Summary
Es wird ein Protokoll zur Verarbeitung von Cochleae für junge Erwachsene und ältere Rennmäuse durch Immunmarkierung der afferenten synaptischen Strukturen und Haarzellen, Abschreckung der Autofluoreszenz in gealtertem Gewebe, Sezieren und Abschätzen der Länge der Cochleae und Quantifizierung der Synapsen in Bildstapeln vorgestellt, die mit konfokaler Bildgebung erhalten wurden.
Abstract
Es wird angenommen, dass der Verlust von Bandsynapsen, die innere Haarzellen und afferente Hörnervenfasern verbinden, eine Ursache für altersbedingten Hörverlust ist. Die gebräuchlichste Methode zum Nachweis des Verlustes von Bandsynapsen ist die Immunmarkierung, da sie eine quantitative Probenahme von mehreren tonotopischen Stellen in einer einzelnen Cochlea ermöglicht. Die interessierenden Strukturen sind jedoch tief im Inneren der knöchernen Cochlea vergraben. Rennmäuse werden als Tiermodell für altersbedingten Hörverlust verwendet. Hier werden Routineprotokolle für die Fixierung, die Immunmarkierung von Gerbil-Cochlea-Ganzkörpern, konfokale Bildgebung und die Quantifizierung von Bandsynapsenzahlen und -volumina beschrieben. Darüber hinaus werden die besonderen Herausforderungen hervorgehoben, die mit der Beschaffung von gutem Material von wertvollen alternden Menschen verbunden sind.
Rennmäuse werden eingeschläfert und entweder kardiovaskulär durchblutet, oder ihre Paukenfelle werden vorsichtig aus dem Schädel seziert. Die Cochleae werden an der Spitze und Basis geöffnet und direkt auf das Fixiermittel übertragen. Unabhängig von der Ausgangsmethode werden die Cochleae postfixiert und anschließend entkalkt. Das Gewebe wird dann mit primären Antikörpern gegen prä- und postsynaptische Strukturen und Haarzellen markiert. Als nächstes werden die Cochleae mit sekundären fluoreszenzmarkierten Antikörpern inkubiert, die spezifisch gegen ihre jeweiligen primären Antikörper sind. Die Cochleae gealterter Rennmäuse werden dann mit einem Autofluoreszenz-Quencher behandelt, um die typischerweise erhebliche Hintergrundfluoreszenz älterer Tiergewebe zu reduzieren.
Schließlich werden Cochleae in 6-11 Segmente zerlegt. Die gesamte Cochlea-Länge wird so rekonstruiert, dass bestimmte Cochlea-Stellen zuverlässig zwischen Individuen bestimmt werden können. Konfokale Bildstapel, die sequentiell aufgenommen werden, helfen, Haarzellen und Synapsen an den ausgewählten Stellen zu visualisieren. Die konfokalen Stapel werden dekonvolutiert, und die Synapsen werden entweder manuell mit ImageJ gezählt, oder eine umfangreichere Quantifizierung synaptischer Strukturen wird mit Bildanalyseverfahren durchgeführt, die speziell in Matlab geschrieben wurden.
Introduction
Altersbedingter Hörverlust ist eine der weltweit am weitesten verbreiteten Krankheiten, von der mehr als ein Drittel der Weltbevölkerung im Alter von 65 Jahren und älter betroffenist 1. Die zugrunde liegenden Ursachen werden noch diskutiert und aktiv untersucht, können aber den Verlust der spezialisierten Synapsen umfassen, die innere Haarzellen (IHCs) mit afferenten Hörnervenfasern verbinden2. Diese Bandsynapsen bestehen aus einer präsynaptischen Struktur, an die Vesikel mit dem daran gebundenen Neurotransmitter Glutamat gefüllt sind, sowie aus postsynaptischen α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionsäure (AMPA)-Glutamatrezeptoren 3,4,5. In der Rennmaus berühren ~ 20 afferente Hörnervenfasern eine IHC 6,7,8. Fasern auf dem IHC, die dem Modiolus zugewandt sind, stehen großen synaptischen Bändern gegenüber, während die Fasern, die sich auf der Säulenseite des IHC verbinden, kleinen synaptischen Bändern gegenüberstehen (dh bei Katzen9, Rennmäusen7, Meerschweinchen 10 und Mäusen 3,11,12,13,14). Darüber hinaus sind bei der Rennmaus die Größe der präsynaptischen Bänder und der postsynaptischen Glutamatflecken positiv korreliert 7,14. Fasern, die großen Bändern auf der modiolären Seite des IHC entgegengesetzt sind, sind kleinkalibrig und haben niedrige spontane Raten und hohe Schwellen15. Es gibt Hinweise darauf, dass Fasern mit niedriger spontaner Rateanfälliger für Lärmexposition 10 und ototoxische Medikamente 16 sind als hochspontane niedrigschwellige Fasern, die sich auf der Säulenseite von IHCs15 befinden.
Der Verlust von Bandsynapsen ist das früheste degenerative Ereignis bei altersbedingtem Hörverlust im Cochlea-Neuralbereich, während der Verlust von Spiralganglionzellen und ihren afferenten Hörnervenfasern hinter17,18 zurückbleibt. Elektrophysiologische Korrelate umfassen Aufzeichnungen von auditiven Hirnstammreaktionen17 und zusammengesetzten Aktionspotentialen8; Diese spiegeln jedoch nicht die Feinheiten des Synapsenverlustes wider, da Fasern mit niedriger spontaner Rate nicht zu diesen Maßnahmen beitragen16. Weitere vielversprechende elektrophysiologische Metriken sind der vom Massenpotential abgeleitete neuronale Index19 und die peristimulus time response20. Diese sind jedoch nur dann zuverlässig, wenn das Tier keine anderen Cochlea-Pathologien hat, abgesehen vom Verlust der Hörnervenfasern, die die Aktivität der verbleibenden Hörnervenfasern beeinflussen8. Darüber hinaus wurden verhaltensbezogene Schwellenwerte in der Rennmaus nicht mit Synapsenzahlen21 korreliert. Eine zuverlässige Quantifizierung der überlebenden Bandsynapsen und damit der Anzahl der funktionellen Hörnervenfasern ist daher nur durch direkte Untersuchung des Cochlea-Gewebes möglich.
Die Mongolische Rennmaus (Meriones unguiculatus) ist ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung von altersbedingtem Hörverlust. Es hat eine kurze Lebensdauer, hat ein niederfrequentes Gehör ähnlich dem Menschen, ist leicht zu pflegen und zeigt Ähnlichkeiten mit menschlichen Pathologien im Zusammenhang mit altersbedingtem Hörverlust 2,22,23,24. Rennmäuse gelten als gealtert, wenn sie 36 Monate alt sind, was dem Ende ihrer durchschnittlichen Lebensdauervon 22 entspricht. Wichtig ist, dass ein altersbedingter Verlust von Bandsynapsen bei Rennmäusen nachgewiesen wurde, die in ruhigen Umgebungen aufgezogen und gealtert sind 8,21.
Hier wird ein Protokoll zur Immunmarkierung, Sezierung und Analyse von Cochleae von Rennmäusen unterschiedlichen Alters, von jungen Erwachsenen bis zu älteren Menschen, vorgestellt. Antikörper, die gegen Komponenten der Präsynapse (CtBP2), postsynaptische Glutamatrezeptorpflaster (GluA2) und IHCs (myoVIIa) gerichtet sind, werden verwendet. Es wird ein Autofluoreszenz-Quencher angewendet, der den Hintergrund in gealterten Cochleae reduziert und das Fluoreszenzsignal intakt lässt. Weiterhin wird beschrieben, wie die Cochlea zu sezieren ist, um sowohl das sensorische Epithel als auch die Stria vascularis zu untersuchen. Die Cochlea-Länge wird gemessen, um die Auswahl verschiedener Cochlea-Positionen zu ermöglichen, die bestimmten besten Frequenzenentsprechen 25. Die Quantifizierung von Synapsenzahlen erfolgt mit der frei verfügbaren Software ImageJ26. Eine zusätzliche Quantifizierung von Synapsenvolumina und -positionen innerhalb des einzelnen HC erfolgt mit einer in Matlab benutzerdefinierten Software. Diese Software wird nicht öffentlich zugänglich gemacht, da den Autoren die Ressourcen fehlen, um professionelle Dokumentation und Unterstützung bereitzustellen.
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Protocol
Alle Protokolle und Verfahren wurden von den zuständigen Behörden Niedersachsens, Deutschland, mit den Genehmigungsnummern AZ 33.19-42502-04-15/1828 und 33.19-42502-04-15/1990 genehmigt. Dieses Protokoll gilt für mongolische Rennmäuse (M. unguiculatus) beiderlei Geschlechts. Junger Erwachsener bezieht sich auf das Alter von 3-12 Monaten, während Rennmäuse im Alter von 36 Monaten und älter gelten. Wenn nicht anders angegeben, können Puffer und Lösungen vorbereitet und bis zu mehreren Monaten (4-8 °C) im Kühlschrank gelagert werden. Stellen Sie vor dem Gebrauch sicher, dass die Puffer und Lösungen nicht ausgefällt wurden.
1. Fixierung und Orgelentnahme
HINWEIS: Wenn nur die Cochleae benötigt werden, wird empfohlen, das etwas einfachere Verfahren der Fixierung durch Eintauchen durchzuführen. Wenn jedoch auch ein gut erhaltenes Gehirn benötigt wird, ist die transkardiale Perfusion die einzige Option. Das Fixiermittel ist in beiden Fällen 4% Paraformaldehyd (PFA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Diese sollte frisch zubereitet werden, kann aber bis zur Verwendung gefroren gelagert werden. Verwenden Sie Aliquots von ~ 300 ml für eine transkardiale Perfusion oder ~ 50-100 ml pro Cochlea für die Fixierung durch Immersion.
ACHTUNG: PFA ist ein gefährlicher Stoff; Behandeln Sie es gemäß den allgemeinen Sicherheitsverfahren des Labors.
- Fixierung durch transkardiale Perfusion
- Spülen Sie das Perfusionssetup, bis der Schlauch frei von Luftblasen ist. Füllen Sie den Perfusionsschlauch mit PBS, das Heparin enthält (0,2 ml in 100 ml PBS), um eine Blutgerinnung zu verhindern. Stoppen Sie den Fluss, sobald der Schlauch mit PBS gefüllt ist und sich die Flüssigkeitsvorratsflasche gerade geleert hat. Gießen Sie 200 ml aufgetautes PFA hinein.
HINWEIS: Das Setup ist jetzt bereit für das Tier. Das verbleibende PBS im Schlauch reicht aus, um das Blut auszuspülen, und wird automatisch von dem Fixiermittel gefolgt, sobald der Fluss wieder aufgenommen wird. - Stellen Sie sicher, dass ein Abfallsammelsystem für den Abfluss von PFA vorhanden ist. Verwenden Sie eine frische Kanüle (19 G) und haben Sie eine große Schere, eine Pinzette (mit abgeflachter Spitze), Hämostaten, Skalpell oder scharfe Kanüle und eine Gummimatte mit Stiften zur Hand.
- Euthanasie die Rennmaus mit einer intraperitonealen Überdosierung von Pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml pro Tier, Körpergewichtsbereich: 50-120 g). Setzen Sie das Tier wieder in seinen Käfig. Wenn der Atemstillstand so einsetzt, dass die Atmung in Abständen von 30 s oder länger unregelmäßig wird, legen Sie die Rennmaus auf den Rücken auf die Gummimatte und fixieren Sie beide Vorderpfoten und eine Hinterpfote mit Stiften (lassen Sie eine Hinterpfote frei, um sich zu bewegen, um den Durchblutungserfolg besser beurteilen zu können; siehe Hinweis nach Schritt 1.1.7).
- Um die Brusthöhle zu öffnen, heben Sie die Haut über dem Brustbein mit einer Pinzette an und schneiden Sie die Haut etwa 0,5 cm unterhalb des Brustbeins mit einer Schere, bis der weiß gefärbte Processus xiphoideus sichtbar ist. Halten Sie das Brustbein am Processus xiphoideus mit einer Pinzette fest und schneiden Sie es entlang des Zwerchfells, um einen guten Blick in die Brusthöhle zu erhalten. Schneiden Sie die Rippen seitlich auf beiden Seiten ab, bis ein guter Zugang zum Herzen besteht. Stellen Sie sicher, dass der Winkel der Schere parallel und flach in Bezug auf den Körper der Rennmaus ist, um Schäden an Organen zu vermeiden und somit ein geschlossenes Kreislaufsystem zu gewährleisten.
- Klemmen Sie einen Hämostat auf das Brustbein, heben Sie den Brustkorb an und legen Sie den Hämostat über die Schulter der Rennmaus, ohne den Hämostat auf Körperteilen abzulegen, um zu vermeiden, dass der Blutfluss blockiert wird.
- Öffnen Sie den Flüssigkeitsstrom leicht, bis etwa alle 2 s ein Tropfen PBS aus der Kanüle (19 G) fließt. Halten Sie das Herz mit einer Pinzette fest und drehen Sie es ein wenig nach links, so dass der linke Ventrikel deutlich zu sehen ist. Führen Sie die Kanüle in einem Winkel in den linken Ventrikel ein, der ein Eindringen in das Septum vermeidet. Halten Sie die Nadel entweder von Hand oder mit einem anderen Hämostat an Ort und Stelle.
HINWEIS: Der linke und rechte Ventrikel können durch ihre unterschiedlichen Farbtöne unterschieden werden; Der linke Ventrikel erscheint heller in der Farbe als der Rest des Herzgewebes. - Erhöhen Sie langsam den Druck des Flüssigkeitsstroms und öffnen Sie den rechten Vorhof entweder mit einer feinen Schere, einem Skalpell oder einer anderen Kanüle. Öffnen Sie den Flüssigkeitsstrom weiter, bis etwa 2-3 Tropfen / s an der Tropfkammer beobachtet werden, oder stellen Sie einen Durchfluss von 4 ml / min für die Pumpe ein. Sobald die Fixierung des Herzens einsetzt, stellen Sie sicher, dass die Perfusionskanüle an Ort und Stelle bleibt, ohne weiter gehalten zu werden.
HINWEIS: Anzeichen einer erfolgreichen Perfusion sind langsame Muskelkontraktionen, Versteifung des Halses und der Extremitäten, blasse Leber und rosige Lungen. Das Zeichen einer erfolglosen Perfusion ist die Aufhellung der Lunge, was darauf hindeutet, dass der Lungenkreislauf aufgrund einer Punktion des Septums durchblutet ist. - Bei erfolgloser Durchblutung versuchen Sie, die Kanüle weiter nach oben in die Aorta zu bewegen und mit einem Hämostat festzuklemmen.
- Enthaupte die Rennmaus. Entfernen Sie die Bullen und schneiden und brechen Sie ihren Knochen ab, wie in Schritt 1.2.2 beschrieben.
HINWEIS: Wenn das Gewebe nicht ausreichend fixiert ist, löst sich das sensorische Epithel während der Dissektion aus dem Corti-Organ. - Wenn die Perfusion innerhalb von 5-10 Minuten keine Anzeichen einer Fixierung zeigt, brechen Sie sie ab und befolgen Sie sofort das folgende Verfahren zur Fixierung durch Eintauchen. Behandeln Sie dazu die Cochlea wie in Schritt 1.2.2 und postfixieren Sie das Gewebe in ca. 50-80 ml 4% PFA in Schraubverschlussbehältern für 1-2 Tage auf einem 2D-Shaker bei 8 °C.
HINWEIS: Da es schwierig sein kann, die Qualität der Fixierung während der Perfusion letztendlich zu bewerten, wird empfohlen, die Cochleae routinemäßig wie beschrieben zu postfixieren.
- Spülen Sie das Perfusionssetup, bis der Schlauch frei von Luftblasen ist. Füllen Sie den Perfusionsschlauch mit PBS, das Heparin enthält (0,2 ml in 100 ml PBS), um eine Blutgerinnung zu verhindern. Stoppen Sie den Fluss, sobald der Schlauch mit PBS gefüllt ist und sich die Flüssigkeitsvorratsflasche gerade geleert hat. Gießen Sie 200 ml aufgetautes PFA hinein.
- Fixierung durch Eintauchen in das Gewebe
- Euthanasie die Rennmäuse mit einer intraperitonealen Überdosierung von Pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml pro Tier, Körpergewichtsbereich: 50-120 g). Wenn die Rennmaus aufgehört hat zu atmen, enthaupten Sie das Tier.
- Entfernen Sie die Bullen und schneiden und brechen Sie ihren Knochen mit einer Schere bzw. einer Pinzette ab, um die Cochleae zu erreichen. Entfernen Sie die Kanäle Maellus, Incus und Halbkreis. Machen Sie kleine Löcher an der Spitze und in der basalen Drehung, indem Sie vorsichtig mit der Pinzette über das Cochlea-Knochen kratzen. Übertragen Sie die Bullen sofort in einen Überschuss an kaltem Fixiermittel (mindestens 50 ml) und fixieren Sie das Gewebe in der Kälte (4-8 ° C) unter sanfter Bewegung (2D-Shaker [100 U / min]) für 2 Tage.
HINWEIS: Nach dem Fixieren des Gewebes können die Cochleae entweder sofort verarbeitet oder in PBS mit 0,05% Natriumazid gelagert werden. ACHTUNG: Natriumazid ist giftig. Beachten Sie, dass die Lagerdauer die Qualität der Färbung negativ beeinflussen kann. Begrenzte Studien haben gezeigt, dass die Immunfärbung nach 2 Jahren der Lagerung des Gewebes in Natriumazid schwächer erschien.
2. Gewebeaufbereitung und Immunmarkierung
- Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Pulver in PBS lösen, um eine 0,5 M Lösung bei pH 8 zu erzeugen. Legen Sie dazu ein Becherglas auf einen Magnetrührer, füllen Sie es mit etwa der Hälfte der Gesamtmenge des PBS und fügen Sie die entsprechende Menge EDTA-Pulver hinzu, was zu einer sauren Suspension führt. Fügen Sie vorsichtig konzentrierte Natriumhydroxidlösung (NaOH) hinzu, während Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät überwachen. Füllen Sie PBS bis zum gewünschten Endvolumen auf und filtern Sie die Lösung, um eine mikrobielle Kontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Das EDTA-Pulver löst sich erst dann vollständig auf, wenn die Suspension einen neutralen pH-Wert erreicht hat. - Zur Entkalkung die Cochleae auf 80 ml 0,5 M EDTA in PBS übertragen. Inkubieren Sie das Gewebe in der Kälte (4-8 °C) unter sanfter Bewegung auf dem 2D-Shaker (100 U / min) für 2 Tage.
HINWEIS: Nach dem Entkalkungsschritt kann das Gewebe mehrere Tage bis zu 3 Wochen in PBS gelagert werden, bevor mit den verbleibenden Verarbeitungsschritten fortgefahren wird. Für Antikörper, die die Stria vascularis markieren, ist es ratsam, die Cochleae an dieser Stelle (d.h. vor der Immunfärbung) entlang der Modiolarachse in zwei Hälften zu schneiden, um einen einheitlichen Zugang der Antikörper zu ihren jeweiligen Zielen zu gewährleisten. Dies ist antikörperabhängig und gilt nicht für die Antikörper, die hier zur Markierung synaptischer Strukturen und IHCs verwendet werden. Verwenden Sie für das Schneiden ein Stück zerbrechliche Rasierklinge und einen Klingenhalter (wie in Schritt 4.2 beschrieben). - Führen Sie die folgenden Schritte (bis Schritt 3.2) in 2-ml-Reaktionsröhrchen mit sicherer Abdichtung durch. Wenn das Gewebestück zu groß ist, um in den Schlauch zu passen, schneiden Sie das überschüssige Gewebe mit einer Schere ab. Um die Penetration der Antikörper zu verbessern, permeabilisieren Sie zunächst das Gewebe in 1 ml von 1% Triton (Triton X-100) in PBS auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für 1 h. Waschen Sie das Gewebe 3x mit 1 ml 0,2% Triton (Triton X-100) in PBS auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten.
- Um unspezifische Antigene zu blockieren, inkubieren Sie die Cochleae in 1 ml blockierender Lösung (3% Rinderserumalbumin [BSA], 0,2% Triton, in PBS) auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für 1 h.
HINWEIS: Die Blockierungslösung kann im Voraus vorbereitet werden, sollte aber nicht älter als ~ 10 Tage sein. - Verdünnen Sie die folgenden primären Antikörper frisch im selben Aliquot der blockierenden Lösung: Anti-MyoVIIa (Myosin VIIa) zur Kennzeichnung von IHCs (IgG polyklonales Kaninchen), verdünnt 1:400; Anti-CtBP2 (C-terminales bindendes Protein 2) zur Markierung präsynaptischer Bänder (monoklonale IgG1-Maus), verdünnt 1:400; und Anti-GluA2 zur Kennzeichnung postsynaptischer Rezeptorpflaster (monoklonale IgG2a-Maus), verdünnt 1:200. Stellen Sie sicher, dass die Cochleae vollständig mit der Antikörperlösung (typischerweise 0,4 ml) bedeckt sind, und inkubieren Sie sie bei 37 °C für 24 h.
- Als nächstes waschen Sie das Gewebe 5x mit 0,2% Triton in PBS auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur für jeweils 5 Minuten. Wählen Sie sekundäre Antikörper, die zu den Wirtsspezies ihrer primären Gegenstücke passen, und verdünnen Sie sie erneut frisch in 3% BSA, 0,2% Triton, in PBS: Ziegen-Anti-Maus (IgG1)-Alexa-Fluorophor (AF) 488, verdünnt 1:1.000; Ziegen-Anti-Maus (IgG2a)-AF568, verdünnt 1:500; und Esel-Anti-Kaninchen-AF647 (IgG), verdünnt 1:1.000. Wickeln Sie die Tube in Aluminiumfolie, um ein Ausbleichen der Fluoreszenz zu verhindern. Inkubieren Sie die Cochleae in 0,4 ml sekundärer Antikörperlösung bei 37 °C für 24 h.
HINWEIS: Begrenzte Studien haben gezeigt, dass die Inkubation von Cochlea-Gewebe bei 37 °C für 24 h mit primären und sekundären Antikörpern zu einer helleren Immunfärbung führte als nach dem häufigeren Inkubationsverfahren mit niedrigeren Temperaturen und kürzerer Dauer. - Waschen Sie die Cochleae 2x mit 1 ml 0,2% Triton in PBS für jeweils 5 min und 3x mit PBS für jeweils 5 min auf dem 2D-Shaker (100 U / min) bei Raumtemperatur.
HINWEIS: Nach diesen Waschschritten können die Cochleae mehrere Tage in PBS im Kühlschrank bei ~4 °C verbleiben.
3. Behandlung mit Autofluoreszenzabfrage (optional)
HINWEIS: Cochleae von Rennmäusen mittleren Alters und im Alter zeigen eine umfangreiche Hintergrundautofluoreszenz. Im Gewebe junger Erwachsener ist eine Behandlung mit einem Autofluoreszenz-Quencher nicht notwendig. Grundsätzlich ist es möglich, den Autofluoreszenz-Quencher vor dem Immunfärbungsverfahren anzuwenden, wodurch dann eine unbeabsichtigte Reduktion der gewünschten Antikörperfluoreszenz vermieden wird. Laut dem Datenblatt des Herstellers ist die Verwendung von Reinigungsmitteln (wie Triton X-100 im aktuellen Protokoll) jedoch nicht mehr möglich, da sie den Querncher aus dem Gewebe entfernen.
- Die Cochleae werden unter einem Stereomikroskop halbiert, wie in Schritt 4.2 beschrieben.
- Mischen Sie den Autofluoreszenzabscheider mit 70% Ethanol, um eine 5% ige Lösung zu erhalten, und inkubieren Sie die Cochleae in dieser Lösung auf dem 2D-Shaker bei Raumtemperatur für 1 min. Waschen Sie die Cochleae 3x mit 1 ml PBS auf dem 2D-Shaker bei Raumtemperatur für jeweils 5 min.
ACHTUNG: Der Autofluoreszenz-Quencher ist gefährlich und schädlich. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit dieser Substanz umgehen.
4. Endgültige Feindissektion
- Sezieren Sie die Cochlea unter einem Stereomikroskop. Füllen Sie eine Polystyrol-Petrischale und ihren Deckel mit PBS und halten Sie zwei feine Pinzetten, eine Vannas-Federschere, einen Klingenhalter und eine zerbrechliche Rasierklinge bereit. Brechen Sie Stücke von der Rasierklinge, um je nach Sezierschritt eine Schnittfläche von ~2-4 mm zu erhalten. Bereiten Sie einen Objektträger vor, indem Sie drei Tropfen Montagemedium hintereinander legen.
HINWEIS: Die Schnittfläche der Rasierklinge nutzt sich schnell ab. Die Klinge muss nach dem Sezieren und Montieren von etwa jedem zweiten Stück der Cochlea ausgetauscht werden. - Wenn dies nicht bereits in Schritt 3.1 geschehen ist, schneiden Sie zuerst die Cochlea entlang des Modiolus unter einem Stereomikroskop in zwei Hälften. Positionieren Sie dazu ein Stück einer Rasierklinge, das länger als die gewickelte Länge der Cochlea ist, in einen Klingenhalter. Legen Sie die Cochlea in die Petrischale und schneiden Sie überschüssiges Gewebe mit dem Stück Rasierklinge weg. Halten Sie die Cochlea mit einer feinen Pinzette an Ort und Stelle und schneiden Sie sie entlang des Modiolus in zwei Hälften.
- Beginnen Sie mit einer Hälfte, lassen Sie aber auch die andere Hälfte in der Petrischale. Fixieren Sie die Cochlea-Hälfte vorsichtig mit einer Pinzette, so dass die Schneide nach oben zeigt. Verwenden Sie eine feine Federschere, um den Knochen der Cochlea oberhalb des Helicozements abzuschneiden und die Spitze zu bedecken.
- Um die Trennung der Cochlea-Stücke zu beginnen, isolieren Sie die mittlere Drehung, indem Sie mit einer Schere durch den Modiolus und den Hörnerv schneiden, oben (scala vestibuli) und unten (scala tympani).
- Schneiden Sie durch den Cochlea-Knochen, der die Stria vascularis im Cochlea-Gang bedeckt. Machen Sie zwei Schnitte auf beiden Seiten des Cochlea-Knochens über dem Corti-Organ und entlang der Stria vascularis und verwenden Sie die Rasierklinge, um schließlich die Cochlea-Stücke zu trennen.
HINWEIS: Die Stria vascularis ist als dunkler Streifen gut sichtbar. Das Schneiden entlang der Stria vascularis lässt das Corti-Organ intakt. - Optional: Um die Stria vascularis zu sammeln, schneiden Sie vorsichtig zwischen das Organ von Corti und die Stria vascularis, um die beiden zu trennen. Lassen Sie die Stria vascularis mit dem Spiralband verbunden (das an dem Knochen befestigt ist, der die äußere Oberfläche der Cochlea bedeckt) und entfernen Sie den entkalkten Knochen mit einer Pinzette. Legen Sie das Stück mit der Stria-Seite nach oben auf den Objektträger in einem Tropfen Montagemedium.
HINWEIS: Wenn das gesammelte Stück zu stark gekrümmt ist, kann es notwendig sein, es in kleinere Stücke zu teilen, damit es flach genug für die Montage auf dem Schlitten ist. - Die Cochlea-Stücke auf den PBS-gefüllten Deckel der Polystyrol-Petrischale geben, um sicherzustellen, dass die Cochlea-Ganzkörperhalterungen so flach wie möglich auf dem Schlitten liegen. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, wie Teile des Spiralbandes auf der abneuralen Seite und Teile des spiralförmigen Limbus auf der neuronalen Seite. Entfernen Sie die tektoriale Membran vorsichtig mit einer superfeinen Pinzette.
- Legen Sie die Cochlea-Stücke auf den Schlitten in einen Tropfen Montagemedium. Platzieren Sie die Cochlea-Ganzkörperhalterungen mit dem Corti-Organ nach oben auf dem Objektträger, um zu vermeiden, dass die IHCs im optischen Pfad für die Bildgebung verdeckt werden. Suchen Sie nach einer Invagination des spiralförmigen Limbus in unmittelbarer Nähe der IHCs, die sichtbar ist, indem Sie das Cochlea-Stück in die Sagittalebene verschieben, um die nach oben gerichtete Seite zu identifizieren.
HINWEIS: Um die komplette Cochlea aus ihren Einzelstücken während der Weiterverarbeitung digital zu rekonstruieren, empfiehlt es sich dringend, Skizzen der Stücke zu dokumentieren und Landmarken zu notieren. Des Weiteren sollten die Stücke idealerweise in der richtigen Reihenfolge auf dem Dia angeordnet werden. - Wiederholen Sie die Schritte 4.3 bis 4.8, bis die gesamte Cochlea auf den Objektträger übertragen wurde. Fügen Sie bei Bedarf mehr Montagemedium hinzu, bedecken Sie den Schlitten und versiegeln Sie den Decklack mit schwarzem Nagellack, der an den Rändern lackiert ist. Lassen Sie es im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie das Dia dann im Dunkeln bei 4 °C.
HINWEIS: Selbst wenn Teile des sensorischen Epithels selbst versehentlich verloren gehen, ist es wichtig, dennoch das zu montieren, was vom Cochlea-Stück übrig ist, um eine korrekte Längenschätzung zu erhalten.
5. Cochlea-Längenmessung
- Messen Sie die Länge der Cochlea anhand von Hellfeldbildern ihrer Stücke mit einem Epifluoreszenzmikroskopsystem und der zugehörigen Software. Speichern Sie Bilder mit geringer Vergrößerung (4-faches Objektiv) von jedem Cochlea-Stück und verwenden Sie das Lasso-Messwerkzeug der Mikroskopsoftware, um in jedem der Bilder eine Linie entlang der Reihe von IHCs zu zeichnen. Berechnen Sie die Gesamtlänge, indem Sie die Längen aller Teile addieren.
HINWEIS: Wenn Teile des sensorischen Epithels in einem Cochlea-Stück fehlen, interpolieren Sie die Linie. - Um die Cochlea-Positionen zu definieren, die in einer einzelnen Cochlea analysiert werden sollen, berechnen Sie ihre entsprechenden Abstände vom Scheitelpunkt mit der Gleichung von Müller25. Markieren Sie diese Stellen zum Beispiel auf einem Ausdruck der Cochlea-Stücke.
6. Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop
- Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop mit einem 40-fachen Öl-Immersionsobjektiv (numerische Apertur 1,3) und dem entsprechenden Öl für hochauflösende Bildgebung.
HINWEIS: Wenn das konfokale Mikroskop einen invertierten Lichtweg hat, muss der Objektträger verkehrt herum positioniert werden. Geben Sie der Probe in diesem Fall etwa 30 Minuten Zeit, um zu sinken und stabil auf dem Deckglas zu ruhen, bevor Sie mit dem endgültigen Scan beginnen. Alternativ können Sie ein Montagemedium verwenden, das während der gesamten Dauer der Dissektion flüssig ist, aber später erstarrt und gleichzeitig die Fluoreszenz konserviert. - Aktivieren Sie die entsprechenden Laser: In diesem Protokoll werden zwei optisch gepumpte Halbleiterlaser mit Wellenlängen von λ = 488 nm und λ = 522 nm sowie ein Diodenlaser mit einer Wellenlänge von λ = 638 nm verwendet. Wählen Sie den Emissionsbereich der Fluoreszenz-Tags (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Wenn ein Hybriddetektor die freigesetzten Photonen zählt, platzieren Sie die Laserlinie mindestens 10 nm von der Emissionskurve entfernt.
HINWEIS: Es ist wichtig, Vorabprüfungen mit einfach markiertem Gewebe durchzuführen, um sicherzustellen, dass die gewählten Detektorbandbreiten die Farbkanäle sauber trennen (d.h. nicht zu Kanalübersprechen führen). Radiowellen stören den Hybriddetektor, was zu einer maximalen Photonenzahl führt und somit artefaktische Streifen im Stapel verursacht. Vermeiden Sie daher die Verwendung eines Mobiltelefons in der Nähe des Mikroskops. - Zoomen Sie auf das Gewebe, bis das Bild 10 IHCs umfasst. Wählen Sie die Auflösung des Bildes nach Nyquist-Probe, die typischerweise ~ 40-60 nm / Pixel beträgt. Stellen Sie die Schrittweite in Z-Richtung auf 0,3 μm und die Abbildungsgeschwindigkeit auf 400-700 Hz ein.
HINWEIS: Beide Einstellungen (Schrittweite und Bildgebungsgeschwindigkeit) stellen Kompromisse zwischen der Verwendung optimaler Bildgebungsparameter und der Einsparung von Scanzeit dar. - Führen Sie bidirektionale Probenahmen durch, um die Bildgebungszeit zu verkürzen. Kumulieren Sie den Rahmen für den 488-nm- und 638-nm-Kanal 3x und für den 522-nm-Kanal 6x; Zusätzlich können Sie die Linien für jeden Kanal 3x mitteln. Wählen Sie den Anfang und das Ende des Stapels in der z-Dimension.
- Stellen Sie die Verstärkung auf 100 ein, wenn Sie den Hybriddetektor (Zählmodus) verwenden, um ein verringertes Signal-Rausch-Verhältnis zu vermeiden. Stellen Sie die Laserleistung so ein, dass kein Pixel im interessierenden Bereich gesättigt ist, aber die Strukturen decken meist den gesamten 8-Bit-Bereich ab. Beginnen Sie mit einer geringen Laserleistung von 0,5% und erhöhen Sie sie, bis Strukturen sichtbar sind.
HINWEIS: Eine gute Färbung benötigt in der Regel eine Laserleistung zwischen 0,1% und 5%. - Verwenden Sie Dekonvolutionssoftware für die Post-hoc-Verarbeitung der Bildstapel, um den unscharfen Halo um kleine fluoreszierende Strukturen mit einer theoretischen Punktspreizungsfunktion zu entfernen. Verwenden Sie für jeden Stack innerhalb eines Experiments dieselben Einstellungen. Speichern Sie die entflechteten Bilder als .tif oder .ics.
HINWEIS: Das myoVIIa-Label (IHCs) profitiert nicht von der Dekonvolution und kann weggelassen werden, um Zeit zu sparen. Die Software verwendet Metadaten der Bilddateien; Es müssen jedoch mehrere Parameter wie der Lichtweg, das Einbettungsmedium oder das Tauchmedium angegeben werden.
7. Synapsenquantifizierung
- Öffnen Sie eine Kopie der dekonvolutierten Stacks in der frei zugänglichen Software ImageJ mit dem zusätzlichen Biovoxxel-Plugin, das auch auf ihrer Website verfügbar ist.
- Passen Sie die Farben einzelner Kanäle an, indem Sie die Kanäle aufteilen (Bild | Farbe | Geteilte Kanäle) und Zusammenführen (Image | Farbe | Merge Channels) sie erneut und weisen verschiedene Farben zu. Konvertieren Sie das Bild in einen RGB-Stack (Bild | Farbe | Auf RGB stapeln) und Helligkeit und Kontrast anpassen (Bild | | anpassen Helligkeit/Kontrast | B. Auto oder Slider bezüglich des Maximums), falls erforderlich, so dass sich die prä- und postsynaptischen Strukturen und das IHC-Label angenehm vom Hintergrund unterscheiden.
- Wählen Sie fünf IHCs aus und beschriften Sie diese mit dem Textwerkzeug (IHC1-IHC5), indem Sie auf die gewünschte Stelle innerhalb des Stapels klicken. Öffnen Sie den ROI-Manager (| analysieren Tools | ROI-Manager); Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Labels , um die Punkte mit einer Nummer zu kennzeichnen. Zoomen Sie auf die IHC von Interesse.
- Verwenden Sie das Punkt-/Mehrpunktwerkzeug im Mehrpunktmodus (klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Werkzeug, um zwischen Punkt- oder Mehrpunktmodus zu wählen). Klicken Sie auf eine funktionelle Ribbon-Synapse (d. h. ein präsynaptisches Ribbon in enger Gegenüberstellung zu einem postsynaptischen Glutamat-Patch), während Sie durch die Z-Dimension scrollen.
HINWEIS: Abhängig von ihrer Überlappung und der für jeden Kanal gewählten Farbe werden die gemeinsam genutzten Pixel in gemischten Farben angezeigt. Normalerweise ist die Unterscheidung zwischen einzelnen funktionellen Synapsen einfach, weil sie ausreichend voneinander entfernt sind. - Wenn alle interessanten Strukturen angekreuzt sind, klicken Sie auf der grafischen Benutzeroberfläche des ROI-Managers auf Hinzufügen . Klicken Sie auf den beliebigen Namen und wählen Sie Umbenennen.
HINWEIS: Die Punktbeschriftungen bleiben weiterhin in allen Ebenen des Stapels erhalten, wenn das Kontrollkästchen Alle anzeigen im Optionsmenü des Punktwerkzeugs aktiviert ist (doppelklicken Sie auf das Symbol des Punktwerkzeugs), wodurch vermieden wird, dass dieselbe Multifunktionsleisten-Synapse mehrmals gezählt wird. - Wenn Sie den nächsten IHC für die Zählung auswählen, vermeiden Sie versehentliches Hinzufügen von Zählungen, indem Sie das Bild so anpassen, dass der nächste IHC mit dem Handwerkzeug vollständig angezeigt wird. Wechseln Sie von Multipoint-Tool zu Punkt-Tool , um zu vermeiden, dass den zuvor gespeicherten Daten mehr Puncta hinzugefügt wird. Klicken Sie im nächsten IHC auf eine interessante Struktur und wechseln Sie zurück zum Multipoint-Tool. Wiederholen Sie die Schritte 7.4 bis 7.5, bis alle IHCs von Interesse bewertet sind.
- Um Daten zu speichern, klicken Sie im ROI-Manager auf ein Dataset und dann auf Measure. Warten Sie, bis ein neues Fenster mit den gemessenen Datenpunkten angezeigt wird. Speichern Sie diese Liste als Tabellenkalkulationsdatei (Datei | Speichern unter). Speichern Sie das Bild, indem Sie im ROI-Manager die Option Alle anzeigen aktivieren. Klicken Sie auf Flatten , um die Punktbeschriftungen dauerhaft zum Stapel hinzuzufügen. Stimmen Sie beim Schließen des Image-Stacks zu, die Änderungen zu speichern.
8. Analyse des Synapsenvolumens und der Position auf der Haarzelle
HINWEIS: Die Autoren verwendeten ein benutzerdefiniertes Programm, das auf Matlab basiert. Da es nicht öffentlich zugänglich ist, wird es hier nur in groben Zügen dargestellt (siehe auch7). Bitte wenden Sie sich an den entsprechenden Autor, wenn Sie daran interessiert sind, es zu verwenden. Das Verfahren erwartet einen dreifach beschrifteten (IHCs, prä- und postsynaptischen) Bildstapel im TIFF-Format als Eingabe, führt den Anwender über eine grafische Oberfläche durch die verschiedenen Analyseschritte und liefert eine umfangreiche Ausgabe der Ergebnisse im Tabellenkalkulationsformat.
- Normalisieren Sie die Position der synaptischen Strukturen auf ein 3D-Koordinatensystem, das durch die Ausdehnung des einzelnen IHC auf der Säulen-Modiolar-Achse und der Cochlea-apikal-basalen Achse und der IHC-Achse von oben (kutikuläre Platte) nach unten (synaptischer Pol) definiert wird.
HINWEIS: Die Volumina der synaptischen Elemente (sowohl prä- als auch postsynaptisch und das kombinierte Volumen der funktionellen Synapsen) werden in μm 3 angegeben und auf den jeweiligen Medianwert3 normiert.
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Representative Results
Cochleae wurden entweder nach kardiovaskulärer Durchblutung mit Fixierung des gesamten Tieres geerntet oder nach dem Einschläfern des Tieres schnell seziert und in die Immersion fixiert. Bei der letzteren Methode blieben die IHCs während der Dissektion an Ort und Stelle, während bei erfolgloser Perfusion und damit unzureichend fixiertem Gewebe das sensorische Epithel häufig zerstört wurde. Beachten Sie, dass die Autoren auf Fälle stießen, in denen die Fixierung der Cochleae nach transkardialer Perfusion unzureichend war, während die Fixierung des Gehirns noch ausreichend war. Gewebe aus einer minderwertigen Perfusion könnte immer noch gerettet werden, indem Löcher in die Cochlea-Spitze und -Base geöffnet und die Cochleae durch Eintauchen in 4% PFA für 2 Tage nachfixiert werden.
Die Längenbestimmung der gesamten Cochlea wurde nach Müller25 durchgeführt, um IHCs und ihre Synapsen an bestimmten Cochlea-Positionen zu bewerten, die unterschiedlichen charakteristischen Frequenzen entsprechen (Tabelle 1). Dazu wurden die gewünschten Cochlea-Positionen als Prozentsätze der Basilarmembranlänge von der Cochlea-Base berechnet. Die mittlere Cochlea-Länge von 13 Cochleae von jungen erwachsenen Rennmäusen betrug 11,3 mm (Interquartilsbereich: 11,02-11,52 mm). Die mittlere Cochlea-Länge von 24 Cochleae von gealterten Rennmäusen betrug 11,5 mm (Interquartilsbereich: 11,24-11,73 mm). Es gab keinen signifikanten Unterschied zwischen der Länge der jungen Erwachsenen und der gealterten Cochleae (Mann-Whitney U-Test: U = -1,62 , p = 0,105); Der Gesamtmedian betrug 11,48 mm. Man kann argumentieren, dass diese Variation in der Länge der einzelnen Cochleae gering war und die Verwendung fester Längenpositionen (in mm) ausreichend ist. Die Ortsfrequenzfunktion ist jedoch nichtlinear. Daher verursacht eine Abweichung von der Medianlänge bei basalen Cochlea-Lagen einen größeren Fehler als bei relativ apikaleren Cochlea-Standorten. Zum Beispiel reichte für die Cochlea-Position, die einer Frequenz von 1 kHz entspricht, berechnet auf der Grundlage der mittleren Cochlea-Länge (d. h. 11,48 mm), die entsprechende Frequenz von 1,16 kHz bis 0,91 kHz für die kürzeste (10,36 mm) bzw. die längste Cochlea (12,28 mm) in dieser Probe. Für eine basal lokalisierte Frequenz (z. B. 32 kHz) betrug der Frequenzbereich 51,62 kHz bis 23,97 kHz für die kürzeste bzw. längste Cochlea. Daher empfiehlt es sich, die einzelnen Stellen auf jeder Cochlea zu berechnen, insbesondere bei der Untersuchung basaler Cochlea-Standorte.
Abbildung 1 zeigt die Z-Dimensions-Projektionen der maximalen Intensität von Cochleae von einem jungen Erwachsenen (10 Monate, Abbildung 1A) und einer gealterten Rennmaus (38 Monate, Abbildung 1B), die Beispiele für ideale Immunmarkierungen sind. In dem Bild, das die Cochlea der jungen erwachsenen Rennmaus zeigt, stehen die mit myoVIIa gekennzeichneten IHCs, hier in Blau, in scharfem Kontrast zum schwarzen Hintergrund. Daher sind einzelne IHCs leicht nachweisbar. Die prä- und postsynaptischen Strukturen sind deutlich sichtbar als grüne bzw. rote Elemente. Es wird angenommen, dass sie eine funktionelle Synapse bilden, wenn sie sich in enger Gegenüberstellung befinden (Abbildung 1A',B'). Es gab selten ungepaarte präsynaptische Strukturen (verwaiste Bänder), die sich in den Cochleae von gealterten Rennmäusen zeigten. Die Cochlea der alten Rennmaus (Abbildung 1B) wurde mit dem Autofluoreszenzlöscher behandelt. Das IHC-Label scheint schwächer zu sein, obwohl die Laserleistung, die in dieser Probe verwendet wurde, dreimal höher war als die für die Cochlea der jungen erwachsenen Rennmaus. Dennoch unterscheiden sich die IHCs immer noch vom Hintergrund. Die prä- und postsynaptischen Strukturen sind deutlich sichtbar, und die Laserleistung, die für beide Kanäle verwendet wurde, war ähnlich oder sogar unter der für die junge erwachsene Probe. Gewebe von gealterten Tieren zeigte typischerweise signifikant mehr unspezifisch aussehendes fluoreszierendes Signal. Daher ist der Hauptunterschied im Protokoll für junges erwachsenes und gealtertes Material die Behandlung mit einem Autofluoreszenz-Quencher. Beachten Sie, dass dies nach der Immunfärbung mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern durchgeführt wurde und im Prinzip auch die beabsichtigte Antikörpermarkierung beeinflussen könnte. Die Behandlung reduzierte jedoch effektiv die Fremdfluoreszenz unspezifischen Ursprungs und hinterließ gleichzeitig ein ausreichendes Signal der spezifischen Markierung der interessierenden Strukturen (vergleichen Sie Abbildung 1B mit Abbildung 2B). Vorläufige Ergebnisse deuteten jedoch darauf hin, dass sich in den Stria vascularis keine Fremdfluoreszenz in Proben von gealterten Rennmäusen manifestierte.
Beispiele für Stacks, die suboptimal verarbeitet wurden, sind in Abbildung 2 dargestellt. Abbildung 2A zeigt die maximale Z-Projektion eines Stapels von einer alten Rennmaus (36 Monate), bei der die IHCs, die ebenfalls entweder unnatürlich gebogen oder auseinandergerissen wurden, nicht vollständig gescannt wurden. Infolgedessen sind in diesem Scan nur die apikalen und basalen Pole von IHCs sichtbar. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass sich im fehlenden mittleren Teil der IHCs mehr Synapsen befanden und daher eine zuverlässige Analyse nicht möglich ist. Daher ist es entscheidend, dass alle ausgewerteten IHCs vollständig im konfokalen Stack gescannt werden. Abbildung 2B zeigt die maximale Z-Projektion eines Stapels, der bei einer gealterten Rennmaus (38 Monate) beprobt wurde. Die Fluoreszenz unklaren Ursprungs ist hoch, da der Autofluoreszenz-Quencher in diesem Fall nicht verwendet wurde. Die Fremdfluoreszenz war jedoch weitgehend auf den (roten) Kanal beschränkt, der mit dem GluA2-Label assoziiert ist, was ziemlich typisch ist. In solchen Fällen kann es immer noch möglich sein, funktionelle Synapsen zu zählen, wenn das CtBP2-Label der Bänder relativ sauber und spezifisch ist. Abbildung 2C zeigt die maximale Z-Projektion eines Stapels, der von einer gealterten Rennmaus (42 Monate) erhalten wurde. Hier können die Synapsen nicht einzelnen IHCs zugeordnet werden, da die IHCs weitgehend zerfallen waren; In der Tat ist es schwierig, sicher zu sein, wie viele IHCs vertreten sind. In dem in Abbildung 3A gezeigten Beispiel wurde während des Scans ein Mobiltelefon in unmittelbarer Nähe des konfokalen Mikroskops verwendet. Streifen sind im blauen Kanal sichtbar (IHC-Label). Glücklicherweise betraf dies in diesem Fall nicht die synaptischen Kanäle und betraf nur den oberen Teil der IHCs, so dass eine Analyse immer noch praktikabel war.
Abbildung 3 zeigt die maximalen Z-Projektionen von Stapeln, die aus demselben Stück Cochlea einer jungen erwachsenen Rennmaus entnommen wurden, die 3 Monate (Abbildung 3A, A') und 29,5 Monate (Abbildung 3B, B') nach der Immunfärbung erworben wurden. Um vergleichbar zu bleiben, wurden die Bilder nicht von genau derselben Stelle aufgenommen (die möglicherweise durch den vorherigen Scan gebleicht wurde), sondern von demselben Cochlea-Stück. Für den Scan zum späteren Zeitpunkt musste die Laserleistung ~2- bis 3-fach erhöht werden. Dennoch sind die beschrifteten Strukturen noch klar. Das Signal-Rausch-Verhältnis hatte abgenommen, insbesondere in den Kanälen, die postsynaptische und IHC-Strukturen aufweisen, während der Kanal mit dem präsynaptischen Label weniger betroffen war. Die Quantifizierung von funktionellen Synapsen per IHC ist weiterhin möglich.
Typische Ergebnisse für die Analyse des Synapsenvolumens und der Position auf dem IHC sind in Abbildung 4 unter Verwendung des in Abbildung 1A gezeigten konfokalen Stapels dargestellt. Individuell definierte IHCs werden grafisch als Rasterrekonstruktionen in unterschiedlichen Farben dargestellt, mit oder ohne die funktionalen Synapsen (definiert durch Kolokalisierung von prä- und postsynaptischen Labels), die jedem zugeordnet sind. Diese Anzeige kann in 3D frei gedreht werden, um verschiedene Blickwinkel zu erhalten (Abbildung 4A,B). IHCs können auch für die grafische Darstellung ausgewählt werden (Abbildung 4B). Es wird eine Vielzahl von Datengraphen erstellt, die verschiedene Aspekte der Verteilung synaptischer Volumina innerhalb des IHC-zentrierten Koordinatensystems veranschaulichen (Beispiele in Abbildung 4C-E). Die quantitativen Rohdaten für jedes IHC und jedes synaptische Element stehen auch als Tabellenkalkulationen zur Verfügung, die dann beispielsweise über mehrere konfokale Stapel für weitere statistische Analysen kombiniert werden können.
Abbildung 1: Beispiele für erfolgreich verarbeitete Cochleae. Z-Projektionen mit maximaler Intensität von konfokalen Stapeln von (A) einer jungen erwachsenen Rennmaus (10 Monate), erhalten an einer Cochlea-Stelle, die 1 kHz entspricht, und (B) einer gealterten Rennmaus (38 Monate, Panel B), erhalten an einer Cochlea-Stelle, die 500 Hz entspricht. IHCs wurden mit einem Antikörper gegen myoVIIa (blau) gefärbt, präsynaptische Bänder wurden mit Anti-CtBP2 (grün) markiert, und postsynaptische Glutamatpflaster wurden mit Anti-GluA2 (rot) markiert. Die Cochlea der gealterten Rennmaus wurde nach der Immunfärmung mit einem Autofluoreszenz-Quencher behandelt. Aus Gründen der Klarheit sind die Umrisse der IHCs durch gestrichelte Linien gekennzeichnet. Die Tafeln (A') und (B') zeigen eine Vergrößerung der Flächen, die durch die Quadrate in den entsprechenden Cochleae aus den Tafeln (A) und (B) umrissen werden. Gelbe Pfeilspitzen verweisen auf funktionelle Synapsen. Die Kanäle, die die prä- und postsynaptischen Strukturen (aber nicht den IHC-Kanal) zeigten, wurden dekonvolutiert. Maßstabsstäbe = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Abkürzungen: IHC = innere Haarzelle; myoVIIa = Myosin VIIa; CtBP2 = C-terminales bindendes Protein 2; GluA2 = ionotroper Glutamatrezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Beispiele für suboptimal verarbeitete Cochleae. Z-Projektionen mit maximaler Intensität von konfokalen Stacks, für die die Verarbeitung suboptimal war, von Rennmäusen, die (A) 36 Monate und (B, C) 38 Monate alt waren, und von Cochlea-Stellen, die 16 kHz, 8 kHz bzw. 32 kHz entsprechen. Rennmäuse, von denen die Cochleae in den Panels (A) und (C) abgeleitet wurden, wurden transkardial perfundiert, und die Cochlea aus Panel (C) wurde zusätzlich für 3 Tage in 4% PFA postfixiert. Die Cochlea von (B) wurde 2 Tage lang in 4% PFA eingetaucht. Cochleae aus (A) und (C) wurden mit dem Autofluoreszenz-Quencher behandelt. IHCs wurden mit einem Antikörper gegen myoVIIa (blau) gefärbt, präsynaptische Bänder wurden mit Anti-CtBP2 (grün) markiert und postsynaptische Glutamatflecken wurden mit Anti-GluA2 (rot) markiert. Alle Kanäle wurden dekonvolviert. Helligkeit und Kontrast wurden nach dem konfokalen Scan weiter angepasst. Maßstabsstäbe = 10 μm. Abkürzungen: PFA = Paraformaldehyd; IHC = innere Haarzelle; myoVIIa = Myosin VIIa; CtBP2 = C-terminales bindendes Protein 2; GluA2 = ionotroper Glutamatrezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Stabilität des Immunolabels nach längerer Lagerung. Z-Projektionen mit maximaler Intensität von konfokalen Stapeln von einer jungen erwachsenen Rennmaus (10 Monate), die an der 16 kHz Cochlea-Stelle, (A) 3 Monate nach der Färbung und (B) an einer etwas basaleren Cochlea-Position auf demselben Cochlea-Stück 29,5 Monate nach der Färbung entnommen werden. Die Cochlea wurde 2 Tage lang in 4% PFA eingetaucht. Aus Gründen der Übersichtlichkeit zoomen (A') und (B') nur wenige funktionale Synapsen aus den Bereichen, die durch Quadrate in (A) bzw. (B) gekennzeichnet sind. IHCs wurden mit einem Antikörper gegen myoVIIa (blau) gefärbt, präsynaptische Bänder wurden mit Anti-CtBP2 (grün) markiert und postsynaptische Glutamatflecken wurden mit Anti-GluA2 (rot) markiert. Die Laserleistung für die IHC-Kanäle betrug 1,3% bzw. 3%, für die präsynaptischen Kanäle 0,4% bzw. 1,1% und für die postsynaptischen Kanäle 1,1% bzw. 2% in (A) bzw. (B). Beachten Sie, dass in (A) im oberen Teil der IHCs blaue Streifen sichtbar sind, die sich aus der Verwendung eines Mobiltelefons in unmittelbarer Nähe des konfokalen Mikroskops ergeben. Maßstabsstäbe = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Abkürzungen: PFA = Paraformaldehyd; IHC = innere Haarzelle; myoVIIa = Myosin VIIa; CtBP2 = C-terminales bindendes Protein 2; GluA2 = ionotroper Glutamatrezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse der Quantifizierung des Synapsenvolumens . (A) Zehn IHCs als verschiedenfarbige Gitterrekonstruktionen basierend auf dem myoVIIa-Immunlabel. Ihre zugehörigen funktionellen Synapsen, definiert durch kolokalisierte CtBP2- (grün) und GluA2-markierte Elemente (rot), werden zusammen mit den IHCs und auch separat unten zur Verdeutlichung angezeigt. Beachten Sie, dass der Blickwinkel so gewählt wurde, dass er senkrecht zur Längsachse der IHCs steht und sich somit vom ursprünglichen konfokalen Bild unterscheidet (Abbildung 1A). (B) Eine der hervorgehobenen und um 90° gedrehten IHCs einer der IHCs. Die schwarze Ebene wurde vom Benutzer manuell definiert und halbiert die IHC entlang ihrer Säulen-Modiolar-Achse. (C) Blasendiagramm, das die Position aller funktionellen Synapsen in diesem konfokalen Stapel relativ zu den normalisierten drei Achsen ihrer jeweiligen IHC zeigt. Die Größe der Symbole ist proportional zum Volumen des präsynaptischen Elements. Beachten Sie, dass der Blickwinkel so gewählt wurde, dass er dem Panel (B) ähnelt. (D) Boxplot der normalisierten Volumina synaptischer Elemente, getrennt für die präsynaptischen (linke 2 Boxen) und postsynaptischen (rechts 2 Boxen) Partner von funktionellen Synapsen und weiter getrennt nach ihrer Position in der modiolären oder Säulenhälfte ihrer jeweiligen IHC (verschiedene Farben). Kästchen stellen Interquartilsbereiche dar, wobei die Mediane durch Linien gekennzeichnet sind. Gestrichelte Schnurrhaare zeigen das 1,5-fache des Interquartilsbereichs an, und die Kreuze zeigen darüber hinausgehende Werte an. (E) Streudiagramm der normalisierten Volumina prä- vs. postsynaptischer Partner funktioneller Synapsen. Verschiedene Symbole zeigen die Position in der Modiolar- oder Säulenhälfte ihres jeweiligen IHC an. Abkürzungen: IHC = innere Haarzelle; myoVIIa = Myosin VIIa; CtBP2 = C-terminales bindendes Protein 2; GluA2 = ionotroper Glutamatrezeptor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: Entfernungen vom Scheitelpunkt, die bestimmten Zielfrequenzen in Cochleae unterschiedlicher Länge entsprechen. Die äquivalenten besten Frequenzen wurden auf der Grundlage der Gleichung von Müller25 berechnet. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Mit der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ist es möglich, IHCs und synaptische Strukturen in Cochleae von jungen erwachsenen und gealterten Rennmäusen zu immunisieren, vermutete funktionelle Synapsen durch Kolokalisierung prä- und postsynaptischer Elemente zu identifizieren, sie einzelnen IHCs zuzuordnen und ihre Anzahl, ihr Volumen und ihre Position zu quantifizieren. Die bei diesem Ansatz verwendeten Antikörper markierten auch äußere Haarzellen (OHCs; myoVIIa) und ihre präsynaptischen Bänder. Darüber hinaus ist eine praktikable Alternative für die Immunmarkierung von IHCs und OHCs ein Antikörper gegen Otoferlin, wobei OHCs viel schwächer erscheinen als IHCs.
Die Perfusion kann mit zwei verschiedenen Setups durchgeführt werden. 1) Ein schwerkraftgespeistes Tropfleitungssystem, bei dem eine einzelne Flasche, die eine kommerzielle Tropfleitung füttert, an einem Flaschenrad etwa 1,5 m über dem Tier aufgehängt wird. Flüssigkeiten werden nacheinander nach dem Absenken der Flasche eingeführt, die oben offen ist. 2) Ein System mit einer digitalen Peristaltikpumpe mit variabler Drehzahl, mit einem dünnen, langen Rohr, das an einem Ende geöffnet ist, um die Flüssigkeit aufzunehmen, und einer Nadel, die leicht am anderen Ende befestigt werden kann. Beide funktionieren gleich gut, und die feinen Unterschiede werden hier nicht näher ausgeführt. Die Autoren empfehlen jedoch ausdrücklich eine Werkbank im Stil eines Daunenentwurfs, bei der das Tier auf einer perforierten Plattform steht und die Dämpfe darunter abgezogen werden. Dies ermöglicht einen guten Zugang zum Operationsbereich, ohne die Abgasfunktion zu beeinträchtigen (im Gegensatz zum Arbeiten in einem offenen Abgasschrank).
Die richtige Fixierung des Gewebes ist von entscheidender Bedeutung, da sich sonst das sensorische Epithel während der Dissektion löst und zerfällt. Bei der Rennmaus ist eine längere Exposition gegenüber dem Fixiermittel erforderlich als üblicherweise verwendet (z. B. für Mäuse 17,27,13 oder Meerschweinchen 28). Die bevorzugte Methode für Rennmäuse ist die schnelle Extraktion der Cochlea nach dem Tod des Tieres und die Immersionsfixierung für mindestens 1,5 Tage. Wenn eine kardiovaskuläre Perfusion bevorzugt wird, ist es entscheidend, dass die Fixierung innerhalb weniger Minuten einsetzt und gut verläuft. Da es schwierig sein kann, die Qualität der Fixierung während der Perfusion letztendlich zu bewerten, wird empfohlen, die Cochleae routinemäßig wie beschrieben zu postfixieren.
Es ist wichtig, die Waschschritte einzuhalten, wobei der letzte Waschschritt (Schritt 2.7) der wichtigste ist. Wenn es nicht ausreichend gewaschen wird, ist das Gewebe klebrig und haftet an den Dissektionsinstrumenten, was die Dissektion erschwert. Es wird auch empfohlen, einen Autofluoreszenzabgleich in Cochleae zu verwenden, der von gealterten Rennmäusen geerntet wird, um die unspezifische Fluoreszenz zu reduzieren. Autofluoreszenz könnte von Lipofuscin stammen, das im Gewebe von gealterten Tieren 29,30,31 häufig vorkommt und sowohl breit erregt als auch breit emittierend zu sein scheint. Bei Anregung mit einer Wellenlänge im UV-Spektrum (λ = 364 nm) hat Lipofuscin einen weiten Emissionsbereich (λ = 400-700 nm, mit einem Maximum bei ~λ = 568 nm)32. Im menschlichen Myokardgewebe ist Lipofuszin mit einer Anregung von λ = 555 nm und einer Emission von λ =605 nm 33 sichtbar. In ähnlicher Weise bemerkten die Autoren in den IHCs von Rennmäusen eine Zunahme der unspezifischen Fluoreszenz, die am deutlichsten in dem Kanal für den AF568-Antikörper verwendet wurde, was auf eine Autofluoreszenz von Lipofuscin-Granulaten hindeutet. Eine generelle Empfehlung bei der Arbeit mit Gewebe von Tieren ist daher, die Anregungsbandbreite um 550-600 nm für das am wenigsten kritische Immunlabel zu nutzen.
Die Messung der gesamten Cochlea-Länge und die korrekte Identifizierung spezifischer Cochlea-Positionen ist nur möglich, wenn ihre gesamte Länge erhalten bleibt. Wenn Teile des sensorischen Epithels bei der Dissektion verloren gehen, wird empfohlen, noch den verbleibenden Teil oder sogar nur das Spiralganglionstück zu montieren und detaillierte Notizen zu machen. Es ist dann in der Regel möglich, den fehlenden Abschnitt mit angemessener Genauigkeit abzuschätzen. Wenn die apikalen Teile der Cochlea vollständig erhalten sind, aber das basale Ende fehlt, können bestimmte Cochlea-Positionen auf dem apikalen Teil definiert werden, indem die Positionen basierend auf der mittleren Cochlea-Länge innerhalb der verwendeten Rennmauspopulation berechnet werden, da die Abweichung vom realen Wert gering ist.
Eine wichtige Einschränkung der Synapsenvolumenquantifizierung besteht darin, dass die resultierenden absoluten Volumina über verschiedene konfokale Stacks nicht vergleichbar sind. Der kritische Schritt, der die resultierenden Volumina synaptischer Elemente bestimmt, ist die Wahl des Intensitätsschwellenwerts für die Ersterkennung. Die Wahl dieser Intensitätsschwelle wird jedoch subjektiv vom Benutzer im aktuellen Protokoll und vielen anderen 3,27,34 getroffen. Darüber hinaus hängt die Helligkeit der Immunfluoreszenz im konfokalen Bild von vielen Faktoren ab, die sehr schwer über Proben hinweg zu standardisieren sind, wie z. B. Gewebedicke, Ausrichtung des Gewebes relativ zum optischen Pfad, Dauer der Laserbelichtung und präzise konfokale und Dekonvolutionseinstellungen. All diese Vorbehalte werden verschärft, wenn seltenes Material über einen längeren Zeitraum erworben wird, wie es für alternde Rennmäuse typisch ist. Zusammengenommen bedeutet dies, dass Verzerrungen in gepoolten Daten sehr schwer auszuschließen sind und das Best-Case-Szenario ein Datensatz mit hoher Varianz ist. Es wird daher empfohlen, synaptische Volumina routinemäßig auf das jeweilige Medianvolumen des einzelnen konfokalen Stapels zu normalisieren, wie es von Liberman et al.3 eingeführt wurde. Der offensichtliche Nachteil ist, dass synaptische Volumina dann nur innerhalb eines gegebenen Bildstapels vergleichbar sind, z.B. zwischen verschiedenen Orten auf dem IHC, aber nicht zwischen verschiedenen Cochlea-Standorten oder Probenaltersgruppen.
Die doppelte Etikettierung von prä- und postsynaptischen Strukturen und die Anforderung der Kolokalisierung ermöglichen eine zuverlässigere Schätzung der Anzahl der funktionellen Synapsen als die Verwendung beider Labels allein. Wenn nur eine Kennzeichnung möglich ist, wird aus zwei Gründen empfohlen, das präsynaptische Anti-CtBP2 zu verwenden, das an AF488- oder fluoreszierende Tags mit ähnlichen Wellenlängenspezifikationen gekoppelt ist. Erstens scheinen verwaiste Bänder, dh CtBP2-markierte Elemente ohne eine co-lokalisierte postsynaptische Markierung, seltenzu sein 17, und die Autoren bestätigten dies für gealterte Rennmäuse. Daher ist der Fehler, der dadurch verursacht wird, dass die Kolokalisierung mit einem postsynaptischen Partner nicht verifiziert werden kann, gering. Es sollte jedoch beachtet werden, dass dies bei der Untersuchung von lärmexponierten Ohren (z. B. 28) zu einem wichtigeren Thema wird. Zweitens beeinflusste das Rauschen in Fällen mit hohem Fluoreszenzsignal unklaren Ursprungs typischerweise den Kanal mit einer Anregungswellenlänge um 568 nm am stärksten (Beispiel in Abbildung 2B, das das GluA2-Label darstellt). Zumindest ein Teil dieses Geräusches kann in Gewebe von gealterten Tieren Lipofuszin-Autofluoreszenz sein. Um die Chance auf ein sauberes, einzelnes Anti-CtBP2-Label zu maximieren, ist es daher ratsam, diesen Wellenlängenkanal zu vermeiden. Schließlich wurde gezeigt, dass bei richtigen kühlen und dunklen Lagerbedingungen die hier verwendete Immunmarkierung über lange Zeiträume von bis zu mindestens 2,5 Jahren stabil ist (Abbildung 3B), was die Neubewertung von wertvollem Gewebe, etwa von gealterten Rennmäusen, ermöglicht.
Die Quantifizierung der IHC-afferenten Synapsenzahl ist in vielen Kontexten, darunter altersbedingter Hörverlust, zu einer wichtigen Metrik für die Bewertung des Zustands des peripheren auditorischen Systems geworden. Es gibt verschiedene Protokolle, die jetzt veröffentlicht wurden (z.B. Rennmäuse 21, Mäuse17,13, Meerschweinchen 10,28 und Menschen35). Die hier beschriebene Methode ist in ihren Details spezifisch für junge erwachsene und gealterte Rennmäuse, aber es wurden einige allgemeine Empfehlungen abgeleitet, die auch bei anderen Arten von Nutzen sein können.
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Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.
Acknowledgments
Die Autoren danken Lichun Zhang für die Hilfe bei der Etablierung der Methode und der Serviceeinheit Fluoreszenzmikroskopie, Carl von Ossietzky Universität Oldenburg, für die Nutzung der bildgebenden Einrichtungen. Diese Forschung wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie EXC 2177/1 gefördert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
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