krysser IHC langs søyle-modiolaraksen. (C) Bobleplott som viser plasseringen av alle funksjonelle synapser i denne kontrokale stabelen, i forhold til de normaliserte tre aksene til deres respektive IHC. størrelsen på symbolene er proporsjonal med volumet til det presynaptiske elementet. Vær oppmerksom på at synsvinkelen ble valgt slik at den ligner på panelet (B). (D) Boxplot av de normaliserte volumene av synaptiske elementer, separat for presynaptiske (venstre 2 bokser) og postsynaptiske (høyre 2 bokser) partnere av funksjonelle synapser og ytterligere separert i henhold til deres posisjon i modiolaren eller søyle halvparten av deres respektive IHC (forskjellige farger). Bokser representerer interkvartile områder, med medianene angitt med linjer. Stiplede whiskers indikerer 1,5 ganger interkvartilområdet, og kryssene indikerer ytre verdier utover det. (E) Scatterplot av de normaliserte volumene av pre- vs. postsynaptiske partnere av funksjonelle synapser. Ulike symboler indikerer posisjonen i modiolaren eller søylen halvparten av deres respektive IHC. Forkortelser: IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminal bindingsprotein 2; GluA2 = ionotropisk glutamatreseptor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1: Avstander fra toppen som tilsvarer spesifikke målfrekvenser i cochlea av forskjellige lengder. Tilsvarende beste frekvenser ble beregnet basert på ligningen gitt av Müller25. Klikk her for å laste ned denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med metoden som er skissert i denne protokollen, er det mulig å immunolabel IHCer og synaptiske strukturer i cochlea fra unge voksne og eldre gerbils, identifisere antatt funksjonelle synapser ved samlokalisering av pre- og postsynaptiske elementer, tildele dem til individuelle IHCer og kvantifisere antall, volum og plassering. Antistoffene som brukes i denne tilnærmingen merket også ytre hårceller (OHCer, myoVIIa) og deres presynaptiske bånd. Videre er et levedyktig alternativ for immunolmering av både IHCer og OHCer et antistoff mot otoferlin, med OHCer som virker mye fainter enn IHCer.
Perfusjon kan utføres ved hjelp av to forskjellige oppsett. 1) Et tyngdekraftmatet drypplinjesystem der en enkelt flaske som mater en kommersiell drypplinje, er suspendert på et remskivehjul ca. 1,5 m over dyret. Væsker blir introdusert suksessivt etter å ha senket flasken, som er åpen på toppen. 2) Et system som bruker en digital peristaltisk pumpe med variabel hastighet, med et tynt, langt rør åpent i den ene enden for å ta inn væsken og en nål som lett kan festes i den andre enden. Begge fungerer like bra, og de subtile forskjellene vil ikke bli utdypet her. Forfatterne anbefaler imidlertid spesielt en nedtrekksstilt arbeidsbenk, med dyret på en perforert plattform og røyken trukket av nedenfor. Dette gir god tilgang til operasjonsområdet uten at det går på bekostning av eksosfunksjonen (i motsetning til å jobbe i et åpent avtrekksskap).
Riktig fiksering av vevet er av kritisk betydning, siden ellers vil det sensoriske epitelet løsne og oppløses under disseksjon. I gerbil er mer langvarig eksponering for fikseringsmiddelet nødvendig enn vanlig brukt (f.eks. for mus 17,27,13 eller marsvin28). Den foretrukne metoden for gerbils er rask utvinning av cochlea etter dyrets død og nedsenkningsfiksering i minst 1,5 dager. Hvis kardiovaskulær perfusjon foretrekkes, er det avgjørende at fiksering setter inn i løpet av få minutter og fortsetter bra. Siden det kan være vanskelig å til slutt vurdere kvaliteten på fiksering under perfusjon, anbefales det å rutinemessig postfix cochlea som beskrevet.
Det er viktig å overholde vasketrinnene, der det siste vasketrinnet (trinn 2.7) er det viktigste. Hvis det ikke vaskes tilstrekkelig, er vevet klebrig og holder seg til disseksjonsinstrumentene, noe som gjør disseksjonen vanskelig. Det anbefales også å bruke en autofluorescence quencher i cochlea høstet fra alderen gerbils for å redusere ikke-spesifikk fluorescens. Autofluorescence kan stamme fra lipofuscin, som er vanlig i vev fra eldre dyr 29,30,31, og synes å være bredt begeistret så vel som bredt avgir. Når du er spent med en bølgelengde i UV-spekteret (λ = 364 nm), har lipofuscin et bredt utslippsområde (λ = 400-700 nm, med maksimalt ~ λ = 568 nm)32. I humant myokardvev er lipofuscin synlig med en eksitasjon av λ = 555 nm og utslipp av λ = 605 nm33. På samme måte, i IHCene av gerbils, la forfatterne merke til en økning i ikke-spesifikk fluorescens mest fremtredende i kanalen som brukes til AF568-antistoffet, noe som antyder autofluorescens fra lipofuscingranulat. En generell anbefaling når du arbeider med vev fra dyr er dermed å bruke eksitasjonsbåndbredden rundt 550-600 nm for den minst kritiske immunolabelen.
Måling av total cochlealengde og riktig identifikasjon av spesifikke cochleaposisjoner er bare mulig hvis hele lengden er bevart. Hvis deler av det sensoriske epitelet går tapt i disseksjonen, anbefales det å fortsatt montere den gjenværende delen eller til og med bare spiral ganglion stykket, og holde detaljerte notater. Det er da vanligvis mulig å estimere den manglende delen med rimelig nøyaktighet. Hvis de apikale delene av cochlea er helt bevart, men basalenden mangler, kan spesifikke cochleasteder på den apikale delen være definerbare ved å beregne posisjonene basert på median cochlealengde i den brukte gerbilpopulasjonen fordi avviket fra den virkelige verdien er liten.
En viktig begrensning ved kvantifisering av synapsevolumet er at de resulterende absolutte volumene ikke kan sammenlignes på tvers av forskjellige konfomiske stabler. Det kritiske trinnet som bestemmer de resulterende volumene av synaptiske elementer, er valget av intensitetsterskelen for første gjenkjenning. Valget av denne intensitetsterskelen gjøres imidlertid subjektivt av brukeren i den nåværende protokollen og mange andre 3,27,34. Videre avhenger lysstyrken av immunfluorescence i det konfiskere bildet av mange faktorer, som er svært vanskelig å standardisere på tvers av prøver, for eksempel vevstykkelse, vevsretning i forhold til den optiske banen, varigheten av lasereksponering og presise konfiskerings- og dekonvolusjonsinnstillinger. Alle disse forbeholdene forverres hvis sjeldent materiale er anskaffet over en betydelig tidsperiode, som det er typisk for aldrende gerbils. Sammen betyr dette at skjevheter er svært vanskelige å utelate i grupperte data, og det beste tilfellet er et datasett med høy varians. Det anbefales derfor å rutinemessig normalisere synaptiske volumer til det respektive medianvolumet til den enkelte konfektstakken, som introdusert av Liberman et al.3. Den åpenbare ulempen er at synaptiske volumer da bare er sammenlignbare i en gitt bildestakk, for eksempel mellom forskjellige steder på IHC, men ikke mellom forskjellige cochlea-steder eller prøvealder.
Den doble merkingen av pre- og postsynaptiske strukturer og kravet om samlokalisering gir et mer pålitelig estimat av antall funksjonelle synapser enn å bruke en av etikettene alene. Hvis bare en etikett er mulig, anbefales det å bruke presynaptisk anti-CtBP2, koblet til AF488 eller fluorescerende koder med lignende bølgelengdespesifikasjoner, av to grunner. For det første ser foreldreløse bånd, det vil være CtBP2-merkede elementer uten en samlok lokalisert postsynaptisk etikett, ut til å være sjeldne17, og forfatterne bekreftet dette for alderen gerbils. Dermed er feilen som ble introdusert ved ikke å kunne verifisere samlokalisering med en postsynaptisk partner liten. Det skal imidlertid bemerkes at dette blir et mer betydelig problem når man undersøker støyutsatte ører (f.eks. 28). For det andre, i tilfeller med høyt fluorescenssignal av uklar opprinnelse, påvirket støyen vanligvis kanalen ved hjelp av en eksitasjonsbølgelengde rundt 568 nm i størst grad (eksempel i figur 2B, som representerer GluA2-etiketten). Minst en del av denne støyen kan, i vev fra eldre dyr, være lipofuscin autofluorescence. For å maksimere sjansen for en ren, enkelt anti-CtBP2-etikett, anbefales det derfor å unngå denne bølgelengdekanalen. Til slutt ble det vist at med riktige kjølige og mørke lagringsforhold er immunisoleringen som brukes her stabil over lange perioder, opptil minst 2,5 år (figur 3B), noe som gjør reevaluering av verdifullt vev, for eksempel fra alderen gerbils, mulig.
Kvantifiseringen av IHC-afferent synapsenummer har blitt en viktig beregning for å evaluere tilstanden til det perifere hørselssystemet i mange sammenhenger, blant annet aldersrelatert hørselstap. Det er ulike protokoller publisert nå (f.eks. gerbils21, mus17,13, marsvin10,28 og mennesker35). Metoden som er skissert her er i sine detaljer spesifikk for unge voksne og eldre gerbils, men noen generelle anbefalinger har blitt avledet som også kan være til nytte hos andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Forfatterne anerkjenner Lichun Zhang for å bidra til å etablere metoden og Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, for bruk av bildeanleggene. Denne forskningen ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
