Summary
Um protocolo para processar a cópula gerbil jovem e envelhecida imunolabelando as estruturas sinápticas e células ciliadas anciavelmente, saciando a autofluorescência no tecido envelhecido, dissecando e estimando o comprimento da cóclea, e quantificando as sinapses em pilhas de imagens obtidas com imagens confocalas.
Abstract
A perda de sinapses de fita que conectam células ciliares internas e fibras nervosas auditivas diferentes é considerada uma das causas da perda auditiva relacionada à idade. O método mais comum para detectar a perda de sinapses de fita é o imunolabeling porque permite a amostragem quantitativa de vários locais tonotópicos em uma cóclea individual. No entanto, as estruturas de interesse estão enterradas no interior da cóclea óssea. Gerbils são usados como modelo animal para perda auditiva relacionada à idade. Aqui, protocolos de rotina para fixação, montagens inteiras de gerbil coclear de imunolabeling, imagens confocal e números e volumes de sinapse de fita quantificando são descritos. Além disso, destacam-se os desafios particulares associados à obtenção de bons materiais de indivíduos valiosos do envelhecimento.
Gerbils são eutanizados e ou perfundidos cardiovascularmente, ou suas bípricas timpânicas são cuidadosamente dissecadas para fora do crânio. A cóclea é aberta no ápice e base e diretamente transferida para o fixador. Independentemente do método inicial, a cóclea é postfixada e posteriormente descalcificada. O tecido é então rotulado com anticorpos primários contra estruturas pré e postiáticas e células ciliadas. Em seguida, a cóclea é incubada com anticorpos com marca de fluorescência secundária que são específicos contra seus respectivos primários. A cóclea de gerbils envelhecidos é então tratada com uma quencher de autofluorescência para reduzir a fluorescência de fundo tipicamente substancial dos tecidos dos animais mais velhos.
Finalmente, a cóclea é dissecada em segmentos 6-11. Todo o comprimento coclear é reconstruído de tal forma que locais cocleares específicos podem ser determinados de forma confiável entre os indivíduos. Pilhas de imagens confocal, adquiridas sequencialmente, ajudam a visualizar células ciliadas e sinapses nos locais escolhidos. As pilhas confocal são desconvolvadas, e as sinapses são contadas manualmente usando ImageJ, ou a quantificação mais extensa de estruturas sinápticas é realizada com procedimentos de análise de imagem escritos sob medida no Matlab.
Introduction
A perda auditiva relacionada à idade é uma das doenças mais prevalentes do mundo que afeta mais de um terço da população mundial com 65 anos oumais de 1 ano. As causas subjacentes ainda estão em debate e estão sendo investigadas ativamente, mas podem incluir a perda das sinapses especializadas que conectam células ciliadas internas (IHCs) com diferentes fibras nervosas auditivas2. Estas sinapses de fita compreendem uma estrutura pré-sináptica que tem vesículas preenchidas com o glutamato neurotransmissor amarrado a ele, bem como receptores de glutamato α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropionic ácido (AMPA)receptores de glutamato 3,4,5. No gerbil, ~20 fibras nervosas auditivas diferentes entram em contato com um IHC 6,7,8. As fibras no IHC voltadas para o modiólus se opõem a grandes fitas sinápticas, enquanto as fibras que se conectam no lado do pilar do IHC enfrentam pequenas fitas sinápticas (ou seja, em gatos9, gerbils7, cobaias10 e ratos 3,11,12,13,14). Além disso, no gerbil, o tamanho das fitas pré-sinápticas e as manchas de glutamato postsintáptico estão correlacionados positivamente 7,14. As fibras que se opõem a grandes fitas no lado modiolar do IHC são pequenas de calibre e têm baixas taxas espontâneas e limiares elevados15. Há evidências de que as fibras de baixa taxa espontânea são mais vulneráveis à exposição ao ruído10 e drogas ototóxias16 do que fibras de baixo limiar espontâneos, que estão localizadas no lado pilar dos IHCs15.
A perda de sinapses de fita é o mais antigo evento degenerativo na perda auditiva relacionada à idade neural coclear, enquanto a perda de células de gânglio espiral e suas diferentes fibras nervosas auditivas fica atrásde 17,18. Correlações eletrofisiológicas incluem gravações de respostas auditivas do troncocerebral 17 e potenciais de ação composta8; entretanto, não refletem as sutilezas da perda de sinapse, uma vez que as fibras de baixa taxa espontânea não contribuem para essas medidas16. Métricas eletrofisiológicas mais promissoras são o índice neural derivado de massa19 e a resposta ao tempo peristimulus20. No entanto, estes só são confiáveis se o animal não tiver outras patologias cocleares, além da perda auditiva de fibras nervosas, que afetam a atividade das fibras nervosas auditivas restantes8. Além disso, os limiares avaliados comportamentalmente no gerbil não foram correlacionados com os números da sinapse21. Portanto, a quantificação confiável das sinapses de fita sobreviventes e, assim, o número de fibras nervosas auditivas funcionais só é possível mediante o exame direto do tecido coclear.
O gerbil mongol (Meriones unguiculatus) é um modelo animal adequado para estudar a perda auditiva relacionada à idade. Tem uma vida útil curta, tem audição de baixa frequência semelhante aos humanos, é fácil de manter, e mostra semelhanças com patologias humanas relacionadas à perda auditiva relacionada à idade 2,22,23,24. Os gerbils são considerados idosos quando chegam aos 36 meses de idade, o que está perto do fim de sua média de vida22. É importante ressaltar que uma perda relacionada à idade das sinapses de fita tem sido demonstrada em gerbils criados e envelhecidos em ambientes tranquilos 8,21.
Aqui, é apresentado um protocolo para imunolabel, dissecar e analisar cócleas de gerbils de diferentes idades, de adultos jovens a idosos. Anticorpos direcionados contra componentes da presinapse (CtBP2), patches de receptor de glutamato postânaptic (GluA2) e IHCs (myoVIIa). Aplica-se um quencher de autofluorescência que reduz o fundo em cóclea envelhecida e deixa o sinal de fluorescência intacto. Além disso, é dada uma descrição de como dissecar a cóclea para examinar tanto o epitélio sensorial quanto a estria vascularis. O comprimento coclear é medido para permitir a seleção de locais cocleares distintos que correspondem às melhores frequências específicas25. A quantificação dos números da sinapse é realizada com o software disponível livremente ImageJ26. A quantificação adicional de volumes e locais de sinapse dentro do HC individual é realizada com software personalizado escrito no Matlab. Este software não é disponibilizado publicamente, pois os autores não têm recursos para fornecer documentação profissional e suporte.
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Protocol
Todos os protocolos e procedimentos foram aprovados pelas autoridades competentes da Baixa Saxônia, Alemanha, com números de licenças AZ 33.19-42502-04-15/1828 e 33.19-42502-04-15/1990. Este protocolo é para gerbils mongóis (M. unguiculatus) de ambos os sexos. O adulto jovem refere-se à idade de 3-12 meses, enquanto os gerbils são considerados com idade aos 36 meses ou mais. Quando não indicado o contrário, buffers e soluções podem ser preparados e armazenados na geladeira por até vários meses (4-8 °C). Antes de usar, certifique-se de que os buffers e soluções não tenham precipitado.
1. Fixação e coleta de órgãos
NOTA: Se apenas a cóclea for necessária, recomenda-se realizar o procedimento um pouco mais simples de fixação por imersão. No entanto, se um cérebro bem preservado também é necessário, então a perfusão transcárvia é a única opção. O fixador em ambos os casos é 4% de paraformaldeído (PFA) em soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Isso deve ser feito recentemente, mas pode ser armazenado congelado até o uso. Use alíquotas de ~300 mL para uma perfusão transcárvia ou ~50-100 mL por cóclea para fixação por imersão.
ATENÇÃO: A PFA é uma substância perigosa; lidar com isso de acordo com os procedimentos gerais de segurança do laboratório.
- Fixação por perfusão transcárvia
- Lave a configuração de perfusão até que a tubulação esteja livre de bolhas de ar. Encha a tubulação de perfusão com PBS contendo heparina (0,2 mL em 100 mL de PBS) para evitar a coagulação sanguínea. Pare o fluxo quando a tubulação estiver cheia de PBS e o frasco de armazenamento de fluidos tiver acabado de esvaziar; despeje 200 mL de PFA descongelado nele.
NOTA: A configuração está agora pronta para o animal. O PBS restante na tubulação é suficiente para limpar o sangue e será automaticamente seguido pelo fixador assim que o fluxo for retomado. - Certifique-se de que um sistema de coleta de lixo esteja em vigor para o fluxo de PFA. Use uma cânula fresca (19 G) e tenha uma tesoura grande, fórceps (com ponta achatada), hemostats, bisturi ou cânula afiada, e um tapete de borracha com pinos à mão.
- Eutanize o gerbil com uma overdose intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, faixa de peso corporal: 50-120 g). Coloque o animal de volta em sua gaiola. Quando a parada respiratória se fixa em tal forma que a respiração se torne irregular com intervalos de 30 s ou mais, coloque o gerbil nas costas no tapete de borracha e fixe tanto patas dianteiras quanto uma pata traseira com pinos (deixe uma pata traseira livre para se mover para melhor julgamento do sucesso da perfusão; veja nota após o passo 1.1.7).
- Para abrir a cavidade torácica, levante a pele acima do esterno com fórceps e corte a pele aproximadamente 0,5 cm abaixo do esterno com uma tesoura até que o processo de cor branca xiphoideus seja visível. Segure o esterno no processo xiphoideus com fórceps e corte ao longo do diafragma para obter uma boa visão da cavidade torácica. Corte as costelas lateralmente em ambos os lados até que haja um bom acesso ao coração. Certifique-se de que o ângulo da tesoura seja paralelo e plano em relação ao corpo do gerbil para evitar danos aos órgãos e, assim, garantir um sistema circulatório fechado.
- Fixar um hemostata no esterno, levantar a caixa torácica e colocar o hemostata sobre o ombro do gerbil sem descansar o hemostato em qualquer parte do corpo para evitar bloquear o fluxo sanguíneo.
- Abra o fluxo de fluido ligeiramente até que uma gota de PBS flua para fora da cânula (19 G) aproximadamente a cada 2 s. Segure o coração com fórceps e gire-o um pouco para a esquerda de tal forma que o ventrículo esquerdo possa ser claramente visto. Insira a cânula no ventrículo esquerdo em um ângulo que evite penetrar o septo. Segure a agulha no lugar, à mão ou com outro hemostata.
NOTA: Os ventrículos esquerdo e direito podem ser diferenciados por suas diferentes tonalidades de cor; o ventrículo esquerdo aparece de cor mais clara do que o resto do tecido cardíaco. - Aumente lentamente a pressão do fluxo de fluidos e abra o átrio direito com uma tesoura fina, um bisturi ou outra cânula. Abra ainda mais o fluxo de fluido até que aproximadamente 2-3 gotas/s sejam observadas na câmara de gotejamento, ou defina um fluxo de 4 mL/min para a bomba. Uma vez que a fixação do coração se instale, certifique-se de que a cânula de perfusão permaneça no lugar sem ser realizada mais adiante.
NOTA: Os sinais de perfusão bem sucedida são contrações musculares lentas, endurecimento do pescoço e extremidades, o fígado ficando pálido, e pulmões rosados. O sinal de perfusão mal sucedida é o clareamento dos pulmões, o que indica que a circulação pulmonar está perfusada devido à punção do septo. - Em caso de perfusão mal sucedida, tente mover a cânula mais para cima, para a aorta, e fixá-la no lugar com um hemostat.
- Decapitar o gerbil. Remova o bullae e corte e quebre seu osso conforme descrito na etapa 1.2.2.
NOTA: Se o tecido não estiver suficientemente fixo, o epitélio sensorial se desalojará do órgão de Corti durante a dissecção. - Se a perfusão não mostrar sinais de fixação dentro de 5-10 minutos, aborte-a e siga imediatamente o procedimento abaixo para fixação por imersão. Para isso, trate a cóclea como na etapa 1.2.2 e poste o tecido em aproximadamente 50-80 mL de 4% pfa em recipientes de tampa de parafuso por 1-2 dias em um shaker 2D a 8 °C.
NOTA: Uma vez que pode ser difícil avaliar a qualidade da fixação durante a perfusão, recomenda-se postar rotineiramente a cóclea como descrito.
- Lave a configuração de perfusão até que a tubulação esteja livre de bolhas de ar. Encha a tubulação de perfusão com PBS contendo heparina (0,2 mL em 100 mL de PBS) para evitar a coagulação sanguínea. Pare o fluxo quando a tubulação estiver cheia de PBS e o frasco de armazenamento de fluidos tiver acabado de esvaziar; despeje 200 mL de PFA descongelado nele.
- Fixação por imersão tecidual
- Eutanize os gerbils com uma overdose intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, faixa de peso corporal: 50-120 g). Quando o gerbil parar de respirar, decapite o animal.
- Remova o bullae e corte e quebre seu osso com tesouras e fórceps, respectivamente, para alcançar a cóclea. Remova os canais maellus, incus e semicircular. Faça pequenos orifícios no ápice e na curva basal coçando cuidadosamente sobre o osso coclear com fórceps. Transfira imediatamente o bullae em excesso de fixação a frio (pelo menos 50 mL) e fixe o tecido no frio (4-8 °C) sob agitação suave (2D-shaker [100 rpm]) por 2 dias.
NOTA: Após a fixação do tecido, a cóclea pode ser processada imediatamente ou armazenada em PBS com azida de sódio de 0,05%. ATENÇÃO: O azida de sódio é tóxico. Observe que o comprimento do armazenamento pode influenciar negativamente a qualidade da coloração. Estudos limitados sugerem que a imunostaining parecia mais fraca após 2 anos armazenando o tecido em azida de sódio.
2. Preparação e imunolabelamento de tecidos
- Dissolver o ácido etilenodiaminatotraacético (EDTA) em pó de PBS para produzir uma solução de 0,5 M em pH 8. Para isso, coloque um béquer em um agitador magnético, preencha-o com aproximadamente metade da quantidade total do PBS e adicione a quantidade apropriada de pó EDTA, resultando em uma suspensão ácida. Adicione cuidadosamente a solução concentrada de hidróxido de sódio (NaOH) enquanto monitora o pH com um medidor de pH. Encha com PBS até o volume final desejado e filtre a solução para evitar contaminação microbiana.
NOTA: O pó EDTA só se dissolverá completamente quando a suspensão atingir um valor de pH neutro. - Para descalcificação, transfira a cóclea para 80 mL de 0,5 M EDTA na PBS. Incubar o tecido no frio (4-8 °C) sob agitação suave no shaker 2D (100 rpm) por 2 dias.
NOTA: Após a etapa de descalcificação, o tecido pode ser armazenado em PBS por vários dias até 3 semanas antes de continuar com as etapas restantes de processamento. Para anticorpos que rotulam a estria vascularis, é aconselhável cortar a cóclea ao meio ao longo do eixo modiolar neste ponto (ou seja, antes da imunostaining) para garantir o acesso uniforme de anticorpos aos seus respectivos alvos. Isso é dependente de anticorpos e não se aplica aos anticorpos aqui utilizados para rotular estruturas sinápticas e IHCs. Use um pedaço de lâmina de barbear quebrável e um suporte de lâmina (conforme descrito na etapa 4.2) para o corte. - Realize as seguintes etapas (até o passo 3.2) em tubos de reação de vedação segura de 2 mL. Se a peça de tecido for muito grande para caber dentro do tubo, corte o excesso de tecido com uma tesoura. Para melhorar a penetração dos anticorpos, primeiro permeabilize o tecido em 1 mL de triton de 1% (Triton X-100) em PBS no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente por 1 h. Lave o tecido 3x com 1 mL de triton de 0,2% (Triton X-100) em PBS no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente por 5 min cada.
- Para bloquear antígenos não específicos, incubar a cóclea em 1 mL de solução de bloqueio (3% de albumina de soro bovino [BSA], 0,2% triton, em PBS) no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente por 1h.
NOTA: A solução de bloqueio pode ser preparada com antecedência, mas não deve ser maior que ~10 dias. - Diluir os seguintes anticorpos primários recentemente na mesma alíquota da solução de bloqueio: anti-myoVIIa (myosin VIIa) para rotular IHCs (coelhinho policlonal IgG), diluído 1:400; anti-CtBP2 (proteína de ligação terminal C 2) para rotular fitas pré-sinápticas (camundongo monoclonal IgG1), diluído 1:400; e anti-GluA2 para rotular patches de receptores postinápticos (mouse monoclonal IgG2a), diluídos 1:200. Certifique-se de que a cóclea está totalmente coberta com a solução de anticorpos (tipicamente 0,4 mL) e incuba-as a 37 °C por 24 h.
- Em seguida, lave o tecido 5x com triton de 0,2% no PBS no shaker 2D (100 rpm) em temperatura ambiente por 5 min cada. Escolha anticorpos secundários para combinar com as espécies hospedeiras de suas contrapartes primárias e novamente diluí-los recentemente em 3% BSA, 0,2% triton, em PBS: anti-rato de cabra (IgG1)-Alexa fluorophore (AF) 488, diluído 1:1.000; anti-rato de cabra (IgG2a)-AF568, diluído 1:500; e burro anti-coelho-AF647 (IgG), diluído 1:1.000. Enrole o tubo em papel alumínio para evitar branqueamento da fluorescência. Incubar a cóclea em 0,4 mL de solução de anticorpos secundários a 37 °C por 24 h.
NOTA: Estudos limitados indicaram que a incubação de tecido coclear a 37 °C por 24 h com anticorpos primários e secundários resultou em imunostaining mais brilhante do que seguir o procedimento de incubação mais comum com temperaturas mais baixas e durações mais curtas. - Lave a cóclea 2x com 1 mL de 0,2% de triton em PBS por 5 min cada e 3x com PBS por 5 min cada no shaker 2D (100 rpm) à temperatura ambiente.
NOTA: Após estas etapas de lavagem, a cóclea pode permanecer em PBS na geladeira a ~4 °C por vários dias.
3. Tratamento com quencher de autofluorescência (opcional)
NOTA: Cóclea de gerbils de meia-idade e idade apresentam extensa autofluorescência de fundo. No tecido adulto jovem, o tratamento com uma quencher de autofluorescência não é necessário. É, em princípio, possível aplicar a quencher de autofluorescência antes do procedimento de imunossuagem, o que evita qualquer redução inadvertida da fluorescência de anticorpos desejada. No entanto, de acordo com a folha de dados do fabricante, o uso de detergentes (como Triton X-100 no protocolo atual) não é mais possível, pois eles removem a saciador do tecido.
- Corte a cóclea ao meio sob um estereoscópio, conforme descrito na etapa 4.2.
- Misture a saciador de autofluorescência com 70% de etanol para obter uma solução de 5% e incubar a cóclea nesta solução no shaker 2D à temperatura ambiente por 1 min. Lave a cóclea 3x com 1 mL de PBS no shaker 2D à temperatura ambiente por 5 minutos cada.
ATENÇÃO: A saciador de autofluorescência é perigosa e prejudicial. Use luvas ao manusear esta substância.
4. Dissecção final da multa
- Disseque a cóclea sob um estereótipo. Encha uma placa de Petri de polistyrole e sua tampa com PBS e mantenha dois fórceps finos, tesoura de mola Vannas, um porta-lâminas, e um lâmina de barbear útil. Quebre peças da lâmina de barbear para obter uma superfície de corte de ~2-4 mm dependendo da etapa de dissecção. Prepare um slide de microscópio colocando três gotas de meio de montagem em uma fileira.
NOTA: A superfície de corte da lâmina de barbear passa rapidamente. A lâmina deve ser trocada após dissecar e montar aproximadamente cada segundo pedaço da cóclea. - Se ainda não foi feito na etapa 3.1, primeiro corte a cóclea ao meio ao longo do modiósoco sob um estereómico. Para isso, posicione um pedaço de um razorblade por mais tempo do que o comprimento enrolado da cóclea em um suporte de lâmina. Coloque a cóclea na placa de Petri e corte o excesso de tecido com o pedaço de lâmina de barbear. Segure a cóclea no lugar com fórceps finos e corte ao meio ao longo do modiolo.
- Comece com metade, mas deixe a outra metade na placa de Petri também. Fixar cuidadosamente a metade coclear com fórceps de tal forma que a borda de corte esteja voltada para cima. Use uma tesoura de mola fina para cortar o osso da cóclea acima do helicotrema, cobrindo o ápice.
- Para iniciar a separação das peças cocleares, isole a curva média cortando com tesouras através do míquilo e nervo auditivo, acima (scala vestibuli) e abaixo (scala tympani).
- Corte através do osso coclear cobrindo a estria vascularis dentro do duto coclear. Faça dois cortes em ambos os lados do osso coclear acima do órgão de Corti e ao longo da estria vascularis e use o razorblade para eventualmente separar as peças cocleares.
NOTA: A estria vascularis é facilmente visível como uma listra escura. Cortar ao longo da estria vascularis deixa o órgão de Corti intacto. - Opcional: Para coletar a estria vascularis, corte cuidadosamente entre o órgão de Corti e a estria vascularis para separar os dois. Deixe a estria vasculare conectada ao ligamento espiral (presa ao osso que cobre a superfície externa da cóclea) e remova o osso decalcificado usando fórceps. Coloque a peça com o lado estria para cima no deslizamento do microscópio em uma gota de meio de montagem.
NOTA: Se a peça coletada for curvada com muita força, pode ser necessário dividi-la em pedaços menores para que ela seja plana o suficiente para a montagem no slide. - Transfira as peças cocleares para a tampa cheia de PBS da placa petri de poliestireno, garantindo que as montagens inteiras cocleares deitem o mais plano possível no escorregador. Remova o excesso de tecido, como partes do ligamento espiral no lado abneural e partes do limbus espiral no lado neural. Remova cuidadosamente a membrana tectorial com fórceps super finos.
- Coloque as peças cocleares sobre o slide em uma gota de meio de montagem. Coloque as montagens inteiras cocleares com o órgão de Corti voltado para cima no slide para evitar ocultar os IHCs no caminho óptico para imagem. Procure a invaginação do limbus espiral nas proximidades dos IHCs, que é visível deslocando a peça coclear para o plano sagital para identificar o lado a olhar para cima.
NOTA: Para reconstruir digitalmente a cóclea completa de suas peças individuais durante o processamento posterior, é fortemente recomendável documentar esboços das peças e observar marcos. Além disso, as peças devem ser organizadas na ordem correta no slide. - Repita as etapas 4.3 a 4.8 até que toda a cóclea seja transferida para o slide do microscópio. Se necessário, adicione mais meio de montagem, cubra o slide e sele o deslizamento no lugar com esmalte preto pintado ao redor das bordas. Deixe-o secar no escuro à temperatura ambiente e, em seguida, armazene o slide no escuro a 4 °C.
NOTA: Mesmo que partes do epitélio sensorial em si sejam acidentalmente perdidas, é importante, no entanto, montar o que sobrou da peça coclear para a estimativa correta do comprimento.
5. Medição do comprimento coclear
- Meça o comprimento da cóclea a partir de imagens de brightfield de suas peças usando um sistema de microscópio epi-fluorescência e software associado. Salve imagens de baixa ampliação (lente 4x) de cada peça coclear e use a ferramenta de medição de laços do software de microscópio para desenhar uma linha ao longo da linha de IHCs em cada uma das imagens. Calcule o comprimento total adicionando os comprimentos de todas as peças.
NOTA: Quando partes do epitélio sensorial estão faltando dentro de uma peça coclear, interpolar a linha. - Para definir os locais cocleares que devem ser analisados em uma cóclea individual, calcule suas distâncias correspondentes do ápice usando a equação dada por Müller25. Marque esses locais, por exemplo, em uma impressão das peças cocleares.
6. Aquisição de imagem com microscópio confocal
- Use um microscópio confocal com um objetivo de imersão a óleo de 40x (abertura numérica 1.3) e o óleo apropriado para imagens de alta resolução.
NOTA: Se o microscópio confocal tiver um caminho de luz invertida, o slide deve ser posicionado de cabeça para baixo. Neste caso, dê ao espécime aproximadamente 30 minutos para afundar e descansar firmemente na tampa antes de iniciar a varredura final. Alternativamente, use um meio de montagem que seja fluido durante toda a duração da dissecção, mas solidifica posteriormente e simultaneamente conserva a fluorescência. - Ative os lasers apropriados: dois lasers semicondutores bombeados opticamente com comprimentos de onda de λ = 488 nm e λ = 522 nm, e um laser de diodo com comprimento de onda de λ = 638 nm são usados neste protocolo. Escolha a faixa de emissão das tags de fluorescência (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Como um detector híbrido conta os fótons liberados, coloque a linha laser a pelo menos 10 nm de distância da curva de emissão.
NOTA: É importante realizar verificações preliminares com tecido de etiqueta única para garantir que as larguras de banda do detector escolhidos separem limpamente os canais de cores (ou seja, não levam ao crosstalk do canal). Ondas de rádio interferem com o detector híbrido, resultando em contagem máxima de fótons, e assim causam listras artefatos na pilha. Portanto, evite usar um celular perto do microscópio. - Amplie o tecido até que a imagem se estecie em 10 IHCs. Escolha a resolução da imagem de acordo com a amostragem de Nyquist, que normalmente é ~40-60 nm/pixel. Defina o tamanho da etapa na direção z para 0,3 μm e a velocidade de imagem para 400-700 Hz.
NOTA: Ambas as configurações (tamanho da etapa e velocidade de imagem) são comprometidas entre o uso de parâmetros de imagem ideais e a economia de tempo de varredura. - Realize amostragem bidirecional para encurtar o tempo de imagem. Acumule o quadro para o canal 3x de 488 nm e 638 nm e para o canal 6x de 522 nm; adicionalmente, média das linhas 3x para cada canal. Escolha o início e o fim da pilha na dimensão z.
- Ajuste o ganho para 100 ao usar o detector híbrido (modo de contagem) para evitar a diminuição da relação sinal-ruído. Defina a potência do laser para que nenhum pixel esteja saturado na região de interesse, mas as estruturas cobrem principalmente toda a gama de 8 bits. Comece com uma baixa potência laser de 0,5% e aumente-a até que as estruturas sejam visíveis.
NOTA: Uma boa coloração normalmente precisa de uma potência laser entre 0,1% e 5%. - Use software de desconvolução para processamento pós-hoc das pilhas de imagens para remover o halo de desfoque em torno de pequenas estruturas fluorescentes usando uma função teórica de propagação de pontos. Use as mesmas configurações para cada pilha dentro de um experimento. Salve as imagens desconvolvadas como .tif ou .ics.
NOTA: O rótulo myoVIIa (IHCs) não se beneficia da desconvolução e pode ser omitido para economizar tempo. O software usa meta-dados dos arquivos de imagem; no entanto, vários parâmetros como o caminho da luz, o meio de incorporação ou o meio de imersão precisam ser especificados.
7. Quantificação sinapse
- Abra uma cópia das pilhas desconvolved no software de acesso livre ImageJ com o biovoxxel-plugin adicional, que também está disponível em seu site.
- Ajuste as cores dos canais individuais dividindo os canais (Imagem | | de cor Canais Divididos) e fusão (| de imagem | de cor Mesclar canais) novamente, atribuindo cores diferentes. Converta a imagem em uma pilha de RGB (| de imagem | de cor Empilhe para RGB) e ajuste o brilho e o contraste (imagem | Ajuste | brilho/contraste | Tanto auto quanto slider em relação ao Máximo), se necessário, de modo que as estruturas pré e postsinápticas e o rótulo IHC sejam agradavelmente distintos do plano de fundo.
- Escolha cinco IHCs e rotule-os com a ferramenta de texto (IHC1-IHC5) clicando no local desejado dentro da pilha. Abra o gerente do ROI (Analisar | Ferramentas | Gerente de ROI); ativar as etiquetas da caixa de marcação para rotular os pontos com um número. Amplie o IHC de interesse.
- Use a ferramenta ponto/vários pontos no modo multiponto (clique com o botão direito do mouse na ferramenta para escolher entre o modo ponto ou multiponto). Clique em uma sinapse de fita funcional (ou seja, uma fita pré-sináptica em justaposição próxima a um patch de glutamato postsynáptico) enquanto percorre a dimensão z.
NOTA: Dependendo da quantidade de sobreposição e da cor escolhida para cada canal, os pixels compartilhados aparecem em cores mistas. Geralmente, a distinção entre sinapses funcionais individuais é simples porque elas são suficientemente distantes umas das outras. - Quando todas as estruturas de interesse estiverem marcadas, clique em Adicionar na interface gráfica do usuário do gerenciador de ROI. Clique no nome arbitrário e escolha Renomear.
NOTA: Os rótulos de ponto ainda permanecem em todos os planos da pilha quando a caixa de seleção Mostrar todas são selecionadas no menu de opções de ferramentas de ponto (clique duas vezes no ícone da ferramenta point ), o que ajuda a evitar contar a mesma sinapse de fita várias vezes. - Ao escolher o próximo IHC para contar, evite adicionar inadvertidamente contagens ajustando a imagem para exibir totalmente o próximo IHC com a ferramenta manual. Mude de ferramenta de vários pontos para ferramenta de ponto para evitar adicionar mais puncta aos dados armazenados anteriormente. Clique em uma estrutura de interesse dentro do próximo IHC e mude de volta para a ferramenta multiponto. Repetição de passos de 7,4 a 7,5 até que todos os IHCs de interesse sejam avaliados.
- Para salvar dados, clique em um conjunto de dados no gerenciador de ROI e, em seguida, em medida. Aguarde que uma nova janela apareça, listando os pontos de dados medidos. Salve esta lista como um arquivo de planilha (Arquivo | Salve como). Salve a imagem ativando o Show All no gerenciador de ROI. Clique em Achatar para adicionar permanentemente os rótulos de ponto à pilha. Ao fechar a pilha de imagens, concorde em salvar as alterações.
8. Análise do volume e posição da sinapse na célula ciliar
NOTA: Os autores utilizaram um procedimento programado sob medida baseado no Matlab. Uma vez que não está disponível publicamente, é descrito aqui apenas em termos gerais (veja também7). Entre em contato com o autor correspondente, se tiver interesse em usá-lo. O procedimento espera uma pilha de imagens de três rótulos (IHCs, pré e postsynaptic) no formato TIFF como entrada, orienta o usuário através das várias etapas de análise através de uma interface gráfica e fornece uma saída extensiva dos resultados em formato de planilha.
- Normalize a posição das estruturas sinápticas para um sistema de coordenadas 3D definido pela extensão individual do IHC no eixo pilar-modificador e eixo aclássico-basal coclear e o eixo topo (placa cuticular) do IHC para o eixo inferior (polo sináptico).
NOTA: Os volumes de elementos sinápticos (pré e postssynaptic, e o volume combinado de sinapses funcionais) são fornecidos em μm3 e normalizados ao respectivo valor mediano3.
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Representative Results
A cóclea foi colhida após perfusão cardiovascular com fixação de todo o animal ou rapidamente dissecada após eutanásia do animal e imersão fixada. Com este último método, os IHCs permaneceram no lugar durante a dissecção, enquanto, em casos de perfusão mal sucedida e, portanto, tecido insuficientemente fixo, o epitélio sensorial foi muitas vezes destruído. Note-se que os autores encontraram casos em que a fixação da cóclea após a perfusão transcárlica foi insuficiente enquanto a fixação do cérebro ainda era adequada. O tecido de uma perfusão inferior ainda poderia ser salvo abrindo orifícios no ápice e base coclear e postfixando a cóclea por imersão em 4% pfa por 2 dias.
A determinação de comprimento de toda a cóclea foi conduzida de acordo com Müller25 para avaliar os IHCs e suas sinapses em posições cocleares específicas, equivalentes a frequências características distintas (Tabela 1). Para isso, as posições cocleares desejadas foram calculadas como percentuais de comprimento da membrana basilar da base coclear. O comprimento coclear médio de 13 cócleas de gerbils adultos jovens foi de 11,3 mm (intervalo interquartil: 11,02-11,52 mm). O comprimento coclear médio de 24 cócleas de gerbils envelhecidos foi de 11,5 mm (faixa interquartil: 11,24-11,73 mm). Não houve diferença significativa entre o comprimento da cóclea jovem adulto e envelhecida (Teste U de Mann-Whitney: U = -1,62, p = 0,105); a mediana geral foi de 11,48 mm. Pode-se argumentar que essa variação no comprimento da cóclea individual era pequena e o uso de posições de comprimento fixo (em mm) é adequado. No entanto, a função de frequência local não é linear. Portanto, um desvio do comprimento mediano causa um erro maior para locais cocleares basais do que para locais cocleares relativamente mais apical. Por exemplo, para a localização coclear equivalente a uma frequência de 1 kHz, calculada com base no comprimento coclear mediano (ou seja, 11,48 mm), a frequência correspondente variou de 1,16 kHz a 0,91 kHz para o menor (10,36 mm) e a cóclea mais longa (12,28 mm) nesta amostra, respectivamente. Para uma frequência localizada basalmente (por exemplo, 32 kHz), a faixa de frequência foi de 51,62 kHz a 23,97 kHz, para a cóclea mais curta e longa, respectivamente. Portanto, é aconselhável calcular os locais individuais em cada cóclea, em particular ao examinar locais cocleares basais.
A Figura 1 retrata projeções de intensidade máxima da dimensão Z de cóclea de um adulto jovem (10 meses, Figura 1A) e um gerbil envelhecido (38 meses, Figura 1B), que são exemplos de imunolabels ideais. Na imagem que retrata a cóclea do jovem adulto Gerbil, os IHCs rotulados pela mioVIIa, aqui mostrados em azul, estão em contraste acentuado com o fundo preto. Portanto, os IHCs individuais são facilmente detectáveis. As estruturas pré e postiática são claramente visíveis como elementos verdes e vermelhos, respectivamente. Presume-se que eles formem uma sinapse funcional sempre que estiverem em justaposição próxima (Figura 1A',B'). Raramente havia estruturas pré-sinápticas não pagas (fitas órfãs) aparentes na cóclea de gerbils envelhecidos. A cóclea do velho gerbil (Figura 1B) foi tratada com a quencher de autofluorescência. O rótulo IHC parece mais fraco, embora o poder laser usado neste espécime tenha sido três vezes maior do que o usado para a cóclea do jovem adulto gerbil. No entanto, os IHCs ainda são distintos do fundo. As estruturas pré e postiáticas são claramente visíveis, e o poder laser usado para ambos os canais foi semelhante ou mesmo abaixo do que para o espécime adulto jovem. Tecidos de animais idosos tipicamente apresentaram significativamente mais sinal fluorescente de aparência específica. Portanto, a principal diferença no protocolo para material adulto jovem e idoso é o tratamento com uma autofluorescência quencher. Note-se que isso foi realizado após a imunossuagem com anticorpos marcados por fluorescência e pode, em princípio, também afetar o rótulo de anticorpo pretendido. No entanto, o tratamento efetivamente reduziu a fluorescência ímã de origem inespecífica, deixando sinal suficiente do rótulo específico das estruturas de interesse (compare a Figura 1B com a Figura 2B). Resultados preliminares indicaram, no entanto, que, nas estrias vascularis, a fluorescência estímpara não se manifestou em amostras de gerbils envelhecidos.
Exemplos de pilhas que foram processadas subotimamente são mostrados na Figura 2. A Figura 2A retrata a projeção z de intensidade máxima de uma pilha de um gerbil antigo (36 meses), onde os IHCs, que também eram não naturalmente dobrados ou rasgados, não foram escaneados em sua totalidade. Como resultado, apenas os polos apical e basal dos IHCs são visíveis nesta varredura. Não se pode excluir que mais sinapses foram localizadas na parte média ausente dos IHCs e, portanto, uma análise confiável não é possível. Assim, é crucial que todos os IHCs avaliados sejam digitalizados completamente na pilha confocal. A Figura 2B mostra a projeção z de intensidade máxima de uma pilha amostrada em um gerbil envelhecido (38 meses). A fluorescência de origem pouco clara é alta, pois o quencher de autofluorescência não foi usado neste caso. No entanto, a fluorescência ím loca foi em grande parte confinada ao canal (vermelho) associado ao rótulo GluA2, o que é bastante típico. Nesses casos, ainda pode ser possível contar sinapses funcionais se o rótulo CTBP2 das fitas for relativamente limpo e específico. A Figura 2C retrata a projeção z de intensidade máxima de uma pilha obtida de um gerbil envelhecido (42 meses). Aqui, as sinapses não podem ser alocadas para IHCs individuais, pois os IHCs foram em grande parte desintegrados; na verdade, é difícil ter certeza de quantos IHCs estão representados. No exemplo mostrado na Figura 3A, um telefone celular foi usado nas proximidades do microscópio confocal durante a varredura. As listras são visíveis no canal azul (etiqueta IHC). Felizmente, neste caso, isso não afetou os canais sinápticos e afetou apenas a parte superior dos IHCs, portanto, a análise ainda era viável.
A Figura 3 apresenta projeções z-de intensidade máxima de pilhas retiradas do mesmo pedaço de cóclea de um jovem adulto gerbil, adquiridas 3 meses (Figura 3A,A') e 29,5 meses (Figura 3B,B') após a imunosstaining. Para permanecer comparáveis, as imagens não foram tiradas exatamente do mesmo local (que poderia ter sofrido branqueamento da varredura anterior), mas da mesma peça coclear. Para a varredura feita no ponto de tempo posterior, a potência do laser teve que ser aumentada ~2- para 3 vezes. No entanto, as estruturas rotuladas ainda são claras. A relação sinal-ruído diminuiu, especialmente nos canais que exibem estruturas postiáticas e IHC, enquanto o canal com o rótulo pré-sináptico foi menos afetado. A quantificação das sinapses funcionais por IHC ainda é possível.
Os resultados típicos para a análise do volume e posição da sinapse no IHC são ilustrados na Figura 4, utilizando a pilha confocal mostrada na Figura 1A. Os IHCs definidos individualmente são exibidos graficamente como reconstruções de grade em cores diferentes, com ou sem as sinapses funcionais (definidas pela colocalização de etiquetas pré e postsináspticas) alocadas a cada uma. Este display pode ser livremente girado em 3D para obter vários ângulos de visão (Figura 4A,B). Os IHCs também podem ser destacados para exibição gráfica (Figura 4B). Uma grande variedade de gráficos de dados, ilustrando diferentes aspectos da distribuição de volumes sinápticos dentro do sistema de coordenadas centrado no IHC, é produzida (exemplos na Figura 4C-E). Os dados quantitativos brutos para cada IHC e cada elemento sináptico também estão disponíveis como planilhas que podem, por exemplo, ser combinadas em várias pilhas confocal para análises estatísticas adicionais.
Figura 1: Exemplos de cóclea processada com sucesso. Projeções z de intensidade máxima de pilhas confocal de (A) um gerbil adulto jovem (10 meses), obtidas em um local coclear correspondente a 1 kHz, e (B) um gerbil envelhecido (38 meses, painel B), obtido em um local coclear equivalente a 500 Hz. Os IHCs foram manchados com um anticorpo contra mioVIIa (azul), fitas pré-sinápticas foram rotuladas com anti-CtBP2 (verde), e manchas de glutamato postânaptica foram rotuladas com anti-GluA2 (vermelho). A cóclea do gerbil envelhecido foi tratada com uma quencher de autofluorescência após a imunostainação. Para maior clareza, os contornos dos IHCs são indicados por linhas tracejadas. Os painéis (A') e (B') apresentam um alargamento das áreas delineadas pelos quadrados na cóclea correspondente dos painéis (A) e (B). Pontas de flecha amarela apontam para sinapses funcionais. Os canais que exibem as estruturas pré e postiáticas (mas não o canal IHC) sofreram desconvolução. Barras de escala = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Abreviaturas: IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = Proteína de ligação terminal C 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrótrópico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de cóclea subótimamente processada. Projeções z de intensidade máxima de pilhas confocal para as quais o processamento foi subótimo, de gerbils que eram (A) 36 meses e (B, C) 38 meses de idade e de locais cocleares correspondentes a 16 kHz, 8 kHz e 32 kHz, respectivamente. Os gerbils dos quais a cóclea nos painéis (A) e (C) foram derivados foram transcardialmente perfumados, e a cóclea do painel (C) foi adicionalmente postfixada por 3 dias em 4% de PFA. A cóclea de (B) foi fixada em 4% de PFA por 2 dias. Cócleas de (A) e (C) foram tratados com a quencher de autofluorescência. Os IHCs foram manchados com um anticorpo contra a mioVIIA (azul), as fitas pré-sinápticas foram rotuladas com anti-CtBP2 (verde), e manchas de glutamato postânaptic foram rotuladas com anti-GluA2 (vermelho). Todos os canais foram desconvolvados. Brilho e contraste foram ajustados após a varredura confocal. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: PFA = paraformaldeído; IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = Proteína de ligação terminal C 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrótrópico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Estabilidade do imunolabel após armazenamento prolongado. Projeções z de intensidade máxima de pilhas confocal de um jovem adulto gerbil (10 meses), tomadas no local coclear de 16 kHz, (A) 3 meses após a coloração e (B) em um local coclear ligeiramente mais basal na mesma peça coclear 29,5 meses após a coloração. A cóclea foi corrigida em 4% de PFA por 2 dias. Para clareza, (A') e (B') ampliam apenas algumas sinapses funcionais das áreas indicadas por quadrados em (A) e (B), respectivamente. Os IHCs foram manchados com um anticorpo contra a mioVIIA (azul), as fitas pré-sinápticas foram rotuladas com anti-CtBP2 (verde), e manchas de glutamato postânaptic foram rotuladas com anti-GluA2 (vermelho). A potência laser para os canais IHC foi de 1,3% e 3%, para os canais pré-sinápticos 0,4% e 1,1%, e para os canais postynaptic 1,1% e 2% em (A) e (B), respectivamente. Note que em (A), as listras azuis são visíveis na parte superior dos IHCs, que resultam do uso de um telefone celular nas proximidades do microscópio confocal. Barras de escala = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Abreviaturas: PFA = paraformaldeído; IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = Proteína de ligação terminal C 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrótrópico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos da quantificação do volume sinapse. (A) Dez IHCs mostrados como reconstruções de grade de cores diferentes baseadas no imunolabel myoVIIa. Suas sinapses funcionais associadas, definidas por elementos ctbp2-(verde) e rotulados glua2 (vermelho), são exibidas juntamente com os IHCs, e também separadamente abaixo, para clareza. Observe que o ângulo de visão foi escolhido para ser perpendicular ao eixo longo dos IHCs e, portanto, difere da imagem confocal original (Figura 1A). (B) Um dos IHCs destacou-se e mostrou-se girado 90°. O plano preto foi definido manualmente pelo usuário e bissecta o IHC ao longo de seu eixo pilar-modiolar. (C) Gráfico de bolhas mostrando a localização de todas as sinapses funcionais nesta pilha confocal, em relação aos três eixos normalizados de seu respectivo IHC. o tamanho dos símbolos é proporcional ao volume do elemento pré-sináptico. Observe que o ângulo de visão foi escolhido para ser semelhante ao painel (B). (D) Boxplot dos volumes normalizados de elementos sinápticos, separadamente para os parceiros pré-sinápticos (esquerda 2 caixas) e postsiná-sinapticos (direita 2 caixas) de sinapses funcionais e ainda separados de acordo com sua posição na metade do mólolar ou pilar de suas respectivas IHC (cores diferentes). As caixas representam faixas interquartil, com as medianas indicadas por linhas. Bigodes tracejados indicam 1,5 vezes a faixa interquartil, e as cruzes indicam valores desopulo além disso. (E) Dispersão dos volumes normalizados de parceiros pré-vs. postsynaptic de sinapses funcionais. Diferentes símbolos indicam a posição na metade do mólmo ou pilar de seu respectivo IHC. Abreviaturas: IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = Proteína de ligação terminal C 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrótrópico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Distâncias do ápice que equivalem a frequências de destino específicas em cócleas de diferentes comprimentos. As melhores frequências equivalentes foram calculadas com base na equação dada por Müller25. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Com o método descrito neste protocolo, é possível imunolabel IHCs e estruturas sinápticas em cócleas de gerbils jovens adultos e idosos, identificar supostas sinapses funcionais por co-localização de elementos pré e post-sinápticos, alocá-los para IHCs individuais e quantificar seu número, volume e localização. Os anticorpos utilizados nesta abordagem também rotularam células ciliadas externas (OHCs; myoVIIa) e suas fitas pré-sinápticas. Além disso, uma alternativa viável para a imunolabelagem de ambos os IHCs e OHCs é um anticorpo contra a otoferlina, com OSCs aparecendo muito mais fracos que os IHCs.
A perfusão pode ser realizada usando duas configurações diferentes. 1) Um sistema de linha de gotejamento alimentado pela gravidade no qual uma única garrafa alimentando uma linha comercial de gotejamento é suspensa em uma roda de polia aproximadamente 1,5 m acima do animal. Os fluidos são introduzidos sucessivamente após a redução da garrafa, que está aberta na parte superior. 2) Um sistema que utiliza uma bomba peristáltica de velocidade variável digital, com um tubo fino e longo aberto em uma extremidade para pegar o fluido e uma agulha que pode ser facilmente anexada na outra extremidade. Ambos funcionam igualmente bem, e as diferenças sutis não serão elaboradas aqui. Os autores recomendam especificamente, no entanto, uma bancada no estilo rascunho, com o animal em uma plataforma perfurada e a fumaça extraída abaixo. Isso permite um bom acesso à área cirúrgica sem comprometer a função de escape (ao contrário de trabalhar em um armário de fumaça aberta).
A fixação adequada do tecido é de importância crítica, pois caso contrário, o epitélio sensorial se desprenderá e se desintegrará durante a dissecção. No gerbil, é necessária uma exposição mais prolongada ao fixador do que comumente utilizada (por exemplo, para camundongos 17,27,13 ou cobaias 28). O método preferido para gerbils é a rápida extração da cóclea após a morte do animal e a fixação de imersão por pelo menos 1,5 dias. Se a perfusão cardiovascular é preferida, é crucial que a fixação se instale em poucos minutos e prossiga bem. Uma vez que pode ser difícil, em última análise, avaliar a qualidade da fixação durante a perfusão, recomenda-se postfixar rotineiramente a cóclea como descrito.
É importante estar em conformidade com as etapas de lavagem, em que a última etapa de lavagem (etapa 2.7) é a mais importante. Se não for adequadamente lavado, o tecido é pegajoso e adere aos instrumentos de dissecção, o que dificulta a dissecção. Recomenda-se também o uso de uma quencher de autofluorescência em cóclea colhida de gerbils envelhecidos para reduzir a fluorescência não específica. A autofluorescência pode se originar da lipofuscina, que é comum no tecido de animais idosos 29,30,31, e parece estar amplamente animado, bem como amplamente emitindo. Quando excitada com um comprimento de onda no espectro UV (λ = 364 nm), a lipofuscina tem uma ampla faixa de emissão (λ = 400-700 nm, com um máximo de ~λ = 568 nm)32. No tecido miocárdio humano, a lipofuscina é visível com uma excitação de λ = 555 nm e emissão de λ = 605 nm33. Da mesma forma, nos IHCs dos gerbils, os autores notaram um aumento da fluorescência não específica mais proeminente no canal utilizado para o anticorpo AF568, o que sugere autofluorescência de grânulos lipofuscinados. Uma recomendação geral ao trabalhar com tecido de animais é, portanto, usar a largura de banda de excitação em torno de 550-600 nm para o imunolabel menos crítico.
A medição do comprimento coclear total e a correta identificação de posições cocleares específicas só são possíveis se toda a sua extensão for preservada. Se partes do epitélio sensorial forem perdidas na dissecção, recomenda-se ainda montar a parte restante ou mesmo apenas a peça de gânglio espiral, e manter notas detalhadas. É então geralmente possível estimar a seção faltante com precisão razoável. Se as porções apical da cóclea estiverem completamente preservadas, mas falta a extremidade basal, locais cocleares específicos na parte apical podem ser definíveis calculando as posições com base no comprimento coclear mediano dentro da população gerbil usada porque o desvio do valor real é pequeno.
Uma limitação importante da quantificação do volume da sinapse é que os volumes absolutos resultantes não são comparáveis em diferentes pilhas confocal. A etapa crítica que determina os volumes resultantes dos elementos sinápticos é a escolha do limiar de intensidade para detecção inicial. No entanto, a escolha desse limiar de intensidade é feita subjetivamente pelo usuário no protocolo atual e muitos outros 3,27,34. Além disso, o brilho da imunofluorescência na imagem confocal depende de muitos fatores, que são muito difíceis de padronizar entre as amostras, como espessura do tecido, orientação do tecido em relação ao caminho óptico, duração da exposição ao laser e configurações confocal e deconvolução precisas. Todas essas ressalvas são exacerbadas se material raro for adquirido ao longo de um período considerável de tempo, como é típico para gerbils envelhecidos. Juntos, isso significa que os vieses são muito difíceis de excluir em dados agrupados, e o melhor cenário é um conjunto de dados com alta variância. Recomenda-se, portanto, normalizar rotineiramente os volumes sinápticos ao respectivo volume mediano da pilha confocal individual, conforme introduzido por Liberman et al.3. A desvantagem óbvia é que os volumes sinápticos são então apenas comparáveis dentro de uma determinada pilha de imagens, por exemplo, entre diferentes locais no IHC, mas não entre diferentes locais cocleares ou idades de espécimes.
A rotulagem dupla de estruturas pré e post-sinápticas e a exigência de co-localização permitem uma estimativa mais confiável do número de sinapses funcionais do que usar qualquer um dos rótulos sozinho. Se apenas um rótulo for viável, recomenda-se usar o anti-CtBP2 pré-sináptico, acoplado a AF488 ou tags fluorescentes com especificidades semelhantes de comprimento de onda, por duas razões. Primeiro, fitas órfãs, ou seja, elementos rotulados pelo CtBP2 sem um rótulo postsináspico co-localizado, parecem ser raros17, e os autores confirmaram isso para gerbils envelhecidos. Assim, o erro introduzido por não poder verificar a co-localização com um parceiro postinápico é pequeno. Deve-se notar, no entanto, que isso se torna uma questão mais significativa ao examinar orelhas expostas ao ruído (por exemplo,28). Em segundo lugar, em casos com alto sinal de fluorescência de origem pouco clara, o ruído tipicamente afetava o canal usando um comprimento de onda de excitação em torno de 568 nm na maior extensão (exemplo na Figura 2B, representando o rótulo GluA2). Pelo menos parte desse ruído pode, no tecido de animais idosos, ser autofluorescência lipofuscina. Assim, para maximizar a chance de um rótulo anti-CtBP2 limpo e único, é aconselhável evitar este canal de comprimento de onda. Por fim, mostrou-se que, com condições adequadas de armazenamento frio e escuro, o imunolabelamento utilizado aqui é estável por longos períodos de tempo, até pelo menos 2,5 anos (Figura 3B), o que torna possível a reavaliação de tecidos valiosos, como de gerbils envelhecidos.
A quantificação do número de sinapse aferente do IHC tornou-se uma métrica importante para avaliar o estado do sistema auditivo periférico em muitos contextos, entre eles a perda auditiva relacionada à idade. Existem vários protocolos publicados agora (por exemplo, gerbils21, ratos17,13, cobaias10,28 e humanos35). O método aqui descrito é, em seus detalhes, específico para gerbils jovens adultos e idosos, mas algumas recomendações gerais foram derivadas que podem ser de uso em outras espécies também.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem Lichun Zhang por ajudar a estabelecer o método e a Unidade de Serviço de Microscopia de Fluorescência, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, para o uso das instalações de imagem. Esta pesquisa foi financiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha - EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
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