Summary
En protokol til behandling af unge voksne og alderen gerbil cochleae ved immunolabeling af de afferente synaptiske strukturer og hårceller, slukning af autofluorescens i alderen væv, dissekering og estimering af længden af cochleae og kvantificering af synapserne i billedstakke opnået med konfokal billeddannelse præsenteres.
Abstract
Tabet af båndsynapser, der forbinder indre hårceller og afferente auditive nervefibre, antages at være en årsag til aldersrelateret høretab. Den mest almindelige metode til påvisning af tab af båndsynapser er immunolabeling, fordi det giver mulighed for kvantitativ prøveudtagning fra flere tonotopiske steder i en individuel cochlea. Imidlertid er de interessante strukturer begravet dybt inde i den benede cochlea. Gerbils bruges som en dyremodel for aldersrelateret høretab. Her beskrives rutinemæssige protokoller for fiksering, immunolabeling af gerbil cochlear hele monteringer, konfokal billeddannelse og kvantificering af båndsynapsnumre og volumener. Desuden fremhæves de særlige udfordringer, der er forbundet med at opnå godt materiale fra værdifulde aldrende individer.
Gerbils aflives og enten perfunderes kardiovaskulært, eller deres tympaniske bullae dissekeres omhyggeligt ud af kraniet. Cochleae åbnes i toppen og bunden og overføres direkte til fikseringsmidlet. Uanset den oprindelige metode efterfikses cochleae og afkalkes derefter. Vævet mærkes derefter med primære antistoffer mod præ- og postsynaptiske strukturer og hårceller. Dernæst inkuberes cochleae med sekundære fluorescensmærkede antistoffer, der er specifikke mod deres respektive primære. Cochleae af alderen gerbils behandles derefter med en autofluorescens quencher for at reducere den typisk betydelige baggrundsfluorescens af ældre dyrs væv.
Endelig dissekeres cochleae i 6-11 segmenter. Hele cochlear-længden rekonstrueres således, at specifikke cochlear-steder kan bestemmes pålideligt mellem individer. Konfokale billedstakke, erhvervet sekventielt, hjælper med at visualisere hårceller og synapser på de valgte steder. De konfokale stakke dekonvoleres, og synapserne tælles enten manuelt ved hjælp af ImageJ, eller mere omfattende kvantificering af synaptiske strukturer udføres med billedanalyseprocedurer, der er specialskrevet i Matlab.
Introduction
Aldersrelateret høretab er en af verdens mest udbredte sygdomme, der rammer mere end en tredjedel af verdens befolkning i alderen 65 år og ældre1 år. De underliggende årsager er stadig under debat og undersøges aktivt, men kan omfatte tabet af de specialiserede synapser, der forbinder indre hårceller (IHC'er) med afferente auditive nervefibre2. Disse båndsynapser omfatter en præsynaptisk struktur, der har vesikler fyldt med neurotransmitteren glutamat bundet til det, såvel som postsynaptiske α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionsyre (AMPA) glutamatreceptorer 3,4,5. I gerbilen kontakter ~ 20 afferente auditive nervefibre en IHC 6,7,8. Fibre på IHC, der vender mod modiolus, er imod store synaptiske bånd, mens fibrene, der forbinder på søjlesiden af IHC, står over for små synaptiske bånd (dvs. hos katte9, gerbils7, marsvin10 og mus 3,11,12,13,14). Desuden er størrelsen af de presynaptiske bånd og de postsynaptiske glutamatpletter i gerbilen positivt korreleret 7,14. Fibre, der er imod store bånd på den modiolære side af IHC, er små i kaliber og har lave spontane hastigheder og høje tærskler15. Der er tegn på, at fibre med lav spontan hastighed er mere sårbare over for støjeksponering10 og ototoksiske lægemidler16 end fibre med høj spontan lav tærskel, som er placeret på søjlesiden af IHC'er15.
Tabet af båndsynapser er den tidligste degenerative begivenhed i cochlear neural aldersrelateret høretab, mens tabet af spiralganglionceller og deres afferente auditive nervefibre halterbagefter 17,18. Elektrofysiologiske korrelater inkluderer optagelser af auditive hjernestammeresponser17 og sammensatte handlingspotentialer8; disse afspejler imidlertid ikke finesserne ved synapsetab, da fibre med lav spontan hastighed ikke bidrager til disse foranstaltninger16. Mere lovende elektrofysiologiske målinger er det massepotentialeafledte neurale indeks19 og peristimulus-tidsresponsen20. Disse er dog kun pålidelige, hvis dyret ikke har andre cochleapatologier ud over auditivt nervefibertab, der påvirker aktiviteten af de resterende auditive nervefibre8. Desuden var adfærdsmæssigt vurderede tærskler i gerbilen ikke korreleret med synapsetal21. Derfor er pålidelig kvantificering af overlevende båndsynapser og dermed antallet af funktionelle auditive nervefibre kun mulig ved direkte undersøgelse af cochlear-vævet.
Den mongolske gerbil (Meriones unguiculatus) er en velegnet dyremodel til undersøgelse af aldersrelateret høretab. Det har en kort levetid, har lavfrekvent hørelse svarende til mennesker, er let at vedligeholde og viser ligheder med menneskelige patologier relateret til aldersrelateret høretab 2,22,23,24. Gerbils betragtes som gamle, når de når 36 måneder, hvilket er nær slutningen af deres gennemsnitlige levetid22. Det er vigtigt, at der er påvist et aldersrelateret tab af båndsynapser i gerbils, der er hævet og ældet i rolige omgivelser 8,21.
Her præsenteres en protokol til immunolabel, dissekering og analyse af cochleae fra gerbils i forskellige aldre, fra unge voksne til alderen. Antistoffer rettet mod komponenter i presynapse (CtBP2), postsynaptiske glutamatreceptorplastrepletter (GluA2) og IHC'er (myoVIIa) anvendes. Der anvendes en autofluorescens quencher, der reducerer baggrunden i alderen cochleae og efterlader fluorescenssignalet intakt. Endvidere gives en beskrivelse af, hvordan man dissekerer cochlea for at undersøge både det sensoriske epitel og stria vascularis. Cochlear-længden måles for at gøre det muligt at vælge forskellige cochlea-steder, der svarer til specifikke bedste frekvenser25. Kvantificering af synapsenumre udføres med den frit tilgængelige software ImageJ26. Yderligere kvantificering af synapsevolumener og placeringer inden for den enkelte HC udføres med software, der er tilpasset skrevet i Matlab. Denne software gøres ikke offentligt tilgængelig, da forfatterne mangler ressourcer til at levere professionel dokumentation og support.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller og procedurer blev godkendt af de relevante myndigheder i Niedersachsen, Tyskland, med tilladelsesnumre AZ 33.19-42502-04-15/1828 og 33.19-42502-04-15/1990. Denne protokol er for mongolske gerbils (M. unguiculatus) af begge køn. Ung voksen refererer til en alder af 3-12 måneder, mens gerbils betragtes som 36 måneder og ældre. Medmindre andet er angivet, kan buffere og opløsninger tilberedes og opbevares i køleskabet i op til flere måneder (4-8 °C). Før brug skal det sikres, at bufferne og opløsningerne ikke er udfældet.
1. Fiksering og organindsamling
BEMÆRK: Hvis kun cochleae er nødvendig, anbefales det at udføre den noget enklere procedure for fiksering ved nedsænkning. Men hvis der også er behov for en velbevaret hjerne, er transkardieperfusion den eneste mulighed. Fikseringsmidlet er i begge tilfælde 4% paraformaldehyd (PFA) i fosfatbufferet saltvand (PBS). Dette skal være frisklavet, men kan opbevares frosset indtil brug. Brug aliquoter på ~ 300 ml til en transkardie perfusion eller ~ 50-100 ml pr. Cochlea til fiksering ved nedsænkning.
FORSIGTIG: PFA er et farligt stof; håndtere det i henhold til generelle laboratoriesikkerhedsprocedurer.
- Fiksering ved transkardieperfusion
- Skyl perfusionsopsætningen, indtil slangen er fri for luftbobler. Fyld perfusionsslangen med PBS indeholdende heparin (0,2 ml i 100 ml PBS) for at forhindre blodpropper. Stop strømmen, når slangen er fyldt med PBS, og væskeopbevaringsflasken lige er tømt; hæld 200 ml optøet PFA i den.
BEMÆRK: Opsætningen er nu klar til dyret. Den resterende PBS i slangen er tilstrækkelig til at skylle blodet ud og vil automatisk blive efterfulgt af fikseringsmidlet, når strømmen er genoptaget. - Sikre, at der er et affaldsindsamlingssystem til udstrømning af PFA. Brug en frisk kanyle (19 G) og har stor saks, tang (med en flad spids), hæmostater, skalpel eller skarp kanyle og en gummimåtte med stifter praktisk.
- Afliv gerbilen med en intraperitoneal overdosis af pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml pr. Dyr, kropsvægtområde: 50-120 g). Sæt dyret tilbage i buret. Når åndedrætsstop sætter ind, så vejrtrækningen bliver uregelmæssig med intervaller på 30 s eller længere, skal gerbilen placeres på ryggen på gummimåtten og fastgøres både forpote og en bagpote med stifter (lad en bagpote være fri til at bevæge sig for bedre vurdering af perfusionssucces; se note efter trin 1.1.7).
- For at åbne brysthulen skal du løfte huden over brystbenet med tang og skære huden ca. 0,5 cm under brystbenet med en saks, indtil den hvidfarvede processus xiphoideus er synlig. Hold brystbenet ved processus xiphoideus med tang og skær langs membranen for at få et godt udsyn ind i brysthulen. Skær ribbenene sideværts på begge sider, indtil der er god adgang til hjertet. Sørg for, at saksens vinkel er parallel og flad i forhold til gerbilens krop for at undgå skader på organer og dermed sikre et lukket kredsløbssystem.
- Klem en hæmostat på brystbenet, løft brystkassen, og læg hæmostaten over gerbilens skulder uden at hvile hæmostaten på kropsdele for at undgå at blokere blodgennemstrømningen.
- Åbn væskestrømmen let, indtil en dråbe PBS strømmer ud af kanylen (19 G) ca. hver 2. s. Hold hjertet med tang og drej det lidt til venstre, så venstre ventrikel tydeligt kan ses. Indsæt kanylen i venstre ventrikel i en vinkel, der undgår at trænge ind i septum. Hold nålen på plads enten i hånden eller med en anden hæmostat.
BEMÆRK: Venstre og højre ventrikler kan differentieres ved deres forskellige farvetoner; venstre ventrikel ser lysere ud i farven end resten af hjertevævet. - Øg langsomt trykket af væskestrømmen og åbn højre atrium enten med fin saks, en skalpel eller en anden kanyle. Åbn væskestrømmen yderligere, indtil der observeres ca. 2-3 dråber/s ved drypkammeret, eller indstil et flow på 4 ml/min for pumpen. Når fikseringen af hjertet sætter ind, skal du sikre dig, at perfusionskanylen forbliver på plads uden at blive holdt længere.
BEMÆRK: Tegn på vellykket perfusion er langsomme muskelsammentrækninger, afstivning af nakke og ekstremiteter, leveren bliver bleg og rosenrøde lunger. Tegnet på mislykket perfusion er blegning af lungerne, hvilket indikerer, at lungecirkulationen er perfunderet på grund af punktering af septum. - I tilfælde af mislykket perfusion, prøv at flytte kanylen længere op, ind i aorta, og klem den på plads med en hæmostat.
- Halshug gerbilen. Bullae fjernes, skæres og brækkes bort som beskrevet i trin 1.2.2.
BEMÆRK: Hvis vævet ikke er tilstrækkeligt fastgjort, vil det sensoriske epitel løsne sig fra Cortis organ under dissektionen. - Hvis perfusionen ikke viser tegn på fiksering inden for 5-10 minutter, skal du afbryde den og straks følge nedenstående procedure for fiksering ved nedsænkning. Til det formål behandles cochlea som i trin 1.2.2 og anbringes vævet i ca. 50-80 ml 4% PFA i skruelågbeholdere i 1-2 dage på en 2D-ryster ved 8 °C.
BEMÆRK: Da det kan være svært i sidste ende at bedømme kvaliteten af fiksering under perfusion, anbefales det rutinemæssigt at postfiksere cochleae som beskrevet.
- Skyl perfusionsopsætningen, indtil slangen er fri for luftbobler. Fyld perfusionsslangen med PBS indeholdende heparin (0,2 ml i 100 ml PBS) for at forhindre blodpropper. Stop strømmen, når slangen er fyldt med PBS, og væskeopbevaringsflasken lige er tømt; hæld 200 ml optøet PFA i den.
- Fiksering ved vævsfordybelse
- Afliv gerbilerne med en intraperitoneal overdosis af pentobarbital (160 mg / ml, 0,3 ml pr. Dyr, kropsvægtområde: 50-120 g). Når gerbilen er stoppet med at trække vejret, skal du halshugge dyret.
- Fjern bullae og skær og brækker knoglen væk med henholdsvis saks og tang for at nå cochleae. Fjern maellus, incus og halvcirkelformede kanaler. Lav små huller i toppen og i basaldrejningen ved forsigtigt at ridse over cochlearbenet med tang. Overfør straks bullae til et overskud af koldt fikseringsmiddel (mindst 50 ml) og fastgør vævet i kulden (4-8 ° C) under blid omrøring (2D-shaker [100 o / min]) i 2 dage.
BEMÆRK: Efter fiksering af vævet kan cochleae enten behandles straks eller opbevares i PBS med 0,05% natriumazid. FORSIGTIG: Natriumazid er giftigt. Bemærk, at opbevaringslængden kan påvirke farvningens kvalitet negativt. Begrænsede forsøg har antydet, at immunostaining syntes svagere efter 2 års opbevaring af vævet i natriumazid.
2. Vævsforberedelse og immunmærkning
- Ethylendiamintetraeddikesyrepulver (EDTA) opløses i PBS for at fremstille en 0,5 M opløsning ved pH 8. Til dette formål anbringes et bægerglas på en magnetisk omrører, fyldes med ca. halvdelen af den samlede mængde PBS, og der tilsættes en passende mængde EDTA-pulver, hvilket resulterer i en sur suspension. Der tilsættes forsigtigt koncentreret natriumhydroxidopløsning (NaOH), mens pH-værdien overvåges med en pH-meter. Fyld pbs op til det ønskede slutvolumen, og opløsningen filtreres for at forhindre mikrobiel kontaminering.
BEMÆRK: EDTA-pulveret opløses først helt, når suspensionen har nået en neutral pH-værdi. - Til afkalkning overføres cochleae til 80 ml 0,5 M EDTA i PBS. Inkuber vævet i kulden (4-8 °C) under blid omrøring på 2D-shakeren (100 o / min) i 2 dage.
BEMÆRK: Efter afkalkningstrinnet kan vævet opbevares i PBS i flere dage op til 3 uger, før de resterende behandlingstrin fortsættes. For antistoffer, der mærker stria vascularis, anbefales det at skære cochleae i halvdelen langs den modiolære akse på dette tidspunkt (dvs. før immunostaining) for at sikre ensartet adgang af antistoffer til deres respektive mål. Dette er antistofafhængigt og gælder ikke for de antistoffer, der anvendes her til at mærke synaptiske strukturer og IHC'er. Brug et stykke barberblad, der kan gå i stykker, og en knivholder (som beskrevet i trin 4.2) til skæringen. - Udfør følgende trin (op til trin 3.2) i 2 ml sikkerhedsforseglingsreaktionsrør. Hvis vævsstykket er for stort til at passe ind i røret, skal du trimme det overskydende væv med en saks. For at forbedre penetrationen af antistofferne skal vævet først permeabiliseres i 1 ml 1% triton (Triton X-100) i PBS på 2D-shakeren (100 o / min) ved stuetemperatur i 1 time. Vævet 3x vaskes med 1 ml 0,2% triton (Triton X-100) i PBS på 2D-rysteren (100 o/min) ved stuetemperatur i 5 min hver.
- For at blokere uspecifikke antigener inkuberes cochleae i 1 ml blokeringsopløsning (3% bovint serumalbumin [BSA], 0,2% triton, i PBS) på 2D-rysteren (100 o / min) ved stuetemperatur i 1 time.
BEMÆRK: Blokeringsløsningen kan fremstilles på forhånd, men bør ikke være ældre end ~ 10 dage. - Fortynd følgende primære antistoffer frisk i samme aliquot af blokeringsopløsning: anti-myoVIIa (myosin VIIa) for at mærke IHC'er (IgG polyklonal kanin), fortyndet 1:400; anti-CtBP2 (C-terminalt bindende protein 2) til mærkning af præsynaptiske bånd (IgG1 monoklonal mus), fortyndet 1:400; og anti-GluA2 til mærkning af postsynaptiske receptorplastre (IgG2a monoklonal mus), fortyndet 1:200. Sørg for, at cochleae er fuldt dækket med antistofopløsningen (typisk 0,4 ml), og inkuber dem ved 37 ° C i 24 timer.
- Vask derefter vævet 5x med 0,2% triton i PBS på 2D-shakeren (100 o / min) ved stuetemperatur i 5 minutter hver. Vælg sekundære antistoffer for at matche værtsarterne for deres primære modstykker og fortynd dem igen frisk i 3% BSA, 0,2% triton, i PBS: gede-antimus (IgG1)-Alexa fluorophore (AF) 488, fortyndet 1: 1.000; ged anti-mus (IgG2a)-AF568, fortyndet 1:500; og æsel anti-kanin-AF647 (IgG), fortyndet 1:1.000. Pak røret ind i aluminiumsfolie for at forhindre blegning af fluorescensen. Cochleaen inkuberes i 0,4 ml sekundær antistofopløsning ved 37 °C i 24 timer.
BEMÆRK: Begrænsede forsøg har vist, at inkubation af cochlear-væv ved 37 °C i 24 timer med primære og sekundære antistoffer resulterede i lysere immunstaining end efter den mere almindelige inkubationsprocedure med lavere temperaturer og kortere varigheder. - Cochleae 2x vaskes med 1 ml 0,2% triton i PBS i 5 minutter hver og 3x med PBS i 5 minutter hver på 2D-rysteren (100 o / min) ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Efter disse vasketrin kan cochleae forblive i PBS i køleskabet ved ~ 4 ° C i flere dage.
3. Behandling med autofluorescens quencher (valgfrit)
BEMÆRK: Cochleae fra midaldrende og gamle gerbils viser omfattende baggrund autofluorescens. I ung voksenvæv er behandling med en autofluorescens quencher ikke nødvendig. Det er i princippet muligt at anvende autofluorescensslukkeren før immunostainingproceduren, som derefter undgår utilsigtet reduktion af det ønskede antistoffluorescens. Ifølge producentens datablad er brugen af vaskemidler (såsom Triton X-100 i den nuværende protokol) imidlertid ikke længere mulig, da de fjerner quencher fra vævet.
- Cochleae halveres under et stereomikroskop som beskrevet i trin 4.2.
- Bland autofluorescenslukkeren med 70% ethanol for at opnå en 5% opløsning, og cochleae inkonkurreres i denne opløsning på 2D-rysteren ved stuetemperatur i 1 minut. Cochleae vaskes 3x med 1 ml PBS på 2D-shakeren ved stuetemperatur i 5 min hver.
FORSIGTIG: Autofluorescens quencher er farlig og skadelig. Brug handsker, når du håndterer dette stof.
4. Endelig fin dissektion
- Disseker cochlea under et stereomikroskop. Fyld et polystyrol petriskål og dets låg med PBS, og hav to fine tang, Vannas fjedersaks, en knivholder og et barberblad, der kan knækkes, ved hånden. Bryd stykker fra barberbladet for at opnå en skæreflade på ~ 2-4 mm afhængigt af dissektionstrinnet. Forbered et mikroskopglas ved at placere tre dråber monteringsmedium i træk.
BEMÆRK: Barberbladets skæreflade slides hurtigt af. Bladet skal udskiftes efter dissekering og montering ca. hvert andet stykke af cochlea. - Hvis det ikke allerede er gjort i trin 3.1, skal du først skære cochlea i halvdelen langs modiolus under et stereomikroskop. Til dette skal du placere et stykke barberblad længere end cochleaens oprullede længde i en knivholder. Læg cochlea i petriskålen og skær overskydende væv væk med barberbladet. Hold cochlea på plads med fine tang og skær i halve langs modiolus.
- Start med den ene halvdel, men lad også den anden halvdel være i petriskålen. Fastgør forsigtigt cochlear-halvdelen med pincet, så skærekanten vender opad. Brug fin fjedersaks til at skære cochleaens knogle væk over helicotremaet, der dækker toppen.
- For at begynde adskillelsen af de cochleære stykker skal du isolere den midterste drejning ved at skære med en saks gennem modiolus og hørenerven, over (scala vestibuli) og under (scala tympani).
- Skær gennem cochlear-knoglen, der dækker stria vascularis i cochlear-kanalen. Lav to snit på begge sider af cochlear-knoglen over Cortis organ og langs stria vascularis, og brug barberbladet til til sidst at adskille cochlear-stykkerne.
BEMÆRK: Stria vascularis er let synlig som en mørk stribe. Skæring langs stria vascularis efterlader Cortis organ intakt. - Valgfrit: For at opsamle stria vascularis skal du omhyggeligt skære mellem Corti-organet og stria vascularis for at adskille de to. Lad stria vascularis være forbundet med spiralbåndet (fastgjort til knoglen, der dækker den ydre overflade af cochlea) og fjern den afkalkede knogle ved hjælp af tang. Placer stykket med stria-siden opad på mikroskopglasset i en dråbe monteringsmedium.
BEMÆRK: Hvis det opsamlede stykke er buet for stærkt, kan det være nødvendigt at opdele det i mindre stykker, så det er fladt nok til montering på diaset. - Overfør cochlear-stykkerne til det PBS-fyldte låg på polystyrol petriskålen, så du sikrer, at cochlear-holderne ligger så fladt som muligt på rutsjebanen. Fjern overskydende væv, såsom dele af spiralbåndet på abneuralsiden og dele af spiral limbus på neuralsiden. Fjern forsigtigt tectorialmembranen med superfine pincet.
- Placer cochlear-stykkerne på glideren i en dråbe monteringsmedium. Placer hele cochlear-holderne med Cortis organ opad på diaset for at undgå at skjule IHC'erne i den optiske vej til billeddannelse. Se efter invagination af spiral limbus i nærheden af IHC'erne, hvilket er synligt ved at flytte cochlear-stykket ind i sagittalplanet for at identificere den side, der skal vende opad.
BEMÆRK: For digitalt at rekonstruere den komplette cochlea fra dens individuelle stykker under videre behandling anbefales det kraftigt at dokumentere skitser af stykkerne og notere landemærker. Desuden skal stykkerne ideelt set arrangeres i den rigtige rækkefølge på diaset. - Trin 4.3 til 4.8 gentages, indtil hele cochlea overføres til mikroskopglasset. Tilføj om nødvendigt mere monteringsmedium, dækslip glideren og forsegl dækslippen på plads med sort neglelak malet rundt om kanterne. Lad det tørre i mørke ved stuetemperatur, og opbevar derefter diaset i mørke ved 4 °C.
BEMÆRK: Selvom dele af selve det sensoriske epitel ved et uheld går tabt, er det vigtigt ikke desto mindre at montere det, der er tilbage af cochlear-stykket for korrekt længdeestimering.
5. Måling af cochlear-længde
- Mål længden af cochlea fra brightfield-billeder af dets stykker ved hjælp af et epi-fluorescensmikroskopsystem og tilhørende software. Gem billeder med lav forstørrelse (4x objektiv) fra hvert cochlear-stykke, og brug lasso-måleværktøjet i mikroskopsoftwaren til at tegne en streg langs rækken af IHC'er i hvert af billederne. Beregn den samlede længde ved at tilføje længderne på alle stykkerne.
BEMÆRK: Når dele af det sensoriske epitel mangler i et cochlear-stykke, interpoleres linjen. - For at definere de cochlea-steder, der skal analyseres i en individuel cochlea, skal du beregne deres tilsvarende afstande fra toppen ved hjælp af ligningen givet af Müller25. Marker f.eks. disse steder på en udskrift af cochlear-stykkerne.
6. Billedoptagelse med et konfokalt mikroskop
- Brug et konfokalt mikroskop med et olie-nedsænkning 40x mål (numerisk blænde 1.3) og den passende olie til billeddannelse i høj opløsning.
BEMÆRK: Hvis konfokalmikroskopet har en omvendt lysbane, skal diaset placeres på hovedet. I dette tilfælde skal du give prøven ca. 30 minutter til at synke og hvile stabilt på dækslen, inden du starter den endelige scanning. Alternativt kan du bruge et monteringsmedium, der er flydende i hele dissektionens varighed, men størkner senere og samtidig bevarer fluorescensen. - Aktiver de relevante lasere: to optisk pumpede halvlederlasere med bølgelængder på λ = 488 nm og λ = 522 nm og en diodelaser med en bølgelængde på λ = 638 nm anvendes i denne protokol. Vælg fluorescensmærkernes emissionsområde (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). Når en hybriddetektor tæller de frigivne fotoner, skal du placere laserlinjen mindst 10 nm væk fra emissionskurven.
BEMÆRK: Det er vigtigt at udføre indledende kontroller med enkeltmærket væv for at sikre, at de valgte detektorbåndbredder adskiller farvekanalerne rent (dvs. ikke fører til kanalkrydstale). Radiobølger forstyrrer hybriddetektoren, hvilket resulterer i maksimalt fotonantal og forårsager dermed artefaktiske striber i stakken. Undgå derfor at bruge en mobiltelefon i nærheden af mikroskopet. - Zoom ind på vævet, indtil billedet spænder over 10 IHC'er. Vælg billedets opløsning i henhold til Nyquist-sampling, som typisk er ~ 40-60 nm / pixel. Indstil trinstørrelsen i z-retningen til 0,3 μm og billedhastigheden til 400-700 Hz.
BEMÆRK: Begge disse indstillinger (trinstørrelse og billedhastighed) er kompromiser mellem at bruge optimale billedparametre og spare scanningstid. - Udfør tovejsprøvetagning for at forkorte billeddannelsestiden. Akkumulere rammen for 488 nm og 638 nm kanalen 3x og for 522 nm kanalen 6x; derudover gennemsnit linjerne 3x for hver kanal. Vælg begyndelsen og slutningen af stakken i z-dimensionen.
- Indstil forstærkningen til 100, når du bruger hybriddetektoren (tælletilstand) for at undgå nedsat signal/støj-forhold. Indstil lasereffekten, så ingen pixel er mættet i interesseområdet, men strukturerne dækker for det meste hele 8 bitområdet. Start med en lav lasereffekt på 0,5% og øg den, indtil strukturer er synlige.
BEMÆRK: God farvning kræver typisk en lasereffekt mellem 0,1% og 5%. - Brug dekonvolutionssoftware til post hoc-behandling af billedstakkene for at fjerne sløringsglorien omkring små fluorescerende strukturer ved hjælp af en teoretisk punktspredningsfunktion. Brug de samme indstillinger for hver stak i et eksperiment. Gem de dekonvolverede billeder som .tif eller .ics.
BEMÆRK: MyoVIIa-mærket (IHC'er) drager ikke fordel af dekonvolution og kan udelades for at spare tid. Softwaren bruger metadata fra billedfilerne; der skal dog specificeres flere parametre såsom lysbanen, indlejringsmediet eller nedsænkningsmediet.
7. Synapse kvantificering
- Åbn en kopi af de dekonvolverede stakke i den frit tilgængelige software ImageJ med det ekstra Biovoxxel-plugin, som også er tilgængeligt på deres hjemmeside.
- Juster farverne på de enkelte kanaler ved at opdele kanalerne (billede | Farve | Opdel kanaler) og fletning (| Farve | Flet kanaler) dem igen og tildele forskellige farver. Konverter billedet til en RGB-stak (billede | Farve | Stak til RGB), og juster lysstyrken og kontrasten (| Juster | Lysstyrke/kontrast | enten Auto eller skyder vedrørende Maksimum), hvis det er nødvendigt, så de præ- og postsynaptiske strukturer og IHC-etiketten er behageligt forskellige fra baggrunden.
- Vælg fem IHC'er, og mærk dem med tekstværktøjet (IHC1-IHC5) ved at klikke på den ønskede placering i stakken. Åbn ROI manager (Analyser | Værktøjer | ROI Manager); aktiver afkrydsningsfeltet Etiketter for at mærke punkterne med et tal. Zoom ind på IHC af interesse.
- Brug punkt-/multipunktværktøjet i multipunkttilstand (højreklik på værktøjet for at vælge mellem punkt- eller multipunkttilstand). Klik på en funktionel båndsynaps (dvs. et præsynaptisk bånd i tæt sidestilling med en postsynaptisk glutamatpatlaps), mens du ruller gennem z-dimensionen.
BEMÆRK: Afhængigt af deres overlapning og den farve, der er valgt for hver kanal, vises de delte pixels i blandede farver. Normalt er sondringen mellem individuelle funktionelle synapser enkel, fordi de er tilstrækkeligt fjernt fra hinanden. - Når alle strukturer af interesse er markeret, skal du klikke på Tilføj på ROI-lederens grafiske brugergrænseflade. Klik på det vilkårlige navn, og vælg Omdøb.
BEMÆRK: Punktetiketterne forbliver stadig gennem alle planer i stakken, når afkrydsningsfeltet Vis alle er markeret i menuen med indstillinger for punktværktøjet (dobbeltklik på punktværktøjsikonet ), hvilket hjælper med at undgå at tælle den samme båndsynaps flere gange. - Når du vælger den næste IHC, der skal tælles, skal du undgå utilsigtet at tilføje tællinger ved at justere billedet, så det vises fuldt ud med det næste IHC-værktøj. Skift fra multipunktværktøj til punktværktøj for at undgå at tilføje flere punkter til de tidligere gemte data. Klik på en struktur af interesse inden for den næste IHC og skift tilbage til multipoint værktøj. Gentag trin 7.4 til 7.5, indtil alle IHC'er af interesse er evalueret.
- For at gemme data skal du klikke på et datasæt i ROI manager og derefter på måling. Vent på, at der vises et nyt vindue, der viser de målte datapunkter. Gem denne liste som en regnearksfil (Fil | Gem som). Gem billedet ved at aktivere Vis alle i ROI-manageren. Klik på Flad for permanent at tilføje punktetiketterne til stakken. Når du lukker billedstakken, skal du acceptere at gemme ændringerne.
8. Analyse af synapsevolumen og position på hårcellen
BEMÆRK: Forfatterne brugte en specialprogrammeret procedure baseret på Matlab. Da den ikke er offentligt tilgængelig, er den her kun beskrevet i store træk (se ogsåpunkt 7). Kontakt venligst den tilsvarende forfatter, hvis du er interesseret i at bruge den. Proceduren forventer en tredobbelt mærket (IHC'er, præ- og postsynaptisk) billedstak i TIFF-format som input, guider brugeren gennem de forskellige analysetrin via en grafisk grænseflade og giver omfattende output af resultaterne i regnearkformat.
- Normaliser placeringen af de synaptiske strukturer til et 3D-koordinatsystem defineret af den enkelte IHC's udstrækning på søjlemodiolær aksen og cochlear apikal-basal akse og IHC's øverste (cuticular plate) til bund (synaptisk pol) akse.
BEMÆRK: Volumenerne af synaptiske elementer (både præ- og postsynaptiske og det kombinerede volumen af funktionelle synapser) tilvejebringes i μm3 og normaliseres til den respektive medianværdi3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cochleae blev enten høstet efter kardiovaskulær perfusion med fiksering af hele dyret eller hurtigt dissekeret efter aflivning af dyret og nedsænkningsfikseret. Med sidstnævnte metode forblev IHC'erne på plads under dissektion, mens det sensoriske epitel i tilfælde af mislykket perfusion og dermed utilstrækkeligt fikseret væv ofte blev ødelagt. Bemærk, at forfatterne stødte på tilfælde, hvor fiksering af cochleae efter transkardieperfusion var utilstrækkelig, mens fiksering af hjernen stadig var tilstrækkelig. Væv fra en ringere perfusion kunne stadig reddes ved at åbne huller i cochlear apex og base og postfiksere cochleae ved nedsænkning i 4% PFA i 2 dage.
Længdebestemmelse af hele cochlea blev udført i henhold til Müller25 for at evaluere IHC'er og deres synapser ved specifikke cochlea-positioner svarende til forskellige karakteristiske frekvenser (tabel 1). Til dette blev de ønskede cochleapositioner beregnet som procentdele af basilarmembranlængden fra cochlear-basen. Den gennemsnitlige cochlealængde på 13 cochleae fra unge voksne gerbils var 11,3 mm (interkvartilområde: 11,02-11,52 mm). Den gennemsnitlige cochlealængde på 24 cochleae fra gamle gerbils var 11,5 mm (interkvartilområde: 11,24-11,73 mm). Der var ingen signifikant forskel mellem længden af ung voksen og alderen cochleae (Mann-Whitney U-test: U = -1,62, p = 0,105); den samlede median var 11,48 mm. Man kan argumentere for, at denne variation i længden af individuel cochleae var lille, og at det er tilstrækkeligt at bruge faste længdepositioner (i mm). Stedfrekvensfunktionen er imidlertid ikke-lineær. Derfor forårsager en afvigelse fra medianlængden en større fejl for basale cochlea-steder end for relativt mere apikale cochlear-steder. For den cochlea-placering, der svarer til en frekvens på 1 kHz, beregnet ud fra den mediane cochlealængde (dvs. 11,48 mm), varierede den tilsvarende frekvens f.eks. fra 1,16 kHz til 0,91 kHz for henholdsvis den korteste (10,36 mm) og den længste cochlea (12,28 mm) i denne prøve. For en basalt placeret frekvens (f.eks. 32 kHz) var frekvensområdet 51,62 kHz til 23,97 kHz for henholdsvis den korteste og længste cochlea. Derfor er det tilrådeligt at beregne de enkelte placeringer på hver cochlea, især når man undersøger basale cochlea-placeringer.
Figur 1 viser maksimal intensitet z-dimension fremskrivninger af cochleae fra en ung voksen (10 måneder, figur 1A) og en alderen gerbil (38 måneder, figur 1B), som er eksempler på ideelle immunlabels. På billedet, der viser den unge voksne gerbils cochlea, er de myoVIIa-mærkede IHC'er, her vist med blåt, i skarp kontrast til den sorte baggrund. Derfor er individuelle IHC'er let detekterbare. De præ- og postsynaptiske strukturer er tydeligt synlige som henholdsvis grønne og røde elementer. De antages at danne en funktionel synapse, når de er i tæt sammenstilling (figur 1A', B'). Der var sjældent uparrede præsynaptiske strukturer (forældreløse bånd) synlige i cochleae af alderen gerbils. Cochlea fra den gamle gerbil (figur 1B) blev behandlet med autofluorescens quencher. IHC-etiketten ser svagere ud, selvom lasereffekten, der blev brugt i denne prøve, var tre gange højere end den, der blev brugt til cochlea fra den unge voksne gerbil. Ikke desto mindre adskiller IHC'erne sig stadig fra baggrunden. De præ- og postsynaptiske strukturer er tydeligt synlige, og laserkraften, der blev brugt til begge disse kanaler, var ens eller endda under den for den unge voksne prøve. Væv fra ældre dyr viste typisk signifikant mere uspecifikt udseende fluorescerende signal. Derfor er den største forskel i protokollen for ung voksen og ældre materiale behandlingen med en autofluorescens quencher. Bemærk, at dette blev udført efter immunstaining med fluorescensmærkede antistoffer og i princippet også kan påvirke den tilsigtede antistofetiket. Behandlingen reducerede imidlertid effektivt ekstern fluorescens af uspecifik oprindelse, samtidig med at den efterlod tilstrækkeligt signal om den specifikke etiket af de interessante strukturer (sammenlign figur 1B med figur 2B). Foreløbige resultater viste imidlertid, at i stria vascularis manifesterede fremmed fluorescens sig ikke i prøver fra alderen gerbils.
Eksempler på stakke, der blev suboptimalt behandlet, er vist i figur 2. Figur 2A viser den maksimale intensitet z-projektion af en stak fra en gammel gerbil (36 måneder), hvor IHC'erne, som også enten var unaturligt bøjede eller revet fra hinanden, ikke blev scannet i deres helhed. Som et resultat er kun de apikale og basale poler af IHC'er synlige i denne scanning. Det kan ikke udelukkes, at flere synapser var placeret i den manglende midterste del af IHC'erne, og derfor er en pålidelig analyse ikke mulig. Det er således afgørende, at alle evaluerede IHC'er scannes fuldstændigt i confocalstakken. Figur 2B viser z-projektionen med maksimal intensitet af en stak udtaget i en alderen gerbil (38 måneder). Fluorescensen af uklar oprindelse er høj, da autofluorescens quencher ikke blev brugt i dette tilfælde. Den fremmede fluorescens var dog stort set begrænset til den (røde) kanal, der er forbundet med GluA2-etiketten, hvilket er ret typisk. I sådanne tilfælde kan det stadig være muligt at tælle funktionelle synapser, hvis båndenes CtBP2-etiket er relativt ren og specifik. Figur 2C viser z-projektionen med maksimal intensitet af en stak opnået fra en alderen gerbil (42 måneder). Her kan synapserne ikke allokeres til individuelle IHC'er, da IHC'erne stort set blev opløst; Det er faktisk svært at være sikker på, hvor mange IHC'er der er repræsenteret. I eksemplet vist i figur 3A blev der brugt en mobiltelefon i nærheden af det konfokale mikroskop under scanningen. Striber er synlige i den blå kanal (IHC-etiket). Heldigvis påvirkede dette i dette tilfælde ikke de synaptiske kanaler og påvirkede kun den øverste del af IHC'erne, og en analyse var således stadig levedygtig.
Figur 3 viser z-fremskrivninger med maksimal intensitet af stakke taget fra det samme stykke cochlea fra en ung voksen gerbil, erhvervet 3 måneder (figur 3A, A ') og 29,5 måneder (figur 3B, B ') efter immunstaining. For at forblive sammenlignelige blev billederne ikke taget fra nøjagtig samme sted (som måske har lidt blegning fra den forrige scanning), men fra det samme cochlear-stykke. For scanningen taget på det senere tidspunkt skulle lasereffekten øges ~ 2- til 3 gange. Ikke desto mindre er de mærkede strukturer stadig klare. Signal-støj-forholdet var faldet, især i kanalerne, der viste postsynaptiske og IHC-strukturer, mens kanalen med den præsynaptiske etiket var mindre påvirket. Kvantificering af funktionelle synapser pr. IHC er stadig mulig.
Typiske resultater for analysen af synapsevolumen og position på IHC er illustreret i figur 4 ved hjælp af den konfokale stak vist i figur 1A. Individuelt definerede IHC'er vises grafisk som gitterrekonstruktioner i forskellige farver, med eller uden de funktionelle synapser (defineret ved kolonisering af præ- og postsynaptiske etiketter), der er tildelt hver. Denne skærm kan frit drejes i 3D for at opnå forskellige synsvinkler (figur 4A, B). IHC'er kan også udpeges til grafisk visning (figur 4B). Der produceres et stort udvalg af datagrafer, der illustrerer forskellige aspekter af fordelingen af synaptiske volumener inden for det IHC-centrerede koordinatsystem (eksempler i figur 4C-E). De rå kvantitative data for hver IHC og hvert synaptisk element er også tilgængelige som regneark, som derefter for eksempel kan kombineres på tværs af flere konfokale stakke til yderligere statistisk analyse.
Figur 1: Eksempler på vellykket behandlet cochleae. Maksimal intensitet z-fremspring af konfokale stakke fra (A) en ung voksen gerbil (10 måneder), opnået på et cochlear sted svarende til 1 kHz, og (B) en alderen gerbil (38 måneder, panel B), opnået på et cochlear sted svarende til 500 Hz. IHC'er blev farvet med et antistof mod myoVIIa (blå), præsynaptiske bånd blev mærket med anti-CtBP2 (grøn), og postsynaptiske glutamatplastre blev mærket med anti-GluA2 (rød). Cochlea af den gamle gerbil blev behandlet med en autofluorescens quencher efter immunostaining. For klarhedens skyld er IHC'ernes konturer angivet med stiplede linjer. Paneler (A') og (B') viser en udvidelse af de områder, der er skitseret af firkanterne i den tilsvarende cochleae fra paneler (A) og (B). Gule pilespidser peger på funktionelle synapser. Kanalerne, der viste de præ- og postsynaptiske strukturer (men ikke IHC-kanalen), gennemgik dekonvolution. Skalastænger = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Forkortelser: IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindende protein 2; GluA2 = ionotrop glutamatreceptor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Eksempler på suboptimalt behandlet cochleae. Z-fremskrivninger med maksimal intensitet af konfokale stakke, for hvilke behandlingen ikke var optimal, fra gerbils, der var (A) 36 måneder og (B, C) 38 måneder gamle, og fra cochlealokationer svarende til henholdsvis 16 kHz, 8 kHz og 32 kHz. Gerbils, hvorfra cochleae i paneler (A) og (C) blev afledt, blev transkardiely perfunderet, og cochlea fra panel (C) blev desuden postfikseret i 3 dage i 4% PFA. Cochlea fra (B) blev nedsænkningsfikseret i 4% PFA i 2 dage. Cochleae fra (A) og (C) blev behandlet med autofluorescens quencher. IHC'er blev farvet med et antistof mod myoVIIa (blå), præsynaptiske bånd blev mærket med anti-CtBP2 (grøn), og postsynaptiske glutamatplastre blev mærket med anti-GluA2 (rød). Alle kanaler blev dekonvolveret. Lysstyrke og kontrast blev yderligere justeret efter konfokal scanningen. Skalastænger = 10 μm. Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindende protein 2; GluA2 = ionotrop glutamatreceptor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Stabilitet af immunolabel efter langvarig opbevaring. Z-fremspring med maksimal intensitet af konfokale stakke fra en ung voksen gerbil (10 måneder), taget på 16 kHz cochlear-lokationen, (A) 3 måneder efter farvning og (B) på et lidt mere basalt cochlear-sted på det samme cochlear-stykke 29,5 måneder efter farvning. Cochlea blev nedsænket i 4% PFA i 2 dage. For klarhedens skyld zoomer (A') og (B') kun ind på nogle få funktionelle synapser fra de områder, der er angivet med kvadrater i henholdsvis (A) og (B). IHC'er blev farvet med et antistof mod myoVIIa (blå), præsynaptiske bånd blev mærket med anti-CtBP2 (grøn), og postsynaptiske glutamatplastre blev mærket med anti-GluA2 (rød). Lasereffekten for IHC-kanalerne var 1,3% og 3%, for de presynaptiske kanaler 0,4% og 1,1% og for de postsynaptiske kanaler henholdsvis 1,1% og 2% i (A) og (B). Bemærk, at i (A) er blå striber synlige i den øverste del af IHC'erne, som skyldes brugen af en mobiltelefon i nærheden af det konfokale mikroskop. Skalastænger = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Forkortelser: PFA = paraformaldehyd; IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindende protein 2; GluA2 = ionotrop glutamatreceptor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative resultater af kvantificeringen af synapsevolumen. (A) Ti IHC'er vist som forskelligt farvede gitterrekonstruktioner baseret på myoVIIa immunolabel. Deres tilknyttede funktionelle synapser, defineret af colocaliserede CtBP2-(grøn) og GluA2-mærkede elementer (rød), vises sammen med IHC'erne og også separat nedenfor for klarhedens skyld. Bemærk, at synsvinklen blev valgt til at være vinkelret på IHC'ernes lange akse og dermed adskiller sig fra det oprindelige konfokale billede (figur 1A). (B) En af IHC'erne udpeget og vist roteret 90°. Det sorte plan blev manuelt defineret af brugeren og gennemskærer IHC langs sin søjlemodiolære akse. (C) Boblediagram, der viser placeringen af alle funktionelle synapser i denne konfokale stak i forhold til de normaliserede tre akser i deres respektive IHC. symbolernes størrelse er proportional med volumenet af det presynaptiske element. Bemærk, at synsvinklen blev valgt til at ligne panel (B). (D) Boxplot af de normaliserede volumener af synaptiske elementer, separat for de præsynaptiske (venstre 2 kasser) og postsynaptiske (højre 2 kasser) partnere af funktionelle synapser og yderligere adskilt i henhold til deres position i den modiolære eller søjlehalvdel af deres respektive IHC (forskellige farver). Kasser repræsenterer interkvartilområder, med medianerne angivet med linjer. Stiplede whiskers angiver 1,5 gange interkvartilområdet, og krydsene angiver fjerntliggende værdier ud over det. (E) Spredning af de normaliserede mængder af præ- vs. postsynaptiske partnere af funktionelle synapser. Forskellige symboler angiver placeringen i den modiolære eller søjlehalvdel af deres respektive IHC. Forkortelser: IHC = indre hårcelle; myoVIIa = myosin VIIa; CtBP2 = C-terminalt bindende protein 2; GluA2 = ionotrop glutamatreceptor. Klik her for at se en større version af denne figur.
Tabel 1: Afstande fra toppen, der svarer til specifikke målfrekvenser i cochleae af forskellig længde. De tilsvarende bedste frekvenser blev beregnet ud fra ligningen givet af Müller25. Klik her for at downloade denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med den metode, der er skitseret i denne protokol, er det muligt at immunolabel IHC'er og synaptiske strukturer i cochleae fra unge voksne og gamle gerbils, identificere formodede funktionelle synapser ved samtidig lokalisering af præ- og postsynaptiske elementer, allokere dem til individuelle IHC'er og kvantificere deres antal, volumen og placering. Antistofferne, der anvendes i denne tilgang, mærkede også ydre hårceller (OHC'er; myoVIIa) og deres præsynaptiske bånd. Desuden er et levedygtigt alternativ til immunmærkning af både IHC'er og OHC'er et antistof mod otoferlin, hvor OHC'er forekommer meget svagere end IHC'er.
Perfusion kan udføres ved hjælp af to forskellige opsætninger. 1) Et tyngdekraftsfodret drypledningssystem, hvor en enkelt flaske, der fodrer en kommerciel drypledning, er ophængt på et remskivehjul ca. 1,5 m over dyret. Væsker indføres successivt efter sænkning af flasken, som er åben øverst. 2) Et system, der bruger en digital peristaltisk pumpe med variabel hastighed, med et tyndt, langt rør åbent i den ene ende for at tage væsken ind og en nål, der let kan fastgøres i den anden ende. Begge fungerer lige godt, og de subtile forskelle vil ikke blive uddybet her. Forfatterne anbefaler dog specifikt et arbejdsbord i duntrækstil med dyret på en perforeret platform og dampene trukket af nedenfor. Dette giver god adgang til det kirurgiske område uden at gå på kompromis med udstødningsfunktionen (i modsætning til at arbejde i et åbent røgkabinet).
Korrekt fiksering af vævet er af afgørende betydning, da det sensoriske epitel ellers vil løsne og opløses under dissektion. I gerbilen er det nødvendigt med mere langvarig eksponering for fikseringsmidlet end almindeligt anvendt (f.eks. for mus 17,27,13 eller marsvin28). Den foretrukne metode til gerbils er hurtig ekstraktion af cochlea efter dyrets død og nedsænkningsfiksering i mindst 1,5 dage. Hvis kardiovaskulær perfusion foretrækkes, er det afgørende, at fiksering sætter ind inden for få minutter og fortsætter godt. Da det kan være svært i sidste ende at bedømme kvaliteten af fiksering under perfusion, anbefales det rutinemæssigt at postfiksere cochleae som beskrevet.
Det er vigtigt at overholde vasketrinnene, hvorved det sidste vasketrin (trin 2.7) er det vigtigste. Hvis det ikke vaskes tilstrækkeligt, er vævet klæbrigt og klæber til dissektionsinstrumenterne, hvilket gør dissektionen vanskelig. Det anbefales også at bruge en autofluorescens quencher i cochleae høstet fra alderen gerbils for at reducere uspecifik fluorescens. Autofluorescens kan stamme fra lipofuscin, som er almindeligt i væv fra alderen dyr 29,30,31, og synes at være bredt ophidset såvel som bredt emitterende. Når lipofuscin exciteres med en bølgelængde i UV-spektret (λ = 364 nm), har lipofuscin et bredt emissionsområde (λ = 400-700 nm, med et maksimum på ~ λ = 568 nm)32. I humant myokardievæv er lipofuscin synlig med en excitation på λ = 555 nm og emission af λ = 605 nm33. Tilsvarende bemærkede forfatterne i IHC'erne af gerbils en stigning i uspecifik fluorescens mest fremtrædende i den kanal, der anvendes til AF568-antistoffet, hvilket tyder på autofluorescens fra lipofuscingranulat. En generel anbefaling ved arbejde med væv fra dyr er således at bruge excitationsbåndbredden omkring 550-600 nm for det mindst kritiske immunmærke.
Måling af den samlede cochlealængde og korrekt identifikation af specifikke cochlear-positioner er kun mulig, hvis hele dens længde bevares. Hvis dele af det sensoriske epitel går tabt i dissektion, anbefales det stadig at montere den resterende del eller endda kun spiralganglionstykket og holde detaljerede noter. Det er derefter normalt muligt at estimere den manglende sektion med rimelig nøjagtighed. Hvis de apikale dele af cochlea er fuldstændigt bevaret, men den basale ende mangler, kan specifikke cochlea-placeringer på den apikale del defineres ved at beregne positionerne baseret på den mediane cochlear-længde inden for den anvendte gerbilpopulation, fordi afvigelsen fra den reelle værdi er lille.
En vigtig begrænsning af synapsevolumenkvantificeringen er, at de resulterende absolutte volumener ikke er sammenlignelige på tværs af forskellige konfokale stakke. Det kritiske trin, der bestemmer de resulterende mængder af synaptiske elementer, er valget af intensitetstærsklen for indledende detektion. Valget af denne intensitetstærskel foretages imidlertid subjektivt af brugeren i den aktuelle protokol og mange andre 3,27,34. Desuden afhænger lysstyrken af immunfluorescensen i det konfokale billede af mange faktorer, som er meget vanskelige at standardisere på tværs af prøver, såsom vævstykkelse, vævets orientering i forhold til den optiske vej, varigheden af lasereksponering og præcise konfokale og dekonvolutionsindstillinger. Alle disse forbehold forværres, hvis sjældent materiale erhverves over en længere periode, som det er typisk for aldrende gerbils. Tilsammen betyder det, at bias er meget vanskelige at udelukke i samlede data, og det bedste scenarie er et datasæt med høj varians. Det anbefales derfor rutinemæssigt at normalisere synaptiske volumener til det respektive medianvolumen af den enkelte konfokale stak, som introduceret af Liberman et al.3. Den åbenlyse ulempe er, at synaptiske volumener derefter kun er sammenlignelige inden for en given billedstak, f.eks. mellem forskellige placeringer på IHC, men ikke mellem forskellige cochlea-placeringer eller prøvealdre.
Den dobbelte mærkning af præ- og postsynaptiske strukturer og kravet om co-lokalisering giver mulighed for et mere pålideligt skøn over antallet af funktionelle synapser end at bruge begge etiketter alene. Hvis kun en etiket er mulig, anbefales det at bruge den presynaptiske anti-CtBP2, koblet til AF488 eller fluorescerende tags med lignende bølgelængdespecifikationer, af to grunde. For det første synes forældreløse bånd, det vil sige CtBP2-mærkede elementer uden en co-lokaliseret postsynaptisk etiket, at være sjældne17, og forfatterne bekræftede dette for alderen gerbils. Således er fejlen introduceret ved ikke at være i stand til at verificere co-lokalisering med en postsynaptisk partner lille. Det skal dog bemærkes, at dette bliver et mere væsentligt problem ved undersøgelse af støjeksponerede ører (f.eks.28). For det andet, i tilfælde med højt fluorescenssignal af uklar oprindelse, påvirkede støjen typisk kanalen ved hjælp af en excitationsbølgelængde omkring 568 nm i størst omfang (eksempel i figur 2B, der repræsenterer GluA2-etiketten). I det mindste en del af denne støj kan i væv fra ældre dyr være lipofuscin autofluorescens. For at maksimere chancen for en ren, enkelt anti-CtBP2-etiket anbefales det således at undgå denne bølgelængdekanal. Endelig blev det vist, at med passende kølige og mørke opbevaringsforhold er den immunmærkning, der anvendes her, stabil over lange perioder, op til mindst 2,5 år (figur 3B), hvilket gør revurdering af værdifuldt væv, såsom fra alderen gerbils, mulig.
Kvantificeringen af IHC afferent synapse nummer er blevet en vigtig metrik til evaluering af tilstanden af det perifere auditive system i mange sammenhænge, blandt dem aldersrelateret høretab. Der er forskellige protokoller offentliggjort nu (f.eks. Gerbils21, mus17,13, marsvin10,28 og mennesker35). Metoden, der er skitseret her, er i sine detaljer specifik for unge voksne og gamle gerbils, men der er afledt nogle generelle anbefalinger, der også kan være nyttige i andre arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender Lichun Zhang for at have hjulpet med at etablere metoden og Fluorescence Microscopy Service Unit, Carl von Ossietzky University of Oldenburg, for brugen af billeddannelsesfaciliteterne. Denne forskning blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
- Liberman, M. C. Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review. F1000Research. 6 (927), (2017).
- Heeringa, A. N., Koeppl, C. The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy. Hearing. 376, 111-124 (2019).
- Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses. The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).
- Khimich, D., et al. Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling. Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).
- Pangršič, T., et al. Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells. Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).
- Meyer, A. C., et al. Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea. Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).
- Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells. Hearing Research. 364, 81-89 (2018).
- Steenken, F., et al. Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity. Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).
- Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate. Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).
- Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates. Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).
- Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice. The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).
- Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).
- Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse. Scientific Reports. 6 (1), 25056 (2016).
- Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains. Hearing Research. 390, 107933 (2020).
- Liberman, M. C. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).
- Bourien, J., et al. Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve. Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).
- Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline. The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).
- Viana, L. M., et al. Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue. Hearing Research. 327, 78-88 (2015).
- Batrel, C., et al. Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve. PLoS ONE. 12 (1), 0169890 (2017).
- Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978 (2021).
- Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils. Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).
- Cheal, M. The gerbil: A unique model for research on aging. Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).
- Gates, G. A., Mills, J. H.
- Ryan, A. F. Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Müller, M. The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil. Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis. STAR Protocols. 2 (2), 100544 (2021).
- Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea. Scientific Reports. 10 (1), 19945 (2020).
- Gray, D. A., Woulfe, J. Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste. Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1 (2005).
- Li, H. -S., Hultcrantz, M. Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice. ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).
- Kobrina, A., et al. Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss. Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).
- Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration. Frontiers in Neuroscience. 12, 464 (2018).
- Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy. Journal of Pathology Informatics. 7, 15 (2016).
- Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).
- Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear. Neuroscience. 407, 8-20 (2019).
