Summary
구심성 시냅스 구조 및 모발 세포를 면역표지하고, 노화된 조직에서 자가형광을 담금질하고, 달팽이관의 길이를 해부 및 추정하고, 공초점 영상으로 얻은 이미지 스택에서 시냅스를 정량화함으로써 젊은 성인 및 노인 게르빌 달팽이관을 처리하기 위한 프로토콜이 제시된다.
Abstract
내부 모발 세포와 구심성 청각 신경 섬유를 연결하는 리본 시냅스의 손실은 연령 관련 청력 손실의 한 원인으로 간주됩니다. 리본 시냅스의 손실을 검출하는 가장 일반적인 방법은 개별 달팽이관의 여러 토노토픽 위치에서 정량적 샘플링을 허용하기 때문에 면역 표지입니다. 그러나 관심있는 구조는 뼈 달팽이관 깊숙이 묻혀 있습니다. Gerbils는 연령 관련 청력 손실에 대한 동물 모델로 사용됩니다. 여기에서는 고정, 게르빌 달팽이관 전체 마운트, 공초점 이미징 및 리본 시냅스 수 및 부피 정량화를 위한 일상적인 프로토콜이 설명된다. 또한, 귀중한 노화 된 개인으로부터 좋은 재료를 얻는 것과 관련된 특별한 도전이 강조됩니다.
Gerbils는 안락사되어 심혈관적으로 관류되거나 고막 bullae가 두개골에서 조심스럽게 해부됩니다. 달팽이관은 정점과 기저부에서 열리고 고정제로 직접 옮겨집니다. 초기 방법에 관계없이, 달팽이관은 후고정되고 이후에 탈석회화됩니다. 그런 다음 조직은 시냅스 전후 구조 및 모발 세포에 대한 일차 항체로 표지됩니다. 다음에, 달팽이관은 그들의 각각의 일차 것들에 특이적인 이차 형광 태깅된 항체와 함께 인큐베이션된다. 노화 된 gerbils의 달팽이관은 자기 형광 소광기로 처리되어 오래된 동물 조직의 전형적으로 실질적인 배경 형광을 줄입니다.
마지막으로, 달팽이관은 6-11 개의 세그먼트로 해부됩니다. 전체 달팽이관 길이는 특정 달팽이관 위치가 개인간에 안정적으로 결정될 수 있도록 재구성됩니다. 순차적으로 획득된 공초점 이미지 스택은 선택한 위치에서 모발 세포와 시냅스를 시각화하는 데 도움이 됩니다. 공초점 스택은 디컨볼루브되고 시냅스는 ImageJ를 사용하여 수동으로 계산되거나 Matlab에서 사용자 정의 작성된 이미지 분석 절차를 사용하여 시냅스 구조의보다 광범위한 정량화가 수행됩니다.
Introduction
연령 관련 난청은 65세 이상 1세 이상 세계 인구의 3분의1 이상에 영향을 미치는 세계에서 가장 널리 퍼진 질병 중 하나입니다. 근본적인 원인은 여전히 논쟁 중이며 적극적으로 조사되고 있지만 구심성 청각 신경 섬유2와 내부 모발 세포 (IHC)를 연결하는 특수 시냅스의 손실을 포함 할 수 있습니다. 이러한 리본 시냅스는 신경 전달 물질 글루타메이트로 채워진 소포뿐만 아니라 시냅스 후 α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피온산(AMPA) 글루타메이트 수용체 3,4,5로 채워진 소포를 갖는 시냅스 전 구조를 포함한다. 게르빌에서, ~20개의 구심성 청각 신경 섬유가 하나의 IHC 6,7,8에 접촉한다. 모디올러스를 향하는 IHC 상의 섬유는 큰 시냅스 리본과 반대되는 반면, IHC의 기둥 측에 연결되는 섬유는 작은 시냅스 리본(즉, 고양이9, 게르빌7, 기니피그 10, 및 마우스 3,11,12,13,14)을 직면한다. 또한, 게르빌에서는 시냅스 전 리본과 시냅스 후 글루타메이트 패치의 크기가 7,14와 양의 상관 관계가 있습니다. IHC의 모디올라 쪽에 있는 큰 리본에 반대되는 섬유는 구경이 작고 낮은 자발적 속도와 높은 임계값(15)을 갖는다. 낮은 자발적 속도 섬유가 IHCs(15)의 기둥 측에 위치하는 높은 자발적 저역치 섬유보다 소음 노출(10) 및 이독성 약물(16)에 더 취약하다는 증거가 있다.
리본 시냅스의 손실은 달팽이관 신경 연령 관련 청력 손실에서 가장 초기의 퇴행성 사건이며, 나선형 신경절 세포와 구심성 청각 신경 섬유의 손실은17,18보다 뒤쳐집니다. 전기생리학적 상관관계는 청각 뇌간 반응(17) 및 복합 작용 전위(8)의 기록을 포함한다; 그러나, 이들은 시냅스 손실의 미묘함을 반영하지 않는데, 이는 낮은 자발적 속도 섬유가 이들 측정(16)에 기여하지 않기 때문이다. 더 유망한 전기생리학적 메트릭들은 질량 전위-유도 신경 지수(19) 및 주변 자극 시간 응답(20)이다. 그러나, 이들은 동물이 청각 신경 섬유 손실을 넘어 나머지 청각 신경 섬유의 활성에 영향을 미치는 다른 달팽이관 병리가없는 경우에만 신뢰할 수 있습니다8. 또한, 게르빌에서 행동적으로 평가된 역치는 시냅스 번호21과 상관관계가 없었다. 따라서, 생존하는 리본 시냅스의 신뢰할 수 있는 정량화, 따라서, 기능적 청각 신경 섬유의 수는 달팽이관 조직의 직접적인 검사에 의해서만 가능하다.
몽골 게르빌 (Meriones unguiculatus)은 연령과 관련된 청력 손실을 연구하기에 적합한 동물 모델입니다. 수명이 짧고 인간과 비슷한 저주파 청력을 가지며 유지가 쉽고 연령 관련 청력 손실과 관련된 인간 병리와 유사성을 보여줍니다 2,22,23,24. Gerbils는 평균 수명22의 끝 부분에 가까운 36 개월에 도달하면 노화 된 것으로 간주됩니다. 중요하게도, 리본 시냅스의 연령과 관련된 손실은 조용한 환경에서 양육되고 노화 된 게르빌에서 입증되었습니다 8,21.
여기에서는 젊은 성인에서 노인에 이르기까지 다양한 연령대의 게르빌에서 달팽이관을 면역표지, 해부 및 분석하기위한 프로토콜이 제시됩니다. 시냅스 전 (CtBP2), 시냅스 후 글루타메이트 수용체 패치 (GluA2) 및 IHC (myoVIIa)의 성분에 대해 지시된 항체가 사용된다. 노화된 달팽이관의 배경을 감소시키고 형광 신호를 그대로 유지하는 자가형광 소광기가 적용됩니다. 또한, 달팽이관을 해부하여 감각 상피와 선조 혈관을 모두 검사하는 방법에 대한 설명이 제공됩니다. 달팽이관 길이는 특정 최적 주파수(25)에 대응하는 별개의 달팽이관 위치들의 선택을 가능하게 하기 위해 측정된다. 시냅스 수의 정량화는 자유롭게 이용가능한 소프트웨어 ImageJ26으로 수행된다. 개별 HC 내의 시냅스 부피 및 위치의 추가적인 정량화는 Matlab으로 작성된 소프트웨어 커스텀으로 수행됩니다. 이 소프트웨어는 저자가 전문적인 문서 및 지원을 제공 할 수있는 리소스가 부족하기 때문에 공개적으로 사용할 수 없습니다.
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Protocol
모든 프로토콜과 절차는 독일 니더작센주의 관련 당국에 의해 승인되었으며, 허가 번호는 AZ 33.19-42502-04-15/1828 및 33.19-42502-04-15/1990입니다. 이 프로토콜은 남녀 모두의 몽골 게르빌 (M. unguiculatus)을위한 것입니다. 젊은 성인은 3-12 개월의 나이를 말하며, gerbils는 36 개월 이상에서 노인으로 간주됩니다. 달리 언급되지 않은 경우, 완충액 및 용액을 제조하고 최대 수개월 (4-8 °C) 동안 냉장고에 저장할 수 있습니다. 사용하기 전에 버퍼와 용액이 침전되지 않았는지 확인하십시오.
1. 고정 및 장기 수집
참고 : 달팽이관 만 필요한 경우 침수로 다소 간단한 고정 절차를 수행하는 것이 좋습니다. 그러나 잘 보존 된 뇌가 필요하다면 심질 관류가 유일한 옵션입니다. 두 경우 모두 고정제는 인산완충식염수(PBS) 중의 4% 파라포름알데히드(PFA)이다. 이것은 신선하게 만들어야하지만 사용할 때까지 냉동 보관할 수 있습니다. 심질 관류를 위해 ~ 300 mL의 분취량을 사용하거나 달팽이관 당 ~ 50-100 mL의 분취량을 사용하여 침지하여 고정하십시오.
주의: PFA는 유해 물질입니다. 일반적인 실험실 안전 절차에 따라 처리하십시오.
- 경추 관류에 의한 고정
- 튜브에 기포가 없어질 때까지 관류 설정을 플러시합니다. 관류 튜브를 헤파린(PBS 100 mL 중 0.2 mL)을 함유하는 PBS로 채워 혈액 응고를 방지한다. 튜브가 PBS로 채워지고 유체 저장 병이 방금 비워지면 흐름을 멈추십시오. 해동된 PFA 200mL를 부어 넣습니다.
참고: 이제 동물을 위한 설정이 준비되었습니다. 튜빙 내의 나머지 PBS는 혈액을 플러시하기에 충분하며, 흐름이 재개되면 자동으로 고정제에 뒤따를 것이다. - PFA의 유출을 위해 폐기물 수집 시스템이 마련되어 있는지 확인하십시오. 신선한 캐뉼라 (19G)를 사용하고 큰 가위, 포셉 (평평한 팁 포함), 지혈제, 메스 또는 날카로운 캐뉼라 및 핀이있는 고무 매트가 있습니다.
- 펜토바르비탈의 복강 내 과다 복용으로 게르빌을 안락사시킵니다 (160 mg / mL, 동물 당 0.3 mL, 체중 범위 : 50-120 g). 동물을 새장에 다시 넣으십시오. 호흡 정지가 30 초 이상 간격으로 불규칙해질 때, 고무 매트 위에 게르빌을 등에 놓고 앞발과 뒷발 하나를 핀으로 고정하십시오 (관류 성공에 대한 더 나은 판단을 위해 뒷발 하나를 자유롭게 움직이게하십시오. 1.1.7 단계 이후의 참고 사항 참조).
- 흉강을 열려면 포셉으로 흉골 위의 피부를 들어 올리고 흰 색의 프로세스 인 xiphoideus 가 보일 때까지 가위로 흉골 아래 약 0.5cm 피부를 자릅니다. 포셉으로 프로세스 우리 xiphoideus 에서 흉골을 잡고 횡격막을 따라 잘라 흉강을 잘 볼 수 있습니다. 심장에 잘 접근 할 때까지 양쪽의 갈비뼈를 옆으로 자르십시오. 장기의 손상을 피하기 위해 게르빌의 몸체와 관련하여 가위의 각도가 평행하고 평평한지 확인하고 폐쇄 된 순환계를 보장하십시오.
- 흉골에 지혈제를 고정시키고, 흉곽을 들어 올리고, 혈류가 막히지 않도록 지혈제를 신체 부위에 놓지 않고 게르빌의 어깨 위에 지혈제를 놓습니다.
- PBS의 한 방울이 대략 매 2 초마다 캐뉼라 (19 G)에서 흘러 나올 때까지 유체 흐름을 약간 엽니 다. 포셉으로 심장을 잡고 좌심실을 명확하게 볼 수 있도록 왼쪽으로 약간 돌립니다. 캐뉼라를 중격에 침투하지 않도록 좌심실에 삽입하십시오. 바늘을 손으로 또는 다른 지혈제로 제자리에 고정하십시오.
참고 : 좌심실과 우심실은 다른 색조로 구별 될 수 있습니다. 좌심실은 심장 조직의 나머지 부분보다 색상이 가벼워 보입니다. - 천천히 유체 흐름의 압력을 높이고 미세한 가위, 메스 또는 다른 캐뉼라로 오른쪽 아트리움을 엽니 다. 드립 챔버에서 약 2-3 방울 / s가 관찰 될 때까지 유체 흐름을 더 열거 나 펌프에 대해 4 mL / min의 흐름을 설정하십시오. 일단 심장의 고정이 시작되면, 관류 캐뉼라가 더 이상 유지되지 않고 제자리에 머물러 있는지 확인하십시오.
참고 : 성공적인 관류의 징후는 느린 근육 수축, 목과 사지의 뻣뻣함, 창백한 간 및 장밋빛 폐입니다. 실패한 관류의 징후는 폐의 미백이며, 이는 중격의 펑크로 인해 폐 순환이 관류되었음을 나타냅니다. - 관류가 실패한 경우, 캐뉼라를 대동맥으로 더 위로 옮기고 지혈제로 제자리에 고정하십시오.
- 게르빌을 무력화시킨다. 불레를 제거하고 1.2.2 단계에서 설명한 대로 뼈를 자르고 떼어냅니다.
참고 : 조직이 충분히 고정되어 있지 않으면 감각 상피가 해부 중에 코르티 기관에서 빠져 나옵니다. - 관류가 5-10 분 이내에 고정의 징후를 보이지 않으면 중단하고 즉시 침지로 고정을 위해 아래 절차를 따르십시오. 이를 위해, 단계 1.2.2에서와 같이 달팽이관을 치료하고, 8°C에서 2D-진탕기 상에서 1-2일 동안 스크류 캡 용기 중의 대략 50-80 mL의 4% PFA에 조직을 포스트픽싱한다.
참고 : 관류 중에 궁극적으로 고정의 품질을 평가하는 것이 어려울 수 있으므로 설명 된대로 달팽이관을 일상적으로 게시하는 것이 좋습니다.
- 튜브에 기포가 없어질 때까지 관류 설정을 플러시합니다. 관류 튜브를 헤파린(PBS 100 mL 중 0.2 mL)을 함유하는 PBS로 채워 혈액 응고를 방지한다. 튜브가 PBS로 채워지고 유체 저장 병이 방금 비워지면 흐름을 멈추십시오. 해동된 PFA 200mL를 부어 넣습니다.
- 조직 침지에 의한 고정
- 펜토바르비탈의 복강 내 과다 복용으로 게르빌을 안락사시킵니다 (160 mg / mL, 동물 당 0.3 mL, 체중 범위 : 50-120 g). 게르빌이 호흡을 멈췄을 때, 동물을 무력화시킨다.
- 불레를 제거하고 가위와 포셉으로 뼈를 자르고 떼어 달팽이관에 도달하십시오. maellus, incus 및 반원형 운하를 제거하십시오. 포셉으로 달팽이관 뼈를 조심스럽게 긁어서 정점과 기저 회전에 작은 구멍을 뚫으십시오. 즉시 불라를 과량의 차가운 고정제(적어도 50 mL)로 옮기고, 2일 동안 완만한 교반기(2D-shaker[100 rpm]) 하에 차가운 상태(4-8°C)에서 조직을 고정시킨다.
참고 : 조직을 고정 한 후, 달팽이관은 즉시 처리되거나 0.05 % 나트륨 아지드가있는 PBS에 저장할 수 있습니다. 주의: 아지드 나트륨은 독성이 있습니다. 저장 길이는 염색의 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. 제한된 시험에서는 조직을 나트륨 아지드에 저장 한 2 년 후에 면역 염색이 약하게 나타났다는 것을 시사했습니다.
2. 조직 준비 및 면역 표지
- 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 분말을 PBS에 용해시켜 pH 8에서 0.5 M 용액을 생성한다. 이를 위해 비커를 자기 교반기 위에 놓고 PBS 총량의 약 절반으로 채우고 적절한 양의 EDTA 분말을 첨가하여 산성 현탁액을 만듭니다. 농축된 수산화나트륨 용액(NaOH)을 조심스럽게 첨가하면서 pH 측정기로 pH를 모니터링한다. 원하는 최종 부피로 PBS를 채우고 용액을 여과하여 미생물 오염을 방지한다.
참고: EDTA 분말은 현탁액이 중성 pH 값에 도달한 후에만 완전히 용해됩니다. - 탈석회화를 위해, 달팽이관을 PBS 중의 0.5 M EDTA의 80 mL로 옮긴다. 조직을 2일 동안 2D-진탕기(100 rpm) 상에서 완만한 교반 하에 냉간(4-8°C)에서 인큐베이션한다.
참고: 탈석회화 단계 후, 조직은 나머지 처리 단계를 계속하기 전에 최대 3주 동안 며칠 동안 PBS에 저장될 수 있다. 줄무늬 혈관을 표지하는 항체의 경우,이 시점에서 (즉, 면역 염색 전에) 모디올라 축을 따라 달팽이관을 반으로 절단하여 각각의 표적에 대한 항체의 균일 한 접근을 보장하는 것이 좋습니다. 이것은 항체-의존성이며 시냅스 구조 및 IHCs를 표지하기 위해 여기에 사용된 항체에는 적용되지 않는다. 절단을 위해 깨지기 쉬운 면도날과 블레이드 홀더 (4.2 단계에서 설명한대로)를 사용하십시오. - 2 mL 안전 밀봉 반응 튜브에서 다음 단계(최대 단계 3.2)를 수행하십시오. 조직 조각이 너무 커서 튜브 내부에 들어갈 수 없으면 과도한 조직을 가위로 다듬으십시오. 항체의 침투를 향상시키기 위해, 먼저 실온에서 1 h 동안 2D-진탕기 (100 rpm) 상의 PBS 중의 1 mL의 1% 트리톤 (Triton X-100) 중의 조직을 투과시킨다. 3x 조직을 PBS 중의 0.2% 트리톤(Triton X-100) 1 mL로 실온에서 각각 5분 동안 2D-진탕기(100 rpm) 상에서 세척하였다.
- 비특이적 항원을 차단하기 위해, 실온에서 1시간 동안 2D 진탕기(100 rpm) 상의 블로킹 용액 1 mL(3% 소 혈청 알부민[BSA], 0.2% 트리톤, PBS 중)에 달팽이관을 인큐베이션한다.
참고 : 차단 솔루션은 미리 준비 할 수 있지만 ~ 10 일 이상이어야합니다. - 다음의 일차 항체를 블로킹 용액의 동일한 분취량에 신선하게 희석한다: IHCs (IgG 폴리클로날 토끼)를 표지하기 위해 항-myoVIIa (미오신 VIIa)를 1:400으로 희석하고; 항-CtBP2 (C-말단 결합 단백질 2)를 표지하기 위해 시냅스 전 리본 (IgG1 모노클로날 마우스)을 1:400으로 희석하고; 및 항-GluA2를 표지하여 시냅스 후 수용체 패치(IgG2a 모노클로날 마우스)를 1:200으로 희석하였다. 달팽이관이 항체 용액 (전형적으로 0.4 mL)으로 완전히 덮여 있는지 확인하고 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션한다.
- 다음에, 조직을 각각 5분 동안 실온에서 2D-진탕기(100 rpm) 상에서 PBS 중의 0.2% 트리톤으로 5x 세척한다. 그들의 1차 대응물의 숙주 종과 일치하도록 2차 항체를 선택하고 PBS에서 3% BSA, 0.2% 트리톤으로 다시 신선하게 희석한다: 염소 항-마우스 (IgG1)-알렉사 형광단 (AF) 488, 희석 1:1,000; 염소 항-마우스 (IgG2a)-AF568, 희석된 1:500; 당나귀 항-토끼-AF647 (IgG)을 1:1,000으로 희석하였다. 형광의 표백을 방지하기 위해 튜브를 알루미늄 호일에 싸십시오. 달팽이관을 0.4 mL의 이차 항체 용액에 24시간 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
참고: 제한된 시험에서 일차 및 이차 항체로 37°C에서 24시간 동안 인큐베이션하면 더 낮은 온도와 더 짧은 지속 시간으로 더 일반적인 배양 절차를 따르는 것보다 더 밝은 면역 염색이 이루어졌다는 사실이 밝혀졌습니다. - 달팽이관 2x를 실온에서 2D 진탕기(100 rpm) 상에서 각각 5분 동안 PBS 중의 0.2% 트리톤 1 mL로 각각 5분 동안 및 3x PBS로 세척한다.
참고 :이 세척 단계 후, 달팽이관은 며칠 동안 ~ 4 °C의 냉장고에있는 PBS에 남아있을 수 있습니다.
3. 자기 형광 소광기로 처리 (선택 사항)
참고 : 중년 및 노인 게르빌의 달팽이관은 광범위한 배경 자기 형광을 보여줍니다. 젊은 성인 조직에서는 자가 형광 소광기로 치료할 필요가 없습니다. 원칙적으로, 면역염색 절차 전에 자가형광 소광제를 적용하는 것이 가능하며, 이는 원하는 항체 형광의 임의의 부주의한 감소를 피한다. 그러나 제조업체의 데이터 시트에 따르면 세제 (예 : 현재 프로토콜의 Triton X-100)는 조직에서 소광제를 제거하므로 더 이상 사용할 수 없습니다.
- 단계 4.2에 설명된 바와 같이 달팽이관을 입체현미경으로 반으로 자른다.
- 자가형광 소광기를 70% 에탄올과 혼합하여 5% 용액을 수득하고, 이 용액에서 달팽이관을 실온에서 1분 동안 2D-진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 달팽이관 3x를 PBS 1 mL로 실온에서 5분 동안 실온에서 2D 진탕기로 각각 세척한다.
주의: 자가형광 소광기는 위험하고 해롭다. 이 물질을 다룰 때 장갑을 착용하십시오.
4. 최종 미세 해부
- 달팽이관을 입체 현미경으로 해부하십시오. 폴리스티롤 페트리 접시와 그 뚜껑을 PBS로 채우고 두 개의 미세한 포셉, Vannas 스프링 가위, 블레이드 홀더 및 깨지기 쉬운 면도날을 편리하게 보관하십시오. 면도날로부터 조각을 파절하여 해부 단계에 따라 ∼2-4 mm의 절단면을 얻는다. 세 방울의 장착 매체를 연속으로 배치하여 현미경 슬라이드를 준비합니다.
참고: 면도날의 절단면이 빠르게 마모됩니다. 블레이드는 달팽이관의 대략 매 초마다 해부하고 장착 한 후에 교환해야합니다. - 단계 3.1에서 아직 완료되지 않았다면, 먼저 입체 현미경으로 모디올러스를 따라 달팽이관을 반으로 자른다. 이를 위해 달팽이관의 코일 길이보다 긴 면도날 조각을 블레이드 홀더에 넣으십시오. 달팽이관을 페트리 접시에 넣고 면도날 조각으로 과도한 조직을 잘라냅니다. 달팽이관을 미세한 포셉으로 제자리에 고정시키고 모디올러스를 따라 반으로 자릅니다.
- 절반부터 시작하되 나머지 절반은 페트리 접시에 남겨 두십시오. 절삭 날이 위쪽을 향하도록 포셉으로 달팽이관 절반을 조심스럽게 고정하십시오. 미세한 스프링 가위를 사용하여 헬리코트 위의 달팽이관의 뼈를 잘라 정점을 덮으십시오.
- 달팽이관 조각의 분리를 시작하려면 모디올러스와 청각 신경을 통해 가위로 절단하여 중간 회전을 분리하십시오 (스칼라 현관) 및 아래 (스칼라 tympani).
- 달팽이관 내의 선조골 혈관을 덮고있는 달팽이관 뼈를 통해 자릅니다. 코르티 (Corti)의 장기 위와 줄무늬 혈관을 따라 달팽이관 뼈의 양쪽에 두 번 자르고 면도날을 사용하여 결국 달팽이관 조각을 분리하십시오.
참고 : 줄무늬 혈관은 어두운 줄무늬로 쉽게 볼 수 있습니다. 줄무늬 혈관을 따라 절단하면 Corti의 장기가 손상되지 않습니다. - 선택 사항 : 선조증 혈관을 수집하려면 Corti의 기관과 줄무늬 혈관 사이를 조심스럽게 잘라 두 가지를 분리하십시오. 나선형 인대 (달팽이관의 외부 표면을 덮고있는 뼈에 부착 됨)에 연결된 줄무늬 혈관을 떠나 포셉을 사용하여 탈석회화 된 뼈를 제거하십시오. 스트리아 측면이있는 조각을 현미경 슬라이드에 올려 놓고 장착 매체 한 방울에 넣으십시오.
참고: 수집된 조각이 너무 강하게 구부러져 있는 경우, 슬라이드에 장착하기에 충분히 평평해지도록 작은 조각으로 분할해야 할 수 있습니다. - 달팽이관 조각을 폴리스티롤 페트리 접시의 PBS로 채워진 뚜껑으로 옮겨 달팽이관 전체 마운트가 슬라이드에 가능한 한 평평하게 놓여 있는지 확인하십시오. 복부 측의 나선형 인대 부분과 신경 측의 나선형 사지 부분과 같은 과도한 조직을 제거하십시오. 초미세 포셉으로 지각 막을 조심스럽게 제거하십시오.
- 달팽이관 조각을 슬라이드 위에 장착 매체 한 방울에 놓습니다. 코티의 오르간이 슬라이드에 위로 향하도록 달팽이관 전체 마운트를 배치하여 이미징을 위한 광학 경로에서 IHC가 가려지지 않도록 합니다. IHC에 근접한 나선형 림푸스의 질내 부전을 찾으십시오.이 IHC는 달팽이관 조각을 시상 평면으로 이동하여 위쪽을 향하게하는 측면을 식별하여 볼 수 있습니다.
참고: 추가 처리 중에 개별 조각에서 전체 달팽이관을 디지털 방식으로 재구성하려면 조각의 스케치를 문서화하고 랜드 마크를 메모하는 것이 좋습니다. 또한 조각은 이상적으로 슬라이드에서 올바른 순서로 배열되어야합니다. - 달팽이관 전체가 현미경 슬라이드로 옮겨질 때까지 4.3-4.8단계를 반복합니다. 필요한 경우 장착 매체를 더 추가하고 슬라이드를 커버슬립한 다음 가장자리 주위에 칠해진 검은색 매니큐어로 커버슬립을 제자리에 밀봉합니다. 실온에서 어둠 속에서 건조시킨 다음 슬라이드를 4°C의 어둠 속에 보관한다.
참고: 감각 상피 자체의 일부가 실수로 손실되더라도 올바른 길이 추정을 위해 달팽이관 조각의 남은 부분을 장착하는 것이 중요합니다.
5. 달팽이관 길이 측정
- epi-fluorescence 현미경 시스템 및 관련 소프트웨어를 사용하여 조각의 밝은 필드 이미지에서 달팽이관의 길이를 측정하십시오. 모든 달팽이관 조각에서 저배율 이미지 (4x 렌즈)를 저장하고 현미경 소프트웨어의 올가미 측정 도구를 사용하여 각 이미지에서 IHC 행을 따라 선을 그립니다. 모든 조각의 길이를 추가하여 전체 길이를 계산합니다.
참고: 달팽이관 조각 내에서 감각 상피의 일부가 누락되면 선을 보간하십시오. - 개별 달팽이관에서 분석해야 하는 달팽이관 위치를 정의하려면 Müller25에 의해 주어진 방정식을 사용하여 정점으로부터 해당 거리를 계산하십시오. 예를 들어, 달팽이관 조각의 인쇄물에 이러한 위치를 표시하십시오.
6. 공초점 현미경으로 이미지 수집
- 오일 침지 40x 대물(수치 조리개 1.3)과 고해상도 이미징에 적합한 오일이 있는 공초점 현미경을 사용하십시오.
참고: 공초점 현미경에 반전된 조명 경로가 있는 경우 슬라이드를 거꾸로 배치해야 합니다. 이 경우 최종 스캔을 시작하기 전에 시편을 약 30 분 동안 가라 앉히고 커버 슬립에 안정적으로 휴식을 취하십시오. 대안으로, 해부 기간 동안 유체이지만 나중에 응고되고 동시에 형광을 보존하는 장착 매체를 사용하십시오. - 적절한 레이저를 활성화하십시오 : λ = 488 nm 및 λ = 522 nm의 파장을 가진 두 개의 광학적으로 펌핑 된 반도체 레이저와 λ = 638 nm의 파장을 가진 다이오드 레이저가이 프로토콜에 사용됩니다. 형광 태그의 방출 범위를 선택합니다(AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). 하이브리드 검출기가 방출된 광자를 세려면 레이저 라인을 방출 곡선에서 최소 10nm 떨어진 곳에 두십시오.
참고: 단일 표지된 조직으로 예비 검사를 수행하여 선택한 검출기 대역폭이 색상 채널을 깨끗하게 분리하는지 확인하는 것이 중요합니다(즉, 채널 누화로 이어지지 않음). 전파가 하이브리드 검출기를 방해하여 최대 광자 수를 초래하여 스택에 인공적인 줄무늬가 생깁니다. 따라서 현미경 근처에서 휴대 전화를 사용하지 마십시오. - 이미지가 10개의 IHC에 걸쳐 있을 때까지 조직을 확대합니다. 나이퀴스트 샘플링에 따라 이미지의 해상도를 선택하십시오 (일반적으로 ~ 40-60 nm / 픽셀). z 방향의 스텝 크기를 0.3μm로 설정하고 이미징 속도를 400-700Hz로 설정합니다.
참고: 이 두 설정(스텝 크기 및 이미징 속도)은 최적의 이미징 파라미터를 사용하는 것과 스캔 시간 절약 사이의 절충안입니다. - 양방향 샘플링을 수행하여 이미징 시간을 단축합니다. 488 nm 및 638 nm 채널에 대한 프레임을 3x 및 522 nm 채널에 대해 6x로 축적하고; 또한 각 채널에 대해 3x 행의 평균을 구합니다. z차원에서 스택의 시작과 끝을 선택합니다.
- 신호 대 잡음비 감소를 방지하기 위해 하이브리드 검출기(카운팅 모드)를 사용할 때 게인을 100으로 설정하십시오. 관심 영역에서 픽셀이 포화되지 않도록 레이저 파워를 설정하지만 구조는 대부분 전체 8비트 범위를 커버합니다. 0.5 %의 낮은 레이저 출력으로 시작하여 구조물이 보일 때까지 증가시킵니다.
참고: 좋은 염색은 일반적으로 0.1%와 5% 사이의 레이저 파워가 필요합니다. - 이미지 스택의 사후 처리를 위해 디컨볼루션 소프트웨어를 사용하여 이론적 인 포인트 확산 기능을 사용하여 작은 형광 구조 주변의 흐릿한 후광을 제거하십시오. 실험 내의 각 스택에 대해 동일한 설정을 사용합니다. 디컨볼볼로브된 이미지를 .tif 또는 .ics로 저장합니다.
참고: myoVIIa-label(IHC)은 디컨볼루션의 이점을 받지 않으며 시간을 절약하기 위해 생략될 수 있습니다. 이 소프트웨어는 이미지 파일의 메타 데이터를 사용합니다. 그러나, 광 경로, 임베딩 매질, 또는 침지 매질과 같은 몇몇 파라미터들이 특정될 필요가 있다.
7. 시냅스 정량화
- 자유롭게 액세스 할 수있는 소프트웨어 ImageJ에서 deconvolved 스택의 사본을 추가 Biovoxxel-plugin으로 엽니 다.
- 채널을 분할하여 개별 채널의 색상 조정(이미지 | 색상 | 채널 분할) 및 병합(이미지 | 색상 | 채널 병합) 다시 다른 색상을 할당합니다. 이미지를 RGB 스택으로 변환(이미지 | 색상 | RGB에 스택)하고 밝기와 대비를 조정하십시오 (이미지 | | 조정 밝기/명암비 | 필요한 경우 최대 또는 최대 관련 슬라이더)를 사용하여 시냅스 전후 구조와 IHC 레이블이 배경과 유쾌하게 구별되도록 합니다.
- 다섯 개의 IHC를 선택하고 스택 내에서 원하는 위치를 클릭하여 텍스트 도구 (IHC1-IHC5)로 레이블을 지정합니다. ROI 관리자 열기(분석 | 도구 | ROI 관리자); 체크박스 레이블을 활성화하여 점으로 숫자에 레이블 을 지정합니다. 관심 있는 IHC를 확대합니다.
- 다중 점 모드에서 점/다중 점 도구를 사용합니다(도구를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하여 점 또는 다중 점 모드 중에서 선택). z차원을 스크롤하면서 기능적 리본 시냅스(즉, 시냅스 후 글루타메이트 패치와 밀접한 병치의 시냅스 전 리본)를 클릭합니다.
참고: 겹침의 양과 각 채널에 대해 선택한 색상에 따라 공유 픽셀이 혼합 색상으로 나타납니다. 일반적으로 개별 기능적 시냅스의 구별은 서로 충분히 멀리 떨어져 있기 때문에 간단합니다. - 관심있는 모든 구조가 선택되면 ROI 관리자의 그래픽 사용자 인터페이스에서 추가 를 클릭하십시오. 임의의 이름을 클릭하고 이름 바꾸기를 선택하십시오.
참고: 점 도구 옵션 메뉴(점 도구 아이콘을 두 번 클릭)에서 모두 표시 확인란을 선택하면 동일한 리본 시냅스가 여러 번 계산되지 않도록 할 때 점 레이블이 스택의 모든 평면에 계속 남아 있습니다. - 계산할 다음 IHC를 선택할 때는 핸드 툴로 다음 IHC를 완전히 표시하도록 이미지를 조정하여 실수로 카운트를 추가하지 마십시오. 이전에 저장된 데이터에 더 많은 누점이 추가되지 않도록 다중 포인트 도구에서 점 도구로 변경합니다. 다음 IHC 내에서 관심 있는 구조를 클릭하고 멀티포인트 도구로 다시 변경합니다. 관심있는 모든 IHC가 평가될 때까지 7.4~7.5단계를 반복합니다.
- 데이터를 저장하려면 ROI 관리자에서 데이터 세트를 클릭한 다음 측정을 클릭합니다. 측정된 데이터 요소를 나열하는 새 창이 나타날 때까지 기다립니다. 이 목록을 스프레드시트 파일로 저장(파일 | 다른 이름으로 저장). ROI 관리자에서 모두 표시 를 활성화하여 이미지를 저장합니다. Flatten을 클릭하여 포인트 레이블을 스택에 영구적으로 추가합니다. 이미지 스택을 닫을 때 변경 사항을 저장하는 데 동의합니다 .
8. 모발 세포의 시냅스 부피 및 위치 분석
참고: 저자는 Matlab을 기반으로 사용자 지정 프로그래밍된 절차를 사용했습니다. 공개적으로 사용할 수 없기 때문에 여기서는 광범위한 용어로만 요약되어 있습니다 (7 참조). 사용에 관심이있는 경우 해당 저자에게 문의하십시오. 이 절차에서는 TIFF 형식의 트리플 레이블(IHC, 시냅스 전후) 이미지 스택을 입력으로 예상하고, 그래픽 인터페이스를 통해 다양한 분석 단계를 통해 사용자를 안내하며, 스프레드시트 형식으로 결과의 광범위한 출력을 제공합니다.
- 시냅스 구조의 위치를 기둥-모디올라 축과 달팽이관 정근-기저 축 및 IHC의 상단(큐티큘러 플레이트)에서 하단(시냅스 극) 축에 대한 개별 IHC의 범위에 의해 정의된 3D 좌표계로 정규화합니다.
참고: 시냅스 요소의 부피(시냅스 전후 및 기능적 시냅스의 결합 부피)는μm3 으로 제공되며 각각의 중앙값3으로 정규화됩니다.
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Representative Results
달팽이관은 전체 동물의 고정으로 심혈관 관류 후 수확하거나 동물을 안락사시키고 침지 고정 한 후 신속하게 해부했습니다. 후자의 방법으로, IHCs는 해부 동안 제자리에 머물렀고, 반면, 관류가 실패하여 조직이 불충분하게 고정 된 경우, 감각 상피는 종종 파괴되었습니다. 저자들은 뇌의 고정이 여전히 적절하면서 심질 관류 후 달팽이관의 고정이 불충분 한 경우에 직면했습니다. 열등한 관류로부터의 조직은 달팽이관 정점과 기저부에 구멍을 열고 2 일 동안 4 % PFA에 침지하여 달팽이관을 포스트 고정함으로써 여전히 절약 될 수 있습니다.
전체 달팽이관의 길이 결정은 뚜렷한 특성 주파수와 동등한 특정 달팽이관 위치에서 IHCs 및 그들의 시냅스를 평가하기 위해 뮐러25 에 따라 수행되었다 (표 1). 이를 위해, 원하는 달팽이관 위치는 달팽이관 염기로부터의 바질라 막 길이의 백분율로서 계산되었다. 젊은 성인 gerbils에서 13 달팽이관의 중간 달팽이관 길이는 11.3 mm (사분위 범위 : 11.02-11.52 mm)이었다. 노화 된 gerbils에서 24 달팽이관의 중간 달팽이관 길이는 11.5 mm (사분위 범위 : 11.24-11.73 mm)이었다. 젊은 성인과 노인 달팽이관의 길이 사이에는 유의미한 차이가 없었다 (만-휘트니 U-검정: U= -1.62, p=0.105); 전체 중앙값은 11.48mm였다. 개별 달팽이관 길이의 이러한 변화는 작았으며 고정 길이 위치 (mm)를 사용하는 것이 적절하다고 주장 할 수 있습니다. 그러나 장소-주파수 함수는 비선형입니다. 따라서 중간 길이로부터의 편차는 상대적으로 더 정점 달팽이관 위치보다 기저 달팽이관 위치에 대해 더 큰 오차를 발생시킵니다. 예를 들어, 1kHz의 주파수에 해당하는 달팽이관 위치의 경우, 중간 달팽이관 길이(즉, 11.48mm)를 기준으로 계산되며, 해당 주파수는 이 샘플에서 가장 짧은(10.36mm) 및 가장 긴 달팽이관(12.28mm)에 대해 각각 1.16kHz ~ 0.91kHz 범위였다. 기저부에 위치하는 주파수(예를 들어, 32kHz)의 경우, 주파수 범위는 최단 및 가장 긴 달팽이관에 대해 각각 51.62kHz 내지 23.97kHz였다. 따라서 각 달팽이관의 개별 위치, 특히 기저 달팽이관 위치를 검사 할 때 계산하는 것이 좋습니다.
도 1은 이상적인 면역표지의 예인 젊은 성인(10개월, 도 1A) 및 노화된 게르빌(38개월, 도 1B)로부터의 달팽이관의 최대 강도 z-차원 투영을 묘사한다. 젊은 성인 게르빌의 달팽이관을 묘사 한 이미지에서 파란색으로 표시된 myoVIIa 라벨이 붙은 IHC는 검은 색 배경과 뚜렷한 대조를 이룹니다. 따라서 개별 IHC는 쉽게 검출할 수 있습니다. 시냅스 전후 구조는 각각 녹색과 빨간색 요소로 명확하게 볼 수 있습니다. 이들은 가까운 병치에있을 때마다 기능적 시냅스를 형성하는 것으로 가정합니다 (그림 1A', B'). 노화 된 gerbils의 달팽이관에서 명백하게 드러나는 짝이없는 시냅스 전 구조 (고아 리본)는 거의 없었습니다. 오래된 게르빌로부터의 달팽이관(도 1B)을 자가형광 소광제로 처리하였다. IHC 라벨은 약한 것처럼 보이지만,이 표본에 사용 된 레이저 파워는 젊은 성인 gerbil의 달팽이관에 사용 된 것보다 세 배 더 높았습니다. 그럼에도 불구하고 IHC는 여전히 배경과 구별됩니다. 시냅스 전후 구조가 명확하게 보이고, 두 채널 모두에 사용 된 레이저 파워는 젊은 성인 표본의 경우와 비슷하거나 심지어 그 이하였습니다. 노화된 동물로부터의 조직은 전형적으로 유의하게 더 비특이적으로 보이는 형광 신호를 나타냈다. 따라서, 젊은 성인 및 노인 물질에 대한 프로토콜의 주요 차이점은 자동 형광 소광기로 치료하는 것입니다. 이것은 형광 태깅된 항체로 면역염색 후에 수행되었으며, 원칙적으로 의도된 항체 표지에도 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의한다. 그러나, 처리는 관심있는 구조물의 특정 표지의 충분한 신호를 남기면서 비특이적 기원의 외래 형광을 효과적으로 감소시켰다 (도 1B와 도 2B를 비교). 그러나 예비 결과는 줄무늬 혈관에서 외래 형광이 노화 된 gerbils의 샘플에서 나타나지 않았 음을 나타 냈습니다.
차선책으로 처리된 스택의 예는 그림 2에 나와 있습니다. 그림 2A는 오래된 게르빌(36개월)에서 스택의 최대 강도 z-투영을 묘사하며, 여기서 부자연스럽게 구부러지거나 찢어진 IHC는 전체적으로 스캔되지 않았다. 결과적으로, IHC의 정점 및 기저 극 만이 스캔에서 볼 수 있습니다. IHC의 누락 된 중간 부분에 더 많은 시냅스가 위치했기 때문에 신뢰할 수있는 분석이 불가능하다는 것을 배제 할 수 없습니다. 따라서 평가된 모든 IHC가 공초점 스택에서 완전히 스캔되는 것이 중요합니다. 도 2B는 숙성된 게르빌(38개월)에서 샘플링된 스택의 최대 강도 z-프로젝션을 도시한다. 불분명 기원의 형광은 자가형광 소광제로서 높으며, 이 경우에는 사용되지 않았다. 그러나, 외래 형광은 GluA2-표지와 관련된 (적색) 채널에 크게 국한되었으며, 이는 상당히 전형적이다. 이러한 경우, 리본의 CtBP2 라벨이 비교적 깨끗하고 특정한 경우 기능적 시냅스를 세는 것이 여전히 가능할 수 있습니다. 도 2C는 숙성된 게르빌(42개월)로부터 수득된 스택의 최대 강도 z-프로젝션을 도시한다. 여기서, 시냅스는 IHC가 크게 분해되었기 때문에 개별 IHC에 할당될 수 없다; 실제로 얼마나 많은 IHC가 표현되는지 확신하기가 어렵습니다. 도 3A에 도시된 예에서, 휴대 전화는 스캔 동안 공초점 현미경에 근접하여 사용되었다. 줄무늬는 파란색 채널(IHC 레이블)에 표시됩니다. 다행스럽게도이 경우 시냅스 채널에 영향을 미치지 않았으며 IHC의 윗부분에만 영향을 미쳤으므로 분석이 여전히 실행 가능했습니다.
도 3은 면역염색 후 3개월(도 3A,A') 및 29.5개월(도 3B,B')을 획득한 젊은 성인 게르빌로부터 동일한 달팽이관 조각으로부터 채취한 스택의 최대 강도 z-투영을 보여준다. 비교 가능한 상태를 유지하기 위해 이미지는 정확히 동일한 위치 (이전 스캔에서 표백을 겪을 수 있음)가 아니라 동일한 달팽이관 조각에서 촬영되었습니다. 나중 시점에서 스캔을 수행하려면 레이저 파워를 ~ 2 ~ 3 배 증가시켜야했습니다. 그럼에도 불구하고, 라벨이 붙은 구조는 여전히 명확하다. 신호 대 잡음비는 특히 시냅스 후 및 IHC 구조를 표시하는 채널에서 감소한 반면, 시냅스 전 라벨을 가진 채널은 영향을 덜 받았다. IHC 당 기능적 시냅스의 정량화는 여전히 가능하다.
IHC 상의 시냅스 부피 및 위치의 분석에 대한 전형적인 결과는 도 1A에 도시된 공초점 스택을 사용하여 도 4에 예시된다. 개별적으로 정의된 IHC는 각각에 할당된 기능적 시냅스(시냅스 전후 라벨의 공동 현지화에 의해 정의됨)의 유무에 관계없이 서로 다른 색상의 그리드 재구성으로 그래픽으로 표시됩니다. 이 디스플레이는 다양한 시야각을 얻기 위해 3D로 자유롭게 회전할 수 있습니다(그림 4A,B). IHC는 그래픽 디스플레이를 위해 선별될 수도 있습니다(그림 4B). IHC 중심 좌표계 내의 시냅스 부피 분포의 다양한 측면을 보여주는 매우 다양한 데이터 그래프가 생성됩니다 (그림 4C-E의 예). 각 IHC 및 각 시냅스 요소에 대한 원시 정량 데이터는 스프레드 시트로도 사용할 수 있으며, 예를 들어 추가 통계 분석을 위해 여러 공초점 스택에 걸쳐 결합 될 수 있습니다.
그림 1: 성공적으로 처리된 달팽이관의 예. 공초점 스택의 최대 강도 z-돌출부는 (A) 1kHz에 해당하는 달팽이관 위치에서 얻은 젊은 성인 게르빌 (10개월), 및 (B) 500 Hz에 해당하는 달팽이관 위치에서 얻은 숙성된 게르빌 (38개월, 패널 B)로부터의 공초점 스택의 투사이다. IHCs는 myoVIIa (파란색)에 대한 항체로 염색되었고, 시냅스 전 리본은 항-CtBP2 (녹색)로 표지되었고, 및 시냅스 후 글루타메이트 패치를 항-GluA2 (적색)로 표지하였다. 숙성된 게르빌의 달팽이관을 면역염색 후 자가형광 소광기로 처리하였다. 명확성을 위해 IHC의 윤곽선은 파선으로 표시됩니다. 패널 (A') 및 (B')는 패널 (A) 및 (B)로부터 대응하는 달팽이관에서 사각형에 의해 윤곽이 그려진 영역의 확대를 표시한다. 노란색 화살촉은 기능적 시냅스를 가리킵니다. 시냅스 전후 구조를 표시하는 채널(IHC 채널은 아님)은 디컨볼루션을 거쳤습니다. 스케일 막대 = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). 약어: IHC = 내부 모발 세포; myoVIIa = 미오신 VIIa; CtBP2 = C 말단 결합 단백질 2; GluA2 = 이온성 글루타메이트 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 최적이 아닌 처리된 달팽이관의 예. 처리가 최적이 아닌 공초점 스택의 최대 강도 z-투영, (A) 36개월 및 (B, C) 38개월 된 게르빌 및 각각 16kHz, 8kHz 및 32kHz에 해당하는 달팽이관 위치에서. 패널 (A) 및 (C)의 달팽이관이 유래 된 Gerbils는 경심으로 관류되었고, 패널 (C)로부터의 달팽이관은 4 % PFA에서 3 일 동안 추가로 후고정되었다. (B)로부터의 달팽이관을 침지-고정시켜 2일 동안 4% PFA에 고정시켰다. (A) 및 (C)로부터의 달팽이관은 자가형광 소광제로 처리되었다. IHCs를 myoVIIa (파란색)에 대한 항체로 염색하고, 시냅스 전 리본을 항-CtBP2 (녹색)로 표지하고, 시냅스 후 글루타메이트 패치를 항-GluA2 (적색)로 표지하였다. 모든 채널이 해체되었습니다. 밝기 및 콘트라스트는 공초점 스캔 후에 추가로 조정되었다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: PFA = 파라포름알데히드; IHC = 내부 모발 세포; myoVIIa = 미오신 VIIa; CtBP2 = C 말단 결합 단백질 2; GluA2 = 이온성 글루타메이트 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 장기간 보관 후 면역표지의 안정성. 젊은 성인 gerbil (10 개월)로부터의 공초점 스택의 최대 강도 z- 투영은 16kHz 달의 달, (A) 염색 후 3 개월 및 (B) 염색 후 29.5 개월 후에 동일한 달팽이관 조각상의 약간 더 기저 달팽이관 위치에서 촬영했습니다. 달팽이관을 2일 동안 4% PFA에 침지-고정시켰다. 명확성을 위해, (A') 및 (B')는 각각 (A)와 (B)의 사각형으로 표시된 영역으로부터 단지 몇 개의 기능적 시냅스만을 확대한다. IHCs를 myoVIIa (파란색)에 대한 항체로 염색하고, 시냅스 전 리본을 항-CtBP2 (녹색)로 표지하고, 시냅스 후 글루타메이트 패치를 항-GluA2 (적색)로 표지하였다. IHC 채널에 대한 레이저 파워는 1.3% 및 3%, 시냅스 전 채널의 경우 0.4% 및 1.1%, 시냅스 후 채널의 경우 (A) 및 (B)에서 각각 1.1% 및 2%였다. (A)에서 파란색 줄무늬가 IHC의 윗부분에 보이는데, 이는 공초점 현미경에 가까운 곳에서 휴대 전화를 사용했기 때문에 발생합니다. 스케일 바 = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). 약어: PFA = 파라포름알데히드; IHC = 내부 모발 세포; myoVIIa = 미오신 VIIa; CtBP2 = C 말단 결합 단백질 2; GluA2 = 이온성 글루타메이트 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: 시냅스 부피의 정량화의 대표적인 결과 . (A) 열 IHCs는 myoVIIa 면역표지에 기초한 상이한 착색된 격자 재구성으로서 도시된다. 공국소화된 CtBP2-(녹색) 및 GluA2 표지된 요소(적색)에 의해 정의된 이들의 관련 기능적 시냅스는 명확성을 위해 IHC와 함께 그리고 또한 별도로 아래에 표시된다. 화각은 IHC의 장축에 수직으로 선택되었으므로 원래 공초점 이미지와 다릅니다(그림 1A). (B) IHC 중 하나를 골라 90 ° 회전시킨 것으로 나타났습니다. 검은 색 평면은 사용자가 수동으로 정의하고 IHC를 기둥 - 모디올라 축을 따라 이분합니다. (C) 각각의 IHC의 정규화된 세 축을 기준으로 이 공초점 스택에서 모든 기능적 시냅스의 위치를 보여주는 버블 플롯. 기호의 크기는 시냅스 전 요소의 볼륨에 비례합니다. 화각은 패널 (B)과 유사하도록 선택되었습니다. (D) 시냅스 요소의 정규화 된 부피의 Boxplot은 기능성 시냅스의 사전 시냅스 (왼쪽 2 상자) 및 시냅스 후 파트너 (오른쪽 2 상자)에 대해 별도로 분리되고 각각의 IHC (다른 색상)의 모디올라 또는 기둥 절반에서의 위치에 따라 더 분리됩니다. 상자는 사분위수 범위를 나타내며 중앙값은 선으로 표시됩니다. 파선 수염은 사분위수 범위의 1.5 배를 나타내며 십자가는 그 이상의 외곽 값을 나타냅니다. (E) 기능적 시냅스의 시냅스 전 대 시냅스 후 파트너의 정규화된 부피의 산점도. 상이한 기호들은 각각의 IHC의 모디올라 또는 기둥 반쪽에서의 위치를 나타낸다. 약어: IHC = 내부 모발 세포; myoVIIa = 미오신 VIIa; CtBP2 = C 말단 결합 단백질 2; GluA2 = 이온성 글루타메이트 수용체. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1: 길이가 다른 달팽이관에서 특정 목표 주파수와 동일한 정점으로부터의 거리. 등가 최적 주파수는 뮐러(25)에 의해 주어진 방정식에 기초하여 계산되었다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜에 설명 된 방법을 사용하면 젊은 성인 및 노인 게르빌의 달팽이관에서 IHC 및 시냅스 구조를 면역표지하고, 시냅스 전후 및 사후 시냅스 요소의 공동 국소화를 통해 추정 된 기능적 시냅스를 확인하고, 개별 IHC에 할당하고, 수, 부피 및 위치를 정량화 할 수 있습니다. 이 접근법에 사용된 항체는 또한 외부 모발 세포 (OHCs; myoVIIa) 및 그들의 시냅스 전 리본을 표지하였다. 또한, IHC와 OHC 모두의 면역 표지에 대한 실행 가능한 대안은 오토 페린에 대한 항체이며, OHC는 IHC보다 훨씬 희미하게 보입니다.
관류는 두 가지 다른 설정을 사용하여 수행될 수 있다. 1) 상업용 드립 라인을 먹이는 단일 병이 동물 위 약 1.5m 높이의 풀리 휠에 매달려있는 중력 공급 드립 라인 시스템. 유체는 상단에서 열려있는 병을 낮춘 후에 연속적으로 도입됩니다. 2) 디지털 가변 속도 연동 펌프를 사용하는 시스템으로, 한쪽 끝에는 얇고 긴 튜브가 열려 유체를 흡입하고 다른 쪽 끝에서 쉽게 부착 할 수있는 바늘을 사용합니다. 둘 다 똑같이 잘 작동하며, 미묘한 차이점은 여기에서 자세히 설명되지 않습니다. 그러나 저자는 특히 천공 된 플랫폼에 동물과 아래에 그려진 연기가있는 다운 드래프트 스타일의 워크 벤치를 권장합니다. 이것은 배기 기능을 손상시키지 않고 수술 영역에 잘 접근 할 수있게합니다 (개방 된 흄 캐비닛에서 작업하는 것과 달리).
그렇지 않으면 감각 상피가 해부 중에 분리되고 분해되기 때문에 조직의 적절한 고정이 매우 중요합니다. 게르빌에서, 일반적으로 사용되는 것보다 고정제에 대한 더 장기간의 노출이 필요하다(예를 들어, 마우스17,27,13 또는 기니피그(28)의 경우). 게르빌스에 대한 바람직한 방법은 동물의 죽음 및 적어도 1.5 일 동안 침지 고정 후 달팽이관을 신속하게 추출하는 것입니다. 심혈관 관류가 선호되는 경우, 고정이 몇 분 안에 설정되고 잘 진행되는 것이 중요합니다. 관류 중에 궁극적으로 고정의 질을 평가하는 것이 어려울 수 있기 때문에 설명 된대로 달팽이관을 일상적으로 게시하는 것이 좋습니다.
세척 단계를 준수하는 것이 중요하며, 이에 따라 마지막 세척 단계 (단계 2.7)가 가장 중요합니다. 적절하게 씻지 않으면 조직이 끈적 거리며 해부 도구에 달라 붙어 해부하기가 어렵습니다. 또한 비특이적 형광을 줄이기 위해 노화 된 게르빌에서 수확 한 달팽이관에 자기 형광 소광제를 사용하는 것이 좋습니다. 자가 형광은29,30,31 세의 동물의 조직에서 흔히 볼 수있는 리포 푸신 (lipofuscin)에서 유래 할 수 있으며 광범위하게 흥분하고 광범위하게 방출되는 것으로 보입니다. UV 스펙트럼 (λ = 364 nm)에서 파장으로 여기될 때, 리포푸신은 넓은 방출 범위 (λ = 400-700 nm, ~λ = 568 nm에서 최대)32를 갖는다. 인간 심근 조직에서, 리포푸신은 λ = 555 nm의 여기 및 λ = 605 nm33의 방출로 보인다. 유사하게, 게르빌스의 IHCs에서, 저자들은 AF568 항체에 사용되는 채널에서 비특이적 형광의 증가를 가장 두드러지게 발견했는데, 이는 리포푸신 과립으로부터의 자가형광을 시사한다. 따라서 동물로부터의 조직으로 작업할 때 일반적인 권장 사항은 가장 중요하지 않은 면역 표지를 위해 약 550-600nm의 여기 대역폭을 사용하는 것입니다.
전체 달팽이관 길이의 측정과 특정 달팽이관 위치의 정확한 식별은 전체 길이가 보존 된 경우에만 가능합니다. 감각 상피의 일부가 해부에서 손실되면 나머지 부분 또는 나선형 신경절 조각 만 장착하고 자세한 메모를 유지하는 것이 좋습니다. 그런 다음 일반적으로 누락 된 섹션을 합리적인 정확도로 추정 할 수 있습니다. 달팽이관의 정점 부분이 완전히 보존되었지만 기저 끝이 누락 된 경우, 실제 값과의 편차가 작기 때문에 사용 된 게르빌 집단 내의 중간 달팽이관 길이를 기준으로 위치를 계산하여 정점 부분의 특정 달팽이관 위치를 정의 할 수 있습니다.
시냅스 부피 정량화의 중요한 한계는 결과 절대 볼륨이 다른 공초점 스택에서 비교할 수 없다는 것입니다. 시냅스 요소의 결과 부피를 결정하는 중요한 단계는 초기 검출을위한 강도 임계 값을 선택하는 것입니다. 그러나, 이러한 강도 임계치의 선택은 현재 프로토콜에서 사용자와 다른 많은 것들(3,27,34)에 의해 주관적으로 이루어진다. 또한, 공초점 이미지에서 면역 형광의 밝기는 조직 두께, 광학 경로에 대한 조직의 방향, 레이저 노출 지속 시간, 정확한 공초점 및 디컨볼루션 설정과 같은 표본 전반에 걸쳐 표준화하기가 매우 어려운 많은 요인에 따라 달라집니다. 이러한 모든 경고는 노화 된 게르빌의 전형적 인 것처럼 희귀 물질이 상당한 기간 동안 획득되면 악화됩니다. 즉, 이는 편향이 풀링된 데이터에서 제외하기가 매우 어렵다는 것을 의미하며, 가장 좋은 시나리오는 분산이 높은 데이터 세트입니다. 따라서 Liberman et al.3에 의해 도입 된 바와 같이 개별 공초점 스택의 각 중간 부피로 시냅스 부피를 일상적으로 정규화하는 것이 좋습니다. 명백한 단점은 시냅스 볼륨이 주어진 이미지 스택 내에서만 비교할 수 있다는 것입니다 (예 : IHC 상의 다른 위치 사이에서, 그러나 다른 달팽이관 위치 또는 표본 연령 간에는 비교할 수 없습니다.
시냅스 전후 구조의 이중 표지와 공동 현지화의 요구 사항은 어느 라벨을 단독으로 사용하는 것보다 기능적 시냅스의 수를 더 신뢰할 수 있게 추정할 수 있게 합니다. 하나의 라벨 만 가능하다면 두 가지 이유로 AF488 또는 유사한 파장 특이성을 가진 형광 태그에 결합 된 시냅스 전 항 CtBP2를 사용하는 것이 좋습니다. 첫째, 고아 리본, 즉 공동 현지화 된 시냅스 후 라벨이없는 CtBP2 라벨 요소는 희귀 한것으로 보이며 저자들은 노인 게르빌에 대해이를 확인했습니다. 따라서, 시냅스 후 파트너와의 공동 현지화를 검증할 수 없어서 발생하는 오류는 작다. 그러나 소음에 노출 된 귀를 검사 할 때 이것이 더 중요한 문제가된다는 점에 유의해야합니다 (예 : 28). 둘째, 불분명 기원의 높은 형광 신호를 갖는 경우, 잡음은 전형적으로 약 568 nm 주위의 여기 파장을 사용하여 채널에 가장 큰 영향을 미쳤다 ( 도 2B의 예, GluA2 라벨을 나타냄). 이러한 소음의 적어도 일부는, 노화된 동물로부터의 조직에서, 리포푸신 자가형광일 수 있다. 따라서 깨끗하고 단일 CtBP2 방지 라벨의 기회를 극대화하려면이 파장 채널을 피하는 것이 좋습니다. 마지막으로, 적절한 시원하고 어두운 저장 조건에서, 여기에 사용된 면역 표지는 장기간에 걸쳐, 적어도 2.5년까지 안정하다는 것을 보여주었고(그림 3B), 이는 노화된 게르빌과 같은 귀중한 조직의 재평가를 가능하게 한다.
IHC 구심성 시냅스 수의 정량화는 많은 맥락에서 말초 청각 시스템의 상태를 평가하기위한 중요한 지표가되었으며, 그 중에서도 연령 관련 청력 손실이 있습니다. 현재 공개된 다양한 프로토콜이 있다(예를 들어, 게르빌 21, 마우스17,13, 기니피그 10,28, 및 인간35). 여기에 설명 된 방법은 세부 사항에서 젊은 성인과 노인 gerbils에 특정하지만 다른 종에서도 사용할 수있는 몇 가지 일반적인 권장 사항이 파생되었습니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
저자들은 Lichun Zhang이 이미징 시설의 사용을 위해 Oldenburg의 Carl von Ossietzky University of Oldenburg의 Fluorescent Microscopy Service Unit과 방법을 수립하는 데 도움을 준 것을 인정합니다. 이 연구는 독일의 우수성 전략 -EXC 2177/1에 따라 Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation)가 자금을 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
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