Summary
Se presenta un protocolo para el procesamiento de cócleas de jerbos adultos jóvenes y ancianos mediante el inmunoetiquetado de las estructuras sinápticas aferentes y las células ciliadas, el apagado de la autofluorescencia en el tejido envejecido, la disección y estimación de la longitud de las cócleas y la cuantificación de las sinapsis en pilas de imágenes obtenidas con imágenes confocales.
Abstract
Se supone que la pérdida de sinapsis de cinta que conectan las células ciliadas internas y las fibras nerviosas auditivas aferentes es una de las causas de la pérdida auditiva relacionada con la edad. El método más común para detectar la pérdida de sinapsis de cinta es el inmunoetiquetado porque permite el muestreo cuantitativo de varias ubicaciones tonotópicas en una cóclea individual. Sin embargo, las estructuras de interés están enterradas profundamente dentro de la cóclea ósea. Los jerbos se utilizan como modelo animal para la pérdida de audición relacionada con la edad. Aquí, se describen los protocolos de rutina para la fijación, el inmunoetiquetado de montajes enteros cocleares de jerbos, las imágenes confocales y la cuantificación de los números y volúmenes de sinapsis de cinta. Además, se destacan los desafíos particulares asociados con la obtención de buen material de personas valiosas que envejecen.
Los jerbos son sacrificados y perfundidos cardiovascularmente, o sus bullas timpánicas se diseccionan cuidadosamente fuera del cráneo. Las cócleas se abren en el ápice y la base y se transfieren directamente al fijador. Independientemente del método inicial, las cócleas se fijan posteriormente y posteriormente se descalcifican. Luego, el tejido se etiqueta con anticuerpos primarios contra estructuras pre y postsinápticas y células ciliadas. A continuación, las cócleas se incuban con anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia que son específicos contra sus respectivos primarios. Las cócleas de los jerbos envejecidos se tratan con un silenciador de autofluorescencia para reducir la fluorescencia de fondo típicamente sustancial de los tejidos de los animales más viejos.
Finalmente, las cócleas se diseccionan en 6-11 segmentos. Toda la longitud coclear se reconstruye de tal manera que las ubicaciones cocleares específicas se pueden determinar de manera confiable entre individuos. Las pilas de imágenes confocales, adquiridas secuencialmente, ayudan a visualizar las células ciliadas y las sinapsis en las ubicaciones elegidas. Las pilas confocales se descontorbanican, y las sinapsis se cuentan manualmente utilizando ImageJ, o se lleva a cabo una cuantificación más extensa de las estructuras sinápticas con procedimientos de análisis de imágenes escritos a medida en Matlab.
Introduction
La pérdida de audición relacionada con la edad es una de las enfermedades más prevalentes del mundo que afecta a más de un tercio de la población mundial de 65 años o más1. Las causas subyacentes aún están en debate y se están investigando activamente, pero pueden incluir la pérdida de las sinapsis especializadas que conectan las células ciliadas internas (IHC) con las fibras nerviosas auditivas aferentes2. Estas sinapsis de cinta comprenden una estructura presináptica que tiene vesículas llenas del neurotransmisor glutamato atado a ella, así como receptores postsinápticos de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropiónico (AMPA) glutamato 3,4,5. En el jerbo, ~ 20 fibras nerviosas auditivas aferentes entran en contacto con un IHC 6,7,8. Las fibras en el IHC frente al modiolus se oponen a las cintas sinápticas grandes, mientras que las fibras que se conectan en el lado del pilar del IHC se enfrentan a pequeñas cintas sinápticas (es decir, en gatos9, jerbos7, conejillos de indias10 y ratones 3,11,12,13,14). Además, en el jerbo, el tamaño de las cintas presinápticas y los parches de glutamato postsináptico se correlacionan positivamente 7,14. Las fibras que se oponen a las cintas grandes en el lado modiolar de la IHC son de calibre pequeño y tienen bajas tasas espontáneas y umbrales altos15. Existe evidencia de que las fibras de baja tasa espontánea son más vulnerables a la exposición al ruido10 y a los fármacos ototóxicos16 que las fibras de bajo umbral altamente espontáneas, que se encuentran en el lado del pilar de los IHC15.
La pérdida de sinapsis de cinta es el evento degenerativo más temprano en la pérdida auditiva relacionada con la edad neuronal coclear, mientras que la pérdida de células ganglionares espirales y sus fibras nerviosas auditivas aferentes se queda atrásde 17,18. Los correlatos electrofisiológicos incluyen registros de respuestas auditivas del tronco encefálico17 y potenciales de acción compuesto8; sin embargo, estos no reflejan las sutilezas de la pérdida de sinapsis, ya que las fibras de baja tasa espontánea no contribuyen a estas medidas16. Las métricas electrofisiológicas más prometedoras son el índice neuronal derivado del potencial de masa19 y la respuesta de tiempo periestímulo20. Sin embargo, estos solo son confiables si el animal no tiene otras patologías cocleares, más allá de la pérdida de fibras nerviosas auditivas, que afecten la actividad de las fibras nerviosas auditivas restantes8. Además, los umbrales evaluados conductualmente en el jerbo no se correlacionaron con los números de sinapsis21. Por lo tanto, la cuantificación confiable de las sinapsis de cinta sobrevivientes y, por lo tanto, el número de fibras nerviosas auditivas funcionales solo es posible mediante el examen directo del tejido coclear.
El jerbo mongol (Meriones unguiculatus) es un modelo animal adecuado para estudiar la pérdida auditiva relacionada con la edad. Tiene una vida útil corta, tiene audición de baja frecuencia similar a la humana, es fácil de mantener y muestra similitudes con patologías humanas relacionadas con la pérdida auditiva relacionada con la edad 2,22,23,24. Los jerbos se consideran envejecidos cuando alcanzan los 36 meses de edad, que está cerca del final de su vida útil promedio22. Es importante destacar que se ha demostrado una pérdida de sinapsis de cinta relacionada con la edad en jerbos criados y envejecidos en ambientes tranquilos 8,21.
Aquí, se presenta un protocolo para inmunoetiquetar, diseccionar y analizar cócleas de jerbos de diferentes edades, desde adultos jóvenes hasta ancianos. Se utilizan anticuerpos dirigidos contra componentes del presinaptaso (CtBP2), parches de receptores de glutamato postsinápticos (GluA2) y IHC (myoVIIa). Se aplica un silenciador de autofluorescencia que reduce el fondo en las cócleas envejecidas y deja intacta la señal de fluorescencia. Además, se da una descripción de cómo diseccionar la cóclea para examinar tanto el epitelio sensorial como la estría vascular. La longitud coclear se mide para permitir la selección de distintas ubicaciones cocleares que corresponden a las mejores frecuencias específicas25. La cuantificación de los números de sinapsis se lleva a cabo con el software gratuito ImageJ26. La cuantificación adicional de los volúmenes y ubicaciones de sinapsis dentro del HC individual se realiza con un software personalizado escrito en Matlab. Este software no se pone a disposición del público, ya que los autores carecen de los recursos para proporcionar documentación y soporte profesional.
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Protocol
Todos los protocolos y procedimientos fueron aprobados por las autoridades competentes de Baja Sajonia, Alemania, con los números de permiso AZ 33.19-42502-04-15/1828 y 33.19-42502-04-15/1990. Este protocolo es para jerbos mongoles (M. unguiculatus) de ambos sexos. Adulto joven se refiere a la edad de 3-12 meses, mientras que los jerbos se consideran de 36 meses o más. Cuando no se indique lo contrario, los tampones y las soluciones se pueden preparar y almacenar en el refrigerador hasta por varios meses (4-8 ° C). Antes de usar, asegúrese de que los tampones y las soluciones no se hayan precipitado.
1. Fijación y recolección de órganos
NOTA: Si solo se necesitan las cócleas, se recomienda llevar a cabo el procedimiento algo más simple de fijación por inmersión. Sin embargo, si también se necesita un cerebro bien conservado, entonces la perfusión transcárdica es la única opción. El fijador en ambos casos es paraformaldehído al 4% (PFA) en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Esto debe ser recién hecho, pero se puede almacenar congelado hasta su uso. Use alícuotas de ~ 300 ml para una perfusión transcárdica o ~ 50-100 ml por cóclea para la fijación por inmersión.
PRECAUCIÓN: El PFA es una sustancia peligrosa; manejarlo de acuerdo con los procedimientos generales de seguridad del laboratorio.
- Fijación por perfusión transcárdica
- Enjuague la configuración de perfusión hasta que el tubo esté libre de burbujas de aire. Llene el tubo de perfusión con PBS que contenga heparina (0,2 ml en 100 ml de PBS) para prevenir la coagulación de la sangre. Detenga el flujo una vez que el tubo esté lleno de PBS y la botella de almacenamiento de fluido se haya vaciado; vierta 200 ml de PFA descongelado en él.
NOTA: La configuración ya está lista para el animal. El PBS restante en el tubo es suficiente para eliminar la sangre y será seguido automáticamente por el fijador una vez que se reanude el flujo. - Asegúrese de que exista un sistema de recolección de residuos para la salida de PFA. Use una cánula fresca (19 G) y tenga a mano tijeras grandes, pinzas (con una punta aplanada), hemostáticos, bisturí o cánula afilada y una alfombra de goma con alfileres.
- Eutanasiar al jerbo con una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, rango de peso corporal: 50-120 g). Vuelva a poner al animal en su jaula. Cuando el paro respiratorio se establece de tal manera que la respiración se vuelve irregular con intervalos de 30 s o más, coloque el jerbo sobre su espalda sobre la alfombra de goma y fije ambas patas delanteras y una pata trasera con alfileres (deje una pata trasera libre para moverse para un mejor juicio del éxito de la perfusión; ver nota después del paso 1.1.7).
- Para abrir la cavidad torácica, levante la piel por encima del esternón con fórceps y corte la piel aproximadamente 0,5 cm por debajo del esternón con tijeras hasta que el processus xiphoideus de color blanco sea visible. Sostenga el esternón en el processus xiphoideus con fórceps y corte a lo largo del diafragma para obtener una buena vista de la cavidad torácica. Cortar las costillas lateralmente por ambos lados hasta que haya un buen acceso al corazón. Asegúrese de que el ángulo de las tijeras sea paralelo y plano en relación con el cuerpo del jerbo para evitar daños en los órganos y, por lo tanto, asegurar un sistema circulatorio cerrado.
- Sujete un hemostático en el esternón, levante la caja torácica y coloque el hemostático sobre el hombro del jerbo sin apoyar el hemostático en ninguna parte del cuerpo para evitar bloquear el flujo sanguíneo.
- Abra el flujo de fluido ligeramente hasta que una gota de PBS fluya fuera de la cánula (19 G) aproximadamente cada 2 s. Sostenga el corazón con fórceps y gírelo un poco hacia la izquierda para que el ventrículo izquierdo se pueda ver claramente. Inserte la cánula en el ventrículo izquierdo en un ángulo que evite penetrar en el tabique. Sostenga la aguja en su lugar, ya sea con la mano o con otro hemostático.
NOTA: Los ventrículos izquierdo y derecho se pueden diferenciar por sus diferentes tonos de color; el ventrículo izquierdo parece de color más claro que el resto del tejido cardíaco. - Aumente lentamente la presión del flujo de líquido y abra la aurícula derecha, ya sea con tijeras finas, un bisturí u otra cánula. Abra aún más el flujo de fluido hasta que se observen aproximadamente 2-3 gotas / s en la cámara de goteo, o establezca un flujo de 4 ml / min para la bomba. Una vez que la fijación del corazón se establece, asegúrese de que la cánula de perfusión permanezca en su lugar sin ser retenida más.
NOTA: Los signos de perfusión exitosa son contracciones musculares lentas, rigidez del cuello y las extremidades, pálido del hígado y pulmones rosados. El signo de perfusión fallida es el blanqueamiento de los pulmones, lo que indica que la circulación pulmonar se perfunde debido a la punción del tabique. - En caso de perfusión fallida, intente mover la cánula más arriba, hacia la aorta, y sujete en su lugar con un hemostático.
- Decapitar al jerbo. Retire las ampollas y corte y rompa su hueso como se describe en el paso 1.2.2.
NOTA: Si el tejido no está lo suficientemente fijo, el epitelio sensorial se desprenderá del órgano de Corti durante la disección. - Si la perfusión no muestra signos de fijación dentro de los 5-10 minutos, abortarla e inmediatamente seguir el procedimiento a continuación para la fijación por inmersión. Para eso, trate la cóclea como en el paso 1.2.2 y coloque el tejido en aproximadamente 50-80 ml de PFA al 4% en recipientes de tapón de rosca durante 1-2 días en un agitador 2D a 8 ° C.
NOTA: Dado que puede ser difícil calificar en última instancia la calidad de la fijación durante la perfusión, se recomienda posfijar rutinariamente las cócleas como se describe.
- Enjuague la configuración de perfusión hasta que el tubo esté libre de burbujas de aire. Llene el tubo de perfusión con PBS que contenga heparina (0,2 ml en 100 ml de PBS) para prevenir la coagulación de la sangre. Detenga el flujo una vez que el tubo esté lleno de PBS y la botella de almacenamiento de fluido se haya vaciado; vierta 200 ml de PFA descongelado en él.
- Fijación por inmersión tisular
- Eutanasiar a los jerbos con una sobredosis intraperitoneal de pentobarbital (160 mg/mL, 0,3 mL por animal, rango de peso corporal: 50-120 g). Cuando el jerbo haya dejado de respirar, decapita al animal.
- Retira las ampollas y corta y rompe su hueso con tijeras y fórceps, respectivamente, para llegar a las cócleas. Retire el maellus, el incus y los canales semicirculares. Haga pequeños agujeros en el ápice y en el giro basal rascando cuidadosamente el hueso coclear con fórceps. Transfiera inmediatamente las ampollas a un exceso de fijador en frío (al menos 50 ml) y fije el tejido en el frío (4-8 ° C) bajo agitación suave (agitador 2D [100 rpm]) durante 2 días.
NOTA: Después de fijar el tejido, las cócleas pueden procesarse inmediatamente o almacenarse en PBS con azida de sodio al 0,05%. PRECAUCIÓN: La azida de sodio es tóxica. Tenga en cuenta que la duración del almacenamiento puede influir negativamente en la calidad de la tinción. Ensayos limitados han sugerido que la inmunotinción parecía más débil después de 2 años de almacenar el tejido en azida de sodio.
2. Preparación de tejidos e inmunoetiquetado
- Disolver el polvo de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) en PBS para producir una solución de 0,5 M a pH 8. Para esto, coloque un vaso de precipitados en un agitador magnético, llénelo con aproximadamente la mitad de la cantidad total del PBS y agregue la cantidad adecuada de polvo de EDTA, lo que resulta en una suspensión ácida. Agregue cuidadosamente la solución concentrada de hidróxido de sodio (NaOH) mientras monitorea el pH con un medidor de pH. Llene con PBS hasta el volumen final deseado y filtre la solución para evitar la contaminación microbiana.
NOTA: El polvo de EDTA solo se disolverá por completo una vez que la suspensión haya alcanzado un valor de pH neutro. - Para la descalcificación, transfiera las cócleas a 80 ml de 0,5 M de EDTA en PBS. Incubar el tejido en frío (4-8 °C) bajo agitación suave en el agitador 2D (100 rpm) durante 2 días.
NOTA: Después de la etapa de descalcificación, el tejido se puede almacenar en PBS durante varios días hasta 3 semanas antes de continuar con los pasos de procesamiento restantes. Para los anticuerpos que marcan la estría vascular, es aconsejable cortar las cócleas por la mitad a lo largo del eje modiolar en este punto (es decir, antes de la inmunotinción) para garantizar el acceso uniforme de los anticuerpos a sus respectivos objetivos. Esto es dependiente de anticuerpos y no se aplica a los anticuerpos utilizados aquí para etiquetar estructuras sinápticas y IHC. Use un trozo de hoja de afeitar rompible y un soporte para cuchillas (como se describe en el paso 4.2) para el corte. - Realice los siguientes pasos (hasta el paso 3.2) en tubos de reacción de sellado seguro de 2 ml. Si la pieza de tejido es demasiado grande para caber dentro del tubo, recorte el exceso de tejido con tijeras. Para mejorar la penetración de los anticuerpos, primero permeabilice el tejido en 1 ml de tritón al 1% (Tritón X-100) en PBS en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 1 h. Lave el tejido 3x con 1 ml de tritón al 0,2% (Tritón X-100) en PBS en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno.
- Para bloquear antígenos inespecíficos, incubar las cócleas en 1 ml de solución bloqueadora (albúmina sérica bovina al 3% [BSA], tritón al 0,2%, en PBS) en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 1 h.
NOTA: La solución de bloqueo se puede preparar con anticipación, pero no debe tener más de ~ 10 días. - Diluir los siguientes anticuerpos primarios recién en la misma alícuota de solución bloqueadora: anti-mioVIIa (miosina VIIa) para etiquetar los IHC (conejo policlonal IgG), diluido 1:400; anti-CtBP2 (proteína de unión C-terminal 2) para etiquetar cintas presinápticas (ratón monoclonal IgG1), diluido 1:400; y anti-GluA2 para etiquetar parches de receptores postsinápticos (ratón monoclonal IgG2a), diluido 1:200. Asegúrese de que las cócleas estén completamente cubiertas con la solución de anticuerpos (normalmente 0,4 ml) e incube a 37 °C durante 24 h.
- A continuación, lave el tejido 5 veces con tritón al 0,2% en PBS en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente durante 5 minutos cada uno. Elegir anticuerpos secundarios para que coincidan con las especies huésped de sus contrapartes primarias y nuevamente diluirlos recién diluidos en 3% BSA, 0.2% tritón, en PBS: cabra anti-ratón (IgG1)-Alexa fluoróforo (AF) 488, diluido 1: 1,000; cabra anti-ratón (IgG2a)-AF568, diluido 1:500; y burro anti-conejo-AF647 (IgG), diluido 1:1.000. Envuelva el tubo en papel de aluminio para evitar el blanqueamiento de la fluorescencia. Incubar las cócleas en 0,4 ml de solución de anticuerpos secundarios a 37 °C durante 24 h.
NOTA: Ensayos limitados han indicado que la incubación de tejido coclear a 37 °C durante 24 h con anticuerpos primarios y secundarios dio lugar a una inmunotinción más brillante que seguir el procedimiento de incubación más común con temperaturas más bajas y duraciones más cortas. - Lave las cócleas 2x con 1 ml de tritón al 0,2% en PBS durante 5 min cada una y 3x con PBS durante 5 min cada una en el agitador 2D (100 rpm) a temperatura ambiente.
NOTA: Después de estos pasos de lavado, las cócleas pueden permanecer en PBS en el refrigerador a ~ 4 ° C durante varios días.
3. Tratamiento con quencher de autofluorescencia (opcional)
NOTA: Las cócleas de jerbos de mediana edad y envejecidos muestran una amplia autofluorescencia de fondo. En el tejido de adultos jóvenes, no es necesario el tratamiento con un bloqueador de autofluorescencia. En principio, es posible aplicar el atenuador de autofluorescencia antes del procedimiento de inmunotinción, lo que evita cualquier reducción inadvertida de la fluorescencia de anticuerpos deseada. Sin embargo, según la hoja de datos del fabricante, el uso de detergentes (como Triton X-100 en el protocolo actual) ya no es posible, ya que eliminan el quencher del tejido.
- Cortar las cócleas por la mitad bajo un estereomicroscopio, como se describe en el paso 4.2.
- Mezcle el quencher de autofluorescencia con etanol al 70% para obtener una solución al 5% e incube las cócleas en esta solución en el agitador 2D a temperatura ambiente durante 1 min. Lave las cócleas 3x con 1 ml de PBS en el agitador 2D a temperatura ambiente durante 5 minutos cada una.
PRECAUCIÓN: El bloqueador de autofluorescencia es peligroso y dañino. Use guantes cuando manipule esta sustancia.
4. Disección fina final
- Diseccionar la cóclea bajo un estereomicroscopio. Llene una placa de Petri de poliestirole y su tapa con PBS y tenga a mano dos pinzas finas, tijeras de resorte Vannas, un soporte para cuchillas y una cuchilla de afeitar rompible. Rompa las piezas de la hoja de afeitar para obtener una superficie de corte de ~ 2-4 mm dependiendo del paso de disección. Prepare un portaobjetos de microscopio colocando tres gotas de medio de montaje seguidas.
NOTA: La superficie de corte de la cuchilla de afeitar desaparece rápidamente. La cuchilla debe intercambiarse después de diseccionar y montar aproximadamente cada segundo trozo de la cóclea. - Si aún no se ha hecho en el paso 3.1, primero corte la cóclea por la mitad a lo largo del modiolus debajo de un estereomicroscopio. Para esto, coloque un trozo de una hoja de afeitar más larga que la longitud enrollada de la cóclea en un soporte de cuchilla. Coloque la cóclea en la placa de Petri y corte el exceso de tejido con el trozo de cuchilla de afeitar. Sostenga la cóclea en su lugar con fórceps finos y córtela por la mitad a lo largo del modiolus.
- Comience con una mitad, pero deje la otra mitad en la placa de Petri también. Fije cuidadosamente la mitad coclear con fórceps de tal manera que el filo de corte esté orientado hacia arriba. Use tijeras finas de resorte para cortar el hueso de la cóclea por encima del helicotrema, cubriendo el ápice.
- Para comenzar la separación de las piezas cocleares, aísle el giro medio cortando con tijeras a través del modiolus y el nervio auditivo, por encima (scala vestibuli) y por debajo (scala tympani).
- Corte a través del hueso coclear que cubre la estría vascular dentro del conducto coclear. Haga dos cortes a ambos lados del hueso coclear por encima del órgano de Corti y a lo largo de la estría vascular y use la hoja de afeitar para eventualmente separar las piezas cocleares.
NOTA: La estría vascular es fácilmente visible como una franja oscura. El corte a lo largo de la estría vascular deja intacto el órgano de Corti. - Opcional: Para recoger la estría vascular, corte cuidadosamente entre el órgano de Corti y la estría vascular para separar los dos. Deje la estría vascular conectada al ligamento espiral (unido al hueso que cubre la superficie externa de la cóclea) y retire el hueso descalcificado con fórceps. Coloque la pieza con el lado de estría hacia arriba en el portaobjetos del microscopio en una gota de medio de montaje.
NOTA: Si la pieza recogida está curvada con demasiada fuerza, puede ser necesario dividirla en piezas más pequeñas para que sea lo suficientemente plana como para montarla en la corredera. - Transfiera las piezas cocleares a la tapa llena de PBS de la placa de Petri poliestirólica, asegurándose de que los soportes enteros cocleares queden lo más planos posible en la corredera. Elimine el exceso de tejido, como partes del ligamento espiral en el lado abneural y partes del limbo espiral en el lado neural. Retire con cuidado la membrana tectorial con pinzas súper finas.
- Coloque las piezas cocleares en la corredera en una gota de medio de montaje. Coloque los soportes enteros cocleares con el órgano de Corti hacia arriba en la diapositiva para evitar oscurecer los IHC en la trayectoria óptica para la obtención de imágenes. Busque la invaginación del limbo espiral muy cerca de los IHC, que es visible al desplazar la pieza coclear hacia el plano sagital para identificar el lado a mirar hacia arriba.
NOTA: Para reconstruir digitalmente la cóclea completa a partir de sus piezas individuales durante el procesamiento posterior, se recomienda encarecidamente documentar los bocetos de las piezas y anotar los puntos de referencia. Además, lo ideal es que las piezas estén dispuestas en el orden correcto en la diapositiva. - Repita los pasos 4.3 a 4.8 hasta que toda la cóclea se transfiera al portaobjetos del microscopio. Si es necesario, agregue más medio de montaje, cubra la diapositiva y selle la cubierta en su lugar con esmalte de uñas negro pintado alrededor de los bordes. Deje que se seque en la oscuridad a temperatura ambiente y luego guarde el portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C.
NOTA: Incluso si partes del epitelio sensorial en sí se pierden accidentalmente, es importante montar lo que queda de la pieza coclear para una estimación correcta de la longitud.
5. Medición de la longitud coclear
- Mida la longitud de la cóclea a partir de imágenes de campo brillante de sus piezas utilizando un sistema de microscopio de epifluorescencia y el software asociado. Guarde imágenes de bajo aumento (lente 4x) de cada pieza coclear y utilice la herramienta de medición de lazo del software del microscopio para dibujar una línea a lo largo de la fila de IHC en cada una de las imágenes. Calcula la longitud total sumando las longitudes de todas las piezas.
NOTA: Cuando falten partes del epitelio sensorial dentro de una pieza coclear, interpole la línea. - Para definir las ubicaciones cocleares que deben analizarse en una cóclea individual, calcule sus distancias correspondientes desde el ápice utilizando la ecuación dada por Müller25. Marque estas ubicaciones, por ejemplo, en una impresión de las piezas cocleares.
6. Adquisición de imágenes con un microscopio confocal
- Utilice un microscopio confocal con un objetivo de inmersión en aceite 40x (apertura numérica 1.3) y el aceite apropiado para imágenes de alta resolución.
NOTA: Si el microscopio confocal tiene una trayectoria de luz invertida, la diapositiva debe colocarse boca abajo. En este caso, dé a la muestra aproximadamente 30 minutos para que se hunda y descanse de manera estable en la cubierta antes de comenzar el escaneo final. Alternativamente, use un medio de montaje que sea fluido durante toda la duración de la disección, pero que se solidifique más tarde y conserve simultáneamente la fluorescencia. - Activar los láseres apropiados: en este protocolo se utilizan dos láseres semiconductores bombeados ópticamente con longitudes de onda de λ = 488 nm y λ = 522 nm, y un láser de diodo con una longitud de onda de λ = 638 nm. Elija el rango de emisión de las etiquetas de fluorescencia (AF488: 499-542 nm, AF568: 582-621 nm, AF647: 666-776 nm). A medida que un detector híbrido cuenta los fotones liberados, coloque la línea láser al menos a 10 nm de distancia de la curva de emisión.
NOTA: Es importante realizar comprobaciones preliminares con tejido de una sola etiqueta para garantizar que los anchos de banda del detector elegidos separen limpiamente los canales de color (es decir, no conduzcan a la diafonía del canal). Las ondas de radio interfieren con el detector híbrido, lo que resulta en un recuento máximo de fotones y, por lo tanto, causan rayas artefactuales en la pila. Por lo tanto, evite usar un teléfono móvil cerca del microscopio. - Amplíe el tejido hasta que la imagen abarque 10 IHC. Elija la resolución de la imagen de acuerdo con el muestreo de Nyquist, que generalmente es de ~ 40-60 nm / píxel. Establezca el tamaño del paso en la dirección z en 0,3 μm y la velocidad de imagen en 400-700 Hz.
NOTA: Ambas configuraciones (tamaño de paso y velocidad de imagen) son compromisos entre el uso de parámetros de imagen óptimos y el ahorro de tiempo de escaneo. - Realice muestreo bidireccional para acortar el tiempo de obtención de imágenes. Acumule la trama para el canal 3x de 488 nm y 638 nm y para el canal 6x de 522 nm; además, promedie las líneas 3x para cada canal. Elija el principio y el final de la pila en la dimensión z.
- Establezca la ganancia en 100 cuando use el detector híbrido (modo de conteo) para evitar una disminución de la relación señal-ruido. Ajuste la potencia del láser para que ningún píxel esté saturado en la región de interés, pero las estructuras cubren principalmente el rango completo de 8 bits. Comience con una potencia láser baja del 0,5% y aumente hasta que las estructuras sean visibles.
NOTA: Una buena tinción generalmente necesita una potencia láser entre 0.1% y 5%. - Utilice un software de deconvolución para el procesamiento post hoc de las pilas de imágenes para eliminar el halo borroso alrededor de pequeñas estructuras fluorescentes utilizando una función teórica de dispersión de puntos. Utilice la misma configuración para cada pila dentro de un experimento. Guarde las imágenes descontorneadas como .tif o .ics.
NOTA: La etiqueta myoVIIa (IHC) no se beneficia de la deconvolución y puede omitirse para ahorrar tiempo. El software utiliza metadatos de los archivos de imagen; sin embargo, es necesario especificar varios parámetros, como la trayectoria de la luz, el medio de incrustación o el medio de inmersión.
7. Cuantificación de sinapsis
- Abra una copia de las pilas descontorneadas en el software de libre acceso ImageJ con el complemento biovoxxel adicional, que también está disponible en su sitio web.
- Ajuste los colores de los canales individuales dividiendo los canales (Imagen | | de color Dividir canales) y fusionar (Imagen | | de color Merge Channels) ellos de nuevo, asignando diferentes colores. Convertir la imagen en una pila RGB (Imagen | | de color Apilar a RGB) y ajustar el brillo y el contraste (Imagen | Ajustar | | brillo/contraste ya sea Automático o deslizador con respecto al Máximo), si es necesario, de modo que las estructuras pre y postsinápticas y la etiqueta IHC sean agradablemente distintas del fondo.
- Elija cinco IHC y etiquételos con la herramienta de texto (IHC1-IHC5) haciendo clic en la ubicación deseada dentro de la pila. Abra el gestor de ROI (Analizar | Herramientas | Gerente de ROI); active la casilla Etiquetas para etiquetar los puntos con un número. Haga zoom en el IHC de interés.
- Utilice la herramienta punto/multipunto en modo multipunto (haga clic con el botón derecho en la herramienta para elegir entre el modo de punto o multipunto). Haga clic en una sinapsis de cinta funcional (es decir, una cinta presináptica en yuxtaposición cercana a un parche de glutamato postsináptico) mientras se desplaza por la dimensión z.
NOTA: Dependiendo de su cantidad de superposición y del color elegido para cada canal, los píxeles compartidos aparecen en color mixto. Por lo general, la distinción entre las sinapsis funcionales individuales es simple porque están lo suficientemente distantes entre sí. - Cuando todas las estructuras de interés estén marcadas, haga clic en Agregar en la interfaz gráfica de usuario del administrador de ROI. Haga clic en el nombre arbitrario y elija Cambiar nombre.
NOTA: Las etiquetas de puntos aún permanecen en todos los planos de la pila cuando se selecciona la casilla mostrar todo en el menú de opciones de la herramienta de puntos (haga doble clic en el icono de la herramienta de puntos ), lo que ayuda a evitar contar la misma sinapsis de cinta varias veces. - Al elegir el siguiente IHC para contar, evite agregar recuentos inadvertidamente ajustando la imagen para mostrar completamente el próximo IHC con la herramienta manual. Cambie de herramienta multipunto a herramienta punto para evitar agregar más puntos a los datos almacenados anteriormente. Haga clic en una estructura de interés dentro de la siguiente IHC y vuelva a cambiar a la herramienta multipunto. Repita los pasos 7.4 a 7.5 hasta que se evalúen todos los IHC de interés.
- Para guardar datos, haga clic en un conjunto de datos en el administrador de ROI y luego en medir. Espere a que aparezca una nueva ventana, enumerando los puntos de datos medidos. Guarde esta lista como un archivo de hoja de cálculo (archivo | Guardar como). Guarde la imagen activando Mostrar todo en el administrador de ROI. Haga clic en Aplanar para agregar permanentemente las etiquetas de punto a la pila. Al cerrar la pila de imágenes , acepte guardar los cambios.
8. Análisis del volumen y la posición de la sinapsis en la célula ciliada
NOTA: Los autores utilizaron un procedimiento programado a medida basado en Matlab. Dado que no está disponible públicamente, se describe aquí solo en términos generales (véase también7). Por favor, póngase en contacto con el autor correspondiente si está interesado en utilizarlo. El procedimiento espera una pila de imágenes de triple etiqueta (IHC, pre y postsináptica) en formato TIFF como entrada, guía al usuario a través de los diversos pasos del análisis a través de una interfaz gráfica y proporciona una amplia salida de los resultados en formato de hoja de cálculo.
- Normalizar la posición de las estructuras sinápticas a un sistema de coordenadas 3D definido por la extensión individual de la IHC en el eje pilar-modiolar y el eje coclear apical-basal y el eje superior (placa cuticular) a la parte inferior (polo sináptico) de la IHC.
NOTA: Los volúmenes de los elementos sinápticos (tanto pre como postsinápticos, y el volumen combinado de sinapsis funcionales) se proporcionan en μm3 y se normalizan al valor medio respectivo3.
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Representative Results
Las cócleas se cosecharon después de la perfusión cardiovascular con fijador de todo el animal o se diseccionaron rápidamente después de la eutanasia del animal y se fijaron por inmersión. Con este último método, los IHC permanecieron en su lugar durante la disección, mientras que, en casos de perfusión fallida y, por lo tanto, de tejido insuficientemente fijo, el epitelio sensorial a menudo se destruyó. Tenga en cuenta que los autores encontraron casos en los que la fijación de las cócleas después de la perfusión transcárdica fue insuficiente, mientras que la fijación del cerebro seguía siendo adecuada. El tejido de una perfusión inferior aún podría salvarse abriendo agujeros en el ápice coclear y la base y posfijando las cócleas por inmersión en PFA al 4% durante 2 días.
La determinación de la longitud de toda la cóclea se realizó de acuerdo con Müller25 para evaluar las IHC y sus sinapsis en posiciones cocleares específicas, equivalentes a frecuencias características distintas (Tabla 1). Para esto, las posiciones cocleares deseadas se calcularon como porcentajes de la longitud de la membrana basilar a partir de la base coclear. La longitud coclear media de 13 cócleas de jerbos adultos jóvenes fue de 11,3 mm (rango intercuartílico: 11,02-11,52 mm). La longitud coclear media de 24 cócleas de jerbos envejecidos fue de 11,5 mm (rango intercuartílico: 11,24-11,73 mm). No hubo diferencias significativas entre la longitud de las cócleas adultas jóvenes y envejecidas (prueba U de Mann-Whitney: U = -1,62, p = 0,105); la mediana total fue de 11,48 mm. Se puede argumentar que esta variación en la longitud de las cócleas individuales fue pequeña y el uso de posiciones de longitud fija (en mm) es adecuado. Sin embargo, la función de frecuencia de lugar no es lineal. Por lo tanto, una desviación de la longitud mediana causa un error mayor para las ubicaciones cocleares basales que para las ubicaciones cocleares relativamente más apicales. Por ejemplo, para la ubicación coclear equivalente a una frecuencia de 1 kHz, calculada en función de la longitud coclear media (es decir, 11,48 mm), la frecuencia correspondiente varió de 1,16 kHz a 0,91 kHz para la cóclea más corta (10,36 mm) y la más larga (12,28 mm) de esta muestra, respectivamente. Para una frecuencia de ubicación basal (por ejemplo, 32 kHz), el rango de frecuencia fue de 51,62 kHz a 23,97 kHz, para la cóclea más corta y más larga, respectivamente. Por lo tanto, es aconsejable calcular las ubicaciones individuales en cada cóclea, en particular al examinar las ubicaciones cocleares basales.
La Figura 1 muestra proyecciones de dimensión z de máxima intensidad de cócleas de un adulto joven (10 meses, Figura 1A) y un jerbo envejecido (38 meses, Figura 1B), que son ejemplos de inmunoetiquetas ideales. En la imagen que representa la cóclea del jerbo adulto joven, los IHC etiquetados con myoVIIa, que aquí se muestran en azul, están en marcado contraste con el fondo negro. Por lo tanto, los IHC individuales son fácilmente detectables. Las estructuras pre y postsinápticas son claramente visibles como elementos verdes y rojos, respectivamente. Se supone que forman una sinapsis funcional siempre que estén en estrecha yuxtaposición (Figura 1A', B'). Rara vez había estructuras presinápticas no apareadas (cintas huérfanas) aparentes en las cócleas de jerbos envejecidos. La cóclea del jerbo viejo (Figura 1B) fue tratada con el silenciador de autofluorescencia. La etiqueta IHC parece más débil, aunque la potencia láser utilizada en este espécimen fue tres veces mayor que la utilizada para la cóclea del jerbo adulto joven. Sin embargo, los IHC siguen siendo distintos de los antecedentes. Las estructuras pre y postsinápticas son claramente visibles, y la potencia láser utilizada para ambos canales fue similar o incluso inferior a la del espécimen adulto joven. El tejido de animales envejecidos generalmente mostró una señal fluorescente significativamente más inespecífica. Por lo tanto, la principal diferencia en el protocolo para adultos jóvenes y material envejecido es el tratamiento con un silenciador de autofluorescencia. Tenga en cuenta que esto se llevó a cabo después de la inmunotinción con anticuerpos marcados con fluorescencia y, en principio, también podría afectar la etiqueta de anticuerpos prevista. Sin embargo, el tratamiento redujo efectivamente la fluorescencia extraña de origen inespecífico, al tiempo que dejó suficiente señal de la etiqueta específica de las estructuras de interés (compare la Figura 1B con la Figura 2B). Los resultados preliminares indicaron, sin embargo, que, en la estría vascular, la fluorescencia extraña no se manifestó en muestras de jerbos envejecidos.
En la Figura 2 se muestran ejemplos de pilas que se procesaron de manera subóptima. La Figura 2A representa la proyección z de máxima intensidad de una pila de un jerbo viejo (36 meses), donde los IHC, que también estaban doblados o destrozados de forma antinatural, no se escanearon en su totalidad. Como resultado, solo los polos apical y basal de los IHC son visibles en esta exploración. No se puede excluir que se localizaran más sinapsis en la parte media faltante de los IHC y, por lo tanto, no es posible un análisis fiable. Por lo tanto, es crucial que todos los IHC evaluados se escaneen completamente en la pila confocal. La Figura 2B muestra la proyección z de máxima intensidad de una pila muestreada en un jerbo envejecido (38 meses). La fluorescencia de origen poco claro es alta ya que el bloqueador de autofluorescencia no se utilizó en este caso. Sin embargo, la fluorescencia extraña se limitó en gran medida al canal (rojo) asociado con la etiqueta GluA2, que es bastante típico. En tales casos, aún puede ser posible contar las sinapsis funcionales si la etiqueta CtBP2 de las cintas es relativamente limpia y específica. La Figura 2C muestra la proyección z de máxima intensidad de una pila obtenida de un jerbo envejecido (42 meses). Aquí, las sinapsis no se pueden asignar a IHC individuales ya que las IHC se desintegraron en gran medida; de hecho, es difícil estar seguro de cuántos IHC están representados. En el ejemplo que se muestra en la Figura 3A, se utilizó un teléfono móvil cerca del microscopio confocal durante la exploración. Las rayas son visibles en el canal azul (etiqueta IHC). Afortunadamente, en este caso, esto no afectó a los canales sinápticos y afectó solo a la parte superior de los IHC, por lo tanto, un análisis aún era viable.
La Figura 3 muestra proyecciones z de máxima intensidad de pilas tomadas de la misma pieza de cóclea de un jerbo adulto joven, adquiridas 3 meses (Figura 3A, A') y 29.5 meses (Figura 3B, B') después de la inmunotinción. Para seguir siendo comparables, las imágenes no se tomaron exactamente desde la misma ubicación (que podría haber sufrido blanqueamiento por la exploración anterior) sino desde la misma pieza coclear. Para el escaneo tomado en el punto de tiempo posterior, la potencia del láser tuvo que aumentarse ~ 2 a 3 veces. Sin embargo, las estructuras etiquetadas siguen siendo claras. La relación señal-ruido había disminuido, especialmente en los canales que mostraban estructuras postsinápticas e IHC, mientras que el canal con la etiqueta presináptica se vio menos afectado. La cuantificación de las sinapsis funcionales por IHC todavía es posible.
Los resultados típicos para el análisis del volumen y la posición de la sinapsis en el IHC se ilustran en la Figura 4, utilizando la pila confocal que se muestra en la Figura 1A. Los IHC definidos individualmente se muestran gráficamente como reconstrucciones de cuadrícula en diferentes colores, con o sin las sinapsis funcionales (definidas por la colocalización de etiquetas pre y postsinápticas) asignadas a cada una. Esta pantalla se puede girar libremente en 3D para obtener varios ángulos de visión (Figura 4A, B). Los IHC también se pueden seleccionar para su visualización gráfica (Figura 4B). Se produce una gran variedad de gráficos de datos, que ilustran diferentes aspectos de la distribución de volúmenes sinápticos dentro del sistema de coordenadas centrado en IHC (ejemplos en la Figura 4C-E). Los datos cuantitativos en bruto para cada IHC y cada elemento sináptico también están disponibles como hojas de cálculo que luego, por ejemplo, se pueden combinar en varias pilas confocales para un análisis estadístico adicional.
Figura 1: Ejemplos de cócleas procesadas con éxito. Proyecciones z de máxima intensidad de pilas confocales de (A) un jerbo adulto joven (10 meses), obtenidas en una ubicación coclear correspondiente a 1 kHz, y (B) un jerbo envejecido (38 meses, panel B), obtenido en una ubicación coclear equivalente a 500 Hz. Los IHC se tiñeron con un anticuerpo contra myoVIIa (azul), las cintas presinápticas se etiquetaron con anti-CtBP2 (verde), y los parches de glutamato postsinápticos se etiquetaron con anti-GluA2 (rojo). La cóclea del jerbo envejecido fue tratada con un bloqueador de autofluorescencia después de la inmunotinción. Para mayor claridad, los contornos de los IHC se indican con líneas discontinuas. Los paneles (A') y (B') muestran una ampliación de las áreas delineadas por los cuadrados en las cócleas correspondientes a partir de los paneles (A) y (B). Las puntas de flecha amarillas apuntan a sinapsis funcionales. Los canales que muestran las estructuras pre y postsinápticas (pero no el canal IHC) sufrieron deconvolución. Barras de escala = 10 μm (A,B), 1 μm (A',B'). Abreviaturas: IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteína de unión C-terminal 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ejemplos de cócleas procesadas subóptimamente. Proyecciones z de máxima intensidad de pilas confocales para las que el procesamiento fue subóptimo, de jerbos que tenían (A) 36 meses y (B, C) 38 meses de edad y de ubicaciones cocleares correspondientes a 16 kHz, 8 kHz y 32 kHz, respectivamente. Los jerbos de los que se derivaron las cócleas en los paneles (A) y (C) se perfundieron transcárdicamente, y la cóclea del panel (C) se colocó adicionalmente durante 3 días en PFA al 4%. La cóclea de (B) se fijó por inmersión en PFA al 4% durante 2 días. Las cocleas de (A) y (C) fueron tratadas con el quencher de autofluorescencia. Los IHC se tiñeron con un anticuerpo contra myoVIIa (azul), las cintas presinápticas se etiquetaron con anti-CtBP2 (verde) y los parches de glutamato postsinápticos se etiquetaron con anti-GluA2 (rojo). Todos los canales fueron desconvoluctuados. El brillo y el contraste se ajustaron aún más después de la exploración confocal. Barras de escala = 10 μm. Abreviaturas: PFA = paraformaldehído; IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteína de unión C-terminal 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Estabilidad de la inmunoetiqueta después de un almacenamiento prolongado. Proyecciones z de máxima intensidad de pilas confocales de un jerbo adulto joven (10 meses), tomadas en la ubicación coclear de 16 kHz, (A) 3 meses después de la tinción y (B) en una ubicación coclear ligeramente más basal en la misma pieza coclear 29,5 meses después de la tinción. La cóclea se fijó por inmersión en PFA al 4% durante 2 días. Para mayor claridad, (A') y (B') se acercan solo a unas pocas sinapsis funcionales de las áreas indicadas por los cuadrados en (A) y (B), respectivamente. Los IHC se tiñeron con un anticuerpo contra myoVIIa (azul), las cintas presinápticas se etiquetaron con anti-CtBP2 (verde) y los parches de glutamato postsinápticos se etiquetaron con anti-GluA2 (rojo). La potencia láser para los canales IHC fue de 1,3% y 3%, para los canales presinápticos 0,4% y 1,1%, y para los canales postsinápticos 1,1% y 2% en (A) y (B), respectivamente. Tenga en cuenta que en (A), las rayas azules son visibles en la parte superior de los IHC, que resultan del uso de un teléfono móvil en las proximidades del microscopio confocal. Barras de escala = 10 μm (A, B), 1 μm (A', B'). Abreviaturas: PFA = paraformaldehído; IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteína de unión C-terminal 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la cuantificación del volumen de sinapsis. (A) Diez IHC mostrados como reconstrucciones de cuadrícula de diferentes colores basadas en la inmunoetiqueta myoVIIa. Sus sinapsis funcionales asociadas, definidas por elementos colocalizados ctBP2-(verde) y GluA2-etiquetados (rojo), se muestran junto con los IHC, y también por separado a continuación, para mayor claridad. Tenga en cuenta que el ángulo de visión se eligió para ser perpendicular al eje largo de los IHC y, por lo tanto, difiere de la imagen confocal original (Figura 1A). (B) Uno de los IHC señalados y mostrado girado 90°. El plano negro fue definido manualmente por el usuario y divide el IHC a lo largo de su eje pilar-modiolar. (C) Gráfico de burbujas que muestra la ubicación de todas las sinapsis funcionales en esta pila confocal, en relación con los tres ejes normalizados de sus respectivos IHC. el tamaño de los símbolos es proporcional al volumen del elemento presináptico. Tenga en cuenta que el ángulo de visión se eligió para ser similar al panel (B). (D) Diagrama de caja de los volúmenes normalizados de elementos sinápticos, por separado para los socios presinápticos (2 cajas izquierdas) y postsinápticos (2 cajas derechas) de las sinapsis funcionales y separados según su posición en la mitad modiolar o pilar de sus respectivos IHC (diferentes colores). Las cajas representan rangos intercuartílicos, con las medianas indicadas por líneas. Los bigotes discontinuos indican 1,5 veces el rango intercuartílico, y los cruces indican valores periféricos más allá de eso. (E) Diagrama de dispersión de los volúmenes normalizados de socios pre- vs. postsinápticos de sinapsis funcionales. Diferentes símbolos indican la posición en la mitad modiolar o pilar de sus respectivos IHC. Abreviaturas: IHC = célula ciliada interna; myoVIIa = miosina VIIa; CtBP2 = proteína de unión C-terminal 2; GluA2 = receptor de glutamato ionotrópico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Tabla 1: Distancias desde el ápice que son equivalentes a frecuencias objetivo específicas en cócleas de diferentes longitudes. Las mejores frecuencias equivalentes se calcularon en base a la ecuación dada por Müller25. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
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Discussion
Con el método descrito en este protocolo, es posible inmunoetiquetar IHC y estructuras sinápticas en cócleas de jerbos adultos jóvenes y envejecidos, identificar presuntas sinapsis funcionales mediante la colocalización de elementos pre y postsinápticos, asignarlos a IHC individuales y cuantificar su número, volumen y ubicación. Los anticuerpos utilizados en este enfoque también etiquetaron las células ciliadas externas (OHC; myoVIIa) y sus cintas presinápticas. Además, una alternativa viable para el inmunoetiquetado de los IHC y los OHC es un anticuerpo contra la otoferlina, y los OHC parecen mucho más débiles que los IHC.
La perfusión se puede llevar a cabo utilizando dos configuraciones diferentes. 1) Un sistema de línea de goteo alimentado por gravedad en el que una sola botella que alimenta una línea de goteo comercial está suspendida en una rueda de polea aproximadamente 1,5 m por encima del animal. Los fluidos se introducen sucesivamente después de bajar la botella, que está abierta en la parte superior. 2) Un sistema que utiliza una bomba peristáltica digital de velocidad variable, con un tubo delgado y largo abierto en un extremo para absorber el fluido y una aguja que se puede conectar fácilmente en el otro extremo. Ambos funcionan igual de bien, y las sutiles diferencias no se elaborarán aquí. Los autores recomiendan específicamente, sin embargo, un banco de trabajo estilo borrador, con el animal en una plataforma perforada y los humos extraídos a continuación. Esto permite un buen acceso al área quirúrgica sin comprometer la función de escape (a diferencia de trabajar en un gabinete de humos abierto).
La fijación adecuada del tejido es de importancia crítica, ya que de lo contrario el epitelio sensorial se desprenderá y se desintegrará durante la disección. En el jerbo, es necesaria una exposición más prolongada al fijador que la que se usa comúnmente (por ejemplo, para ratones 17,27,13 o conejillos de indias 28). El método preferido para los jerbos es la extracción rápida de la cóclea después de la muerte del animal y la fijación por inmersión durante al menos 1,5 días. Si se prefiere la perfusión cardiovascular, es crucial que la fijación se establezca en unos pocos minutos y proceda bien. Dado que puede ser difícil calificar en última instancia la calidad de la fijación durante la perfusión, se recomienda posfijar rutinariamente las cócleas como se describe.
Es importante cumplir con los pasos de lavado, por lo que el último paso de lavado (paso 2.7) es el más importante. Si no se lava adecuadamente, el tejido es pegajoso y se adhiere a los instrumentos de disección, lo que dificulta la disección. También se recomienda usar un bloqueador de autofluorescencia en cócleas cosechadas de jerbos envejecidos para reducir la fluorescencia inespecífica. La autofluorescencia puede originarse a partir de la lipofuscina, que es común en el tejido de animales envejecidos 29,30,31, y parece ser ampliamente excitada y ampliamente emisora. Cuando se excita con una longitud de onda en el espectro UV (λ = 364 nm), la lipofuscina tiene un amplio rango de emisión (λ = 400-700 nm, con un máximo en ~λ = 568 nm)32. En el tejido miocárdico humano, la lipofuscina es visible con una excitación de λ = 555 nm y emisión de λ = 605 nm33. Del mismo modo, en los IHC de jerbos, los autores notaron un aumento en la fluorescencia inespecífica más prominentemente en el canal utilizado para el anticuerpo AF568, lo que sugiere autofluorescencia a partir de gránulos de lipofuscina. Una recomendación general cuando se trabaja con tejido de animales es, por lo tanto, utilizar el ancho de banda de excitación alrededor de 550-600 nm para la inmunoetiqueta menos crítica.
La medición de la longitud coclear total y la correcta identificación de posiciones cocleares específicas solo es posible si se conserva toda su longitud. Si partes del epitelio sensorial se pierden en la disección, se recomienda montar la parte restante o incluso solo la pieza del ganglio espiral, y mantener notas detalladas. Por lo general, es posible estimar la sección faltante con una precisión razonable. Si las porciones apicales de la cóclea se conservan por completo, pero falta el extremo basal, las ubicaciones cocleares específicas en la parte apical podrían definirse calculando las posiciones basadas en la longitud coclear media dentro de la población de jerbos utilizada porque la desviación del valor real es pequeña.
Una limitación importante de la cuantificación del volumen de sinapsis es que los volúmenes absolutos resultantes no son comparables entre diferentes pilas confocales. El paso crítico que determina los volúmenes resultantes de elementos sinápticos es la elección del umbral de intensidad para la detección inicial. Sin embargo, la elección de este umbral de intensidad se realiza subjetivamente por el usuario en el protocolo actual y muchos otros 3,27,34. Además, el brillo de la inmunofluorescencia en la imagen confocal depende de muchos factores, que son muy difíciles de estandarizar en todas las muestras, como el grosor del tejido, la orientación del tejido en relación con la trayectoria óptica, la duración de la exposición al láser y los ajustes precisos de confocal y deconvolución. Todas estas advertencias se exacerban si se adquiere material raro durante un período de tiempo considerable, como es típico para los jerbos envejecidos. En conjunto, esto significa que los sesgos son muy difíciles de excluir en los datos agrupados, y el mejor de los casos es un conjunto de datos con alta varianza. Por lo tanto, se recomienda normalizar rutinariamente los volúmenes sinápticos al volumen mediano respectivo de la pila confocal individual, como lo introdujeron Liberman et al.3. La desventaja obvia es que los volúmenes sinápticos solo son comparables dentro de una pila de imágenes dada, por ejemplo, entre diferentes ubicaciones en el IHC, pero no entre diferentes ubicaciones cocleares o edades de especímenes.
El doble etiquetado de estructuras pre y postsinápticas y el requisito de colocalización permiten una estimación más fiable del número de sinapsis funcionales que el uso de cualquiera de las etiquetas solas. Si solo es factible una etiqueta, se recomienda usar el anti-CtBP2 presináptico, acoplado a AF488 o etiquetas fluorescentes con especificaciones de longitud de onda similares, por dos razones. En primer lugar, las cintas huérfanas, es decir, los elementos etiquetados con CtBP2 sin una etiqueta postsináptica colocalizada, parecen ser raras17, y los autores confirmaron esto para los jerbos envejecidos. Por lo tanto, el error introducido al no poder verificar la colocalización con un socio postsináptico es pequeño. Cabe señalar, sin embargo, que esto se convierte en un problema más importante cuando se examinan los oídos expuestos al ruido (por ejemplo,28). En segundo lugar, en los casos con señal de alta fluorescencia de origen poco claro, el ruido generalmente afectaba al canal utilizando una longitud de onda de excitación alrededor de 568 nm en la mayor medida (ejemplo en la Figura 2B, que representa la etiqueta GluA2). Al menos parte de este ruido puede, en el tejido de animales envejecidos, ser autofluorescencia de lipofuscina. Por lo tanto, para maximizar la posibilidad de una etiqueta anti-CtBP2 limpia y única, es aconsejable evitar este canal de longitud de onda. Finalmente, se demostró que, con condiciones adecuadas de almacenamiento frío y oscuro, el inmunoetiquetado utilizado aquí es estable durante largos períodos de tiempo, hasta al menos 2,5 años (Figura 3B), lo que hace posible la reevaluación de tejidos valiosos, como los de jerbos envejecidos.
La cuantificación del número de sinapsis aferente de la IHC se ha convertido en una métrica importante para evaluar el estado del sistema auditivo periférico en muchos contextos, entre ellos la pérdida de audición relacionada con la edad. Hay varios protocolos publicados ahora (por ejemplo, jerbos21, ratones 17,13, conejillos de indias10,28 y humanos35). El método descrito aquí es, en sus detalles, específico para jerbos adultos jóvenes y ancianos, pero se han derivado algunas recomendaciones generales que también pueden ser útiles en otras especies.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Los autores reconocen a Lichun Zhang por ayudar a establecer el método y a la Unidad de Servicio de Microscopía de Fluorescencia, Universidad Carl von Ossietzky de Oldenburg, para el uso de las instalaciones de imágenes. Esta investigación fue financiada por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) bajo la Estrategia de Excelencia de Alemania -EXC 2177/1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin Fraction V biotin-free | Carl Roth | 0163.2 | |
| anti-CtBP2 (IgG1 monoclonal mouse) | BD Biosciences, Eysins | 612044 | |
| anti-GluA2 (IgG2a monoclonal mouse) | Millipore | MAB39 | |
| anti-mouse (IgG1)-AF 488 | Molecular Probes Inc. | A21121 | |
| anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal rabbit) | Proteus Biosciences | 25e6790 | |
| Blade Holder & Breaker - Flat Jaws | Fine Science Tools | 10052-11 | |
| Bonn Artery Scissors - Ball Tip | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Coverslip thickness 1.5H, 24 x 60 mm | Carl Roth | LH26.1 | |
| Disposable Surgical Blade | Henry Schein | 0473 | |
| donkey anti-rabbit (IgG)-AF647 | Life Technologies-Molecular Probes | A-31573 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Ethanol, absolute 99.8% | Fisher Scientific | 12468750 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Carl Roth | 8040.2 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Feather Double Edge Blade | PLANO | 112-9 | |
| G19 Cannula | Henry Schein | 9003633 | |
| goat anti-mouse (IgG2a)-AF568 | Invitrogen | A-21134 | |
| Heparin | Ratiopharm | N68542.04 | |
| Huygens Essentials | Scientific Volume Imaging | ||
| ImageJ | Fiji | ||
| Immersol, Immersion oil 518F | Carl Zeiss | 10539438 | |
| Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung) | Braun | 4062957E | |
| ISM596D | Ismatec | peristaltic pump | |
| KL 1600 LED | Schott | 150.600 | light source for stereomicroscope |
| Leica Application suite X | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Leica TCS SP8 system | Leica Microsystem CMS GmbH | ||
| Matlab | The Mathworks Inc. | ||
| Mayo Scissors Tungston Carbide ToghCut | Fine Science Tools | 14512-17 | |
| Mini-100 Orbital-Genie | Scientific Industries | SI-M100 | for use in cold environment |
| Narcoren (pentobarbital) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | ||
| Nikon Eclipse Ni-Ei | Nikon | ||
| NIS Elements | Nikon Europe B.V. | ||
| Paraformaldehyde | Carl Roth | 0335.3 | |
| Petri dish without vents | Avantor VWR | 390-1375 | |
| Phosphate-buffered saline: | |||
| Disodium phosphate | AppliChem | A1046 | |
| Monopotassium phosphate | Carl Roth | 3904.1 | |
| Potassium chloride | Carl Roth | 6781.1 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 31434-M | |
| Screw Cap Containers | Sarstedt | 75.562.300 | |
| Sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| Student Adson Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Student Halsted-Mosquito Hemostat | Fine Science Tools | 91308-12 | |
| Superfrost Adhesion Microscope Slides | Epredia | J1800AMNZ | |
| Triton X | Carl Roth | 3051.2 | |
| TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher | Biotium | 23007 | |
| Vannas Spring Scissors, 3mm | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Vibrax VXR basic | IKA | 0002819000 | |
| VX 7 Dish attachment for Vibrax VXR basic | IKA | 953300 | |
| Wild TYP 355110 (Stereomicroscope) | Wild Heerbrugg | not available anymore |
References
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