Summary
Dit protocol beschrijft de chirurgische stappen van murine gemeenschappelijke iliacale arterioveneuze fistelcreatie. We hebben dit model ontwikkeld om hemodialyse-toegangsgerelateerde ledemaat pathofysiologie te bestuderen.
Abstract
Chronische nierziekte is een groot probleem voor de volksgezondheid en de prevalentie van eindstadium nierziekte (ESRD) die chronische niervervangende therapieën zoals hemodialyse vereist, blijft toenemen. Autogene arterioveneuze fistel (AVF) plaatsing blijft een primaire vasculaire toegangsoptie voor ESRD-patiënten. Helaas ervaart ongeveer de helft van de hemodialysepatiënten dialysetoegangsgerelateerde handdisfunctie (ARHD), variërend van subtiele paresthesie tot digitaal gangreen. Met name de onderliggende biologische factoren die verantwoordelijk zijn voor ARHD zijn slecht begrepen en er bestaat geen adequaat diermodel om de mechanismen op te helderen en / of nieuwe therapieën te ontwikkelen voor de preventie / behandeling van ARHD. Hierin beschrijven we een nieuw muismodel waarin een AVF wordt gemaakt tussen de linker gemeenschappelijke iliacale slagader en ader, waardoor de beoordeling van de pathofysiologie van de ledematen wordt vergemakkelijkt. De microchirurgie omvat vaatisolatie, longitudinale venotomie, creatie van arterioveneuze anastomose en veneuze reconstructie. Schijnoperaties omvatten alle kritieke stappen, behalve het maken van AVF. Iliacale AVF-plaatsing resulteert in klinisch relevante veranderingen in centrale hemodynamiek, perifere ischemie en stoornissen in neuromotorische prestaties van de achterpoten. Dit nieuwe preklinische AVF-model biedt een nuttig platform dat veelvoorkomende neuromotorische verstoringen samenvat die door hemodialysepatiënten worden gemeld, waardoor onderzoekers de mechanismen van ARHD-pathofysiologie kunnen onderzoeken en potentiële therapieën kunnen testen.
Introduction
Het tot stand brengen en behouden van functionele vasculaire toegang blijft een belangrijk primair doel voor patiënten met eindstadium nierziekte (ESRD) die niervervangende therapie krijgen via hemodialyse1. Herhaalde hemodialysebehandelingen zijn nodig om afvalproducten te verwijderen, elektrolyten te normaliseren en de vochtbalans te handhaven zodra de nierfunctie ontoereikend wordt, en zijn dus noodzakelijk voor overleving op lange termijn2. Daarom vertegenwoordigt vasculaire toegang een "levenslijn" voor patiënten met ESRD, en autogene arterioveneuze fistel (AVF) plaatsing blijft een voorkeursoptie voor dialysetoegang onder dit cohort3. Ongeveer 30% -60% van de hemodialysepatiënten ervaart echter een spectrum van handhandicaps, klinisch gedefinieerd als toegangsgerelateerde handdisfunctie (ARHD). De symptomen van ARHD kunnen variëren van zwakte en discoördinatie tot monoplegie en digitaal gangreen, die vroeg na AVF-creatie kunnen optreden of zich geleidelijk kunnen ontwikkelen met fistelrijping. Verder bemoeilijkt ARHD het ESRD-behandelingsschema, dat wordt geassocieerd met een slechte kwaliteit van leven, een hoog risico op hart- en vaatziekten en verhoogde mortaliteit 2,3,4.
Verschillende diermodellen zijn ontwikkeld om vasculaire remodellering geïnduceerd door hemodynamische veranderingen na AVF-creatiete bestuderen 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Grote diermodellen met iliacale of femorale AVF 16,17,18,19,20 en knaagdiermodellen met behulp van carotisslagader-jugulaire aderanastomose of infrarenale aorta-inferieure vena cava-fistelvorming zijn goed ingeburgerd om de bovengenoemde aspecten van AVF-rijping en doorgankelijkheidte onderzoeken 21 . Veneuze hypertensie, grotere luminale diameter en verhoogde aderwanddikte zijn bijvoorbeeld handtekeningen van succesvolle AVF-rijping, terwijl substantiële fibrose van de media en intimale hyperplasie of trombusontwikkeling zonder veranderingen in de stroming vaak AVF-storingen kenmerken 6,15. Grote diermodellen missen echter de experimentele flexibiliteit of transgene mogelijkheden van muizenmodellen, terwijl de huidige knaagdiermodellen het onderzoek van ARHD niet gemakkelijk vergemakkelijken vanwege de anatomische locatie en / of het ontbreken van geassocieerde ledemaatpathologie. Inderdaad, als gevolg van een gebrek aan een gevestigd preklinisch diermodel dat het relevante klinische fenotype samenvat, is de onderzoeksvoortgang om de pathobiologische mechanismen op te helderen en nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen stagneren, ondanks een geleidelijke toename van het aantal symptomatische ARHD-patiënten. Daarom is het primaire doel van deze studie om een uniek muismodel van ARHD te introduceren, met procedurele stappen van AVF-microchirurgie en karakterisering van AVF-gerelateerde pathofysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Florida en het Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.
OPMERKING: Jongvolwassen (8-10 weken oude) mannelijke C57BL / 6J-muizen werden gekocht bij The Jackson Laboratory en gehuisvest in een lichte (12 uur licht: 12 uur donkere cyclus), temperatuur (22 ° C ± 1 ° C) en vochtigheid (50% ± 10%) gecontroleerde dierenfaciliteit. Per kooi mochten vijf muizen wonen (B:18 cm x L:29 cm x H:12,5 cm) waarbij nestmateriaal, voedsel en water ad libitum beschikbaar werden gesteld. Na 7 dagen van habitat acclimatisatie met standaard chow, werden de muizen gedurende 7 dagen veranderd in een op caseïne gebaseerd chow-dieet als een dieetovergangsfase. Daarna kregen muizen de op caseïne gebaseerde chow met 0,2% -0,15% adeninesuppletie gedurende 2-3 weken om nierdisfunctie (CKD) te induceren voorafgaand aan de AVF-operatie zoals eerder beschreven22,23,24. Controlemuizen kregen een op caseïne gebaseerd chow-dieet zonder adenine-suppletie (controle). De controle- en CKD-diëten werden gedurende de postoperatieve herstelperiode (POD) gehandhaafd.
1. Preoperatieve metingen
- Beoordeel baseline/pre-operatieve uitkomstmetingen, aortoiliac vaatdiameters en hemodynamische stromingsparameters met behulp van duplex echografie en de achterpootperfusie via laser Doppler zoals eerder beschreven25.
- Bepaal de eenzijdige achterste grijpsterkte en loopbandloopbeoordeling om de basislijnfunctie achteraf vast te stellen zoals eerder beschreven25,26.
- Beoordeel de nierfunctie door de glomerulaire filtratiesnelheid (GFR) te meten via FITC-inulineklaring en / of serumbloedureumstikstof (BUN) -niveau zoals eerder beschreven22,24,27.
2. Chirurgische voorbereiding
- Bereid de volgende chirurgische hulpmiddelen en benodigdheden voor (materiaaltabel): een hete kraalsterilisator, oogglijmiddel, een pennentrimmer, alcoholpreparaten, chloorhexidinedoekjes, extra fijne Graefe-tang, gesteriliseerde 0,9% zoutoplossing, naaldspuiten van 29 G en 31 G, 2 x 2 niet-geweven sponzen, medium single-ended ronde (SC-9) en kleine dubbelzijdige harde, scherpe, puntige (SC-4) wattenstaafjes, cauterie bij lage temperatuur, rechte Dumont tang, 45° schuine Dumont tang, rechte Vannas veerschaar, gebogen Vannas veerschaar, ronde naaldhouders met ronde handgreep, meerdere maten hechtingen (4-0 zijde, 5-0 PGA, 6-0 zijde en 10-0 nylon hechtingen), heparine, absorbeerbare gelatinespons, een rechte naaldhouder en buprenorfine.
OPMERKING: Extremiteitsbevestigende elastiekjes en retractors voor de buik en benen waren handgemaakt. - Steriliseer chirurgische preparaten met behulp van autoclaaf met stoomsterilisatie bij 120-125 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door drogen gedurende 30 minuten voorafgaand aan de operatie. Gebruik 70% ethanolreiniging gevolgd door hete kraalsterilisatie (240-270 °C gedurende 3 minuten) tussen elke dieroperatie.
- Bereid gesteriliseerde 0,9% normale zoutoplossing, gehepariniseerde zoutoplossing (100 IE / ml) en buprenorfine (0,01 mg / ml) met behulp van 29-31 G naaldspuiten.
3. Anesthesie en positionering
- Start muisanesthesie in de inductiekamer (0,8 ml / min, 2,5% isofluraan). Zodra de muis voldoende is verdoofd, plaatst u de muis in rugligging op het operatiestation bedekt met een steriel gordijn. Laat de isofluraanconcentratie afbouwen tot ~1,2% tijdens de scheer- en positioneringsstappen.
- Breng het oculaire glijmiddel aan om de ogen te beschermen tegen uitdroging tijdens de operatie.
- Scheer met behulp van een pennentrimmer het buikhaar voor de operatie en het beenhaar voor postoperatieve perfusiemetingen. Verwijder het haar van het chirurgische veld.
- Fixeer de bovenste en onderste ledematen met elastiekjes en tacks, controleer de diepte van de anesthesie door de teenknijpreflex te controleren en titreer de anesthesie indien nodig. Voer de evaluatie van het ademhalingspatroon elke 3-5 minuten uit tijdens de chirurgische procedure om het niveau van anesthesie te kalibreren.
4. Verkenning van het chirurgische doelgebied
- Reinig het geschoren huidgebied meerdere keren, afwisselend alcoholvoorbereiding en chloorhexidinedoekjes in een cirkelvormig patroon om het chirurgische veld te desinfecteren.
- Maak een midline laparotomie van de onderrand van de sternale marge naar de symfyse van de schaamstreek. Ontleed het schaambeenvetkussen om een breder operatief veld te verkrijgen.
- Open de celiotomie om toegang te krijgen tot de peritoneale inhoud met retractors en verwijder de dunne en dikke darm met behulp van medium, single-ended ronde wattenstaafjes. Bedek de darmen met een met zoutoplossing doordrenkte niet-geweven spons.
- Zodra voldoende blootstelling van de retroperitoneale vasculatuur is verkregen, bedek de resterende darm, nieren en urineleiders met kleine met zoutoplossing doordrenkte niet-geweven sponzen. Evacueer een opgezwollen blaas door zachtjes in de blaaskoepel te knijpen met medium, single-ended ronde wattenstaafjes als dat nodig is.
- Ontleed voorzichtig de perivasculaire fascia en het vetweefsel van ongeveer 1 cm proximaal tot de aorta-bifurcatie die zich uitstrekt tot het niveau van de linker iliacale bifurcatie met behulp van een rechte Dumont-tang en kleine dubbelzijdige harde, scherpe, puntige wattenstaafjes.
OPMERKING: De linker iliacale slagader en ader worden aan elkaar gehecht terwijl de arterioveneuze structuren massaal worden geïsoleerd. Deze stap zal voldoende scheepsmobilisatie bieden om het creëren van AVF te vergemakkelijken. - Als er kleine veneuze takken worden aangetroffen die afkomstig zijn van of convergeren met de linker gemeenschappelijke iliacale ader, ligate ze dan met behulp van lage temperatuur cautery met of zonder 6-0 zijden hechtdraad indien nodig.
- Passeer de punt van de schuine tang onder de linker gemeenschappelijke iliacale vaatbundel en spreid voorzichtig meerdere keren om de vaten van de onderliggende retroperitoneale musculatuur te mobiliseren (figuur 1A).
5. Creatie van een gemeenschappelijke iliacale arterioveneuze fistelanastomose
- Plaats twee 4-0 zijden hechtingen rond de geïsoleerde linker gemeenschappelijke iliacale arterioveneuze bundel en gebruik ze als ligaturen (bijv. Kruisklemmen) naar de vaatbundel. Maak een enkele knoop met elke 4-0 zijden stropdas en breng ze achtereenvolgens aan van proximaal naar distaal.
- Zorg ervoor dat de kruisklemmen met zijdebind voldoende ver uit elkaar zijn geplaatst om ~ 2 mm vaatlengte te isoleren, en de sequentiële toepassing van de hechtligaturen zal de stuwing van de linker iliacale ader neerslaan.
- Gebruik de 4-0 zijden hechtsnaren als handgrepen om de linker iliacale arterioveneuze vaatbundel met de klok mee te draaien en de positie te verfijnen om de ader tijdelijk voor de slagader te lokaliseren (figuur 1B).
- Maak een longitudinale venotomie (~1 mm) met een rechte Vannas-veerschaar en spoel resterend bloed voorzichtig uit het veneuze lumen met 0,9% zoutoplossing (figuur 1C). Wees voorzichtig tijdens deze stap, omdat een hogedrukzoutoplossingspoeling veneuze verstoring kan veroorzaken.
OPMERKING: Het gebied van rode kleur dat achterblijft in de iliacale slagader na veneus blozen biedt een visueel venster voor de volgende stap. - Plaats een indringende 10-0 nylon hechting door de achterste wand van de ader.
OPMERKING: Dit deel van de iliacale ader moet onmiddellijk worden toegewezen aan de voorste wand van de iliacale slagader en de wanden zijn van nature hechtend. De hechting moet door beide wanden gaan en de hechting met een enkele knoop vastbinden (figuur 1D). Merk op dat een kleine hoeveelheid bloeding, die afkomstig is van het stilstaande bloed in de iliacale slagader, zal verschijnen zodra de naald door beide wanden gaat. Als de intraluminale bloeding tijdens deze stap aanhoudt, kunnen de kruisklemmen van de zijdehechting te los zitten en verder worden aangedraaid. - Pak de geïmriteerde hechtuiteinden vast en plaats ze onder zachte spanning om de voorste wand van de achterste wand van de iliacale slagader te verplaatsen. Maak een ~ 1,0 mm x 0,3 mm elliptische incisie met behulp van een gebogen Vannas-veerschaar, waarbij de aanhangende wanden van zowel de iliacale slagader als de ader worden verwijderd.
OPMERKING: De arterioveneuze fistel ontstaat daardoor zodra dit gemeenschappelijke kanaal is vastgesteld. Het is mogelijk om de laterale wanden van de ader tijdens deze stap te verwonden, omdat de achterste iliacale ader / voorste iliacale slagaderwandincisie wordt uitgevoerd door blootstelling aan venotomie. Voorzichtigheid is geboden om deze complicatie te voorkomen, omdat dit de diameter van de fistel aanzienlijk kan verminderen en kan leiden tot trombusontwikkeling. - Spoel het resterende bloed van het blootgestelde arteriële lumen voorzichtig weg met 0,9% zoutoplossing en gehepariniseerde zoutoplossing (100 IE/ml)28 (figuur 1E).
- Repareer na het maken van de AVF de initiële venotomie van de voorste wand met behulp van twee of drie 10-0 nylon hechtingen op een onderbroken manier (figuur 1F).
- Herstel de vaatbundel in zijn oorspronkelijke anatomische oriëntatie en plaats een klein stukje met zoutoplossing doordrenkte absorbeerbare gelatinespons naast de gerepareerde venotomie om hemostase te vergemakkelijken.
- Maak de ligaturen van de 4-0 enkelknoopsklem achtereenvolgens los van distale naar proximale. Controleer de venotomieplaats nauwlettend op overmatig bloeden terwijl u elke hechting losmaakt.
- Als de reparatie niet voldoende hemostatisch is, breng dan de kruisklemmen opnieuw aan en plaats nog een 10-0 nylon hechting op de plaats van bloeding. Als hemostase is verzekerd, verwijder dan de hechtingen en vervolgens de absorbeerbare gelatinespons.
- Wrijf zachtjes over de vaatbundel met kleine harde, scherpe, puntige wattenstaafjes met dubbele uiteinden, die het herstel van de bloedstroom verder vergemakkelijken. Bevestig het technische succes van de operatie met behulp van visualisatie van pulsatiel, helderrood zuurstofrijk bloed dat de iliacale ader binnendringt en zich mengt met donker veneus bloed dat terugkeert uit de achterhand.
- Injecteer gehepariniseerde zoutoplossing (0,2 IE/g)15 in de IVC voor systemische antistolling om de doorgankelijkheidsresultaten van AVF te verbeteren.
OPMERKING: Hoewel deze stap plaatsvindt na de vasculaire reconstructie (in tegenstelling tot het menselijke analoog waar heparinisatie optreedt voorafgaand aan de kruisklemming van het vaat), werden een vermindering van intraoperatieve bloedingen en verbeterde AVF-doorgankelijkheid waargenomen wanneer deze in dit stadium van de procedure werd uitgevoerd. Injectie op een plaats bedekt met fascia en/of vet heeft de voorkeur om bloedingen van de prikplaats te voorkomen. - Inspecteer de operatieplaats opnieuw op hemostase na de injectie van gehepariniseerde zoutoplossing. Als er geen bloedingsproblemen zijn, sluit u de fascia van de middellijn en vervolgens de huidincisie met absorbeerbare 5-0 PGA-hechtingen op een lopende manier.
- Voor schijnbewerkingen volgt u alle belangrijke stappen van de procedure, behalve voor AVF-formatie. Breng een enkele knoop van de 4-0 zijden ligatuur aan het proximale uiteinde van de linker iliacale arterioveneuze bundel aan en stem de klemtijden af op AVF-operaties (bijv. ~ 20 min, afhankelijk van de vaardigheid van de microchirurg).
6. Postoperatieve zorg en meting
- Meet na sluiting van laparotomie de bloedperfusie van de bilaterale tibialis anterieure spieren en ventrale poten met behulp van laser Doppler beeldvorming.
OPMERKING: Unilaterale perfusietekorten bevestigen de fistelomleiding van de arteriële stroom ("stelen"). - Dien 0,1 mg/kg buprenorfine subcutaan toe en breng de muis terug naar een voorverwarmde muizenkooi met zeer goed opneembaar zacht beddengoed met nest.
- Laat de muis herstellen in de voorverwarmde muizenkooi totdat de anesthesie is uitgewerkt, wat duidelijk zal zijn wanneer de muis ambulant en interactief is (~ 2 uur). Geef de muis tijdens het herstel gemakkelijk toegang tot een gehydrateerd, zacht dieet.
- Dien buprenorfine en/of subcutane zoutoplossing hydratatie elke 12 uur tot 48 uur toe en voer dagelijkse controle uit gedurende 5 dagen postoperatief. Euthanaseer dieren met een verslechterende toestand of overmatige weefselnecrose, geclassificeerd als een gemodificeerde ischemiescore ≥229.
- Gebruik seriële duplex echografiebeoordelingen om de doorgankelijkheid van fistels postoperatief te evalueren; muizen met fisteltrombose worden uitgesloten van latere analyses, tenzij het doel van de experimenten is om AVF-rijpingsfalen te karakteriseren.
- Bepaal andere postoperatieve uitkomstmetingen zoals lokale hemodynamiek, grijpkracht en loopprestaties tijdens de herstelperiode. Verzamel fistel- en spierweefsels om de histomorfologie aan het einde van het experiment te beoordelen tijdens het offer25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieren die zijn blootgesteld aan een adeninedieet hebben verminderde glomerulaire filtratiesnelheden (controle: 441,3 ± 54,2 μl / min vs. CKD: 165,1 ± 118,3 μl / min, p < 0,05 ) en verhoogde serumbloedureumstikstofspiegels (controle: 20,39 ± 4,2 μl / min vs. CKD: 38,20 ± 10,65 μl / min, p < 0,05) in vergelijking met de dieren die op caseïne gebaseerde chow kregen, wat de aanwezigheid van nierinsufficiëntie voorafgaand aan arterioveneuze fistelchirurgie bevestigt.
Validatie van AVF-doorgankelijkheid
Hoewel intra-operatieve visuele bevestiging van technisch succes de initiële identificatie van fisteldoorgankelijkheid is, garandeert het niet volledig doorgankelijkheid of fysiologische rijping gedurende de onderzoeksperiode. Postoperatieve doorgankelijkheidsuitkomsten (d.w.z. succes of falen) werden bepaald met behulp van zowel duplex echografie als histologisch onderzoek, zoals we eerder hebben aangetoond25. Figuur 2 toont respectievelijk de representatieve B-modus, pulsgolf Doppler en kleuren-Doppler-echografiebeelden en morfologische secties van een arterioveneuze fistelanastomose. Een patentfistel wordt direct gevisualiseerd op kleur-Doppleranalyse met turbulente hemodynamiek, evenals spectrale verbreding op de plaats van de fistel. Adaptieve stromingsgemedieerde veranderingen van de in- en uitstroomvaten bevestigen indirect ook de doorgankelijkheid van AVF. In het bijzonder heeft de aorta een verhoogde systolische piek en einddiastolische snelheid, de IVC ontwikkelt pulsatiliteit met verhoogde pieksnelheid en vaatverwijding in zowel de aorta als IVC is duidelijk (figuur 2A). Daarentegen heeft een mislukte of trombose fistel bijna geen veranderingen in instroom- of uitstroommetingen en geen turbulentie of spectrale verbreding binnen de linker iliacale vasculatuur. Gewoonlijk sluit fistelfalen door trombose gedeeltelijk of volledig de linker iliacale slagader af, die wordt gevisualiseerd als minimale tot geen stroom op pulsgolf Doppler-analyse. Figuur 2B toont seriële histologische secties van een AVF 2 weken na chirurgische creatie. De secties zijn 5 μm dik en gekleurd met Masson's trichrome. Chirurgische anastomose van de slagader en ader ligt voor de hand en er is duidelijke veneuze arterialisatie aanwezig (veneuze wandverdikking en fibrose met neo-intimale hyperplasie). Echografie werd uitgevoerd op postoperatieve dag 3 om muizen met vroeg AVF-falen uit te sluiten, en vervolgens werden seriële, niet-invasieve metingen verkregen gedurende de onderzoeksperiode. Morfologische beoordeling biedt periodespecifieke vasculaire remodelleringsdetails op het moment van opoffering en werd gebruikt om echografiebevindingen te bevestigen. Een AVF-doorgankelijkheidspercentage van ongeveer 50% (20% -30% van de postoperatieve sterfte en 20%-30% van het falen van fistels)25 is in eerste instantie te verwachten, maar het chirurgische succespercentage verbetert aanzienlijk (~ 5% -10% uitvalpercentage) met oefening en verhoogde vaardigheid.
Pathofysiologische kenmerken na vorming van iliacale arterioveneuze fistels
Hemodynamische verandering: Kenmerken van AVF-hemodynamiek en distale perfusie van achterpoten moeten worden gekwantificeerd om toegangsgerelateerde pathofysiologie van ledematen te contextualiseren. B-mode en pulse-wave Doppler echografie metingen na de operatie onthulden in- en uitstroomvatverwijding (IVC: 1,4-voudig bij POD3 en 1,6-voudig bij POD13 en IRA: 1,4-voudig bij POD3 en 1,7-voudig bij POD13, p < 0,05) en toename van de piek systolische snelheid (IVC piek systolische snelheid: 5,5-voudig bij POD3 en 4,9-voudig bij POD13 en IRA piek systolische snelheid: 2,8-voudig bij POD3 en 3,7-voudig bij POD13, P < 0,05) in vergelijking met de schijndieren (figuur 3A-D). Verder was unilaterale ischemie van de achterhand postoperatief duidelijk, wat bevestigt dat de arteriële hypoperfusie distaal is van de fistel. Perfusietekorten aan de linkerpoot zijn naar verwachting ~ 20% van de contralaterale ledemaat en het perfusietekort van de tibialis anterieure spier is ~ 60%. Muizen herstelden deze tekorten gedeeltelijk gedurende de onderzoeksperiode (figuur 3E,F).
Hindlimb disfunctie: Ipsilaterale ledemaatinvaliditeit wordt verwacht na AVF-creatie, waarbij milde (in de meeste gevallen) tot ernstige (enkele gevallen) beenhinken betrokken zijn die enkele dagen kunnen duren. Onopgeloste verlamming van de achterpoten en/of pootnecrose kan wijzen op een ernstige ischemische belediging veroorzaakt door fistels die buiten het normale bereik liggen. Hindlimb neuromotorische functie werd gekwantificeerd door middel van gripsterktetests en loopbandpatroonanalyse, die sequentieel werden uitgevoerd gedurende de herstelperiode. De verwachte unilaterale grijpkracht is ~50% van de contralaterale ledemaat op postoperatieve dag 4, met geleidelijk herstel. AVF-muizen hebben ook lagere loopbandsnelheden nodig tijdens de loopbeoordeling (<20 cm / min) (figuur 3G, H).
Figuur 1: Microchirurgische stappen van arterioveneuze fistelanastomose . (A) Blootstelling van het chirurgische doelgebied, inclusief laparotomie van de middellijn en isolatie van de linker iliacale slagader/ader. B) 4-0 hechtligaturen (bv. gebruikt als tijdelijke vatklemmen) op de linker gemeenschappelijke iliacale arterioveneuze bundel op proximale en distale plaatsen. (C) Een longitudinale venotomie op de voorste wand van de iliacale ader. (D) 10-0 imbricating hechting via de achterste wand van de iliacale ader en de voorste wand van de iliacale slagader. (E) Elliptische incisie met de imbricating uitzetting. (F) De initiële longitudinale venotomie van afbeelding C wordt gerepareerd met behulp van een onderbroken 10-0-hechting. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Validatie van arterioveneuze fisteldoorgankelijkheid . (A) Doppler-echografie bepaling van AVF-doorgankelijkheid. Kenmerken van een patentfistel zijn arteriële en veneuze dilatatie op B-mode beeldvorming, turbulente stroming op kleur Doppler-analyse van de linker iliacale vasculatuur, pulsatiele spectrale verbreding op pulsgolf Doppler-beoordeling van de linker iliacale vaten, toename van piek systolische en einddiastolische snelheid van de infrarenale aorta, en pulsatiliteit binnen de IVC met toename van de piek systolische snelheid. Verminderde of afwezige stroming in de iliacale vaten is suggestief voor AVF-falen / trombose. De duplex echografietechniek levert zowel morfologische als fysiologische gegevens. Snelheidsmetingen zijn in millimeters per seconde. (B) Morfologische beoordeling van AVF-anastomose 14 dagen na het ontstaan van fistels. Beelden waren besmeurd met Massons trichrome. Er zijn anatomische veranderingen in seriële sectiemicroscopie van proximale (linkeruiteinde) naar distale (rechteruiteinde) gemeenschappelijke iliacale arterioveneuze anatomie. Occlusie van de vasculatuur als gevolg van stolsel en/of overmatige neointimale hyperplasie bevestigt AVF-falen. Afbeeldingen zijn 10x vergroting. A: Gemeenschappelijke iliacale slagader, V: Gemeenschappelijke iliacale ader. Schaalbalk = 500 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Pathofysiologische kenmerken voorafgaand aan en na AVF-vorming. Kwantificering van echografie in (A) infrarenale aortadiameter, (B) infrarenale aorta piek systolische snelheid, (C) inferieure vena cava diameter, en (D) inferieure vena cava piek systolische snelheid preoperatief en op postoperatieve dagen 3 en 13. Lokale bloedperfusie (Laser doppler) meting op (E) tibialis anterior en (F) ventrale poot vóór de operatie en gedurende de herstelperiode van 2 weken. Neuromotorische functionele testen omvatten (G) grijpkracht en (H) loopbandtest pre- en postoperatief. Gegevens werden geanalyseerd met behulp van een tweerichtings-ANOVA en de post-hoctest van Tukey werd indien nodig uitgevoerd. Waarden zijn ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, **** p < 0,0001 vs. Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, #### p < 0,0001 vs. CKD_Sham. N = 6-10/groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De prevalentie van hemodialysepatiënten met ARHD na het maken van AVF is blijven stijgen met30,31. Inderdaad, onopgeloste symptomatische complicaties 4,32,33 zoals pijn, zwakte, paresthesie en / of verminderd bewegingsbereik kunnen een negatieve invloed hebben op het welzijn van de patiënt4,32,33,34,35,36 en hun vermogen bedreigen om een hoogwaardige repetitieve hemodialysebehandeling te ontvangen. Hoewel het bereiken van duurzame toegang tot hemodialyse een topprioriteit is voor ESRD-patiënten, moeten deze potentieel slopende symptomen voor proefpersonen die lijden aan ARHD worden aangepakt om patiëntgerichte resultaten te verbeteren. In de huidige studie, als een belangrijke preklinische mijlpaal op het gebied van ARHD-onderzoek, introduceren we een gedetailleerde chirurgische procedure om een muismodel van iliacale AVF te genereren, wat het onderzoek van AVF-geassocieerde ledemaatpathofysiologie vergemakkelijkt. Naast de verwachte veranderingen in aorto-iliacale en IVC-hemodynamiek, produceerde iliacale AVF-creatie klinisch relevante kenmerken van ledemaatdisfunctie, waaronder ischemie van perifeer weefsel met grove motorische stoornissen.
Elke stap van microchirurgie moet met de nodige zorg worden uitgevoerd om potentieel vaattrauma te voorkomen, dat aanzienlijke veranderingen in zowel hemodynamiek als ledemaatpathologie kan veroorzaken. Tijdens de ligatie mag de 4-0 zijden knoop alleen voldoende worden aangespannen om de bloedstroom door de chirurgische plaats van belang te voorkomen. Overmatige hechtligatuurknoopspanning kan de vaatwand beschadigen, wat ongewenste bloedingen kan veroorzaken en kan bijdragen aan intimale hyperplasie, wat leidt tot verminderde AVF-doorgankelijkheid. In het bijzonder is venotomieherstel een van de belangrijkste stappen van de chirurgische procedure. Een te grote beet in de aderwand kan leiden tot vaatstenose en uiteindelijk trombose, terwijl een te ondiepe reparatie dehiscentie met bloeding kan veroorzaken. Evenzo kan bloeding ook optreden als de venotomieherstelnaden te ver uit elkaar staan. In onze ervaring is een interval van ~ 0,025-0,03 mm tussen hechtingen voldoende om een hemostatische reparatie te creëren.
Naast de reproduceerbaarheid van de chirurgische techniek is het gebruik van een ziekte- of symptoomspecifiek diermodel een van de belangrijkste bijdragen van het huidige werk. In de huidige studie werden dieren blootgesteld aan een 0,2% -0,15% adeninedieet gedurende 2-3 weken voorafgaand aan en na een AVF-operatie om nierdisfunctie en een uremisch milieu analoog aan ESRD-patiënten vast te stellen. In vergelijking met chirurgische CKD-modellen (bijv. 5/6 nefrectomie) heeft een adeninedieetmodel verschillende voordelen, waaronder zeer lage sterftecijfers en minder interwaarnemersvariatie27,37. Met name de ernst en pathofysiologische gevolgen kunnen worden gewijzigd op basis van de concentratie en / of duur van het adeninedieet38,39. In combinatie met de door voeding geïnduceerde nefropathie, kan het huidige diermodel dat hierin wordt beschreven, de weg vrijmaken voor onderzoekers om de pathofysiologische mechanismen te bestuderen waarmee uremie ARHD beïnvloedt. Verder kunnen aanvullende diermodellen van ziekte worden toegevoegd aan het chirurgische model om de invloed van veel voorkomende comorbide aandoeningen, zoals diabetes, hypertensie of coronaire hartziekte, te testen.
Hoewel de gepresenteerde iliacale AVF-procedure reproduceerbaar belangrijke aspecten van ledemaatpathofysiologie modelleert die relevant zijn voor hemodialysepatiënten met ARHD, zijn er enkele beperkingen en complicaties die het bespreken waard zijn. Ten eerste hebben muizen die aan deze procedure worden onderworpen geen echte "vasculaire toegang"; Experimenten met experimentele hemodialysebehandelingen zijn dus niet mogelijk. Ten tweede wordt de ernst van ledemaatdisfunctie beïnvloed door de grootte van de arterioveneuze communicatie, dus consistente AVF-creatie is van cruciaal belang voor reproduceerbare resultaten. De creatie van een grote AVF kan bijvoorbeeld ernstige ischemie van de achterhand veroorzaken, die kan culmineren in necrose van de ledematen. Nieuwe microchirurgen die de procedure starten, worden aangemoedigd om histologische analyses van de gemaakte AVF's te gebruiken om de grootte op consistentie te analyseren. Bij muizen die werden onderworpen aan andere AVF-modellen, is hartremodellering, waaronder hypertrofie en mogelijk hartfalen, gemeld 40,41,42. Cardiale veranderingen in het huidige model zijn niet rigoureus beoordeeld, hoewel we cardiale hypertrofie kwalitatief hebben waargenomen in vergelijking met schijndieren. Bovendien zijn toekomstige langetermijnanalyses nodig om te evalueren hoe het muriene cardiovasculaire systeem zich aanpast aan de vorming en rijping van de iliacale AVF. Een extra zorg is dat jongere C57BL6-muizen het vermogen hebben om arteriogenese- en angiogenesereacties op ischemische stimuli te genereren, wat leidt tot de vorming van collaterale bloedvaten, zoals blijkt uit het bescheiden herstel in laser Doppler-ledemaatperfusie in deze studie. Het is dus mogelijk dat muizen volledig zullen herstellen van AVF-ledemaatpathologie zodra zich meer robuuste collaterale netwerken hebben gevormd; Toekomstige studies zijn echter nodig om de collaterale groei en distale vasculatuurveranderingen in kaart te brengen.
Tot op heden zijn de onderliggende mechanismen waardoor de handfunctie wordt aangetast en / of verergerd door AVF-plaatsing onvolledig begrepen. Gezien het feit dat het muizengenoom goed gekarakteriseerd is en er direct toegang is tot een breed scala aan transgene modellen voor genmanipulatie bij muizen, biedt dit iliacale AVF-chirurgische model een nuttig hulpmiddel voor biomedische ontdekkingen rond ARHD. In vergelijking met andere AVF-modellen voor knaagdieren, die gebruik maken van centrale vasculatuurchirurgie (bijv. Aorto-caval-fistelmodel), of grote diermodellen met femorale of iliacale AVF, biedt het huidige iliacale AVF-model met of zonder adeninedieet-geïnduceerde uremie onderzoekers een robuust experimenteel platform dat kan worden gebruikt om de onderliggende biologische mechanismen geassocieerd met hemodialyse ARHD te onderzoeken en nieuwe gerichte therapieën te genereren. Bovendien worden preklinische modellen over het algemeen beschouwd als cruciaal voor de vroege ontwikkeling en validatie van farmaceutische therapieën, waarvan er momenteel geen beschikbaar zijn om ARHD te behandelen / voorkomen. Met name is dit model ook vatbaar voor veranderingen in zowel de grootte van AVF als de ernst van nierdisfunctie, waardoor onderzoekers de ernst van de pathologie zorgvuldig kunnen moduleren. Kortom, dit unieke preklinische muis AVF-model kan dienen als een praktisch platform om preklinische therapeutische ontwikkeling te vergemakkelijken die gericht is op het verminderen van handinvaliditeit na AVF-plaatsing.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Dr. Guanyi Lu van de afdeling Vasculaire Chirurgie en Endovasculaire Therapie aan de Universiteit van Florida oprecht voor de technische ondersteuning bij de ontwikkeling van het iliacale AVF-model, evenals chirurgische training, en Ravi Kumar van de afdeling Toegepaste Fysiologie en Kinesiologie aan de Universiteit van Florida voor de technische ondersteuning bij het verkrijgen van de live microchirurgische beelden.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health en National Heart, Lung, and Blood, Institute-nummers R01-HL148697 (aan S.T.S.), evenals het subsidienummer POST903198 van de American Heart Association (aan K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
- Gameiro, J., Ibeas, J. Factors affecting arteriovenous fistula dysfunction: a narrative review. The Journal of Vascular Access. 21 (2), 134-147 (2020).
- Culleton, B. F., Asola, M. R. The impact of short daily and nocturnal hemodialysis on quality of life, cardiovascular risk and survival. Journal of Nephrology. 24 (4), 405 (2011).
- Huber, T. S., et al. Access-related hand ischemia and the hemodialysis fistula maturation study. Journal of Vascular Surgery. 64 (4), 1050-1058 (2016).
- Rehfuss, J. P., et al. The spectrum of hand dysfunction after hemodialysis fistula placement. Kidney International Reports. 2 (3), 332-341 (2017).
- Caplice, N. M., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), 470-475 (2007).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
- Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Kojima, T., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Misra, S., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Nath, K. A., et al. The murine dialysis fistula model exhibits a senescence phenotype: pathobiological mechanisms and therapeutic potential. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (5), 1493-1499 (2018).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), 1718-1725 (2013).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50472 (2015).
- Wong, C. Y., et al. A novel murine model of arteriovenous fistula failure: the surgical procedure in detail. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53294 (2016).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Anatomic configuration affects the flow rate and diameter of porcine arteriovenous fistulae. Kidney International. 81 (8), 745-750 (2012).
- Wang, Y., et al. Venous stenosis in a pig arteriovenous fistula model-anatomy, mechanisms and cellular phenotypes. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (2), 525-533 (2008).
- Loveland-Jones, C. E., et al. A new model of arteriovenous fistula to study hemodialysis access complications. The Journal of Vascular Access. 15 (5), 351-357 (2014).
- Nugent, H. M., et al. Perivascular endothelial implants inhibit intimal hyperplasia in a model of arteriovenous fistulae: a safety and efficacy study in the pig. Journal of Vascular Research. 39 (6), 524-533 (2002).
- Butterfield, A. B., et al. Inverse effect of chronically elevated blood flow on atherogenesis in miniature swine. Atherosclerosis. 26 (2), 215-224 (1977).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. The American Journal of Pathology. 164 (1), 81-89 (2004).
- Berru, F. N., et al. Chronic kidney disease exacerbates ischemic limb myopathy in mice via altered mitochondrial energetics. Scientific Reports. 9 (1), 15547 (2019).
- Khattri, R. B., Thome, T., Ryan, T. E. Tissue-specific 1H-NMR metabolomic profiling in mice with adenine-induced chronic kidney disease. Metabolites. 11 (1), 45 (2021).
- Thome, T., et al. Impaired muscle mitochondrial energetics is associated with uremic metabolite accumulation in chronic kidney disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (1), 139826 (2021).
- Kim, K., et al. Development of a murine iliac arteriovenous fistula model for examination of hemodialysis access-related limb pathophysiology. Journal of Vascular Surgery-Vascular Science. 2, 247-259 (2021).
- Castro, B., Kuang, S. Evaluation of muscle performance in mice by treadmill exhaustion test and whole-limb grip strength assay. Bio-protocol. 7 (8), 2237 (2017).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: a comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 321 (1), 106-119 (2021).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 20 (7), 946-950 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Bello, A. K., et al. Assessment of global kidney health care status. Journal of the American Medical Association. 317 (18), 1864-1881 (2017).
- Levin, A., et al. Global kidney health 2017 and beyond: a roadmap for closing gaps in care, research, and policy. The Lancet. 390 (10105), 1888-1917 (2017).
- Hassabi, M., et al. Comparing strength and range of motion of the upper limb with AV fistula access with the contralateral upper limb among patients treated with hemodialysis. Researcher Bulletin of Medical Sciences. 22 (1), 1 (2017).
- Capitanini, A., Galligani, C., Lange, S., Cupisti, A. Upper limb disability in hemodialysis patients: evaluation of contributing factors aside from amyloidosis. Therapeutic Apheresis and Dialysis. 16 (3), 242-247 (2012).
- Altintepe, L., et al. Physical disability, psychological status, and health-related quality of life in older hemodialysis patients and age-matched controls. Hemodialysis International. 10 (3), 260-266 (2006).
- Castaneda, C., et al. Resistance training to reduce the malnutrition-inflammation complex syndrome of chronic kidney disease. American Journal of Kidney Diseases. 43 (4), 607-616 (2004).
- Hurton, S., et al. Upper extremity complications in patients with chronic renal failure receiving haemodialysis. Journal of Renal Care. 36 (4), 203-211 (2010).
- Mazumder, M. K., Giri, A., Kumar, S., Borah, A. A highly reproducible mice model of chronic kidney disease: Evidences of behavioural abnormalities and blood-brain barrier disruption. Life Sciences. 161, 27-36 (2016).
- Jia, T., et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice. BioMed Central Nephrology. 14, 116 (2013).
- Kieswich, J. E., et al. A novel model of reno-cardiac syndrome in the C57BL/ 6 mouse strain. BioMed Central Nephrology. 19 (1), 346 (2018).
- Abassi, Z., Goltsman, I., Karram, T., Winaver, J., Hoffman, A. Aortocaval fistula in rat: a unique model of volume-overload congestive heart failure and cardiac hypertrophy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 729497 (2011).
- Brower, G. L., Levick, S. P., Janicki, J. S. Inhibition of matrix metalloproteinase activity by ACE inhibitors prevents left ventricular remodeling in a rat model of heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3057-3064 (2007).
- Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).
