Summary
提出了一种通过免疫标记传入突触结构和毛细胞，在老年组织中淬灭自发荧光，解剖和估计耳蜗的长度以及量化通过共聚焦成像获得的图像堆栈中的突触来处理年轻成人和老年沙鼠耳蜗的方案。
Abstract
连接内部毛细胞和传入听觉神经纤维的带状突触的缺失被认为是年龄相关性听力损失的原因之一。检测带状突触丢失的最常见方法是免疫标记，因为它允许从单个耳蜗中的多个视点进行定量采样。然而，感兴趣的结构深埋在骨耳蜗内。沙鼠被用作年龄相关听力损失的动物模型。在这里，描述了固定的常规方案，免疫标记沙鼠耳蜗整个支架，共聚焦成像以及量化带状突触数量和体积。此外，还强调了与从有价值的老年人那里获得优质材料相关的特殊挑战。
沙鼠被安乐死，要么心血管灌注，要么它们的鼓膜大疱被小心地从头骨中解剖出来。耳蜗在顶点和基部打开，并直接转移到固定剂中。无论初始方法如何，耳蜗都会被后固定并随后脱钙。然后用针对突触前和突触后结构和毛细胞的一抗标记组织。接下来，将耳蜗与二级荧光标记抗体一起孵育，这些抗体对各自的主要抗体具有特异性。然后用自发荧光淬灭剂处理老年沙鼠的耳蜗，以减少老年动物组织通常实质性的背景荧光。
最后，将耳蜗解剖成6-11节。重建整个人工耳蜗长度，以便可靠地确定个体之间的特定人工耳蜗位置。按顺序获取的共聚焦图像堆栈有助于可视化所选位置的毛细胞和突触。共聚焦堆栈被解卷积，突触要么使用ImageJ手动计数，要么使用Matlab中定制的图像分析程序对突触结构进行更广泛的量化。
Introduction
与年龄相关的听力损失是世界上最常见的疾病之一，影响着世界上三分之一以上的65岁及以上人口1。其根本原因仍在争论中，并正在积极研究，但可能包括连接内毛细胞（IHC）和传入听觉神经纤维的特殊突触的丧失2。这些带状突触包括突触前结构，其囊泡充满与其相连的神经递质谷氨酸盐，以及突触后α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸（AMPA）谷氨酸受体3，4，5。在沙鼠中，约20个传入听觉神经纤维接触一个IHC6，7，8。IHC上面向莫迪奥卢斯的纤维与大突触带相对，而连接IHC柱侧的纤维则面向小突触带（即，在猫9，沙鼠7，豚鼠10和小鼠3，11，12，13，14中）。此外，在沙鼠中，突触前带和突触后谷氨酸斑块的大小正相关7，14。与IHC的双极侧的大带相对的纤维口径小，自发率低，阈值高15。有证据表明，低自发率纤维比位于IHC15柱侧的高自发性低阈值纤维更容易受到噪声暴露10和耳毒性药物16的影响。
带状突触的丧失是耳蜗神经年龄相关性听力损失中最早的退行性事件，而螺旋神经节细胞及其传入听觉神经纤维的丧失则落后于17，18。电生理相关性包括听觉脑干反应17 和复合动作电位8的记录;然而，这些并不反映突触丢失的微妙之处，因为低自发率纤维不有助于这些措施16。更有希望的电生理学指标是质量电位衍生的神经指数19 和周震颤时间响应20。然而，只有当动物除了听觉神经纤维丧失之外没有其他耳蜗病理影响剩余听觉神经纤维的活动时，这些才是可靠的8。此外，沙鼠的行为评估阈值与突触数21无关。因此，只有通过直接检查耳蜗组织，才能可靠地定量存活的带状突触，从而确定功能性听觉神经纤维的数量。
蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）是研究与年龄相关的听力损失的合适动物模型。它的寿命短，具有与人类相似的低频听力，易于维护，并且与与年龄相关的听力损失相关的人类病理学表现出相似性2，22，23，24。沙鼠在达到36个月大时被认为是衰老的，这接近其平均寿命的结束22。重要的是，在安静环境中饲养和老化的沙鼠中已经证明了与年龄相关的带状突触丧失8，21。
在这里，提出了一种免疫标记，解剖和分析不同年龄的沙鼠（从年轻人到老年人）的耳蜗的方案。使用针对前突触 （CtBP2）、突触后谷氨酸受体贴片 （GluA2） 和 IHC （myoVIIa） 成分的抗体。应用自发荧光淬灭剂，减少老化耳蜗的背景，使荧光信号完好无损。此外，还描述了如何解剖耳蜗以检查感觉上皮和纹状血管。测量耳蜗长度是为了能够选择与特定最佳频率相对应的不同耳蜗位置25。突触数的定量是使用免费软件ImageJ26进行的。使用Matlab中编写的软件自定义来执行单个HC中突触体积和位置的额外定量。该软件不公开，因为作者缺乏提供专业文档和支持的资源。
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Protocol
所有协议和程序均由德国下萨克森州有关当局批准，许可证编号为AZ 33.19-42502-04-15/1828和33.19-42502-04-15/1990。该协议适用于蒙古沙鼠（M. unguiculatus）的两性。年轻人是指3-12个月的年龄，而沙鼠被认为是36个月及以上的年龄。如果没有另行说明，可以制备缓冲液和溶液并在冰箱中储存长达数月（4-8°C）。使用前，确保缓冲液和溶液未沉淀。
1. 固定和器官采集
注意：如果只需要耳蜗，建议通过浸泡进行更简单的固定程序。然而，如果还需要一个保存完好的大脑，那么经心灌注是唯一的选择。在这两种情况下，固定剂都是磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的4%多聚甲醛（PFA）。这应该是新鲜制作的，但可以冷冻储存直到使用。使用约 300 mL 的等分试样进行心内灌注，或使用 ~50-100 mL 的耳蜗通过浸泡固定。
注意：PFA是一种有害物质;根据一般实验室安全程序进行处理。
- 经心灌注固定
- 冲洗灌注装置，直到管道中没有任何气泡。在灌注管中填充含有肝素的 PBS（100 mL PBS 中 0.2 mL），以防止血液凝固。一旦管道充满PBS并且流体储存瓶刚刚清空，就停止流动;将200毫升解冻的PFA倒入其中。
注意：该设置现已为动物准备就绪。管中剩余的PBS足以冲洗血液，一旦恢复流动，将自动接着使用固定剂。 - 确保为PFA的流出建立废物收集系统。使用新鲜的套管（19克），并有大剪刀，镊子（尖端扁平），止血器，手术刀或锋利的套管，以及带有针脚的橡胶垫。
- 用腹腔内过量的戊巴比妥（160mg / mL，每只动物0.3mL，体重范围：50-120g）对沙鼠实施安乐死。把动物放回笼子里。当呼吸停止，呼吸变得不规则，间隔30秒或更长时间时，将沙鼠背放在橡胶垫上，并用针固定前爪和一个后爪（留一个后爪自由移动，以便更好地判断灌注成功;见步骤1.1.7之后的注释）。
- 要打开胸腔，用镊子将胸骨上方的皮肤抬起，并用剪刀将皮肤切开胸骨下方约0.5厘米，直到可以看到白色 的xiphoideus。 用镊子将胸骨保持在 膈肌处 ，并沿着横膈膜切开，以很好地观察胸腔。横向切开两侧的肋骨，直到可以很好地进入心脏。确保剪刀的角度相对于沙鼠的身体是平行和平坦的，以避免对器官的损害，从而确保封闭的循环系统。
- 将止血器夹在胸骨上，抬起胸腔，并将止血器放在沙鼠的肩膀上，不要将止血器放在任何身体部位，以避免阻塞血流。
- 稍微打开流体流动，直到大约每2秒有一滴PBS从套管（19 G）流出。用镊子握住心脏，向左转动一点，以便可以清楚地看到左心室。将插管以避免穿透隔膜的角度插入左心室。用手或用另一种止血剂将针头固定到位。
注意：左心室和右心室可以通过其不同的色调来区分;左心室的颜色比心脏组织的其余部分浅。 - 慢慢增加流体流动的压力，并用细剪刀，手术刀或其他套管打开右心房。进一步打开流体流动，直到在滴注室中观察到大约2-3滴/秒，或为泵设置4 mL / min的流量。一旦心脏固定，确保灌注套管保持在原位，不要进一步固定。
注意：成功灌注的迹象是肌肉收缩缓慢，颈部和四肢僵硬，肝脏苍白，肺部红润。灌注不成功的体征是肺部发白，这表明由于隔膜穿刺，肺循环被灌注。 - 如果灌注不成功，尝试将套管进一步向上移动，进入主动脉，并用止血剂将其夹紧到位。
- 将沙鼠斩首。切除大疱，切除其骨骼，如步骤1.2.2中所述。
注意：如果组织未充分固定，则在解剖过程中，感觉上皮将从皮质器官中移出。 - 如果灌注在5-10分钟内没有固定迹象，请中止并立即按照以下程序进行浸渍固定。为此，按照步骤1.2.2中的步骤处理耳蜗，并将组织在螺旋盖容器中约50-80mL的4%PFA中后固定1-2天，在8°C的2D振荡器上。
注意：由于最终很难对灌注期间的固定质量进行评级，因此建议按照所述常规对耳蜗进行固定后检查。
- 冲洗灌注装置，直到管道中没有任何气泡。在灌注管中填充含有肝素的 PBS（100 mL PBS 中 0.2 mL），以防止血液凝固。一旦管道充满PBS并且流体储存瓶刚刚清空，就停止流动;将200毫升解冻的PFA倒入其中。
- 通过组织浸泡固定
- 用腹腔内过量的戊巴比妥（160mg / mL，每只动物0.3mL，体重范围：50-120g）对沙鼠实施安乐死。当沙鼠停止呼吸时，将动物斩首。
- 取出大疱，分别用剪刀和镊子切开并掰开其骨骼，以到达耳蜗。切除骨髓、胼骨和半规管。在顶端和基底转弯处打小孔，用镊子小心地刮擦耳蜗骨。立即将大疱转移到过量的冷固定剂（至少50mL）中，并在轻柔搅拌（2D振荡器[100rpm]）下将组织固定在冷（4-8°C）中2天。
注意：固定组织后，耳蜗可以立即处理或储存在PBS中，含0.05%叠氮化钠。注意：叠氮化钠是有毒的。请注意，储存时间可能会对染色质量产生负面影响。有限的试验表明，将组织储存在叠氮化钠中2年后，免疫染色似乎较弱。
2. 组织制备和免疫标记
- 将乙二胺四乙酸（EDTA）粉末溶解在PBS中，在pH 8下产生0.5 M溶液。为此，将烧杯放在磁力搅拌器上，用PBS总量的约一半填充，然后加入适量的EDTA粉末，产生酸性悬浮液。小心地加入浓缩的氢氧化钠溶液（NaOH），同时用pH计监测pH值。将PBS填充到所需的最终体积，并过滤溶液以防止微生物污染。
注意：只有当悬浮液达到中性pH值时，EDTA粉末才会完全溶解。 - 对于脱钙，将耳蜗转移到PBS中的80 mL 0.5 M EDTA中。在2D振荡器（100rpm）上轻轻搅拌下，将组织在冷（4-8°C）中孵育2天。
注意：脱钙步骤后，组织可以在PBS中储存数天至3周，然后继续进行剩余的处理步骤。对于标记血管纹的抗体，建议此时（即在免疫染色之前）沿修饰轴将耳蜗切成两半，以确保抗体均匀地进入各自的靶标。这是抗体依赖性的，不适用于此处用于标记突触结构和IHC的抗体。使用一块易碎的剃须刀片和刀片架（如步骤4.2中所述）进行切割。 - 在 2 mL 安全密封反应管中执行以下步骤（直到步骤 3.2）。如果组织片太大而无法放入管内，请用剪刀修剪多余的组织。为了提高抗体的渗透性，首先在室温下在2D振荡器（100rpm）上在PBS中1mL的1%曲拉通（Triton X-100）中透化组织1小时。在室温下，在2D振荡器（100rpm）上用1mL 0.2%曲拉通（Triton X-100）在PBS中洗涤组织3x，每次5分钟。
- 为了阻断非特异性抗原，将耳蜗在室温下在2D振荡器（100rpm）上的1mL封闭溶液（3%牛血清白蛋白[BSA]，0.2%曲拉通，在PBS中）中孵育1小时。
注意：封闭溶液可以提前准备，但不应超过〜10天。 - 将以下一抗新鲜稀释在同一等分试样的封闭溶液中：抗肌VIIa（肌球蛋白VIIa）以标记IHC（IgG多克隆兔），稀释1：400;抗CtBP2（C端结合蛋白2）标记突触前带（IgG1单克隆小鼠），稀释1：400;和抗GluA2标记突触后受体贴片（IgG2a单克隆小鼠），稀释1：200。确保用抗体溶液（通常为0.4mL）完全覆盖耳蜗，并将其在37°C下孵育24小时。
- 接下来，在室温下用PBS中的0.2%triton在2D振荡器（100rpm）上洗涤组织5次，每次5分钟。选择二抗以匹配其主要对应物的宿主物种，并在PBS中再次在3%BSA，0.2%曲拉通中新鲜稀释它们：山羊抗小鼠（IgG1）-Alexa荧光团（AF）488，稀释1：1，000;山羊抗小鼠（IgG2a）-AF568，稀释1：500;和驴抗兔-AF647（IgG），稀释1：1，000。将管包裹在铝箔中以防止荧光漂白。将耳蜗在37°C的0.4mL二抗溶液中孵育24小时。
注意：有限的试验表明，与遵循更常见的孵育程序相比，将耳蜗组织在37°C下用一抗和二抗孵育24小时，导致免疫染色更亮，温度更低，持续时间更短。 - 在室温下，用1mL 0.2%triton在PBS中洗涤耳蜗2次5分钟，用PBS洗涤3次，每次在2D振荡器（100rpm）上洗涤5分钟。
注意：经过这些洗涤步骤后，耳蜗可以在〜4°C的冰箱中保持PBS中数天。
3.用自发荧光淬灭剂处理（可选）
注意：来自中年和老年沙鼠的耳蜗显示出广泛的背景自发荧光。在年轻成人组织中，不需要用自体荧光淬灭剂治疗。原则上，可以在免疫染色程序之前使用自发荧光淬灭剂，从而避免无意中减少所需的抗体荧光。然而，根据制造商的数据表，不再可能使用洗涤剂（例如当前方案中的Triton X-100），因为它们从组织中去除了淬灭剂。
- 在立体显微镜下将耳蜗切成两半，如步骤4.2中所述。
- 将自发荧光淬灭器与70%乙醇混合以获得5%溶液，并将该溶液中的耳蜗在室温下在2D振荡器上孵育1分钟。在室温下用1mL PBS在2D振荡器上洗涤耳蜗3次，每次5分钟。
注意：自发荧光淬灭剂是有害的。处理这种物质时戴上手套。
4. 最终精细解剖
- 在立体显微镜下解剖耳蜗。用PBS填充多发胶培养皿及其盖子，并随身携带两个细镊子，Vannas弹簧剪刀，刀片支架和易碎的剃须刀片。根据解剖步骤，从剃须刀片中折断碎片以获得〜2-4 mm的切割表面。通过将三滴安装介质排成一排来准备显微镜载玻片。
注：剃须刀片的切割表面磨损很快。刀片必须在解剖和安装后更换，大约每隔一块耳蜗。 - 如果在步骤3.1中尚未完成，首先在立体显微镜下沿着莫迪奥卢斯将耳蜗切成两半。为此，将一块长于耳蜗盘绕长度的剃须刀片放入刀片架中。将耳蜗放入培养皿中，并用剃须刀片切掉多余的组织。用细镊子将耳蜗固定到位，并沿着镊子切成两半。
- 从一半开始，但将另一半也留在培养皿中。用镊子小心地固定耳蜗的一半，使切削刃朝上。使用细弹簧剪刀切除耳蜗上方的耳蜗骨，覆盖顶点。
- 要开始分离耳蜗碎片，请用剪刀穿过上方（前庭鳞片）和下方（鼓室鳞片）的莫迪奥勒和听觉神经，从而分离中转。
- 切开覆盖人工耳蜗导管内血管纹的耳蜗骨。在皮质器官上方的耳蜗骨两侧沿着血管纹进行两次切口，并使用剃须刀刃最终分离耳蜗碎片。
注意：血管纹很容易以深色条纹的形式出现。沿着血管纹切割使Corti器官完好无损。 - 可选：要收集血管纹，请在Corti器官和血管纹之间小心切割以分离两者。将连接到螺旋韧带的纹状血管（附着在覆盖耳蜗外表面的骨上）并用镊子去除脱钙的骨。将带有条纹面朝上的片子放在显微镜载玻片上，放入一滴安装介质中。
注意：如果收集的部件弯曲得太强烈，则可能需要将其分成更小的部分，以便使其足够平坦以安装在载玻片上。 - 将耳蜗碎片转移到聚苯乙烯培养皿的PBS填充盖子上，确保整个耳蜗支架尽可能平放在载玻片上。去除多余的组织，例如腹侧的螺旋韧带部分和神经侧的螺旋边缘部分。用超细镊子小心地去除胸膜。
- 将耳蜗片放在载玻片上，放入一滴安装介质中。将整个耳蜗安装座放置在载玻片上，使Corti的器官朝上，以避免遮挡光路中的IHC以进行成像。寻找靠近IHC的螺旋边缘的内陷，通过将人工耳蜗片移入矢状平面以识别朝上一侧，这是可见的。
注意：为了在进一步处理过程中从各个耳蜗中以数字方式重建完整的耳蜗，强烈建议记录碎片的草图并注意地标。此外，理想情况下，这些部件应按正确的顺序排列在载玻片上。 - 重复步骤4.3至4.8，直到整个耳蜗转移到显微镜载玻片上。如有必要，添加更多的安装介质，盖玻片，并在边缘涂上黑色指甲油将盖玻片密封到位。让它在室温下在黑暗中干燥，然后将载玻片储存在4°C的黑暗中。
注意：即使感觉上皮本身的某些部分意外丢失，重要的是要安装耳蜗碎片的剩余部分，以便正确估计长度。
5. 耳蜗长度测量
- 使用落射荧光显微镜系统和相关软件从耳蜗碎片的明场图像测量耳蜗的长度。保存每个人工耳蜗的低倍率图像（4倍镜头），并使用显微镜软件的 套索测量工具 沿每个图像中的IHC行绘制一条线。通过将所有部分的长度相加来计算总长度。
注意：当耳蜗内缺少感觉上皮的部分时，插入线。 - 要定义应在单个耳蜗中分析的耳蜗位置，请使用Müller25给出的方程计算其与顶点的相应距离。例如，在耳蜗碎片的打印输出上标记这些位置。
6. 使用共聚焦显微镜进行图像采集
- 使用带有油浸式40倍物镜（数值孔径1.3）和适当油的共聚焦显微镜进行高分辨率成像。
注意：如果共聚焦显微镜具有倒置光路，则载玻片必须倒置。在这种情况下，在开始最终扫描之前，让标本下沉并稳定地停留在盖玻片上约30分钟。或者，使用在整个解剖过程中流动但稍后固化并同时保存荧光的安装介质。 - 激活适当的激光器：该协议使用两个波长为λ = 488 nm和λ = 522 nm的光学泵浦半导体激光器，以及波长为λ = 638 nm的二极管激光器。选择荧光标签的发射范围（AF488：499-542 nm，AF568：582-621 nm，AF647：666-776 nm）。当混合探测器对释放的光子进行计数时，将激光线放置在距离发射曲线至少10nm的位置。
注意：重要的是要对单标记组织进行初步检查，以确保所选的检测器带宽干净地分离颜色通道（即不会导致通道串扰）。无线电波干扰混合探测器，导致最大光子计数，从而在堆栈中引起人为条纹。因此，避免在显微镜附近使用手机。 - 放大组织，直到图像跨越 10 个 IHC。根据奈奎斯特采样选择图像的分辨率，通常为~40-60 nm /像素。将 z 方向的步长设置为 0.3 μm，将成像速度设置为 400-700 Hz。
注意：这两种设置（步长和成像速度）都是使用最佳成像参数和节省扫描时间之间的折衷方案。 - 执行双向采样以缩短成像时间。累积488 nm和638 nm通道3x和522 nm通道6x的帧;此外，每个通道的线路平均为3倍。在 z 维中选择堆栈的起点和终点。
- 使用混合检波器（计数模式）时，将增益设置为100，以避免信噪比降低。设置激光功率，使感兴趣区域中没有像素饱和，但结构主要覆盖整个8位范围。从0.5%的低激光功率开始，然后增加它，直到结构可见。
注意：良好的染色通常需要0.1%至5%之间的激光功率。 - 使用反卷积软件对图像堆栈进行事后处理，以使用理论点扩散功能消除小荧光结构周围的模糊光晕。对实验中的每个堆栈使用相同的设置。将反卷积图像另存为.tif或.ics。
注意：myoVIIa 标签 （IHC） 不会从反卷积中受益，可以省略以节省时间。该软件使用图像文件的元数据;但是，需要指定几个参数，例如光路，嵌入介质或浸入介质。
7. 突触定量
- 在可自由访问的软件ImageJ中打开反卷积堆栈的副本，并使用额外的Biovoxxel插件，该插件也可在其网站上找到。
- 通过拆分通道来调整各个通道的颜色（图像|颜色|拆分通道）和合并（图像|颜色|再次合并通道），并指定不同的颜色。将图像转换为 RGB 堆栈（图像|颜色|堆叠到 RGB）并调整亮度和对比度（图像|调整|亮度/对比度 |如果需要， 可以自动 或有关 最大值的滑块），以便突触前和突触后结构以及IHC标签与背景截然不同。
- 选择五个 IHC，并通过单击堆栈中的所需位置，使用 文本工具 （IHC1-IHC5） 对其进行标记。打开 ROI 管理器（分析|工具|投资回报率经理）;激活复选框 标签 以使用数字标记点。放大感兴趣的 IHC。
- 在多点模式下使用点/多点工具（右键单击该工具可在点模式或多点模式之间进行选择）。单击功能性丝带突触（即，与突触后谷氨酸贴片紧密并置的突触前丝带），同时滚动浏览 z 维。
注意：根据其重叠量和为每个通道选择的颜色，共享像素以混合颜色显示。通常，单个功能突触之间的区别很简单，因为它们彼此之间足够远。 - 勾选所有感兴趣的结构后，单击 ROI 管理器的图形用户界面上的 添加 。单击任意名称，然后选择 重命名。
注： 在点工具选项菜单中选中“ 全部显示 ”复选框（双击 点工具 图标）时， 点 标签仍会保留在堆栈的所有平面中，这有助于避免多次对同一功能区突触进行计数。 - 在选择要计数的下一个 IHC 时，通过使用 手动工具调整图像以完全显示下一个 IHC，从而避免无意中添加计数。从 多点工具 更改为 点工具 ，以避免向以前存储的数据添加更多点数。在下一个 IHC 中单击感兴趣的结构，然后切换回 多点工具。重复步骤 7.4 到 7.5，直到评估了所有感兴趣的 IHC。
- 要保存数据，请单击 ROI 管理器中的数据集，然后单击 度量。等待出现一个新窗口，列出测量的数据点。将此列表另存为电子表格文件（文件|另存为）。通过在 ROI 管理器中激活 “全部显示” 来保存图像。单击“ 展平 ”以将点标签永久添加到堆栈中。关闭图像堆栈时， 同意 保存更改。
8. 分析毛细胞上的突触体积和位置
注意：作者使用了基于Matlab的自定义编程过程。由于它不是公开的，因此这里仅从广义上概述（另见7）。如有兴趣使用，请联系通讯作者。该过程需要TIFF格式的三重标记（IHC，突触前和突触后）图像堆栈作为输入，通过图形界面指导用户完成分析的各个步骤，并以电子表格格式提供结果的广泛输出。
- 将突触结构的位置归一化为由单个 IHC 在柱-修饰轴和耳蜗顶端-基底轴上的范围以及 IHC 的顶部（角质板）到底部（突触极）轴上的 3D 坐标系。
注意：突触元素的体积（突触前和突触后以及功能突触的组合体积）以μm3 为单位提供，并归一化为各自的中位数3。
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Representative Results
耳蜗要么在心血管灌注后用整只动物的固定剂收获，要么在安乐死动物并浸泡固定后迅速解剖。使用后一种方法，IHC在解剖过程中保持在原位，而在灌注不成功且因此组织固定不足的情况下，感觉上皮经常被破坏。请注意，作者遇到的情况是，经心灌注后耳蜗固定不足，而大脑固定仍然足够。通过打开进入耳蜗顶点和基底的孔，并通过浸入4%PFA浸入耳蜗2天来固定耳蜗，仍然可以保存来自下灌注的组织。
根据Müller25 对整个耳蜗进行长度测定，以评估特定耳蜗位置的IHC及其突触，相当于不同的特征频率（表1）。为此，所需的耳蜗位置计算为距耳蜗基底的基底膜长度的百分比。来自年轻成年沙鼠的13粒耳蜗的中位耳蜗长度为11.3毫米（四分位数范围：11.02-11.52毫米）。来自老年沙鼠的24只耳蜗的中位耳蜗长度为11.5毫米（四分位数范围：11.24-11.73毫米）。年轻人和老年耳蜗的长度之间没有显着差异（曼恩 - 惠特尼 U检验： U = -1.62，p = 0.105）;总体中位数为11.48毫米。有人可能会争辩说，单个耳蜗长度的这种变化很小，使用固定长度的位置（以毫米为单位）就足够了。但是，位置频率函数是非线性的。因此，与中位长度的偏差导致基底耳蜗位置的误差大于相对较多的顶端耳蜗位置的误差。例如，对于根据中位数耳蜗长度（即11.48 mm）计算的相当于1 kHz频率的人工耳蜗位置，该样本中最短（10.36 mm）和最长耳蜗（12.28 mm）的相应频率范围分别为1.16 kHz至0.91 kHz。对于基底定位频率（例如，32 kHz），频率范围分别为51.62 kHz至23.97 kHz，对于最短和最长的耳蜗。因此，建议计算每个耳蜗上的单个位置，特别是在检查基底耳蜗位置时。
图1描绘了来自年轻人（10个月，图1A）和老年沙鼠（38个月，图1B）的耳蜗的最大强度z维投影，这是理想免疫标签的例子。在描绘年轻成年沙鼠耳蜗的图像中，myoVIIa标记的IHC（此处以蓝色显示）与黑色背景形成鲜明对比。因此，单个 IHC 很容易被检测到。突触前和突触后结构分别清晰可见，分别为绿色和红色元素。假设它们在紧密并列时形成功能突触（图1A'，B'）。在老年沙鼠的耳蜗中很少有不成对的突触前结构（孤儿丝带）。来自老沙鼠的耳蜗（图1B）用自发荧光淬灭剂处理。IHC标签似乎较弱，尽管该标本中使用的激光功率比用于年轻成年沙鼠的耳蜗的激光功率高三倍。尽管如此，IHC仍然与背景不同。突触前和突触后的结构清晰可见，用于这两个通道的激光功率与年轻成人标本相似甚至更低。来自老年动物的组织通常显示出明显更多的非特异性荧光信号。因此，年轻成人和老年材料方案的主要区别在于用自体荧光淬灭剂治疗。请注意，这是在用荧光标记的抗体进行免疫染色后进行的，并且原则上也可能影响预期的抗体标记。然而，该处理有效地减少了非特异性来源的外来荧光，同时留下了感兴趣的结构的特定标记的足够信号（将图1B与图2B进行比较）。然而，初步结果表明，在纹状血管中，来自老年沙鼠的样品中没有表现出外来荧光。
图 2 显示了处理欠佳的堆栈示例。图2A描绘了一个来自老沙鼠（36个月）的堆栈的最大强度z投影，其中IHC也被不自然地弯曲或撕裂，没有被完整扫描。因此，在此扫描中仅可以看到IHC的顶极和基极。不能排除更多的突触位于IHC缺失的中间部分，因此，不可能进行可靠的分析。因此，所有评估的IHC都必须完全在共聚焦堆栈中扫描，这一点至关重要。图2B显示了在老年沙鼠（38个月）中采样的堆栈的最大强度z投影。由于在这种情况下未使用自发荧光淬灭器，因此来源不明的荧光很高。然而，外来荧光在很大程度上局限于与GluA2标记相关的（红色）通道，这是非常典型的。在这种情况下，如果色带的CtBP2标签相对干净和特异性，则仍然可以计数功能突触。图2C描绘了从老年沙鼠（42个月）获得的堆栈的最大强度z投影。在这里，突触不能分配给单个IHC，因为IHC在很大程度上已经解体;事实上，很难确定有多少IHC被代表。在图3A所示的示例中，在扫描过程中，在共聚焦显微镜附近使用了一部移动电话。蓝色通道（IHC 标签）中可见条纹。幸运的是，在这种情况下，这不会影响突触通道，只影响IHC的上部，因此，分析仍然是可行的。
图3 显示了从年轻成年沙鼠的同一块耳蜗中提取的最大强度z投影，在免疫染色后获得3个月（图3A，A'）和29.5个月（图3B，B'）。为了保持可比性，这些图像不是从完全相同的位置拍摄的（可能从以前的扫描中遭受了漂白），而是从同一个耳蜗碎片中拍摄的。对于在较晚时间点进行的扫描，激光功率必须增加约2到3倍。尽管如此，标记的结构仍然清晰。信噪比有所下降，特别是在显示突触后和IHC结构的通道中，而具有突触前标记的通道受影响较小。根据IHC对功能突触进行定量仍然是可能的。
使用图1A所示的共聚焦堆栈，分析IHC上的突触体积和位置的典型结果如图4所示。单独定义的IHC以图形方式显示为不同颜色的网格重建，具有或不具有分配给每个功能突触的功能突触（由突触前和突触后标签的共定位定义）。该显示器可以在3D中自由旋转以获得各种视角（图4A，B）。IHC也可以单独挑出来进行图形显示（图4B）。生成了各种各样的数据图，说明了以IHC为中心的坐标系内突触体积分布的不同方面（图4C-E中的示例）。每个IHC和每个突触元素的原始定量数据也可以作为电子表格提供，例如，可以在多个共聚焦堆栈中组合以进行进一步的统计分析。
图1：成功加工耳蜗的示例。 来自（A）一只年轻成年沙鼠（10个月）的共聚焦堆栈的最大强度z投影，在相当于1 kHz的人工耳蜗位置获得，以及（B）一只老年沙鼠（38个月，图 B），在相当于500 Hz的人工耳蜗位置获得。 突触后谷氨酸贴片被标记为抗GluA2（红色）。免疫染色后，用自发荧光淬灭剂处理老年沙鼠的耳蜗。为清楚起见，IHC 的轮廓由虚线表示。面板 （A'） 和 （B'） 显示面板 （A） 和 （B） 中相应耳蜗中正方形所勾勒的区域的放大。黄色箭头指向功能突触。显示突触前和突触后结构的通道（但不是IHC通道）经历了反卷积。比例尺 = 10 μm （A，B）， 1 μm （A'，B'）。缩写：IHC =内毛细胞;肌球菌素VIIa = 肌球蛋白VIIa;CtBP2 = C端结合蛋白2;GluA2 = 离子型谷氨酸受体。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：次优处理的耳蜗示例。 处理欠佳的共聚焦堆栈的最大强度 z 投影，分别来自 （A） 36 个月和 （B、C） 38 个月大的沙鼠以及分别对应于 16 kHz、8 kHz 和 32 kHz 的人工耳蜗位置。从图（A）和（C）中衍生出耳蜗的沙鼠经心灌注，并且从面板（C）中另外在4%PFA中后固定3天的耳蜗。将（B）的耳蜗浸入4%PFA中固定2天。（A）和（C）的耳蜗用自体荧光淬灭剂处理。IHC用抗myoVIIa抗体（蓝色）染色，突触前带标有抗CtBP2（绿色），突触后谷氨酸贴片用抗GluA2（红色）标记。所有通道都已解卷积。共聚焦扫描后，亮度和对比度进一步调整。比例尺 = 10 μm。缩写：PFA =多聚甲醛;IHC = 内毛细胞;肌球菌素VIIa = 肌球蛋白VIIa;CtBP2 = C端结合蛋白2;GluA2 = 离子型谷氨酸受体。 请点击此处查看此图的大图。
图3：长期储存后免疫标记的稳定性。 来自年轻成年沙鼠（10 个月）的共聚焦堆栈的最大强度 z 突起，在染色后 16 kHz 的耳蜗位置采集，（A） 染色后 3 个月，以及 （B） 染色后 29.5 个月在同一人工耳蜗块上稍多的基底耳蜗位置。将耳蜗浸泡在4%PFA中2天。为清楚起见，（A'） 和 （B'） 仅放大 （A） 和 （B） 中正方形所指示区域的几个功能突触。IHC用抗myoVIIa抗体（蓝色）染色，突触前带标有抗CtBP2（绿色），突触后谷氨酸贴片用抗GluA2（红色）标记。IHC通道的激光功率分别为1.3%和3%，突触前通道的激光功率分别为0.4%和1.1%，突触后通道的激光功率分别为（A）和（B）中的1.1%和2%。请注意，在（A）中，在IHC的上部可以看到蓝色条纹，这是由于在共聚焦显微镜附近使用移动电话造成的。比例尺 = 10 μm （A， B）， 1 μm （A'， B'）。缩写：PFA =多聚甲醛;IHC = 内毛细胞;肌球菌素VIIa = 肌球蛋白VIIa;CtBP2 = C端结合蛋白2;GluA2 = 离子型谷氨酸受体。 请点击此处查看此图的大图。
图4：突触体积定量的代表性结果。（A）十个IHC显示为基于myoVIIa免疫标记的不同颜色的网格重建。它们的相关功能突触，由共定位的CtBP2-（绿色）和GluA2标记的元素（红色）定义，与IHC一起显示，并且还单独显示在下面，以保持清晰。请注意，选择的视角垂直于IHC的长轴，因此与原始共聚焦图像不同（图1A）。（B） 其中一个IHC被挑出来并显示旋转90°。黑色平面由用户手动定义，并沿其柱状- 变性轴将IHC一分为二。（C）气泡图显示该共聚焦堆栈中所有功能突触的位置，相对于其各自IHC的归一化三个轴。符号的大小与突触前元素的体积成正比。请注意，选择的视角与面板 （B） 相似。（D）突触元素归一化体积的箱形图，分别用于功能突触的突触前（左2箱）和突触后（右2箱）伙伴，并根据其在各自IHC的 modiolar或柱半部分（不同颜色）中的位置进一步分离。方框表示四分位间距，中位数由线表示。虚线胡须表示四分位距的 1.5 倍，十字表示超出四分位数范围的边远值。（E）功能突触的突触前与突触后伴侣的归一化体积的散点图。不同的符号表示其各自IHC的变性或支柱部分的位置。缩写：IHC =内毛细胞;肌球菌素VIIa = 肌球蛋白VIIa;CtBP2 = C端结合蛋白2;GluA2 = 离子型谷氨酸受体。请点击此处查看此图的大图。
表1：与顶点的距离，相当于不同长度的耳蜗中的特定目标频率。 等效最佳频率是根据穆勒25给出的方程计算的。 请按此下载此表格。
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Discussion
使用该协议中概述的方法，可以从年轻成人和老年沙鼠的耳蜗中免疫标记IHC和突触结构，通过突触前和突触后元素的共定位来识别假定的功能突触，将它们分配给单个IHC，并量化它们的数量，体积和位置。这种方法中使用的抗体还标记外毛细胞（OHCs; myoVIIa）及其突触前带。此外，IHC和OHC免疫标记的可行替代方案是针对乙铁林的抗体，OHCs看起来比IHC暗淡得多。
灌注可以使用两种不同的设置进行。1）重力进料滴注管系统，其中喂养商业滴水管线的单个瓶子悬挂在动物上方约1.5米的滑轮上。在降低瓶子后连续引入液体，瓶子在顶部打开。2）使用数字变速蠕动泵的系统，一端打开一根细长的管子以吸入流体，另一端可以轻松连接针头。两者都同样有效，这里不会详细阐述细微的差异。然而，作者特别推荐一个向下的草稿式工作台，将动物放在穿孔的平台上，烟雾从下面抽出。这样可以很好地进入手术区域，而不会影响排气功能（与在开放式通风柜中工作不同）。
组织的正确固定至关重要，否则感觉上皮会在解剖过程中分离和分解。在沙鼠中，需要比常用的更长时间地暴露于固定剂（例如，对于小鼠17，27，13或豚鼠28）。沙鼠的首选方法是在动物死亡后快速提取耳蜗并浸泡固定至少1.5天。如果首选心血管灌注，则注视点在几分钟内进行并顺利进行至关重要。由于在灌注期间很难最终评估固定质量，因此建议按照所述常规对耳蜗进行固定后检查。
遵守洗涤步骤很重要，其中最后一个洗涤步骤（步骤2.7）是最重要的步骤。如果洗得不充分，组织会粘稠并粘附在解剖器械上，这使得解剖变得困难。还建议在从老年沙鼠收获的耳蜗中使用自发荧光淬灭剂，以减少非特异性荧光。自发荧光可能起源于脂褐素，脂褐素在29，30，31老年动物的组织中很常见，并且似乎具有广泛兴奋和广泛发射。当用紫外光谱（λ = 364nm）中的波长激发时，脂褐素具有较宽的发射范围（λ = 400-700nm，最大值为~λ = 568nm）32。在人心肌组织中，可见脂肪霉素，激发λ = 555nm，发射λ = 605nm33。同样，在沙鼠的IHC中，作者注意到非特异性荧光的增加在用于AF568抗体的通道中最为突出，这表明脂褐素颗粒的自发荧光。因此，在处理动物组织时，一般建议是使用550-600nm左右的激发带宽作为最不关键的免疫标记。
只有保留耳蜗总长度并正确识别特定耳蜗位置，才能测量耳蜗总长度。如果感觉上皮的一部分在解剖中丢失，建议仍然安装剩余部分甚至仅螺旋神经节片，并保留详细的注释。然后，通常可以合理准确地估计缺失的部分。如果耳蜗的顶端部分完全保留，但基端缺失，则可以通过根据所用沙鼠种群中中位数的耳蜗长度计算位置来定义顶端部分的特定耳蜗位置，因为与实际值的偏差很小。
突触体积定量的一个重要限制是，所得到的绝对体积在不同的共聚焦堆栈之间不具有可比性。确定突触元素体积的关键步骤是选择初始检测的强度阈值。然而，该强度阈值的选择是由当前协议中的用户和许多其他协议中的用户主观做出的3，27，34。此外，共聚焦图像中免疫荧光的亮度取决于许多因素，这些因素很难在标本中标准化，例如组织厚度，组织相对于光路的方向，激光曝光的持续时间以及精确的共聚焦和反卷积设置。如果在相当长的时间内获得稀有材料，所有这些警告都会加剧，这是衰老沙鼠的典型特征。总之，这意味着在合并数据中很难排除偏差，而最佳情况是具有高方差的数据集。因此，建议常规地将突触体积归一化为单个共聚焦堆栈的相应中位体积，如Liberman等人3所述。明显的缺点是，突触体积仅在给定的图像堆栈内具有可比性，例如，在IHC上的不同位置之间，但在不同的耳蜗位置或标本年龄之间则不然。
突触前和突触后结构的双重标记以及共定位的要求允许比单独使用任何一个标记更可靠地估计功能突触的数量。如果只有一个标记是可行的，建议使用突触前抗CtBP2，与具有相似波长特异性的AF488或荧光标记偶联，原因有两个。首先，孤儿丝带，即没有共同定位突触后标签的CtBP2标记元素，似乎很少见17，作者证实了这一点用于老年沙鼠。因此，由于无法验证与突触后伴侣的共同定位而引入的错误很小。然而，应该注意的是，在检查暴露于噪音的耳朵时，这成为一个更重要的问题（例如，28）。其次，在具有高荧光信号来源不明的情况下，噪声通常使用568nm左右的激发波长最大程度地影响通道（例如 图2B中，代表GluA2标记）。在老年动物的组织中，这种噪音的至少一部分可能是脂褐素自发荧光。因此，为了最大限度地提高获得干净，单个抗CtBP2标签的机会，建议避免使用此波长通道。最后，表明，在适当的冷暗储存条件下，这里使用的免疫标记在很长一段时间内是稳定的，长达至少2.5年（图3B），这使得重新评估有价值的组织，例如来自老年沙鼠的组织，成为可能。
IHC传入突触数的量化已成为评估外周听觉系统在许多情况下状态的重要指标，其中包括与年龄相关的听力损失。现在有各种方案发表（例如，沙鼠21，小鼠17，13，豚鼠10，28和人类35）。这里概述的方法，在其细节上，是针对年轻成年和老年沙鼠的，但已经得出了一些一般性的建议，这些建议也可能在其他物种中使用。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
作者感谢Lichun Zhang帮助建立了该方法和荧光显微镜服务部门，卡尔·冯·奥西茨基大学奥尔登堡分校，用于使用成像设施。这项研究由德国卓越战略-EXC 2177/1下的德国研究基金会（DFG）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
