Summary
Een protocol voor het verwerken van jongvolwassen en oud gerbil slakkenhuis door immunolabeling van de afferente synaptische structuren en haarcellen, het blussen van autofluorescentie in verouderd weefsel, het ontleden en schatten van de lengte van het slakkenhuis en het kwantificeren van de synapsen in beeldstapels verkregen met confocale beeldvorming wordt gepresenteerd.
Abstract
Het verlies van lintsynapsen die binnenste haarcellen en afferente gehoorzenuwvezels verbinden, wordt verondersteld een oorzaak te zijn van leeftijdsgebonden gehoorverlies. De meest gebruikelijke methode voor het detecteren van het verlies van lintsynapsen is immunolabeling omdat het kwantitatieve bemonstering van verschillende tonotopische locaties in een individueel slakkenhuis mogelijk maakt. De interessante structuren zijn echter diep in het benige slakkenhuis begraven. Gerbils worden gebruikt als diermodel voor leeftijdsgebonden gehoorverlies. Hier worden routinematige protocollen voor fixatie, immunolabeling gerbil cochleaire hele mounts, confocale beeldvorming en het kwantificeren van lint synapsnummers en volumes beschreven. Bovendien worden de specifieke uitdagingen in verband met het verkrijgen van goed materiaal van waardevolle ouder wordende personen benadrukt.
Gerbils worden geëuthanaseerd en ofwel cardiovasculair doordrenkt, of hun trommelvlies bullae worden zorgvuldig uit de schedel ontleed. Het slakkenhuis wordt geopend aan de top en de basis en direct overgebracht naar het fixatief. Ongeacht de initiële methode worden de slakkenhuizen nagefixeerd en vervolgens ontkalkt. Het weefsel wordt vervolgens gelabeld met primaire antilichamen tegen pre- en postsynaptische structuren en haarcellen. Vervolgens worden de slakkenhuizen geïncubeerd met secundaire fluorescentie-gelabelde antilichamen die specifiek zijn tegen hun respectieve primaire antilichamen. Het slakkenhuis van oude gerbils wordt vervolgens behandeld met een autofluorescentie quencher om de typisch substantiële achtergrondfluorescentie van de weefsels van oudere dieren te verminderen.
Ten slotte worden slakkenhuizen ontleed in 6-11 segmenten. De gehele cochleaire lengte wordt zodanig gereconstrueerd dat specifieke cochleaire locaties betrouwbaar kunnen worden bepaald tussen individuen. Confocale beeldstapels, sequentieel verkregen, helpen haarcellen en synapsen op de gekozen locaties te visualiseren. De confocale stapels worden gedeconcentraliseerd en de synapsen worden handmatig geteld met Behulp van ImageJ, of een uitgebreidere kwantificering van synaptische structuren wordt uitgevoerd met beeldanalyseprocedures die op maat zijn geschreven in Matlab.
Introduction
Leeftijdsgebonden gehoorverlies is een van 's werelds meest voorkomende ziekten die meer dan een derde van de wereldbevolking van 65 jaar en oudertreft 1. De onderliggende oorzaken zijn nog steeds in discussie en worden actief onderzocht, maar kunnen het verlies van de gespecialiseerde synapsen omvatten die binnenste haarcellen (IHC's) verbinden met afferente gehoorzenuwvezels2. Deze lintsynapsen bestaan uit een presynaptische structuur met blaasjes gevuld met de neurotransmitter glutamaat eraan vastgebonden, evenals postsynaptische α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionzuur (AMPA) glutamaatreceptoren 3,4,5. In de gerbil komen ~20 afferente gehoorzenuwvezels in contact met één IHC 6,7,8. Vezels op de IHC tegenover de modiolus zijn in tegenstelling tot grote synaptische linten, terwijl de vezels die aan de pijlerzijde van de IHC verbinden, kleine synaptische linten tegenkomen (d.w.z. bij katten9, gerbils7, cavia's10 en muizen 3,11,12,13,14). Bovendien zijn in de gerbil de grootte van de presynaptische linten en de postsynaptische glutamaatpleisters positief gecorreleerd 7,14. Vezels die zich verzetten tegen grote linten aan de modiolaire kant van de IHC zijn klein van kaliber en hebben lage spontane snelheden en hoge drempels15. Er zijn aanwijzingen dat vezels met een lage spontane snelheid kwetsbaarder zijn voor blootstelling aan lawaai10 en ototoxische geneesmiddelen16 dan hoog-spontane laagdrempelige vezels, die zich aan de pijlerzijde van IHC's15 bevinden.
Het verlies van lintsynapsen is de vroegste degeneratieve gebeurtenis in cochleair neuraal leeftijdsgebonden gehoorverlies, terwijl het verlies van spiraalvormige ganglioncellen en hun afferente gehoorzenuwvezels achterblijft bij17,18. Elektrofysiologische correlaten omvatten opnames van auditieve hersenstamresponsen17 en samengestelde actiepotentialen8; deze weerspiegelen echter niet de subtiliteiten van synapsverlies, omdat vezels met een lage spontane snelheid niet bijdragen aan deze metingen16. Meer veelbelovende elektrofysiologische metrieken zijn de massapotentiaal-afgeleide neurale index19 en de peristimulus-tijdrespons20. Deze zijn echter alleen betrouwbaar als het dier geen andere cochleaire pathologieën heeft, naast verlies van gehoorzenuwvezels, die de activiteit van de resterende gehoorzenuwvezels beïnvloeden8. Bovendien waren gedragsmatig beoordeelde drempels in de gerbil niet gecorreleerd met synapsgetallen21. Daarom is betrouwbare kwantificering van overlevende lintsynapsen en dus het aantal functionele gehoorzenuwvezels alleen mogelijk door direct onderzoek van het cochleaire weefsel.
De Mongoolse gerbil (Meriones unguiculatus) is een geschikt diermodel voor het bestuderen van leeftijdsgebonden gehoorverlies. Het heeft een korte levensduur, heeft een laagfrequent gehoor vergelijkbaar met mensen, is gemakkelijk te onderhouden en vertoont overeenkomsten met menselijke pathologieën gerelateerd aan leeftijdsgebonden gehoorverlies 2,22,23,24. Gerbils worden als oud beschouwd wanneer ze 36 maanden oud zijn, wat bijna het einde van hun gemiddelde levensduur22 is. Belangrijk is dat een leeftijdsgebonden verlies van lintsynapsen is aangetoond bij gerbils die zijn opgevoed en verouderd in rustige omgevingen 8,21.
Hier wordt een protocol gepresenteerd om slakkenhuis van gerbils van verschillende leeftijden, van jongvolwassenen tot oud, te labelen, te ontleden en te analyseren. Antilichamen gericht tegen componenten van de presynapse (CtBP2), postsynaptische glutamaatreceptorpleisters (GluA2) en IHC's (myoVIIa) worden gebruikt. Er wordt een autofluorescentie quencher toegepast die de achtergrond in verouderd slakkenhuis vermindert en het fluorescentiesignaal intact laat. Verder wordt een beschrijving gegeven van hoe het slakkenhuis te ontleden om zowel het sensorische epitheel als de stria vascularis te onderzoeken. De cochleaire lengte wordt gemeten om de selectie van verschillende cochleaire locaties mogelijk te maken die overeenkomen met specifieke beste frequenties25. Kwantificering van synapsnummers wordt uitgevoerd met de vrij beschikbare software ImageJ26. Aanvullende kwantificering van synapsvolumes en locaties binnen de individuele HC wordt uitgevoerd met software die op maat is geschreven in Matlab. Deze software wordt niet openbaar gemaakt, omdat de auteurs niet over de middelen beschikken om professionele documentatie en ondersteuning te bieden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protocollen en procedures zijn goedgekeurd door de relevante autoriteiten van Nedersaksen, Duitsland, met vergunningsnummers AZ 33.19-42502-04-15/1828 en 33.19-42502-04-15/1990. Dit protocol is voor Mongoolse gerbils (M. unguiculatus) van beide geslachten. Jongvolwassene verwijst naar de leeftijd van 3-12 maanden, terwijl gerbils worden beschouwd als 36 maanden en ouder. Indien niet anders vermeld, kunnen buffers en oplossingen worden bereid en bewaard in de koelkast gedurende maximaal enkele maanden (4-8 °C). Zorg er voor gebruik voor dat de buffers en oplossingen niet zijn neergeslagen.
1. Fixatie en orgelcollectie
OPMERKING: Als alleen het slakkenhuis nodig is, wordt aanbevolen om de iets eenvoudigere procedure van fixatie door onderdompeling uit te voeren. Als er echter ook een goed bewaard brein nodig is, dan is transcardiale perfusie de enige optie. Het fixatief is in beide gevallen 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS). Dit moet vers worden gemaakt, maar kan bevroren worden bewaard tot gebruik. Gebruik aliquots van ~ 300 ml voor een transcardiële perfusie of ~ 50-100 ml per slakkenhuis voor fixatie door onderdompeling.
LET OP: PFA is een gevaarlijke stof; behandel het volgens algemene laboratoriumveiligheidsprocedures.
- Fixatie door transcardiale perfusie
- Spoel de perfusie-opstelling totdat de slang vrij is van luchtbellen. Vul de perfusieslang met PBS met heparine (0,2 ml in 100 ml PBS) om bloedstolling te voorkomen. Stop de stroom zodra de slang is gevuld met PBS en de vloeistofopslagfles net is geleegd; giet er 200 ml ontdooide PFA in.
OPMERKING: De opstelling is nu klaar voor het dier. De resterende PBS in de slang is voldoende om het bloed weg te spoelen en zal automatisch worden gevolgd door het fixatiemiddel zodra de stroom is hervat. - Zorg ervoor dat er een afvalinzamelingssysteem is voor de uitstroom van PFA. Gebruik een verse canule (19 G) en heb een grote schaar, tang (met een afgeplatte punt), hemostaten, scalpel of scherpe canule en een rubberen mat met pinnen bij de hand.
- Euthanasie de gerbil met een intraperitoneale overdosis pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml per dier, lichaamsgewichtbereik: 50-120 g). Zet het dier terug in zijn kooi. Wanneer de ademstilstand zodanig intreedt dat de ademhaling onregelmatig wordt met tussenpozen van 30 s of langer, plaatst u de gerbil op zijn rug op de rubberen mat en bevestigt u zowel de voorpoten als een achterpoot met pinnen (laat één achterpoot vrij om te bewegen voor een beter oordeel over het succes van de perfusie; zie opmerking na stap 1.1.7).
- Om de borstholte te openen, tilt u de huid boven het borstbeen op met een tang en snijdt u de huid ongeveer 0,5 cm onder het borstbeen met een schaar totdat de witgekleurde processus xiphoideus zichtbaar is. Houd het borstbeen met een tang bij de processus xiphoideus en snijd langs het middenrif om een goed zicht in de thoracale holte te krijgen. Snijd de ribben zijdelings aan beide zijden totdat er een goede toegang tot het hart is. Zorg ervoor dat de hoek van de schaar evenwijdig en vlak is ten opzichte van het lichaam van de gerbil om schade aan organen te voorkomen en zo een gesloten bloedsomloop te garanderen.
- Klem een hemostaat op het borstbeen, til de ribbenkast op en plaats de hemostaat over de schouder van de gerbil zonder de hemostaat op lichaamsdelen te laten rusten om te voorkomen dat de bloedstroom wordt geblokkeerd.
- Open de vloeistofstroom iets totdat ongeveer elke 2 s één druppel PBS uit de canule (19 G) stroomt. Houd het hart vast met een tang en draai het een beetje naar links zodat de linker ventrikel duidelijk te zien is. Steek de canule in de linker ventrikel onder een hoek die voorkomt dat het septum wordt binnengedrongen. Houd de naald met de hand of met een andere hemostat op zijn plaats.
OPMERKING: De linker- en rechterventrikels kunnen worden onderscheiden door hun verschillende kleurtinten; de linker ventrikel lijkt lichter van kleur dan de rest van het hartweefsel. - Verhoog langzaam de druk van de vloeistofstroom en open het rechteratrium met een fijne schaar, een scalpel of een andere canule. Open de vloeistofstroom verder totdat ongeveer 2-3 druppels /s worden waargenomen in de druppelkamer, of stel een stroom van 4 ml / min in voor de pomp. Zodra de fixatie van het hart begint, moet u ervoor zorgen dat de perfusiecanule op zijn plaats blijft zonder verder te worden vastgehouden.
OPMERKING: Tekenen van succesvolle perfusie zijn langzame spiercontracties, verstijving van de nek en ledematen, de lever die bleek wordt en roze longen. Het teken van mislukte perfusie is het bleken van de longen, wat aangeeft dat de pulmonale circulatie wordt doordrenkt als gevolg van punctie van het septum. - In geval van mislukte perfusie, probeer de canule verder omhoog te bewegen, in de aorta, en klem hem op zijn plaats met een hemostat.
- Onthoofd de gerbil. Verwijder de bullae en snijd en breek het bot af zoals beschreven in stap 1.2.2.
OPMERKING: Als het weefsel niet voldoende is gefixeerd, zal het sensorische epitheel tijdens de dissectie loskomen van het orgaan van Corti. - Als de perfusie binnen 5-10 minuten geen tekenen van fixatie vertoont, breek deze dan af en volg onmiddellijk de onderstaande procedure voor fixatie door onderdompeling. Behandel daarvoor het slakkenhuis zoals in stap 1.2.2 en postfixeer het weefsel in ongeveer 50-80 ml 4% PFA in schroefdopcontainers gedurende 1-2 dagen op een 2D-shaker bij 8 °C.
OPMERKING: Omdat het moeilijk kan zijn om uiteindelijk de kwaliteit van de fixatie tijdens perfusie te beoordelen, wordt aanbevolen om het slakkenhuis routinematig te postfixeren zoals beschreven.
- Spoel de perfusie-opstelling totdat de slang vrij is van luchtbellen. Vul de perfusieslang met PBS met heparine (0,2 ml in 100 ml PBS) om bloedstolling te voorkomen. Stop de stroom zodra de slang is gevuld met PBS en de vloeistofopslagfles net is geleegd; giet er 200 ml ontdooide PFA in.
- Fixatie door weefselonderdompeling
- Euthanaseer de gerbils met een intraperitoneale overdosis pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml per dier, lichaamsgewichtbereik: 50-120 g). Wanneer de gerbil is gestopt met ademen, onthoofdt u het dier.
- Verwijder de bullae en knip en breek het bot af met respectievelijk een schaar en een tang om het slakkenhuis te bereiken. Verwijder de maellus, incus en halfronde kanalen. Maak kleine gaatjes aan de top en in de basale draai door voorzichtig met een tang over het cochleaire bot te krabben. Breng de bullae onmiddellijk over in een teveel aan koude fixatiemiddelen (ten minste 50 ml) en fixeer het weefsel in de kou (4-8 ° C) onder zachte agitatie (2D-shaker [100 rpm]) gedurende 2 dagen.
OPMERKING: Na het fixeren van het weefsel kan het slakkenhuis onmiddellijk worden verwerkt of in PBS worden bewaard met 0,05% natriumazide. LET OP: Natriumazide is giftig. Merk op dat de lengte van de opslag de kwaliteit van de kleuring negatief kan beïnvloeden. Beperkte studies hebben gesuggereerd dat de immunostaining zwakker leek na 2 jaar van opslag van het weefsel in natriumazide.
2. Weefselvoorbereiding en immunolabeling
- Los ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) poeder op in PBS om een 0,5 M oplossing bij pH 8 te produceren. Plaats hiervoor een bekerglas op een magneetroerder, vul het met ongeveer de helft van de totale hoeveelheid PBS en voeg de juiste hoeveelheid EDTA-poeder toe, wat resulteert in een zure suspensie. Voeg voorzichtig geconcentreerde natriumhydroxideoplossing (NaOH) toe terwijl u de pH bewaakt met een pH-meter. Vul PBS tot het gewenste eindvolume en filter de oplossing om microbiële besmetting te voorkomen.
OPMERKING: Het EDTA-poeder lost pas volledig op als de suspensie een neutrale pH-waarde heeft bereikt. - Breng voor ontkalking het slakkenhuis over op 80 ml 0,5 M EDTA in PBS. Incubeer het weefsel in de kou (4-8 °C) onder zachte agitatie op de 2D-shaker (100 rpm) gedurende 2 dagen.
OPMERKING: Na de ontkalkingsstap kan het weefsel enkele dagen tot 3 weken in PBS worden opgeslagen voordat de resterende verwerkingsstappen worden voortgezet. Voor antilichamen die de stria vascularis labelen, is het raadzaam om het slakkenhuis op dit punt (d.w.z. voorafgaand aan immunostaining) in tweeën te snijden langs de modiolaire as om een uniforme toegang van antilichamen tot hun respectieve doelen te garanderen. Dit is antilichaamafhankelijk en is niet van toepassing op de antilichamen die hier worden gebruikt om synaptische structuren en IHC's te labelen. Gebruik een stuk breekbaar scheermesje en een meshouder (zoals beschreven in stap 4.2) voor het snijden. - Voer de volgende stappen uit (tot stap 3.2) in 2 ml veilige afdichtingsreactiebuizen. Als het weefselstuk te groot is om in de buis te passen, knip dan het overtollige weefsel bij met een schaar. Om de penetratie van de antilichamen te verbeteren, permeabiliseer het weefsel eerst in 1 ml van 1% triton (Triton X-100) in PBS op de 2D-shaker (100 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was de tissue 3x met 1 ml 0,2% triton (Triton X-100) in PBS op de 2D-shaker (100 rpm) op kamertemperatuur gedurende 5 min elk.
- Om niet-specifieke antigenen te blokkeren, incubeer het slakkenhuis in 1 ml blokkerende oplossing (3% runderserumalbumine [BSA], 0,2% triton, in PBS) op de 2D-shaker (100 rpm) bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
OPMERKING: De blokkeringsoplossing kan van tevoren worden bereid, maar mag niet ouder zijn dan ~ 10 dagen. - Verdun de volgende primaire antilichamen vers in dezelfde aliquot van blokkerende oplossing: anti-myoVIIa (myosine VIIa) om IHC's (IgG polyklonaal konijn) te labelen, verdund 1:400; anti-CtBP2 (C-terminal binding protein 2) om presynaptische linten te labelen (IgG1 monoklonale muis), verdund 1:400; en anti-GluA2 om postsynaptische receptorpleisters te labelen (IgG2a monoklonale muis), verdund 1:200. Zorg ervoor dat de slakkenhuizen volledig bedekt zijn met de antilichaamoplossing (meestal 0,4 ml) en incubeer ze bij 37 °C gedurende 24 uur.
- Was vervolgens het weefsel 5x met 0,2% triton in PBS op de 2D-shaker (100 rpm) op kamertemperatuur gedurende 5 minuten per stuk. Kies secundaire antilichamen om overeen te komen met de gastheersoort van hun primaire tegenhangers en verdun ze opnieuw vers in 3% BSA, 0,2% triton, in PBS: geitenantimuis (IgG1) -Alexa fluorofoor (AF) 488, verdund 1: 1.000; geiten anti-muis (IgG2a)-AF568, verdund 1:500; en ezel anti-konijn-AF647 (IgG), verdund 1:1.000. Wikkel de buis in aluminiumfolie om bleken van de fluorescentie te voorkomen. Incubeer het slakkenhuis in 0,4 ml secundaire antilichaamoplossing bij 37 °C gedurende 24 uur.
OPMERKING: Beperkte studies hebben aangetoond dat incubatie van cochleair weefsel bij 37 °C gedurende 24 uur met primaire en secundaire antilichamen resulteerde in helderdere immunostaining dan het volgen van de meer gebruikelijke incubatieprocedure met lagere temperaturen en kortere duur. - Was het slakkenhuis 2x met 1 ml 0,2% triton in PBS gedurende 5 minuten elk en 3x met PBS gedurende 5 minuten elk op de 2D-shaker (100 rpm) bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Na deze wasstappen kan het slakkenhuis enkele dagen in PBS in de koelkast blijven bij ~ 4 ° C.
3. Behandeling met autofluorescentie quencher (optioneel)
OPMERKING: Slakkenhuis van gerbils van middelbare leeftijd en leeftijd vertonen uitgebreide achtergrondautofluorescentie. In jongvolwassen weefsel is behandeling met een autofluorescentie quencher niet nodig. Het is in principe mogelijk om de autofluorescentie quencher toe te passen vóór de immunostainingprocedure, die vervolgens elke onbedoelde vermindering van de gewenste antilichaamfluorescentie voorkomt. Volgens de datasheet van de fabrikant is het gebruik van detergentia (zoals Triton X-100 in het huidige protocol) echter niet langer mogelijk omdat ze de quencher uit het weefsel verwijderen.
- Snijd het slakkenhuis doormidden onder een stereomicroscoop, zoals beschreven in stap 4.2.
- Meng de autofluorescentie quencher met 70% ethanol om een 5% oplossing te verkrijgen en incubeer het slakkenhuis in deze oplossing op de 2D-shaker bij kamertemperatuur gedurende 1 min. Was het slakkenhuis 3x met 1 ml PBS op de 2D-shaker op kamertemperatuur gedurende 5 minuten per stuk.
LET OP: De autofluorescentie quencher is gevaarlijk en schadelijk. Draag handschoenen bij het hanteren van deze stof.
4. Uiteindelijke fijndissectie
- Ontleed het slakkenhuis onder een stereomicroscoop. Vul een polystyrol petrischaal en het deksel met PBS en houd twee fijne tangen, Vannas veerschaar, een meshouder en een breekbaar scheermesje bij de hand. Breek stukjes van het scheermesje om een snijoppervlak van ~2-4 mm te verkrijgen, afhankelijk van de snijstap. Bereid een microscoopglaasje voor door drie druppels montagemedium op een rij te plaatsen.
OPMERKING: Het snijoppervlak van het scheermesje slijt snel. Het blad moet na het ontleden en monteren ongeveer om de twee stukken van het slakkenhuis worden vervangen. - Als dit nog niet is gedaan in stap 3.1, snijdt u eerst het slakkenhuis doormidden langs de modiolus onder een stereomicroscoop. Plaats hiervoor een stuk van een scheermesje dat langer is dan de opgerolde lengte van het slakkenhuis in een meshouder. Leg het slakkenhuis in de petrischaal en snijd overtollig weefsel weg met het stukje scheermesje. Houd het slakkenhuis op zijn plaats met een fijne tang en snijd het doormidden langs de modiolus.
- Begin met de ene helft, maar laat de andere helft ook in de petrischaal zitten. Fixeer de cochleaire helft zorgvuldig met een tang, zodat de snijkant naar boven is gericht. Gebruik een fijne veerschaar om het bot van het slakkenhuis boven het helicotrema weg te snijden, dat de top bedekt.
- Om de scheiding van de cochleaire stukken te beginnen, isoleert u de middelste draai door met een schaar door de modiolus en gehoorzenuw te snijden, boven (scala vestibuli) en onder (scala tympani).
- Snijd door het cochleaire bot dat de stria vascularis in het cochleaire kanaal bedekt. Maak twee sneden aan beide zijden van het cochleaire bot boven het orgaan van Corti en langs de stria vascularis en gebruik het scheermesje om uiteindelijk de cochleaire stukken te scheiden.
LET OP: De stria vascularis is goed zichtbaar als een donkere streep. Door langs de stria vascularis te snijden blijft het orgaan van Corti intact. - Optioneel: Om de stria vascularis te verzamelen, snijdt u voorzichtig tussen het orgaan van Corti en de stria vascularis om de twee te scheiden. Laat de stria vascularis verbonden met het spiraalvormige ligament (bevestigd aan het bot dat het buitenoppervlak van het slakkenhuis bedekt) en verwijder het ontkalkte bot met behulp van een tang. Plaats het stuk met de stria-kant omhoog op de microscoopglaasje in een druppel montagemedium.
OPMERKING: Als het verzamelde stuk te sterk gebogen is, kan het nodig zijn om het in kleinere stukken te verdelen zodat het vlak genoeg is om op de dia te worden gemonteerd. - Breng de cochleaire stukken over op het met PBS gevulde deksel van de polystyrol petrischaal en zorg ervoor dat de cochleaire hele steunen zo plat mogelijk op de glijbaan liggen. Verwijder overtollig weefsel, zoals delen van het spiraalvormige ligament aan de abnorale kant en delen van de spiraalvormige limbus aan de neurale kant. Verwijder voorzichtig het tectoriale membraan met een superfijne tang.
- Plaats de cochleaire stukken op de schuif in een druppel montagemedium. Plaats de cochleaire hele mounts met het orgaan van Corti naar boven gericht op de dia om te voorkomen dat de IC's in het optische pad voor beeldvorming worden verduisterd. Zoek naar invaginatie van de spiraalvormige limbus in de nabijheid van de IHC's, die zichtbaar is door het cochleaire stuk in het sagittale vlak te verschuiven om de kant naar boven te identificeren.
OPMERKING: Om het volledige slakkenhuis digitaal te reconstrueren uit zijn individuele stukken tijdens verdere verwerking, wordt het sterk aanbevolen om schetsen van de stukken te documenteren en oriëntatiepunten te noteren. Bovendien moeten de stukken idealiter in de juiste volgorde op de dia worden gerangschikt. - Herhaal stap 4.3 tot en met 4.8 totdat het hele slakkenhuis op de microscoopglaas is overgebracht. Voeg indien nodig meer bevestigingsmedium toe, bedekt de dia en sluit de coverslip op zijn plaats met zwarte nagellak die rond de randen is geverfd. Laat het drogen in het donker bij kamertemperatuur en bewaar de glijbaan vervolgens in het donker bij 4 °C.
OPMERKING: Zelfs als delen van het sensorische epitheel zelf per ongeluk verloren gaan, is het belangrijk om toch te monteren wat er nog over is van het cochleaire stuk voor een juiste schatting van de lengte.
5. Cochleaire lengtemeting
- Meet de lengte van het slakkenhuis uit brightfield-afbeeldingen van zijn stukken met behulp van een epifluorescentiemicroscoopsysteem en bijbehorende software. Sla afbeeldingen met een lage vergroting (4x lens) op van elk cochleair stuk en gebruik de lasso-meettool van de microscoopsoftware om een lijn te tekenen langs de rij IHC's in elk van de afbeeldingen. Bereken de totale lengte door de lengtes van alle stukken op te tellen.
OPMERKING: Wanneer delen van het sensorische epitheel ontbreken in een cochleair stuk, interpoleer dan de lijn. - Om de cochleaire locaties te definiëren die in een individueel slakkenhuis moeten worden geanalyseerd, berekent u hun overeenkomstige afstanden tot de top met behulp van de vergelijking gegeven door Müller25. Markeer deze locaties bijvoorbeeld op een afdruk van de cochleaire stukken.
6. Beeldacquisitie met een confocale microscoop
- Gebruik een confocale microscoop met een olie-immersie 40x objectief (numeriek diafragma 1.3) en de juiste olie voor hoge resolutie beeldvorming.
OPMERKING: Als de confocale microscoop een omgekeerd lichtpad heeft, moet de dia ondersteboven worden geplaatst. Geef het monster in dit geval ongeveer 30 minuten om te zinken en rust stabiel op de deklip voordat u met de laatste scan begint. U kunt ook een montagemedium gebruiken dat vloeibaar is gedurende de hele duur van de dissectie, maar later stolt en tegelijkertijd de fluorescentie behoudt. - Activeer de juiste lasers: twee optisch gepompte halfgeleiderlasers met golflengten van λ = 488 nm en λ = 522 nm, en een diodelaser met een golflengte van λ = 638 nm worden in dit protocol gebruikt. Kies het emissiebereik van de fluorescentietags (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Terwijl een hybride detector de vrijgekomen fotonen telt, plaatst u de laserlijn op ten minste 10 nm afstand van de emissiecurve.
OPMERKING: Het is belangrijk om voorlopige controles uit te voeren met weefsel met één label om ervoor te zorgen dat de gekozen detectorbandbreedtes de kleurkanalen netjes scheiden (d.w.z. niet leiden tot kanaaloverspraak). Radiogolven interfereren met de hybride detector, wat resulteert in een maximaal aantal fotonen, en veroorzaken zo artefactuele strepen in de stapel. Vermijd daarom het gebruik van een mobiele telefoon in de buurt van de microscoop. - Zoom in op het weefsel totdat het beeld 10 IC's beslaat. Kies de resolutie van de afbeelding volgens Nyquist-sampling, die meestal ~ 40-60 nm / pixel is. Stel de stapgrootte in de z-richting in op 0,3 μm en de beeldsnelheid op 400-700 Hz.
OPMERKING: Beide instellingen (stapgrootte en beeldsnelheid) zijn compromissen tussen het gebruik van optimale beeldparameters en het besparen van scantijd. - Voer bidirectionele bemonstering uit om de beeldvormingstijd te verkorten. Accumiseer het frame voor het 488 nm en 638 nm kanaal 3x en voor het 522 nm kanaal 6x; bovendien, gemiddelde van de lijnen 3x voor elk kanaal. Kies het begin en het einde van de stapel in de z-dimensie.
- Stel de versterking in op 100 bij gebruik van de hybride detector (telmodus) om een verminderde signaal-ruisverhouding te voorkomen. Stel het laservermogen zo in dat er geen pixel verzadigd is in het interessegebied, maar de structuren meestal het volledige 8-bits bereik bestrijken. Begin met een laag laservermogen van 0,5% en verhoog dit totdat structuren zichtbaar zijn.
OPMERKING: Goede kleuring heeft meestal een laservermogen tussen 0,1% en 5% nodig. - Gebruik deconvolutiesoftware voor post-hocverwerking van de beeldstapels om de vervagende halo rond kleine fluorescerende structuren te verwijderen met behulp van een theoretische point-spread-functie. Gebruik dezelfde instellingen voor elke stapel binnen een experiment. Sla de gedeconvolvede afbeeldingen op als .tif of .ics.
OPMERKING: Het myoVIIa-label (IHC's) heeft geen baat bij deconvolutie en kan worden weggelaten om tijd te besparen. De software maakt gebruik van metagegevens van de afbeeldingsbestanden; verschillende parameters, zoals het lichtpad, het insluitmedium of het onderdompelingsmedium, moeten echter worden gespecificeerd.
7. Synapse kwantificering
- Open een kopie van de gedeconvolved stacks in de vrij toegankelijke software ImageJ met de extra Biovoxxel-plugin, die ook beschikbaar is op hun website.
- Pas de kleuren van afzonderlijke kanalen aan door de kanalen te splitsen (afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen) en samenvoegen (afbeelding | Kleur | Kanalen samenvoegen) ze opnieuw, waarbij verschillende kleuren worden toegewezen. Converteer de afbeelding naar een RGB-stack (afbeelding | Kleur | Stapel op RGB) en pas de helderheid en het contrast aan (afbeelding | | aanpassen Helderheid/contrast | auto of schuifregelaar met betrekking tot het maximum), indien nodig, zodat de pre- en postsynaptische structuren en het IHC-label aangenaam van de achtergrond verschillen.
- Kies vijf IHC's en label ze met de teksttool (IHC1-IHC5) door op de gewenste locatie in de stapel te klikken. Open de ROI-manager (analyseer | Gereedschap | ROI Manager); activeer het selectievakje Labels om de punten met een nummer te labelen. Zoom in op de IHC van belang.
- Gebruik de point/multipoint-tool in de multipoint-modus (klik met de rechtermuisknop op de tool om te kiezen tussen de point- of multipoint-modus). Klik op een functionele lintsynapse (d.w.z. een presynaptisch lint in nauwe juxtapositie met een postsynaptische glutamaatpleister) terwijl u door de z-dimensie scrolt.
OPMERKING: Afhankelijk van de hoeveelheid overlap en de kleur die voor elk kanaal is gekozen, worden de gedeelde pixels in gemengde kleuren weergegeven. Meestal is het onderscheid tussen individuele functionele synapsen eenvoudig omdat ze voldoende ver van elkaar verwijderd zijn. - Wanneer alle interessante structuren zijn aangevinkt, klikt u op Toevoegen op de grafische gebruikersinterface van de ROI-manager. Klik op de willekeurige naam en kies Naam wijzigen.
OPMERKING: De puntlabels blijven nog steeds door alle vlakken van de stapel wanneer het selectievakje Alles weergeven is ingeschakeld in het optiemenu van het gereedschap Punt (dubbelklik op het pictogram van het gereedschap Punt ), waardoor u kunt voorkomen dat dezelfde lintsynaps meerdere keren wordt geteld. - Wanneer u de volgende IHC kiest om te tellen, vermijd dan onbedoeld het toevoegen van tellingen door de afbeelding aan te passen om de volgende IHC volledig weer te geven met het handgereedschap. Verander van multipoint tool naar point tool om te voorkomen dat er meer puncta wordt toegevoegd aan de eerder opgeslagen data. Klik op een interessante structuur in de volgende IHC en ga terug naar multipoint tool. Herhaal stap 7.4 tot en met 7.5 totdat alle IHC's van belang zijn geëvalueerd.
- Om gegevens op te slaan, klikt u op een dataset in de ROI-manager en vervolgens op meten. Wacht tot er een nieuw venster verschijnt met de gemeten gegevenspunten. Sla deze lijst op als spreadsheetbestand (| Opslaan als). Sla de afbeelding op door Alles weergeven te activeren in de ROI-manager. Klik op Afvlakken om de aanwijslabels permanent aan de stapel toe te voegen. Ga er bij het sluiten van de afbeeldingsstapel mee akkoord om de wijzigingen op te slaan.
8. Analyse van synapsvolume en positie op de haarcel
OPMERKING: De auteurs gebruikten een op maat geprogrammeerde procedure op basis van Matlab. Aangezien het niet openbaar beschikbaar is, wordt het hier slechts in grote lijnen beschreven (zie ook7). Neem contact op met de corresponderende auteur als u geïnteresseerd bent in het gebruik ervan. De procedure verwacht een triple-labeled (IHC's, pre- en postsynaptische) beeldstapel in TIFF-formaat als invoer, begeleidt de gebruiker door de verschillende analysestappen via een grafische interface en biedt uitgebreide uitvoer van de resultaten in spreadsheetformaat.
- Normaliseer de positie van de synaptische structuren naar een 3D-coördinatensysteem dat wordt gedefinieerd door de omvang van de individuele IHC op de pijler-modiolaire as en de cochleaire apicale-basale as en de bovenste (cuticulaire plaat) tot de onderste (synaptische pool) as van de IHC.
OPMERKING: De volumes van synaptische elementen (zowel pre- als postsynaptisch, en het gecombineerde volume van functionele synapsen) worden geleverd in μm3 en genormaliseerd naar de respectieve mediaanwaarde3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Slakkenhuis werd geoogst na cardiovasculaire perfusie met fixatie van het hele dier of snel ontleed na het euthanaseren van het dier en onderdompelingsfixatie. Bij deze laatste methode bleven de IC's tijdens de dissectie op hun plaats, terwijl bij mislukte perfusie en dus onvoldoende vast weefsel het sensorische epitheel vaak werd vernietigd. Merk op dat de auteurs gevallen tegenkwamen waarin fixatie van het slakkenhuis na transcardiële perfusie onvoldoende was terwijl fixatie van de hersenen nog steeds voldoende was. Weefsel van een inferieure perfusie kon nog steeds worden gered door gaten in de cochleaire top en basis te openen en het slakkenhuis te postfixeren door 2 dagen onderdompeling in 4% PFA.
Lengtebepaling van het hele slakkenhuis werd uitgevoerd volgens Müller25 om IHC's en hun synapsen te evalueren op specifieke cochleaire posities, equivalent aan verschillende karakteristieke frequenties (tabel 1). Hiervoor werden de gewenste cochleaire posities berekend als percentages basilaire membraanlengte vanaf de cochleaire basis. De mediane cochleaire lengte van 13 slakkenhuizen van jongvolwassen gerbils was 11,3 mm (interkwartielbereik: 11,02-11,52 mm). De mediane cochleaire lengte van 24 slakkenhuizen van verouderde gerbils was 11,5 mm (interkwartielbereik: 11,24-11,73 mm). Er was geen significant verschil tussen de lengte van jongvolwassene en oudere slakkenhuizen (Mann-Whitney U-test: U = -1,62, p = 0,105); de totale mediaan was 11,48 mm. Men zou kunnen stellen dat deze variatie in de lengte van individuele slakkenhuizen klein was en dat het gebruik van vaste lengteposities (in mm) voldoende is. De plaatsfrequentiefunctie is echter niet-lineair. Daarom veroorzaakt een afwijking van de mediane lengte een grotere fout voor basale cochleaire locaties dan voor relatief meer apicale cochleaire locaties. Voor de cochleaire locatie die overeenkomt met een frequentie van 1 kHz, berekend op basis van de mediane cochleaire lengte (d.w.z. 11,48 mm), varieerde de overeenkomstige frequentie bijvoorbeeld van 1,16 kHz tot 0,91 kHz voor respectievelijk de kortste (10,36 mm) en het langste slakkenhuis (12,28 mm) in dit monster. Voor een basaal gelegen frequentie (bijv. 32 kHz) was het frequentiebereik 51,62 kHz tot 23,97 kHz, voor respectievelijk het kortste en langste slakkenhuis. Daarom is het raadzaam om de individuele locaties op elk slakkenhuis te berekenen, in het bijzonder bij het onderzoeken van basale cochleaire locaties.
Figuur 1 toont maximale intensiteit z-dimensie projecties van slakkenhuis van een jongvolwassene (10 maanden, figuur 1A) en een oudere gerbil (38 maanden, figuur 1B), die voorbeelden zijn van ideale immunolabels. In de afbeelding van het slakkenhuis van de jongvolwassen gerbil staan de myoVIIa-gelabelde IC's, hier weergegeven in blauw, in scherp contrast met de zwarte achtergrond. Daarom zijn individuele IHC's gemakkelijk detecteerbaar. De pre- en postsynaptische structuren zijn duidelijk zichtbaar als respectievelijk groene en rode elementen. Ze worden verondersteld een functionele synaps te vormen wanneer ze zich in nauwe juxtapositie bevinden (figuur 1A',B'). Er waren zelden ongepaarde presynaptische structuren (verweesde linten) zichtbaar in het slakkenhuis van oude gerbils. Het slakkenhuis van de oude gerbil (figuur 1B) werd behandeld met de autofluorescentie quencher. Het IHC-label lijkt zwakker, hoewel het laservermogen dat in dit monster werd gebruikt drie keer hoger was dan dat voor het slakkenhuis van de jongvolwassen gerbil. Toch zijn de IC's nog steeds verschillend van de achtergrond. De pre- en postsynaptische structuren zijn duidelijk zichtbaar en het laservermogen dat voor beide kanalen werd gebruikt, was vergelijkbaar of zelfs lager dan dat voor het jongvolwassen exemplaar. Weefsel van oudere dieren vertoonde doorgaans significant meer niet-specifiek uitziend fluorescerend signaal. Daarom is het belangrijkste verschil in het protocol voor jongvolwassen en verouderd materiaal de behandeling met een autofluorescentieblus. Merk op dat dit werd uitgevoerd na de immunostaining met fluorescentie-gelabelde antilichamen en in principe ook van invloed kan zijn op het beoogde antilichaamlabel. De behandeling verminderde echter effectief de externe fluorescentie van niet-specifieke oorsprong, terwijl er voldoende signaal overbleef van het specifieke label van de interessante structuren (vergelijk figuur 1B met figuur 2B). Voorlopige resultaten gaven echter aan dat in de stria vascularis externe fluorescentie zich niet manifesteerde in monsters van verouderde gerbils.
Voorbeelden van stacks die suboptimaal zijn verwerkt, zijn weergegeven in figuur 2. Figuur 2A toont de maximale intensiteit z-projectie van een stapel van een oude gerbil (36 maanden), waarbij de IC's, die ook onnatuurlijk gebogen of uit elkaar gerukt waren, niet in hun geheel werden gescand. Hierdoor zijn in deze scan alleen de apicale en basale polen van IC's zichtbaar. Het kan niet worden uitgesloten dat er meer synapsen zich in het ontbrekende middendeel van de IC's bevonden en daarom is een betrouwbare analyse niet mogelijk. Het is dus cruciaal dat alle geëvalueerde IC's volledig worden gescand in de confocale stack. Figuur 2B toont de maximale intensiteit z-projectie van een stapel bemonsterd in een verouderde gerbil (38 maanden). De fluorescentie van onduidelijke oorsprong is hoog omdat de autofluorescentie quencher in dit geval niet werd gebruikt. De externe fluorescentie was echter grotendeels beperkt tot het (rode) kanaal geassocieerd met het GluA2-label, wat vrij typisch is. In dergelijke gevallen kan het nog steeds mogelijk zijn om functionele synapsen te tellen als het CtBP2-label van de linten relatief schoon en specifiek is. Figuur 2C toont de maximale intensiteit z-projectie van een stapel verkregen uit een verouderde gerbil (42 maanden). Hier kunnen de synapsen niet worden toegewezen aan individuele IHC's, omdat de IHC's grotendeels zijn gedesintegreerd; het is inderdaad moeilijk om zeker te weten hoeveel IHC's vertegenwoordigd zijn. In het voorbeeld in figuur 3A werd tijdens de scan een mobiele telefoon gebruikt in de nabijheid van de confocale microscoop. Strepen zijn zichtbaar in het blauwe kanaal (IHC-label). Gelukkig had dit in dit geval geen invloed op de synaptische kanalen en beïnvloedde alleen het bovenste deel van de IHC's, dus een analyse was nog steeds levensvatbaar.
Figuur 3 toont z-projecties met maximale intensiteit van stapels genomen van hetzelfde stuk slakkenhuis van een jongvolwassen gerbil, verkregen 3 maanden (figuur 3A, A') en 29,5 maanden (figuur 3B, B') na immunostaining. Om vergelijkbaar te blijven, zijn de beelden niet genomen vanaf exact dezelfde locatie (die mogelijk bleek was van de vorige scan) maar van hetzelfde cochleaire stuk. Voor de scan die op het latere tijdstip werd gemaakt, moest het laservermogen ~ 2- tot 3-voudig worden verhoogd. Toch zijn de gelabelde structuren nog duidelijk. De signaal-ruisverhouding was afgenomen, vooral in de kanalen met postsynaptische en IHC-structuren, terwijl het kanaal met het presynaptische label minder werd beïnvloed. Kwantificering van functionele synapsen per IHC is nog steeds mogelijk.
Typische resultaten voor de analyse van synapsvolume en positie op de IHC worden geïllustreerd in figuur 4, met behulp van de confocale stapel in figuur 1A. Individueel gedefinieerde IHC's worden grafisch weergegeven als rasterreconstructies in verschillende kleuren, met of zonder de functionele synapsen (gedefinieerd door colocalisatie van pre- en postsynaptische labels) die aan elk worden toegewezen. Dit display kan vrij in 3D worden gedraaid om verschillende kijkhoeken te verkrijgen (figuur 4A, B). IHC's kunnen ook worden uitgekozen voor grafische weergave (figuur 4B). Er wordt een grote verscheidenheid aan gegevensgrafieken geproduceerd, die verschillende aspecten van de verdeling van synaptische volumes binnen het IHC-gecentreerde coördinatensysteem illustreren (voorbeelden in figuur 4C-E). De ruwe kwantitatieve gegevens voor elke IHC en elk synaptisch element zijn ook beschikbaar als spreadsheets die vervolgens bijvoorbeeld kunnen worden gecombineerd over verschillende confocale stapels voor verdere statistische analyse.
Figuur 1: Voorbeelden van succesvol verwerkt slakkenhuis. Z-projecties met maximale intensiteit van confocale stapels van (A) een jongvolwassen gerbil (10 maanden), verkregen op een cochleaire locatie die overeenkomt met 1 kHz, en (B) een verouderde gerbil (38 maanden, paneel B), verkregen op een cochleaire locatie gelijk aan 500 Hz. IHC's werden gekleurd met een antilichaam tegen myoVIIa (blauw), presynaptische linten werden gelabeld met anti-CtBP2 (groen), en postsynaptische glutamaatpleisters werden gelabeld met anti-GluA2 (rood). Het slakkenhuis van de oude gerbil werd na de immunostaining behandeld met een autofluorescentie quencher. Voor de duidelijkheid worden de contouren van de IHC's aangegeven met stippellijnen. Panelen (A') en (B') geven een vergroting weer van de gebieden die worden geschetst door de vierkanten in het overeenkomstige slakkenhuis van panelen (A) en (B). Gele pijlpunten wijzen op functionele synapsen. De kanalen die de pre- en postsynaptische structuren weergeven (maar niet het IHC-kanaal) ondergingen deconvolutie. Schaalstaven = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Afkortingen: IHC = inner hair cell; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = C-terminal bindend eiwit 2; GluA2 = ionotrope glutamaatreceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Voorbeelden van suboptimaal verwerkt slakkenhuis. Maximale intensiteit z-projecties van confocale stacks waarvoor de verwerking suboptimaal was, van gerbils die (A) 36 maanden en (B, C) 38 maanden oud waren en van cochleaire locaties die overeenkomen met respectievelijk 16 kHz, 8 kHz en 32 kHz. Gerbils waaruit de cochleae in panelen (A) en (C) waren afgeleid, werden transcardiaal doordrenkt en het slakkenhuis van paneel (C) werd bovendien gedurende 3 dagen postfixed in 4% PFA. Het slakkenhuis van (B) was immersie-gefixeerd in 4% PFA gedurende 2 dagen. Slakkenhuizen uit (A) en (C) werden behandeld met de autofluorescentie quencher. IHC's werden gekleurd met een antilichaam tegen myoVIIa (blauw), presynaptische linten werden gelabeld met anti-CtBP2 (groen) en postsynaptische glutamaatpleisters werden gelabeld met anti-GluA2 (rood). Alle kanalen werden gedeconcentraliseerd. Helderheid en contrast werden na de confocale scan verder aangepast. Schaalstaven = 10 μm. Afkortingen: PFA = paraformaldehyde; IHC = binnenste haarcel; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = C-terminal bindend eiwit 2; GluA2 = ionotrope glutamaatreceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stabiliteit van het immunolabel na langdurige opslag. Maximale intensiteit z-projecties van confocale stapels van een jongvolwassen gerbil (10 maanden), genomen op de 16 kHz cochleaire locatie, (A) 3 maanden na kleuring en (B) op een iets meer basale cochleaire locatie op hetzelfde cochleaire stuk 29,5 maanden na kleuring. Het slakkenhuis was immersie-gefixeerd in 4% PFA gedurende 2 dagen. Voor de duidelijkheid zoomen (A') en (B') in op slechts enkele functionele synapsen uit de gebieden die worden aangegeven door vierkanten in respectievelijk (A) en (B). IHC's werden gekleurd met een antilichaam tegen myoVIIa (blauw), presynaptische linten werden gelabeld met anti-CtBP2 (groen) en postsynaptische glutamaatpleisters werden gelabeld met anti-GluA2 (rood). Het laservermogen voor de IHC-kanalen was 1,3% en 3%, voor de presynaptische kanalen 0,4% en 1,1% en voor de postsynaptische kanalen respectievelijk 1,1% en 2% in (A) en (B). Merk op dat in (A) blauwe strepen zichtbaar zijn in het bovenste deel van de IC's, die het gevolg zijn van het gebruik van een mobiele telefoon in de nabijheid van de confocale microscoop. Schaalstaven = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Afkortingen: PFA = paraformaldehyde; IHC = binnenste haarcel; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = C-terminal bindend eiwit 2; GluA2 = ionotrope glutamaatreceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve resultaten van de kwantificering van synapsvolume. (A) Tien IC's weergegeven als verschillend gekleurde rasterreconstructies op basis van het myoVIIa-immunolabel. Hun bijbehorende functionele synapsen, gedefinieerd door gecolokaliseerde CtBP2-(groen) en GluA2-gelabelde elementen (rood), worden samen met de IHC's weergegeven, en ook afzonderlijk hieronder, voor de duidelijkheid. Merk op dat de beeldhoek is gekozen om loodrecht op de lange as van de IC's te staan en dus afwijkt van de oorspronkelijke confocale afbeelding (figuur 1A). (B) Een van de uitgelichte en afgebeelde IC's draaide 90°. Het zwarte vlak werd handmatig gedefinieerd door de gebruiker en doorsnijdt de IHC langs zijn pijler-modiolaire as. (C) Bubble plot met de locatie van alle functionele synapsen in deze confocale stack, ten opzichte van de genormaliseerde drie assen van hun respectievelijke IHC. de grootte van de symbolen is evenredig met het volume van het presynaptische element. Merk op dat de beeldhoek is gekozen om vergelijkbaar te zijn met paneel (B). (D) Boxplot van de genormaliseerde volumes synaptische elementen, afzonderlijk voor de presynaptische (linker 2 vakken) en postsynaptische (rechter 2 vakken) partners van functionele synapsen en verder gescheiden volgens hun positie in de modiolaire of pijlerhelft van hun respectieve IHC (verschillende kleuren). Vakken vertegenwoordigen interkwartielbereiken, waarbij de medianen worden aangegeven door lijnen. Onderbroken snorharen geven 1,5 keer het interkwartielbereik aan en de kruisen geven afgelegen waarden aan die daarbuiten liggen. (E) Scatterplot van de genormaliseerde volumes van pre- vs. postsynaptische partners van functionele synapsen. Verschillende symbolen geven de positie aan in de modiolair of pilaarhelft van hun respectievelijke IHC. Afkortingen: IHC = inner hair cell; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = C-terminal bindend eiwit 2; GluA2 = ionotrope glutamaatreceptor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Afstanden vanaf de top die gelijk zijn aan specifieke doelfrequenties in slakkenhuizen van verschillende lengtes. De equivalente beste frequenties werden berekend op basis van de vergelijking gegeven door Müller25. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de methode die in dit protocol wordt beschreven, is het mogelijk om IHC's en synaptische structuren in slakkenhuizen van jongvolwassen en oudere gerbils te immunolabelen, veronderstelde functionele synapsen te identificeren door colokalisatie van pre- en postsynaptische elementen, ze toe te wijzen aan individuele IHC's en hun aantal, volume en locatie te kwantificeren. De antilichamen die in deze aanpak werden gebruikt, labelden ook buitenste haarcellen (OHCs; myoVIIa) en hun presynaptische linten. Bovendien is een levensvatbaar alternatief voor immunolabeling van zowel IHC's als OHC's een antilichaam tegen otoferline, waarbij OHC's veel zwakker lijken dan IHC's.
Perfusie kan worden uitgevoerd met behulp van twee verschillende opstellingen. 1) Een door de zwaartekracht gevoed druppellijnsysteem waarbij een enkele fles die een commerciële druppelleiding voedt, ongeveer 1,5 m boven het dier aan een katrolwiel wordt opgehangen. Vloeistoffen worden achtereenvolgens geïntroduceerd na het laten zakken van de fles, die aan de bovenkant open is. 2) Een systeem met behulp van een digitale peristaltische pomp met variabele snelheid, met een dunne, lange buis open aan het ene uiteinde om de vloeistof op te nemen en een naald die gemakkelijk kan worden bevestigd aan het andere uiteinde. Beide werken even goed, en de subtiele verschillen zullen hier niet worden uitgewerkt. De auteurs bevelen echter specifiek een dons-tochtachtige werkbank aan, met het dier op een geperforeerd platform en de dampen eronder afgezogen. Dit maakt een goede toegang tot het operatiegebied mogelijk zonder de uitlaatfunctie in gevaar te brengen (in tegenstelling tot werken in een open rookkast).
Een goede fixatie van het weefsel is van cruciaal belang, omdat anders het sensorische epitheel tijdens de dissectie zal loskomen en desintegreren. In de gerbil is langdurigere blootstelling aan het fixatiemiddel noodzakelijk dan gewoonlijk wordt gebruikt (bijvoorbeeld voor muizen 17,27,13 of cavia's28). De voorkeursmethode voor gerbils is snelle extractie van het slakkenhuis na de dood van het dier en onderdompeling-fixatie gedurende ten minste 1,5 dag. Als cardiovasculaire perfusie de voorkeur heeft, is het cruciaal dat de fixatie binnen enkele minuten begint en goed verloopt. Omdat het moeilijk kan zijn om uiteindelijk de kwaliteit van fixatie tijdens perfusie te beoordelen, wordt aanbevolen om het slakkenhuis routinematig te postfixeren zoals beschreven.
Het is belangrijk om te voldoen aan de wasstappen, waarbij de laatste wasstap (stap 2.7) de belangrijkste is. Als het niet voldoende wordt gewassen, is het weefsel plakkerig en hecht het zich aan de dissectie-instrumenten, wat de dissectie moeilijk maakt. Het wordt ook aanbevolen om een autofluorescentie quencher te gebruiken in slakkenhuis geoogst van verouderde gerbils om niet-specifieke fluorescentie te verminderen. Autofluorescentie kan afkomstig zijn van lipofuscine, dat veel voorkomt in weefsel van oudere dierenvan 29,30,31, en lijkt breed opgewonden en breed uit te stoten. Wanneer lipofuscine wordt geëxciteerd met een golflengte in het UV-spectrum (λ = 364 nm), heeft het een breed emissiebereik (λ = 400-700 nm, met een maximum van ~λ = 568 nm)32. In menselijk myocardine weefsel is lipofuscine zichtbaar met een excitatie van λ = 555 nm en emissie van λ = 605 nm33. Evenzo merkten de auteurs in de IHC's van gerbils een toename van niet-specifieke fluorescentie het meest prominent op in het kanaal dat wordt gebruikt voor het AF568-antilichaam, wat autofluorescentie van lipofuscinekorrels suggereert. Een algemene aanbeveling bij het werken met weefsel van dieren is dus om de excitatiebandbreedte rond de 550-600 nm te gebruiken voor het minst kritische immunolabel.
De meting van de totale cochleaire lengte en de juiste identificatie van specifieke cochleaire posities is alleen mogelijk als de volledige lengte behouden blijft. Als delen van het sensorische epitheel verloren gaan bij dissectie, wordt het aanbevolen om nog steeds het resterende deel of zelfs alleen het spiraalvormige ganglionstuk te monteren en gedetailleerde notities bij te houden. Het is dan meestal mogelijk om het ontbrekende gedeelte met redelijke nauwkeurigheid in te schatten. Als de apicale delen van het slakkenhuis volledig bewaard blijven, maar het basale uiteinde ontbreekt, kunnen specifieke cochleaire locaties op het apicale deel definieerbaar zijn door de posities te berekenen op basis van de mediane cochleaire lengte binnen de gebruikte gerbilpopulatie omdat de afwijking van de reële waarde klein is.
Een belangrijke beperking van de synapsvolumekwantificering is dat de resulterende absolute volumes niet vergelijkbaar zijn over verschillende confocale stapels. De kritieke stap die de resulterende volumes van synaptische elementen bepaalt, is de keuze van de intensiteitsdrempel voor initiële detectie. De keuze voor deze intensiteitsdrempel wordt echter subjectief gemaakt door de gebruiker in het huidige protocol en vele anderen 3,27,34. Bovendien hangt de helderheid van de immunofluorescentie in het confocale beeld af van vele factoren, die zeer moeilijk te standaardiseren zijn over monsters, zoals weefseldikte, oriëntatie van weefsel ten opzichte van het optische pad, duur van laserblootstelling en nauwkeurige confocale en deconvolutie-instellingen. Al deze kanttekeningen worden verergerd als zeldzaam materiaal gedurende een aanzienlijke tijdsduur wordt verkregen, zoals typisch is voor ouder wordende gerbils. Samen betekent dit dat vooroordelen zeer moeilijk uit te sluiten zijn in gepoolde gegevens, en het beste scenario is een dataset met een hoge variantie. Het wordt daarom aanbevolen om synaptische volumes routinematig te normaliseren naar het respectieve mediane volume van de individuele confocale stapel, zoals geïntroduceerd door Liberman et al.3. Het voor de hand liggende nadeel is dat synaptische volumes dan alleen vergelijkbaar zijn binnen een bepaalde beeldstapel, bijvoorbeeld tussen verschillende locaties op de IHC, maar niet tussen verschillende cochleaire locaties of specimenleeftijden.
De dubbele etikettering van pre- en postsynaptische structuren en de vereiste van colokalisatie maakt een betrouwbaardere schatting van het aantal functionele synapsen mogelijk dan het gebruik van een van beide labels alleen. Als slechts één label haalbaar is, wordt het aanbevolen om de presynaptische anti-CtBP2 te gebruiken, gekoppeld aan AF488 of fluorescerende tags met vergelijkbare golflengtespecificaties, om twee redenen. Ten eerste lijken verweesde linten, dat wil zeggen CtBP2-gelabelde elementen zonder een co-gelokaliseerd postsynaptisch label, zeldzaam te zijn17, en de auteurs bevestigden dit voor oudere gerbils. De fout die wordt geïntroduceerd door het niet kunnen verifiëren van co-lokalisatie met een postsynaptische partner is dus klein. Er moet echter worden opgemerkt dat dit een belangrijker probleem wordt bij het onderzoeken van aan lawaai blootgestelde oren (bijv.,28). Ten tweede, in gevallen met een hoog fluorescentiesignaal van onduidelijke oorsprong, beïnvloedde de ruis meestal het kanaal met behulp van een excitatiegolflengte rond 568 nm in de grootste mate (voorbeeld in figuur 2B, die het GluA2-label vertegenwoordigt). Ten minste een deel van dit geluid kan, in weefsel van oudere dieren, lipofuscine-autofluorescentie zijn. Om de kans op een schoon, enkel anti-CtBP2-label te maximaliseren, is het dus raadzaam om dit golflengtekanaal te vermijden. Ten slotte werd aangetoond dat, met de juiste koele en donkere opslagomstandigheden, de hier gebruikte immunolabeling stabiel is over lange perioden, tot ten minste 2,5 jaar (figuur 3B), wat de herevaluatie van waardevol weefsel, zoals van oude gerbils, mogelijk maakt.
De kwantificering van het IHC afferente synapsgetal is een belangrijke maatstaf geworden voor het evalueren van de toestand van het perifere auditieve systeem in vele contexten, waaronder leeftijdsgebonden gehoorverlies. Er zijn nu verschillende protocollen gepubliceerd (bijv. Gerbils21, muizen17,13, cavia's10,28 en mensen35). De hier beschreven methode is in zijn details specifiek voor jongvolwassen en oudere gerbils, maar er zijn enkele algemene aanbevelingen afgeleid die ook bij andere soorten van nut kunnen zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
De auteurs erkennen Lichun Zhang voor het helpen opzetten van de methode en de Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, voor het gebruik van de beeldvormingsfaciliteiten. Dit onderzoek werd gefinancierd door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) in het kader van de Duitse Excellence Strategy -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
