Summary
Un protocole pour le traitement des cochlées de gerbilles jeunes adultes et âgées par immunomarquage des structures synaptiques afférentes et des cellules ciliées, extinction de l’autofluorescence dans les tissus âgés, dissection et estimation de la longueur des cochlées et quantification des synapses dans des piles d’images obtenues par imagerie confocale est présenté.
Abstract
La perte de synapses ruban reliant les cellules ciliées internes et les fibres nerveuses auditives afférentes est supposée être l’une des causes de la perte auditive liée à l’âge. La méthode la plus courante pour détecter la perte de synapses rubanées est l’immunomarquage, car elle permet un échantillonnage quantitatif à partir de plusieurs emplacements tonotopiques dans une cochlée individuelle. Cependant, les structures d’intérêt sont enfouies profondément à l’intérieur de la cochlée osseuse. Les gerbilles sont utilisées comme modèle animal pour la perte auditive liée à l’âge. Ici, les protocoles de routine pour la fixation, l’immunomarquage des montures entières cochléaires de gerbille, l’imagerie confocale et la quantification du nombre et des volumes de synapses du ruban sont décrits. En outre, les défis particuliers associés à l’obtention de bons matériaux auprès de personnes vieillissantes précieuses sont mis en évidence.
Les gerbilles sont euthanasiées et perfusées cardiovasculairement, ou leurs bulles tympaniques sont soigneusement disséquées hors du crâne. Les cochlées sont ouvertes à l’apex et à la base et directement transférées au fixateur. Quelle que soit la méthode initiale, les cochlées sont postfixées puis décalcifiées. Le tissu est ensuite marqué avec des anticorps primaires contre les structures pré- et postsynaptiques et les cellules ciliées. Ensuite, les cochlées sont incubées avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence qui sont spécifiques contre leurs anticorps primaires respectifs. Les cochlées des gerbilles âgées sont ensuite traitées avec un quencher à autofluorescence pour réduire la fluorescence de fond généralement importante des tissus des animaux plus âgés.
Enfin, les cochlées sont disséquées en 6 à 11 segments. Toute la longueur cochléaire est reconstruite de manière à ce que des emplacements cochléaires spécifiques puissent être déterminés de manière fiable entre les individus. Les piles d’images confocales, acquises séquentiellement, aident à visualiser les cellules ciliées et les synapses aux endroits choisis. Les piles confocales sont déconvolvées et les synapses sont soit comptées manuellement à l’aide d’ImageJ, soit une quantification plus étendue des structures synaptiques est effectuée avec des procédures d’analyse d’images écrites sur mesure dans Matlab.
Introduction
La perte auditive liée à l’âge est l’une des maladies les plus répandues au monde qui touche plus d’un tiers de la population mondiale âgée de 65 ans et plus1. Les causes sous-jacentes sont encore débattues et activement étudiées, mais peuvent inclure la perte des synapses spécialisées reliant les cellules ciliées internes (IHC) aux fibres nerveuses auditives afférentes2. Ces synapses rubanées comprennent une structure présynaptique qui a des vésicules remplies du neurotransmetteur glutamate attaché à elle, ainsi que des récepteurs postsynaptiques α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique acide (AMPA) glutamate 3,4,5. Dans la gerbille, ~ 20 fibres nerveuses auditives afférentes entrent en contact avec un IHC 6,7,8. Les fibres de l’IHC faisant face au modiolus s’opposent aux grands rubans synaptiques, tandis que les fibres se connectant du côté pilier de l’IHC font face à de petits rubans synaptiques (c’est-à-dire chez les chats9, les gerbilles7, les cochons d’Inde10 et les souris 3,11,12,13,14). De plus, chez la gerbille, la taille des rubans présynaptiques et des patchs de glutamate postsynaptique est positivement corrélée 7,14. Les fibres qui s’opposent aux grands rubans du côté modiolaire de l’IHC sont de petit calibre et ont de faibles taux spontanés et des seuils élevés15. Il existe des preuves que les fibres à faible taux spontané sont plus vulnérables à l’exposition au bruit10 et aux médicaments ototoxiques16 que les fibres à faible seuil spontanées élevées, qui sont situées du côté pilier des IHC15.
La perte de synapses rubanées est le premier événement dégénératif de la perte auditive liée à l’âge du neural cochléaire, tandis que la perte de cellules ganglionnaires en spirale et de leurs fibres nerveuses auditives afférentes est à la traîne par rapport à17,18. Les corrélats électrophysiologiques comprennent les enregistrements des réponses auditives du tronc cérébral17 et des potentiels d’actioncomposés 8; cependant, ceux-ci ne reflètent pas les subtilités de la perte de synapses, car les fibres à faible taux spontané ne contribuent pas à ces mesures16. Les mesures électrophysiologiques les plus prometteuses sont l’indice neuronal dérivé du potentiel de masse19 et la réponse temporelle du péristimulus20. Cependant, ceux-ci ne sont fiables que si l’animal n’a pas d’autres pathologies cochléaires, au-delà de la perte de fibres nerveuses auditives, qui affectent l’activité des fibres nerveuses auditives restantes8. De plus, les seuils évalués comportementalement chez la gerbille n’étaient pas corrélés avec les nombres de synapses21. Par conséquent, une quantification fiable des synapses ruban survivantes et, par conséquent, du nombre de fibres nerveuses auditives fonctionnelles n’est possible que par un examen direct du tissu cochléaire.
La gerbille mongole (Meriones unguiculatus) est un modèle animal approprié pour étudier la perte auditive liée à l’âge. Il a une courte durée de vie, a une audition à basse fréquence similaire à celle des humains, est facile à entretenir et présente des similitudes avec les pathologies humaines liées à la perte auditive liée à l’âge 2,22,23,24. Les gerbilles sont considérées comme âgées lorsqu’elles atteignent l’âge de 36 mois, soit vers la fin de leur durée de vie moyennede 22 ans. Il est important de noter qu’une perte de synapses rubans liée à l’âge a été démontrée chez des gerbilles élevées et vieillies dans des environnements calmes 8,21.
Ici, un protocole pour immunomarquer, disséquer et analyser les cochlées de gerbilles d’âges différents, des jeunes adultes aux personnes âgées, est présenté. Des anticorps dirigés contre des composants de la presynapse (CtBP2), des patchs de récepteurs postsynaptiques du glutamate (GluA2) et des IHC (myoVIIa) sont utilisés. Un quencher d’autofluorescence est appliqué qui réduit le fond dans les cochlées vieillies et laisse le signal de fluorescence intact. En outre, une description est donnée de la façon de disséquer la cochlée pour examiner à la fois l’épithélium sensoriel et la stria vascularis. La longueur cochléaire est mesurée pour permettre la sélection d’emplacements cochléaires distincts qui correspondent aux meilleures fréquences spécifiques25. La quantification des nombres synaptiques est réalisée avec le logiciel gratuit ImageJ26. Une quantification supplémentaire des volumes et des emplacements des synapses au sein du HC individuel est effectuée à l’aide d’un logiciel personnalisé écrit en Matlab. Ce logiciel n’est pas mis à la disposition du public, car les auteurs n’ont pas les ressources nécessaires pour fournir une documentation et un support professionnels.
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Protocol
Tous les protocoles et procédures ont été approuvés par les autorités compétentes de Basse-Saxe (Allemagne), avec les numéros de permis AZ 33.19-42502-04-15/1828 et 33.19-42502-04-15/1990. Ce protocole s’applique aux gerbilles mongoles (M. unguiculatus) des deux sexes. Jeune adulte se réfère à l’âge de 3-12 mois, tandis que les gerbilles sont considérées comme âgées à 36 mois et plus. Sauf indication contraire, les tampons et les solutions peuvent être préparés et conservés au réfrigérateur jusqu’à plusieurs mois (4-8 °C). Avant utilisation, assurez-vous que les tampons et les solutions n’ont pas précipité.
1. Fixation et prélèvement d’organes
REMARQUE: Si seules les cochlées sont nécessaires, il est recommandé d’effectuer la procédure un peu plus simple de fixation par immersion. Cependant, si un cerveau bien préservé est également nécessaire, la perfusion transcardique est la seule option. Dans les deux cas, le fixateur est de 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Celui-ci doit être fraîchement préparé mais peut être conservé congelé jusqu’à utilisation. Utilisez des aliquotes d’environ 300 mL pour une perfusion transcardique ou d’environ 50-100 mL par cochlée pour la fixation par immersion.
ATTENTION : Le PFA est une substance dangereuse; manipulez-le conformément aux procédures générales de sécurité du laboratoire.
- Fixation par perfusion transcardique
- Rincez la configuration de perfusion jusqu’à ce que le tube soit exempt de bulles d’air. Remplissez le tube de perfusion avec du PBS contenant de l’héparine (0,2 mL dans 100 mL de PBS) pour éviter la coagulation du sang. Arrêtez le flux une fois que le tube est rempli de PBS et que la bouteille de stockage de liquide vient de se vider; versez-y 200 mL de PFA décongelé.
REMARQUE: La configuration est maintenant prête pour l’animal. Le PBS restant dans le tube est suffisant pour rincer le sang et sera automatiquement suivi par le fixateur une fois le flux repris. - S’assurer qu’un système de collecte des déchets est en place pour l’écoulement des PFA. Utilisez une canule fraîche (19 G) et ayez de gros ciseaux, une pince (avec une pointe aplatie), des hémostats, un scalpel ou une canule pointue et un tapis en caoutchouc avec des épingles à portée de main.
- Euthanasier la gerbille avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL par animal, poids corporel : 50-120 g). Remettez l’animal dans sa cage. Lorsque l’arrêt respiratoire s’installe de telle sorte que la respiration devient irrégulière avec des intervalles de 30 s ou plus, placez la gerbille sur son dos sur le tapis en caoutchouc et fixez les deux pattes avant et une patte arrière avec des épingles (laissez une patte arrière libre de bouger pour un meilleur jugement du succès de la perfusion; voir note après l’étape 1.1.7).
- Pour ouvrir la cavité thoracique, soulevez la peau au-dessus du sternum avec une pince et coupez la peau à environ 0,5 cm sous le sternum avec des ciseaux jusqu’à ce que le processus xiphoideus de couleur blanche soit visible. Tenez le sternum au niveau du processus xiphoideus avec une pince et coupez le long du diaphragme pour avoir une bonne vue dans la cavité thoracique. Coupez les côtes latéralement des deux côtés jusqu’à ce qu’il y ait un bon accès au cœur. Assurez-vous que l’angle des ciseaux est parallèle et plat par rapport au corps de la gerbille pour éviter d’endommager les organes et, ainsi, assurer un système circulatoire fermé.
- Serrez un hémostat sur le sternum, soulevez la cage thoracique et placez l’hémostat sur l’épaule de la gerbille sans reposer l’hémostat sur aucune partie du corps pour éviter de bloquer le flux sanguin.
- Ouvrez légèrement le flux de fluide jusqu’à ce qu’une goutte de PBS s’écoule de la canule (19 G) environ toutes les 2 s. Tenez le cœur avec une pince et tournez-le un peu vers la gauche de sorte que le ventricule gauche puisse être clairement vu. Insérez la canule dans le ventricule gauche à un angle qui évite de pénétrer dans le septum. Tenez l’aiguille en place à la main ou avec un autre hémostat.
REMARQUE: Les ventricules gauche et droit peuvent être différenciés par leurs différentes teintes de couleur; le ventricule gauche semble de couleur plus claire que le reste du tissu cardiaque. - Augmentez lentement la pression de l’écoulement du fluide et ouvrez l’oreillette droite avec de fins ciseaux, un scalpel ou une autre canule. Ouvrez davantage le débit de fluide jusqu’à ce qu’environ 2-3 gouttes / s soient observées à la chambre d’égouttement, ou réglez un débit de 4 mL / min pour la pompe. Une fois que la fixation du cœur s’installe, assurez-vous que la canule de perfusion reste en place sans être maintenue plus loin.
REMARQUE: Les signes d’une perfusion réussie sont des contractions musculaires lentes, un raidissement du cou et des extrémités, une pâleur du foie et des poumons roses. Le signe d’une perfusion infructueuse est un blanchiment des poumons, ce qui indique que la circulation pulmonaire est perfusée en raison de la ponction du septum. - En cas d’échec de la perfusion, essayez de déplacer la canule plus haut, dans l’aorte, et serrez-la en place avec un hémostat.
- Décapiter la gerbille. Retirez les bulles et coupez et détachez son os comme décrit à l’étape 1.2.2.
REMARQUE: Si le tissu n’est pas suffisamment fixé, l’épithélium sensoriel se délogera de l’organe de Corti pendant la dissection. - Si la perfusion ne montre aucun signe de fixation dans les 5-10 minutes, abandonnez-la et suivez immédiatement la procédure ci-dessous pour la fixation par immersion. Pour cela, traiter la cochlée comme à l’étape 1.2.2 et postfixer le tissu dans environ 50-80 mL de PFA à 4% dans des récipients à bouchon à vis pendant 1-2 jours sur un agitateur 2D à 8 ° C.
REMARQUE: Comme il peut être difficile d’évaluer la qualité de la fixation pendant la perfusion, il est recommandé de postfixer régulièrement les cochlées comme décrit.
- Rincez la configuration de perfusion jusqu’à ce que le tube soit exempt de bulles d’air. Remplissez le tube de perfusion avec du PBS contenant de l’héparine (0,2 mL dans 100 mL de PBS) pour éviter la coagulation du sang. Arrêtez le flux une fois que le tube est rempli de PBS et que la bouteille de stockage de liquide vient de se vider; versez-y 200 mL de PFA décongelé.
- Fixation par immersion tissulaire
- Euthanasier les gerbilles avec un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL par animal, poids corporel : 50-120 g). Lorsque la gerbille a cessé de respirer, décapiter l’animal.
- Retirez les bulles et coupez et détachez son os avec des ciseaux et des pinces, respectivement, pour atteindre les cochlées. Retirez le maellus, l’incus et les canaux semi-circulaires. Faites de petits trous à l’apex et dans le virage basal en grattant soigneusement l’os cochléaire avec une pince. Transférer immédiatement les bulles dans un excès de fixateur froid (au moins 50 mL) et fixer le tissu dans le froid (4-8 °C) sous agitation douce (agitateur 2D [100 tr/min]) pendant 2 jours.
REMARQUE: Après avoir fixé le tissu, les cochlées peuvent être traitées immédiatement ou stockées dans du PBS avec de l’azoture de sodium à 0,05%. ATTENTION : L’azoture de sodium est toxique. Notez que la durée de stockage peut influencer négativement la qualité de la coloration. Des essais limités ont suggéré que l’immunocoloration semblait plus faible après 2 ans de stockage du tissu dans l’azoture de sodium.
2. Préparation tissulaire et immunomarquage
- Dissoudre la poudre d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS pour produire une solution de 0,5 M à pH 8. Pour cela, placez un bécher sur un agitateur magnétique, remplissez-le d’environ la moitié de la quantité totale de PBS et ajoutez la quantité appropriée de poudre d’EDTA, ce qui donne une suspension acide. Ajoutez soigneusement une solution concentrée d’hydroxyde de sodium (NaOH) tout en surveillant le pH avec un pH-mètre. Remplissez de PBS jusqu’au volume final souhaité et filtrez la solution pour éviter toute contamination microbienne.
REMARQUE: La poudre d’EDTA ne se dissout complètement qu’une fois que la suspension a atteint une valeur de pH neutre. - Pour la décalcification, transférer la cochlée à 80 mL de 0,5 M EDTA dans le PBS. Incuber le tissu dans le froid (4-8 °C) sous une agitation douce sur le shaker 2D (100 tr/min) pendant 2 jours.
REMARQUE: Après l’étape de décalcification, le tissu peut être stocké dans PBS pendant plusieurs jours jusqu’à 3 semaines avant de poursuivre les étapes de traitement restantes. Pour les anticorps qui marquent la stria vascularis, il est conseillé de couper les cochlées en deux le long de l’axe modiolar à ce stade (c’est-à-dire avant l’immunocoloration) pour assurer un accès uniforme des anticorps à leurs cibles respectives. Ceci est dépendant des anticorps et ne s’applique pas aux anticorps utilisés ici pour marquer les structures synaptiques et les IHC. Utilisez un morceau de lame de rasoir cassable et un porte-lame (comme décrit à l’étape 4.2) pour la coupe. - Effectuez les étapes suivantes (jusqu’à l’étape 3.2) dans des tubes de réaction à joint sûr de 2 mL. Si le morceau de tissu est trop grand pour tenir à l’intérieur du tube, coupez l’excès de tissu avec des ciseaux. Pour améliorer la pénétration des anticorps, perméabilisez d’abord le tissu dans 1 mL de triton à 1% (Triton X-100) dans le PBS sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante pendant 1 h. Lavez le tissu 3x avec 1 mL de triton à 0,2% (Triton X-100) en PBS sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante pendant 5 min chacun.
- Pour bloquer les antigènes non spécifiques, incuber la cochlée dans 1 mL de solution bloquante (albumine sérique bovine à 3 % [BSA], 0,2 % de triton, dans du PBS) sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante pendant 1 h.
REMARQUE: La solution de blocage peut être préparée à l’avance, mais ne doit pas dater de plus de ~ 10 jours. - Diluer les anticorps primaires suivants fraîchement dans la même aliquote de solution bloquante : anti-myoVIIa (myosine VIIa) pour marquer les IHC (IgG polyclonal rabbit), dilué 1:400 ; anti-CtBP2 (protéine de liaison C-terminale 2) pour marquer les rubans présynaptiques (souris monoclonale IgG1), dilués à 1:400; et anti-GluA2 pour marquer les patchs récepteurs postsynaptiques (souris monoclonale IgG2a), dilués à 1:200. Assurez-vous que les cochlées sont entièrement recouvertes de la solution d’anticorps (généralement 0,4 mL) et incubez-les à 37 °C pendant 24 h.
- Ensuite, lavez le tissu 5x avec 0,2% de triton en PBS sur le shaker 2D (100 tr / min) à température ambiante pendant 5 minutes chacun. Choisissez des anticorps secondaires correspondant aux espèces hôtes de leurs homologues primaires et les diluez à nouveau fraîchement dans 3% de BSA, 0,2% de triton, dans PBS: chèvre anti-souris (IgG1)-Alexa fluorophore (AF) 488, dilué 1:1 000; chèvre anti-souris (IgG2a)-AF568, dilué 1:500; et âne anti-lapin-AF647 (IgG), dilué 1:1 000. Enveloppez le tube dans du papier d’aluminium pour éviter le blanchiment de la fluorescence. Incuber la cochlée dans 0,4 mL de solution d’anticorps secondaires à 37 °C pendant 24 h.
NOTE: Des essais limités ont indiqué que l’incubation du tissu cochléaire à 37 ° C pendant 24 h avec des anticorps primaires et secondaires a entraîné une immunocoloration plus brillante que la procédure d’incubation plus courante avec des températures plus basses et des durées plus courtes. - Lavez les cochlées 2x avec 1 mL de triton à 0,2% dans PBS pendant 5 min chacune et 3x avec PBS pendant 5 min chacune sur le shaker 2D (100 tr/min) à température ambiante.
REMARQUE: Après ces étapes de lavage, les cochlées peuvent rester dans pbS dans le réfrigérateur à ~ 4 ° C pendant plusieurs jours.
3. Traitement avec quencher à autofluorescence (facultatif)
REMARQUE: Les cochlées des gerbilles d’âge moyen et âgées présentent une autofluorescence de fond étendue. Dans les tissus des jeunes adultes, un traitement avec un quencher d’autofluorescence n’est pas nécessaire. Il est, en principe, possible d’appliquer le quencher d’autofluorescence avant la procédure d’immunocoloration, ce qui évite alors toute réduction accidentelle de la fluorescence d’anticorps souhaitée. Cependant, selon la fiche technique du fabricant, l’utilisation de détergents (tels que Triton X-100 dans le protocole actuel) n’est plus possible car ils éliminent le quencher du tissu.
- Coupez les cochlées en deux sous un stéréomicroscope, comme décrit à l’étape 4.2.
- Mélanger le quencher d’autofluorescence avec de l’éthanol à 70% pour obtenir une solution à 5% et incuber la cochlée dans cette solution sur le shaker 2D à température ambiante pendant 1 min. Lavez les cochlées 3x avec 1 mL de PBS sur le shaker 2D à température ambiante pendant 5 min chacune.
ATTENTION : Le quencher à autofluorescence est dangereux et nocif. Portez des gants lorsque vous manipulez cette substance.
4. Dissection finale de l’amende
- Disséquez la cochlée sous un stéréomicroscope. Remplissez une boîte de Petri en polystyrole et son couvercle avec du PBS et gardez à portée de main deux pinces fines, des ciseaux à ressort Vannas, un porte-lame et une lame de rasoir cassable. Cassez les morceaux de la lame de rasoir pour obtenir une surface de coupe d’environ 2-4 mm en fonction de l’étape de dissection. Préparez une lame de microscope en plaçant trois gouttes de support de montage à la suite.
REMARQUE: La surface de coupe de la lame de rasoir s’estompe rapidement. La lame doit être échangée après dissection et montage d’environ une pièce sur deux de la cochlée. - Si ce n’est pas déjà fait à l’étape 3.1, coupez d’abord la cochlée en deux le long du modiolus sous un stéréomicroscope. Pour cela, positionnez un morceau d’une lame de rasoir plus long que la longueur enroulée de la cochlée dans un support de lame. Placez la cochlée dans la boîte de Pétri et coupez l’excès de tissu avec le morceau de lame de rasoir. Maintenez la cochlée en place avec une pince fine et coupez-la en deux le long du modiolus.
- Commencez par une moitié, mais laissez également l’autre moitié dans la boîte de Pétri. Fixez soigneusement la moitié cochléaire avec une pince de telle sorte que le bord de coupe soit tourné vers le haut. Utilisez de fins ciseaux à ressort pour couper l’os de la cochlée au-dessus de l’hélicotréma, recouvrant l’apex.
- Pour commencer la séparation des pièces cochléaires, isolez le tour du milieu en coupant avec des ciseaux à travers le modiolus et le nerf auditif, au-dessus (scala vestibuli) et en dessous (scala tympani).
- Couper à travers l’os cochléaire recouvrant la stria vascularis dans le canal cochléaire. Faites deux coupures des deux côtés de l’os cochléaire au-dessus de l’organe de Corti et le long de la stria vascularis et utilisez la lame de rasoir pour éventuellement séparer les morceaux cochléaires.
REMARQUE: La stria vascularis est facilement visible sous la forme d’une bande sombre. Couper le long de la stria vascularis laisse l’organe de Corti intact. - Facultatif: Pour recueillir la stria vascularis, coupez soigneusement entre l’organe de Corti et la stria vascularis pour séparer les deux. Laissez la stria vascularis reliée au ligament spiralé (attaché à l’os recouvrant la surface externe de la cochlée) et retirez l’os décalcifié à l’aide d’une pince. Placez la pièce avec le côté stria vers le haut sur la lame du microscope dans une goutte de support de montage.
REMARQUE: Si la pièce collectée est incurvée trop fortement, il peut être nécessaire de la diviser en morceaux plus petits pour qu’elle soit suffisamment plate pour être montée sur la glissière. - Transférez les pièces cochléaires dans le couvercle rempli de PBS de la boîte de Petri en polystyrole, en veillant à ce que les supports entiers cochléaires soient aussi plats que possible sur la glissière. Enlevez l’excès de tissu, comme les parties du ligament spiralé du côté abneural et les parties du limbe spiralé du côté neuronal. Retirez soigneusement la membrane tectoriale avec une pince super fine.
- Placez les pièces cochléaires sur la glissière dans une goutte de support de montage. Placez les supports entiers cochléaires avec l’organe de Corti tourné vers le haut sur la glissière pour éviter d’obscurcir les IHC dans le chemin optique pour l’imagerie. Recherchez l’invagination du limbe spiralé à proximité des IHC, qui est visible en déplaçant la pièce cochléaire dans le plan sagittal pour identifier le côté à faire face vers le haut.
REMARQUE: Pour reconstruire numériquement la cochlée complète à partir de ses pièces individuelles lors d’un traitement ultérieur, il est fortement recommandé de documenter les croquis des pièces et de noter les points de repère. De plus, les pièces doivent idéalement être disposées dans le bon ordre sur la diapositive. - Répétez les étapes 4.3 à 4.8 jusqu’à ce que la cochlée entière soit transférée sur la lame du microscope. Si nécessaire, ajoutez plus de support de montage, remettez la glissière et scellez la glissière en place avec du vernis à ongles noir peint sur les bords. Laissez sécher dans l’obscurité à température ambiante, puis conservez la lame dans l’obscurité à 4 °C.
REMARQUE: Même si des parties de l’épithélium sensoriel lui-même sont accidentellement perdues, il est important de monter néanmoins ce qui reste de la pièce cochléaire pour une estimation correcte de la longueur.
5. Mesure de la longueur cochléaire
- Mesurez la longueur de la cochlée à partir d’images en champ clair de ses pièces à l’aide d’un système de microscope à épifluorescence et d’un logiciel associé. Enregistrez les images à faible grossissement (objectif 4x) de chaque pièce cochléaire et utilisez l’outil de mesure du lasso du logiciel de microscope pour tracer une ligne le long de la rangée d’IHC dans chacune des images. Calculez la longueur totale en ajoutant les longueurs de toutes les pièces.
REMARQUE: Lorsque des parties de l’épithélium sensoriel sont manquantes dans une pièce cochléaire, interpolez la ligne. - Pour définir les emplacements cochléaires à analyser dans une cochlée individuelle, calculez leurs distances correspondantes par rapport à l’apex à l’aide de l’équation donnée par Müller25. Marquez ces emplacements, par exemple, sur une impression des pièces cochléaires.
6. Acquisition d’images avec un microscope confocal
- Utilisez un microscope confocal avec un objectif 40x à immersion dans l’huile (ouverture numérique 1.3) et l’huile appropriée pour l’imagerie haute résolution.
REMARQUE: Si le microscope confocal a un chemin de lumière inversé, la lame doit être positionnée à l’envers. Dans ce cas, donnez à l’échantillon environ 30 minutes pour couler et reposez-vous de manière stable sur le couvercle avant de commencer le balayage final. Alternativement, utilisez un milieu de montage qui est fluide pendant toute la durée de la dissection, mais qui se solidifie plus tard et conserve simultanément la fluorescence. - Activez les lasers appropriés : deux lasers à semi-conducteurs à pompage optique avec des longueurs d’onde de λ = 488 nm et λ = 522 nm, et un laser à diode avec une longueur d’onde de λ = 638 nm sont utilisés dans ce protocole. Choisissez la plage d’émission des étiquettes de fluorescence (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Lorsqu’un détecteur hybride compte les photons libérés, placez la ligne laser à au moins 10 nm de la courbe d’émission.
REMARQUE: Il est important d’effectuer des vérifications préliminaires avec des tissus à étiquette unique pour s’assurer que les largeurs de bande du détecteur choisies séparent proprement les canaux de couleur (c’est-à-dire qu’elles ne conduisent pas à la diaphonie des canaux). Les ondes radio interfèrent avec le détecteur hybride, ce qui entraîne un nombre maximal de photons, et provoque ainsi des rayures artéfactuelles dans la pile. Par conséquent, évitez d’utiliser un téléphone portable près du microscope. - Zoomez sur le tissu jusqu’à ce que l’image s’étende sur 10 IHC. Choisissez la résolution de l’image en fonction de l’échantillonnage Nyquist, qui est généralement d’environ 40-60 nm / pixel. Réglez la taille du pas dans la direction z sur 0,3 μm et la vitesse d’imagerie sur 400-700 Hz.
REMARQUE: Ces deux paramètres (taille du pas et vitesse d’imagerie) sont des compromis entre l’utilisation de paramètres d’imagerie optimaux et le gain de temps de numérisation. - Effectuez un échantillonnage bidirectionnel pour raccourcir le temps d’imagerie. Accumuler le cadre pour le canal 488 nm et 638 nm 3x et pour le canal 522 nm 6x; de plus, faites la moyenne des lignes 3x pour chaque canal. Choisissez le début et la fin de la pile dans la dimension z.
- Réglez le gain sur 100 lors de l’utilisation du détecteur hybride (mode de comptage) pour éviter une diminution du rapport signal/bruit. Réglez la puissance laser de sorte qu’aucun pixel ne soit saturé dans la région d’intérêt, mais que les structures couvrent principalement toute la plage de 8 bits. Commencez avec une faible puissance laser de 0,5% et augmentez-la jusqu’à ce que les structures soient visibles.
REMARQUE: Une bonne coloration nécessite généralement une puissance laser comprise entre 0,1% et 5%. - Utilisez un logiciel de déconvolution pour le traitement post-hoc des piles d’images afin d’éliminer le halo flou autour de petites structures fluorescentes à l’aide d’une fonction théorique d’étalement ponctuel. Utilisez les mêmes paramètres pour chaque pile d’une expérience. Enregistrez les images déconcentrées au format .tif ou .ics.
REMARQUE: Le label myoVIIa (IHC) ne bénéficie pas de la déconvolution et peut être omis pour gagner du temps. Le logiciel utilise les métadonnées des fichiers image; cependant, plusieurs paramètres tels que le trajet de la lumière, le milieu d’incorporation ou le milieu d’immersion doivent être spécifiés.
7. Quantification des synapses
- Ouvrez une copie des piles déconvolved dans le logiciel librement accessible ImageJ avec le plugin Biovoxxel supplémentaire, qui est également disponible sur leur site Web.
- Ajustez les couleurs des couches individuelles en divisant les couches (Image | | de couleur Split Channels) et la fusion (Image | | de couleur Merge Channels) à nouveau, en attribuant différentes couleurs. Convertir l’image en pile RVB (Image | | de couleur Empiler sur RVB) et ajuster la luminosité et le contraste (Image | Ajuster | | luminosité/contraste soit Auto ou curseur concernant le Maximum), si nécessaire, afin que les structures pré-et postsynaptiques et l’étiquette IHC soient agréablement distinctes de l’arrière-plan.
- Choisissez cinq IHC et étiquetez-les avec l’outil texte (IHC1-IHC5) en cliquant sur l’emplacement souhaité dans la pile. Ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement (Analyser | Outils | Gestionnaire du retour sur investissement); activez la case à cocher Étiquettes pour étiqueter les points avec un nombre. Zoomez sur l’IHC d’intérêt.
- Utilisez l’outil point/multipoint en mode multipoint (cliquez avec le bouton droit de la souris sur l’outil pour choisir entre le mode point ou multipoint). Cliquez sur une synapse de ruban fonctionnelle (c’est-à-dire un ruban présynaptique en juxtaposition étroite à un patch de glutamate postsynaptique) tout en faisant défiler la dimension z.
REMARQUE: En fonction de leur degré de chevauchement et de la couleur choisie pour chaque couche, les pixels partagés apparaissent en couleur mixte. Habituellement, la distinction entre les synapses fonctionnelles individuelles est simple car elles sont suffisamment éloignées les unes des autres. - Lorsque toutes les structures d’intérêt sont cochées, cliquez sur Ajouter dans l’interface utilisateur graphique du gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur le nom arbitraire et choisissez Renommer.
REMARQUE: Les étiquettes de point restent toujours à travers tous les plans de la pile lorsque la case à cocher Afficher tout est cochée dans le menu des options de l’outil de point (double-cliquez sur l’icône de l’outil de point ), ce qui permet d’éviter de compter la même synapse de ruban plusieurs fois. - Lorsque vous choisissez le prochain IHC à compter, évitez d’ajouter par inadvertance des comptes en ajustant l’image pour afficher complètement le prochain IHC avec l’outil manuel. Passez d’un outil multipoint à un outil ponctuel pour éviter d’ajouter plus de ponctuation aux données précédemment stockées. Cliquez sur une structure d’intérêt dans le prochain IHC et revenez à l’outil multipoint. Répétez les étapes 7.4 à 7.5 jusqu’à ce que tous les CIH d’intérêt soient évalués.
- Pour enregistrer des données, cliquez sur un jeu de données dans le gestionnaire de retour sur investissement, puis sur mesure. Attendez qu’une nouvelle fenêtre apparaisse, répertoriant les points de données mesurés. Enregistrez cette liste en tant que fichier de feuille de calcul (fichier | Enregistrer sous). Enregistrez l’image en activant Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Aplatir pour ajouter définitivement les étiquettes de points à la pile. Lorsque vous fermez la pile d’images, acceptez d’enregistrer les modifications.
8. Analyse du volume et de la position de la synapse sur la cellule ciliée
REMARQUE : Les auteurs ont utilisé une procédure programmée sur mesure basée sur Matlab. Comme il n’est pas accessible au public, il n’est décrit ici qu’en termes généraux (voir aussi7). Veuillez contacter l’auteur correspondant si vous souhaitez l’utiliser. La procédure s’attend à une pile d’images triple étiquetée (IHC, pré- et postsynaptique) au format TIFF en entrée, guide l’utilisateur à travers les différentes étapes de l’analyse via une interface graphique et fournit une sortie complète des résultats au format feuille de calcul.
- Normaliser la position des structures synaptiques à un système de coordonnées 3D défini par l’étendue individuelle de l’IHC sur l’axe pilier-modiolaire et l’axe apical-basal cochléaire et l’axe supérieur (plaque cuticulaire) de l’IHC vers le bas (pôle synaptique).
NOTE: Les volumes d’éléments synaptiques (pré- et postsynaptiques, et le volume combiné des synapses fonctionnelles) sont fournis en μm3 et normalisés à la valeur médiane respective3.
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Representative Results
Les cochlées ont été soit récoltées après perfusion cardiovasculaire avec fixateur de l’animal entier, soit rapidement disséquées après euthanasie de l’animal et fixées par immersion. Avec cette dernière méthode, les IHC sont restés en place pendant la dissection, alors que, en cas de perfusion infructueuse et donc de tissu insuffisamment fixé, l’épithélium sensoriel était souvent détruit. Notez que les auteurs ont rencontré des cas où la fixation des cochlées après perfusion transcardique était insuffisante alors que la fixation du cerveau était encore adéquate. Le tissu d’une perfusion inférieure pourrait encore être sauvé en ouvrant des trous dans l’apex et la base cochléaires et en postfixant les cochlées par immersion dans 4% de PFA pendant 2 jours.
La détermination de la longueur de l’ensemble de la cochlée a été effectuée selon Müller25 pour évaluer les IHC et leurs synapses à des positions cochléaires spécifiques, équivalentes à des fréquences caractéristiques distinctes (tableau 1). Pour cela, les positions cochléaires souhaitées ont été calculées en pourcentage de la longueur de la membrane basilaire à partir de la base cochléaire. La longueur cochléaire médiane de 13 cochlées de gerbilles jeunes adultes était de 11,3 mm (intervalle interquartile : 11,02-11,52 mm). La longueur cochléaire médiane de 24 cochlées de gerbilles âgées était de 11,5 mm (intervalle interquartile : 11,24-11,73 mm). Il n’y avait pas de différence significative entre la longueur des cochlées jeunes adultes et âgées (test U de Mann-Whitney : U = -1,62, p = 0,105) ; la médiane globale était de 11,48 mm. On peut soutenir que cette variation de la longueur des cochlées individuelles était faible et que l’utilisation de positions de longueur fixes (en mm) est adéquate. Cependant, la fonction place-fréquence est non linéaire. Par conséquent, un écart par rapport à la longueur médiane provoque une erreur plus importante pour les emplacements cochléaires basaux que pour les emplacements cochléaires relativement plus apicals. Par exemple, pour l’emplacement cochléaire équivalent à une fréquence de 1 kHz, calculée en fonction de la longueur cochléaire médiane (c.-à-d. 11,48 mm), la fréquence correspondante variait de 1,16 kHz à 0,91 kHz pour la cochlée la plus courte (10,36 mm) et la cochlée la plus longue (12,28 mm) de cet échantillon, respectivement. Pour une fréquence située à la base (p. ex., 32 kHz), la gamme de fréquences était de 51,62 kHz à 23,97 kHz, respectivement pour la cochlée la plus courte et la plus longue. Par conséquent, il est conseillé de calculer les emplacements individuels sur chaque cochlée, en particulier lors de l’examen des emplacements cochléaires basaux.
La figure 1 illustre les projections d’intensité maximale en dimension z des cochlées d’un jeune adulte (10 mois, figure 1A) et d’une gerbille âgée (38 mois, figure 1B), qui sont des exemples d’immunomarques idéales. Dans l’image représentant la cochlée de la jeune gerbille adulte, les IHC marqués en myoVIIa, ici en bleu, contrastent fortement avec le fond noir. Par conséquent, les IHC individuels sont facilement détectables. Les structures pré- et postsynaptiques sont clairement visibles sous forme d’éléments verts et rouges, respectivement. On suppose qu’ils forment une synapse fonctionnelle chaque fois qu’ils sont en juxtaposition étroite (Figure 1A',B'). Il y avait rarement des structures présynaptiques non appariées (rubans orphelins) apparentes dans les cochlées des gerbilles âgées. La cochlée de l’ancienne gerbille (figure 1B) a été traitée avec le quencher d’autofluorescence. L’étiquette IHC semble plus faible, bien que la puissance laser utilisée dans cet échantillon soit trois fois supérieure à celle utilisée pour la cochlée de la gerbille jeune adulte. Néanmoins, les IHC sont encore distincts de l’arrière-plan. Les structures pré-et postsynaptiques sont clairement visibles, et la puissance laser utilisée pour ces deux canaux était similaire ou même inférieure à celle du jeune spécimen adulte. Les tissus d’animaux âgés présentaient généralement un signal fluorescent significativement plus non spécifique. Par conséquent, la principale différence dans le protocole pour les jeunes adultes et les personnes âgées est le traitement avec un quencher à autofluorescence. Notez que cela a été effectué après l’immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence et pourrait, en principe, également affecter l’étiquette d’anticorps prévue. Cependant, le traitement a efficacement réduit la fluorescence étrangère d’origine non spécifique, tout en laissant un signal suffisant de l’étiquette spécifique des structures d’intérêt (comparer la figure 1B avec la figure 2B). Les résultats préliminaires ont toutefois indiqué que, dans la stria vascularis, la fluorescence étrangère ne se manifestait pas dans les échantillons de gerbilles âgées.
Des exemples de piles qui ont été traitées de manière sous-optimale sont illustrés à la figure 2. La figure 2A illustre la projection z d’intensité maximale d’une pile d’une vieille gerbille (36 mois), où les IHC, qui étaient également pliés de manière anormale ou déchirés, n’ont pas été scannés dans leur intégralité. En conséquence, seuls les pôles apical et basal des IHC sont visibles dans ce scan. Il ne peut être exclu que davantage de synapses aient été localisées dans la partie centrale manquante des IHC et, par conséquent, une analyse fiable n’est pas possible. Ainsi, il est crucial que tous les IHC évalués soient complètement scannés dans la pile confocale. La figure 2B montre la projection z d’intensité maximale d’une pile échantillonnée dans une gerbille âgée (38 mois). La fluorescence d’origine incertaine est élevée car le quencher d’autofluorescence n’a pas été utilisé dans ce cas. Cependant, la fluorescence étrangère était en grande partie confinée au canal (rouge) associé à l’étiquette GluA2, ce qui est assez typique. Dans de tels cas, il peut encore être possible de compter les synapses fonctionnelles si l’étiquette CtBP2 des rubans est relativement propre et spécifique. La figure 2C illustre la projection z d’intensité maximale d’une pile obtenue à partir d’une gerbille âgée (42 mois). Ici, les synapses ne peuvent pas être attribuées à des IHC individuels car les IHC ont été en grande partie désintégrés; en effet, il est difficile d’être sûr du nombre de CIH représentés. Dans l’exemple illustré à la figure 3A, un téléphone portable a été utilisé à proximité du microscope confocal pendant le scan. Des rayures sont visibles dans le canal bleu (étiquette IHC). Heureusement, dans ce cas, cela n’a pas affecté les canaux synaptiques et n’a affecté que la partie supérieure des IHC, de sorte qu’une analyse était toujours viable.
La figure 3 montre des projections z d’intensité maximale de piles prélevées sur le même morceau de cochlée d’une gerbille jeune adulte, acquise 3 mois (figure 3A,A') et 29,5 mois (figure 3B,B') après immunocoloration. Pour rester comparables, les images n’ont pas été prises exactement au même endroit (qui aurait pu subir un blanchiment du scan précédent) mais à partir de la même pièce cochléaire. Pour le scan effectué à un moment ultérieur, la puissance du laser a dû être multipliée par ~ 2 à 3. Néanmoins, les structures étiquetées sont encore claires. Le rapport signal/bruit avait diminué, en particulier dans les canaux affichant des structures postsynaptiques et IHC, tandis que le canal avec l’étiquette présynaptique était moins affecté. La quantification des synapses fonctionnelles par IHC est encore possible.
Les résultats typiques pour l’analyse du volume et de la position des synapses sur le CIS sont illustrés à la figure 4, à l’aide de la pile confocale illustrée à la figure 1A. Les IHC définis individuellement sont affichés graphiquement sous forme de reconstructions de grille de différentes couleurs, avec ou sans les synapses fonctionnelles (définies par la colocalisation des étiquettes pré- et postsynaptiques) attribuées à chacune. Cet écran peut être pivoté librement en 3D pour obtenir différents angles de vision (Figure 4A,B). Les IHC peuvent également être distingués pour l’affichage graphique (Figure 4B). Une grande variété de graphiques de données, illustrant différents aspects de la distribution des volumes synaptiques dans le système de coordonnées centré sur L’IHC, est produite (exemples à la figure 4C-E). Les données quantitatives brutes pour chaque IHC et chaque élément synaptique sont également disponibles sous forme de feuilles de calcul qui peuvent ensuite, par exemple, être combinées sur plusieurs piles confocales pour une analyse statistique plus approfondie.
Figure 1 : Exemples de cochlées traitées avec succès. Projections z d’intensité maximale de piles confocales provenant (A) d’une gerbille jeune adulte (10 mois), obtenue à un emplacement cochléaire correspondant à 1 kHz, et (B) d’une gerbille âgée (38 mois, panel B), obtenues à un emplacement cochléaire équivalent à 500 Hz. Les IHC ont été colorés avec un anticorps contre le myoVIIa (bleu), les rubans présynaptiques ont été marqués avec un anti-CtBP2 (vert), et les patchs de glutamate postsynaptiques ont été étiquetés avec anti-GluA2 (rouge). La cochlée de la gerbille âgée a été traitée avec un quencher d’autofluorescence après l’immunocoloration. Pour plus de clarté, les contours des CIH sont indiqués par des lignes pointillées. Les panneaux (A') et (B') présentent un élargissement des zones délimitées par les carrés des cochlées correspondantes des panneaux (A) et (B). Les pointes de flèches jaunes pointent vers des synapses fonctionnelles. Les canaux affichant les structures pré- et postsynaptiques (mais pas le canal IHC) ont subi une déconvolution. Barres d’échelle = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Abréviations: IHC = cellule ciliée interne; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = protéine de liaison C-terminale 2; GluA2 = récepteur ionotropique du glutamate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exemples de cochlées traitées de manière sous-optimale. Projections z d’intensité maximale des piles confocales pour lesquelles le traitement était sous-optimal, provenant de gerbilles âgées (A) de 36 mois et (B, C) de 38 mois et d’emplacements cochléaires correspondant respectivement à 16 kHz, 8 kHz et 32 kHz. Les gerbilles à partir desquelles les cochlées des panneaux (A) et (C) ont été dérivées ont été perfusées par transcardie, et la cochlée du panneau (C) a également été postfixée pendant 3 jours dans du PFA à 4%. La cochlée de (B) a été fixée par immersion dans 4% de PFA pendant 2 jours. Les cochlées de (A) et (C) ont été traitées avec le quencher d’autofluorescence. Les IHC ont été colorés avec un anticorps contre le myoVIIa (bleu), les rubans présynaptiques ont été marqués avec un anti-CtBP2 (vert) et les patchs de glutamate postsynaptique ont été marqués avec un anti-GluA2 (rouge). Tous les canaux ont été déconcentrés. La luminosité et le contraste ont été ajustés après le balayage confocal. Barres d’échelle = 10 μm. Abréviations : PFA = paraformaldéhyde; IHC = cellule ciliée interne; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = protéine de liaison C-terminale 2; GluA2 = récepteur ionotropique du glutamate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Stabilité de l’immunomarque après un stockage prolongé. Projections z d’intensité maximale d’empilements confocaux d’une gerbille jeune adulte (10 mois), prises à l’emplacement cochléaire de 16 kHz, (A) 3 mois après la coloration et (B) à un emplacement cochléaire légèrement plus basal sur la même pièce cochléaire 29,5 mois après la coloration. La cochlée a été fixée en immersion dans 4% de PFA pendant 2 jours. Pour plus de clarté, (A') et (B') zooment sur seulement quelques synapses fonctionnelles à partir des zones indiquées par des carrés dans (A) et (B), respectivement. Les IHC ont été colorés avec un anticorps contre le myoVIIa (bleu), les rubans présynaptiques ont été marqués avec un anti-CtBP2 (vert) et les patchs de glutamate postsynaptique ont été marqués avec un anti-GluA2 (rouge). La puissance laser pour les canaux IHC était de 1,3% et 3%, pour les canaux présynaptiques de 0,4% et 1,1%, et pour les canaux postsynaptiques de 1,1% et 2% en (A) et (B), respectivement. Notez qu’en (A), des bandes bleues sont visibles dans la partie supérieure des IHC, qui résultent de l’utilisation d’un téléphone portable à proximité immédiate du microscope confocal. Barres d’échelle = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Abréviations : PFA = paraformaldéhyde; IHC = cellule ciliée interne; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = protéine de liaison C-terminale 2; GluA2 = récepteur ionotropique du glutamate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Résultats représentatifs de la quantification du volume synaptique. (A) Dix IHC présentés sous forme de reconstructions de grille de couleurs différentes basées sur l’immunomarque myoVIIa. Leurs synapses fonctionnelles associées, définies par des éléments colocalisés marqués CtBP2-(vert) et GluA2 (rouge), sont affichées avec les IHC, ainsi que séparément ci-dessous, pour plus de clarté. Notez que l’angle de vue a été choisi pour être perpendiculaire au long axe des IHC et diffère donc de l’image confocale originale (Figure 1A). (B) L’un des IHC a été distingué et montré tourné à 90°. Le plan noir a été défini manuellement par l’utilisateur et coupe l’IHC en deux le long de son axe pilier-modiolaire. (C) Diagramme à bulles montrant l’emplacement de toutes les synapses fonctionnelles dans cette pile confocale, par rapport aux trois axes normalisés de leur IHC respectif. la taille des symboles est proportionnelle au volume de l’élément présynaptique. Notez que l’angle de vue a été choisi pour être similaire au panneau (B). (D) Boxplot des volumes normalisés d’éléments synaptiques, séparément pour les partenaires présynaptiques (2 cases gauche) et postsynaptiques (2 boîtes droites) des synapses fonctionnelles et séparés en fonction de leur position dans la moitié modiolaire ou pilier de leur IHC respectif (couleurs différentes). Les cases représentent des intervalles interquartiles, les médianes étant indiquées par des lignes. Les moustaches pointillées indiquent 1,5 fois la plage interquartile, et les croix indiquent des valeurs périphériques au-delà. (E) Nuage de points des volumes normalisés des partenaires pré- vs postsynaptiques des synapses fonctionnelles. Différents symboles indiquent la position dans la moitié modiolaire ou pilier de leur IHC respectif. Abréviations: IHC = cellule ciliée interne; myoVIIa = myosine VIIa; CtBP2 = protéine de liaison C-terminale 2; GluA2 = récepteur ionotropique du glutamate. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Tableau 1 : Distances par rapport à l’apex qui sont équivalentes à des fréquences cibles spécifiques dans des cochlées de différentes longueurs. Les meilleures fréquences équivalentes ont été calculées sur la base de l’équation donnée par Müller25. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
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Discussion
Avec la méthode décrite dans ce protocole, il est possible d’immunomarquer les IHC et les structures synaptiques dans les cochlées des gerbilles jeunes adultes et âgées, d’identifier les synapses fonctionnelles présumées par colocalisation d’éléments pré- et postsynaptiques, de les attribuer à des IHC individuels et de quantifier leur nombre, leur volume et leur emplacement. Les anticorps utilisés dans cette approche ont également marqué les cellules ciliées externes (OHC; myoVIIa) et leurs rubans présynaptiques. En outre, une alternative viable pour l’immunomarquage des IHC et des OHC est un anticorps contre l’otoferline, les OHCs apparaissant beaucoup plus faibles que les IHC.
La perfusion peut être effectuée en utilisant deux configurations différentes. 1) Un système de ligne de goutte à goutte alimenté par gravité dans lequel un seul biberon alimentant une ligne d’égouttement commerciale est suspendu à une roue de poulie à environ 1,5 m au-dessus de l’animal. Les fluides sont introduits successivement après l’abaissement de la bouteille, qui est ouverte en haut. 2) Un système utilisant une pompe péristaltique numérique à vitesse variable, avec un tube mince et long ouvert à une extrémité pour absorber le fluide et une aiguille qui peut être facilement fixée à l’autre extrémité. Les deux fonctionnent aussi bien, et les différences subtiles ne seront pas développées ici. Les auteurs recommandent toutefois spécifiquement un établi de style brouillon vers le bas, avec l’animal sur une plate-forme perforée et les fumées aspirées en dessous. Cela permet un bon accès à la zone chirurgicale sans compromettre la fonction d’échappement (contrairement au travail dans une armoire à fumée ouverte).
Une bonne fixation du tissu est d’une importance cruciale, sinon l’épithélium sensoriel se détachera et se désintégrera pendant la dissection. Chez la gerbille, une exposition plus prolongée au fixateur est nécessaire que celle couramment utilisée (p. ex., pour les souris 17,27,13 ou les cochons d’Inde 28). La méthode préférée pour les gerbilles est l’extraction rapide de la cochlée après la mort de l’animal et la fixation par immersion pendant au moins 1,5 jour. Si la perfusion cardiovasculaire est préférée, il est crucial que la fixation s’installe en quelques minutes et se déroule bien. Comme il peut être difficile d’évaluer la qualité de la fixation pendant la perfusion, il est recommandé de postfixer régulièrement les cochlées comme décrit.
Il est important de respecter les étapes de lavage, la dernière étape de lavage (étape 2.7) étant la plus importante. S’il n’est pas correctement lavé, le tissu est collant et adhère aux instruments de dissection, ce qui rend la dissection difficile. Il est également recommandé d’utiliser un quencher d’autofluorescence dans les cochlées récoltées sur des gerbilles âgées afin de réduire la fluorescence non spécifique. L’autofluorescence pourrait provenir de la lipofuscine, qui est commune dans les tissus d’animaux âgés 29,30,31, et semble être largement excitée et largement émettrice. Lorsqu’elle est excitée avec une longueur d’onde dans le spectre UV (λ = 364 nm), la lipofuscine a une large plage d’émission (λ = 400-700 nm, avec un maximum à ~λ = 568 nm)32. Dans le tissu myocardique humain, la lipofuscine est visible avec une excitation de λ = 555 nm et une émission de λ = 605 nm33. De même, dans les IHC des gerbilles, les auteurs ont remarqué une augmentation de la fluorescence non spécifique le plus en évidence dans le canal utilisé pour l’anticorps AF568, ce qui suggère une autofluorescence des granules de lipofuscine. Une recommandation générale lorsque l’on travaille avec des tissus d’animaux est donc d’utiliser la bande passante d’excitation autour de 550-600 nm pour l’immunomarqueur le moins critique.
La mesure de la longueur cochléaire totale et l’identification correcte de positions cochléaires spécifiques ne sont possibles que si toute sa longueur est préservée. Si des parties de l’épithélium sensoriel sont perdues lors de la dissection, il est recommandé de monter encore la partie restante ou même seulement la pièce ganglionnaire en spirale, et de garder des notes détaillées. Il est alors généralement possible d’estimer la section manquante avec une précision raisonnable. Si les parties apicales de la cochlée sont complètement préservées, mais que l’extrémité basale est manquante, des emplacements cochléaires spécifiques sur la partie apicale pourraient être définissables en calculant les positions en fonction de la longueur cochléaire médiane dans la population de gerbilles utilisée, car l’écart par rapport à la valeur réelle est faible.
Une limitation importante de la quantification du volume synapse est que les volumes absolus résultants ne sont pas comparables entre différentes piles confocales. L’étape critique qui détermine les volumes résultants d’éléments synaptiques est le choix du seuil d’intensité pour la détection initiale. Cependant, le choix de ce seuil d’intensité est fait subjectivement par l’utilisateur dans le protocole actuel et bien d’autres 3,27,34. En outre, la luminosité de l’immunofluorescence dans l’image confocale dépend de nombreux facteurs, qui sont très difficiles à normaliser sur les échantillons, tels que l’épaisseur des tissus, l’orientation des tissus par rapport au chemin optique, la durée de l’exposition au laser et les paramètres confocaux et de déconvolution précis. Toutes ces mises en garde sont exacerbées si des matériaux rares sont acquis sur une période de temps considérable, comme c’est typique pour les gerbilles vieillissantes. Ensemble, cela signifie que les biais sont très difficiles à exclure dans les données regroupées, et le meilleur scénario est un ensemble de données à forte variance. Il est donc recommandé de normaliser systématiquement les volumes synaptiques au volume médian respectif de la pile confocale individuelle, comme l’introduisent Liberman et al.3. L’inconvénient évident est que les volumes synaptiques ne sont alors comparables qu’au sein d’une pile d’images donnée, par exemple, entre différents emplacements sur l’IHC, mais pas entre différents emplacements cochléaires ou âges d’échantillons.
Le double étiquetage des structures pré- et postsynaptiques et l’exigence de co-localisation permettent une estimation plus fiable du nombre de synapses fonctionnelles que l’utilisation de l’une ou l’autre étiquette seule. Si une seule étiquette est réalisable, il est recommandé d’utiliser l’anti-CtBP2 présynaptique, couplé à AF488 ou des étiquettes fluorescentes avec des spécificités de longueur d’onde similaires, pour deux raisons. Tout d’abord, les rubans orphelins, c’est-à-dire les éléments étiquetés CtBP2 sans étiquette postsynaptique co-localisée, semblent être rares17, et les auteurs l’ont confirmé pour les gerbilles âgées. Ainsi, l’erreur introduite par le fait de ne pas pouvoir vérifier la colocalisation avec un partenaire postsynaptique est faible. Il convient toutefois de noter que cela devient un problème plus important lors de l’examen des oreilles exposées au bruit (p. ex., 28). Deuxièmement, dans les cas où le signal de fluorescence est élevé d’origine peu claire, le bruit affecte généralement le canal en utilisant une longueur d’onde d’excitation d’environ 568 nm dans la plus grande mesure (exemple à la figure 2B, représentant l’étiquette GluA2). Au moins une partie de ce bruit peut, dans les tissus d’animaux âgés, être une autofluorescence de lipofuscine. Ainsi, pour maximiser les chances d’une étiquette anti-CtBP2 propre et unique, il est conseillé d’éviter ce canal de longueur d’onde. Enfin, il a été démontré que, dans des conditions de stockage fraîches et sombres appropriées, l’immunomarquage utilisé ici est stable sur de longues périodes, jusqu’à au moins 2,5 ans (figure 3B), ce qui rend possible la réévaluation de tissus précieux, tels que ceux de gerbilles âgées.
La quantification du nombre de synapses afférentes IHC est devenue une mesure importante pour évaluer l’état du système auditif périphérique dans de nombreux contextes, parmi lesquels la perte auditive liée à l’âge. Divers protocoles sont publiés actuellement (par exemple, gerbilles21, souris17,13, cochons d’Inde10,28 et humains35). La méthode décrite ici est, dans ses détails, spécifique aux gerbilles jeunes adultes et âgées, mais certaines recommandations générales ont été dérivées qui peuvent être utiles chez d’autres espèces aussi.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Lichun Zhang d’avoir aidé à établir la méthode et l’unité de service de microscopie à fluorescence de l’Université Carl von Ossietzky d’Oldenburg pour l’utilisation des installations d’imagerie. Cette recherche a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
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