Summary
Denne protokollen beskriver kirurgiske trinn av murine vanlig iliac arteriovenøs fistel etablering. Vi utviklet denne modellen for å studere hemodialysetilgangsrelatert lempatofysiologi.
Abstract
Kronisk nyresykdom er et stort folkehelseproblem, og forekomsten av nyresykdom i sluttstadiet (ESRD) som krever kronisk nyreutskiftningsterapi som hemodialyse fortsetter å øke. Autogen plassering av arteriovenøs fistel (AVF) er fortsatt et primært alternativ for vaskulær tilgang for ESRD-pasienter. Dessverre opplever omtrent halvparten av hemodialysepasientene dialysetilgangsrelatert hånddysfunksjon (ARHD), alt fra subtil parestesi til digital koldbrann. Spesielt er de underliggende biologiske driverne som er ansvarlige for ARHD dårlig forstått, og det finnes ingen adekvat dyremodell for å belyse mekanismene og/eller utvikle nye terapeutiske midler for forebygging/behandling av ARHD. Her beskriver vi en ny musemodell der en AVF dannes mellom venstre arteria iliaca communis og venen, og dermed letter vurderingen av patofysiologien i lemmer. Mikrokirurgi inkluderer fartøyisolasjon, langsgående venotomi, opprettelse av arteriovenøs anastomose og venøs rekonstruksjon. Falske operasjoner inkluderer alle de kritiske trinnene bortsett fra AVF-opprettelse. Iliac AVF-plassering resulterer i klinisk relevante endringer i sentral hemodynamikk, perifer iskemi og svekkelser i bakbenets nevromotoriske yteevne. Denne nye prekliniske AVF-modellen gir en nyttig plattform som rekapitulerer vanlige nevromotoriske forstyrrelser rapportert av hemodialysepasienter, slik at forskere kan undersøke mekanismene for ARHD-patofysiologi og teste potensielle terapier.
Introduction
Etablering og bevaring av funksjonell vaskulær tilgang er fortsatt et viktig hovedmål for pasienter med nyresykdom i sluttstadiet (ESRD) som får nyreerstattende behandling via hemodialyse1. Gjentatte hemodialyse behandlinger er nødvendig for å fjerne avfallsstoffer, normalisere elektrolytter, og opprettholde væskebalansen når nyrefunksjonen blir utilstrekkelig, og dermed er nødvendig for langsiktig overlevelse2. Derfor representerer vaskulær tilgang en "livline" for pasienter med ESRD, og plassering av autogen arteriovenøs fistel (AVF) er fortsatt et foretrukket alternativ for dialysetilgang i denne kohorten3. Imidlertid opplever omtrent 30% -60% av hemodialysepasienter et spekter av håndfunksjonshemninger, klinisk definert som tilgangsrelatert hånddysfunksjon (ARHD). Symptomene på ARHD kan variere fra svakhet og diskoordinasjon til monoplegi og digital koldbrann, som kan oppstå tidlig etter AVF-opprettelse eller utvikle seg gradvis med fistelmodning. Videre kompliserer ARHD ESRD-behandlingsplanen, som er forbundet med dårlig livskvalitet, høy risiko for kardiovaskulær sykdom og økt dødelighet 2,3,4.
Flere dyremodeller er utviklet for å studere vaskulær remodellering indusert av hemodynamiske endringer etter AVF-opprettelse 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Store dyremodeller med iliac eller femoral AVF 16,17,18,19,20 og gnagermodeller som bruker enten carotisarterie-jugularveneanastomose eller infrarenal aorta-inferior vena cava fisteldannelse er godt etablert for å undersøke de nevnte aspektene ved AVF-modning og patency 21 . For eksempel er venøs hypertensjon, større luminaldiameter og økt veneveggtykkelse signaturer for vellykket AVF-modning, mens betydelig fibrose av media og intimal hyperplasi eller trombeutvikling uten endringer i strømning ofte karakteriserer AVF-feil 6,15. Imidlertid mangler store dyremodeller den eksperimentelle fleksibiliteten eller transgene egenskapene til murinmodeller, mens nåværende gnagermodeller ikke lett letter undersøkelsen av ARHD på grunn av enten den anatomiske plasseringen og / eller mangelen på tilknyttet lempatologi. Faktisk, på grunn av mangel på en etablert preklinisk dyremodell som rekapitulerer den relevante kliniske fenotypen, har forskningsfremgang for å belyse de patobiologiske mekanismene og utvikle nye terapeutiske strategier forblitt stillestående, til tross for en progressiv økning i antall symptomatiske ARHD-pasienter. Derfor er det primære målet med denne studien å introdusere en unik musemodell av ARHD, som gir prosessuelle trinn for AVF-mikrokirurgi og karakterisering av AVF-relatert patofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Florida og Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.
MERK: Unge voksne (8-10 uker gamle) mannlige C57BL / 6J mus ble kjøpt fra The Jackson Laboratory og plassert i et lys (12 t lys: 12 t mørk syklus), temperatur (22 ° C ± 1 ° C) og fuktighet (50% ± 10%) kontrollert dyreanlegg. Fem mus fikk bo per merd (B:18 cm x L:29 cm x H:12,5 cm) med hekkematerialer, mat og vann tilgjengelig ad libitum. Etter 7 dager med habitatakklimatisering med standard chow, ble musene endret til en kaseinbasert chow-diett i 7 dager som en diettovergangsfase. Deretter ble mus matet kaseinbasert chow med 0,2% -0,15% adenintilskudd i 2-3 uker for å indusere nyredysfunksjon (CKD) før AVF-operasjonen som tidligere beskrevet22,23,24. Kontrollmus fikk en kaseinbasert chow diett uten adenintilskudd (kontroll). Kontroll- og CKD-diettene ble opprettholdt gjennom hele den postoperative restitusjonsperioden (POD).
1. Preoperative målinger
- Vurdere baseline/preoperative utfallsmålinger, aortoiliakale kardiametre og hemodynamiske strømningsparametere ved bruk av tosidig ultralydavbildning og perfusjon i bakbenet via laserdoppler som tidligere beskrevet25.
- Bestem den ensidige grepsstyrken i baklemmene og tredemøllens gangvurdering for å etablere baseline bakkroppsfunksjon som tidligere beskrevet25,26.
- Vurder nyrefunksjonen ved å måle glomerulær filtrasjonshastighet (GFR) via FITC-inulin clearance og / eller serum blod urea nitrogen (BUN) nivå som tidligere beskrevet22,24,27.
2. Kirurgisk forberedelse
- Forbered følgende kirurgiske verktøy og forsyninger (materialfortegnelse): en varm perlesterilisator, øyesmøremiddel, en penntrimmer, alkoholpreps, klorhexidinservietter, ekstra fine Graefe-tang, sterilisert 0,9% saltvann, 29 G og 31 G nålesprøyter, 2 x 2 ikke-vevde svamper, middels enkeltendede runde (SC-9) og små dobbeltendede harde, skarpe, spisse (SC-4) bomullspinner, lavtemperatur. rett Dumont tang, 45 ° vinklet Dumont tang, rett Vannas vårsaks, buede Vannas vårsaks, runde håndterte nåleholdere, flere størrelser suturer (4-0 silke, 5-0 PGA, 6-0 silke og 10-0 nylonsuturer), heparin, absorberbar gelatinsvamp, en rett nålholder og buprenorfin.
MERK: Ekstremitetsfestede gummistrikker og tilbaketrekkere for mage og ben var håndlaget. - Steriliser kirurgiske forberedelser ved bruk av autoklav med dampsterilisering ved 120-125 °C i 30 minutter etterfulgt av tørking i 30 minutter før operasjonen. Bruk 70% etanolrensing etterfulgt av varm perlesterilisering (240-270 °C i 3 minutter) mellom hver dyreoperasjon.
- Tilbered sterilisert 0,9% vanlig saltvann, heparinisert saltvann (100 IE / ml) og buprenorfin (0,01 mg / ml) ved hjelp av 29-31 G nålesprøyter.
3. Anestesi og posisjonering
- Start musebedøvelse i induksjonskammeret (0,8 ml/min, 2,5 % isofluran). Når musen er tilstrekkelig bedøvet, plasser musen i en liggende stilling på operasjonsstasjonen dekket av en steril drapering. Senk isoflurankonsentrasjonen ned til ~1,2 % under barbering og posisjonering.
- Påfør det okulære smøremiddelet for å beskytte øynene mot tørking under operasjonen.
- Bruk en penntrimmer til å barbere magehåret for operasjonen og benhåret for postoperative perfusjonsmålinger. Fjern håret fra det kirurgiske feltet.
- Fikser øvre og nedre ekstremiteter med gummibånd og stifter, kontroller dybden av anestesi ved å overvåke tåklemmerefleksen, og titrer anestesi etter behov. Utfør evalueringen av respiratorisk mønster hvert 3-5 minutt gjennom hele den kirurgiske prosedyren for å kalibrere anestesinivået.
4. Utforskning av det kirurgiske målområdet
- Rengjør det barberte hudområdet flere ganger, vekslende mellom alkoholforberedelse og klorhexidinservietter i et sirkulært mønster for å desinfisere det kirurgiske feltet.
- Lag en midtlinje laparotomi fra nedre kant av sternal margin til pubis symfysen. Dissekere pubis fett pad for å få et bredere operativt felt.
- Åpne celiotomi for å få tilgang til peritonealt innhold med retractors og eviscerate de små og store tarmen ved hjelp av medium, single-ended runde bomullspinner. Dekk tarmene med en saltvann-gjennomvåt, ikke-vevd svamp.
- Når tilstrekkelig eksponering av retroperitoneal vaskulatur er oppnådd, dekk gjenværende tarm, nyrer og urinledere med små saltvann-gjennomvåt ikke-vevde svamper. Evakuer en oppblåst blære ved forsiktig å klemme blærekuppelen med middels, ensidig runde bomullspinner etter behov.
- Dissekere forsiktig perivaskulær fascie og fettvev fra ca. 1 cm proksimalt til aortabifurkasjonen som strekker seg til nivået av venstre iliaca bifurkasjon ved hjelp av rette Dumont-tang og små dobbeltendet harde, skarpe, spisse bomullspinner.
MERK: Den venstre iliac arterien og venen er igjen adherent til hverandre mens isolere arteriovenøse strukturer en masse. Dette trinnet vil gi tilstrekkelig fartøymobilisering for å lette AVF-opprettelsen. - Hvis noen små venøse grener oppstår som stammer fra eller konvergerer med venstre vena iliaca communis, ligate dem ved hjelp av lavtemperatur cautery med eller uten 6-0 silkessutur etter behov.
- Før tuppen av den vinklede tangen under venstre vaskulær bunt iliaca communis og spre forsiktig flere ganger for å mobilisere karene fra underliggende retroperitoneal muskulatur (figur 1A).
5. Opprettelse av en felles iliac arteriovenøs fistelanastomose
- Plasser to 4-0 silkesuturer rundt den isolerte venstre vanlige iliac arteriovenøse bunten og bruk dem som ligaturer (f.eks. Kryssklemmer) til vaskulær bunt. Lag en enkelt knute med hvert 4-0 silkeslips og påfør dem sekvensielt fra proksimalt til distalt.
- Forsikre deg om at silkebåndskryssklemmene er plassert tilstrekkelig langt fra hverandre til å isolere ~ 2 mm karlengde, og den sekvensielle påføringen av suturligaturene vil utfelle venstre iliac vene engorgement.
- Bruk 4-0 silkesuturstrengene som håndtak, roter venstre iliac arteriovenøse vaskulære bunt med klokken og finjuster posisjonen for midlertidig å lokalisere venen foran arterien (figur 1B).
- Lag en langsgående venotomi (~ 1 mm) med rett Vannas fjærsaks og skyll forsiktig ut gjenværende blod fra venøs lumen med 0,9% saltvann (figur 1C). Vær forsiktig under dette trinnet, da en høytrykks saltvannspyling kan forårsake venøs forstyrrelse.
MERK: Området med rød farge som forblir i iliaca arterien etter venøs spyling gir et visuelt vindu for følgende trinn. - Plasser en imbricating 10-0 nylon sutur gjennom den bakre veggen av venen.
MERK: Denne delen av iliacvenen skal være i umiddelbar apposisjon til den fremre veggen av iliac arterien, og veggene er naturlig adherent. Suturen skal gå gjennom begge veggene og binde suturen med en enkelt knute (figur 1D). Legg merke til at en liten mengde blødning, som stammer fra stillestående blod i iliac arterien, vil vises når nålen passerer gjennom begge veggene. Hvis intraluminal blødning fortsetter i løpet av dette trinnet, kan silkesuturkryssklemmene være for løse og må strammes ytterligere. - Ta tak i de imbricated suturendene og legg dem under mild spenning for å forskyve den fremre veggen fra den bakre veggen av iliaca arterien. Lag et ~ 1,0 mm x 0,3 mm elliptisk snitt ved hjelp av buede Vannas fjærsaks, og fjern de vedheftende veggene i både iliac arterien og venen.
MERK: Den arteriovenøse fistelen opprettes dermed når denne felles kanalen er etablert. Det er mulig å skade venens sidevegger i dette trinnet, da det bakre iliaca vena / fremre iliaca arterieveggsnittet utføres ved venotomieksponering. Forsiktighet bør utvises for å unngå denne komplikasjonen, da dette kan redusere fisteldiameteren betydelig og føre til trombeutvikling. - Skyll forsiktig ut gjenværende blod av det eksponerte arterielle lumen med 0,9 % saltvann og heparinisert saltvann (100 IE/ml)28 (figur 1E).
- Etter opprettelsen av AVF, reparer den første fremre veggvenotomien ved å bruke to eller tre 10-0 nylonsuturer på en avbrutt måte (figur 1F).
- Gjenopprett den vaskulære bunten til sin opprinnelige anatomiske orientering og plasser et lite stykke saltvann-gjennomvåt absorberbar gelatinsvamp ved siden av den reparerte venotomien for å lette hemostase.
- Løsne 4-0 enkeltknute kryssklemmeligaturer sekvensielt fra distalt til proksimalt. Overvåk venotomistedet nøye for overdreven blødning mens du løsner hver sutur.
- Hvis reparasjonen ikke er tilstrekkelig hemostatisk, må du bruke kryssklemmene på nytt og plassere en annen 10-0 nylonsutur på blødningsstedet. Hvis hemostase er sikret, fjern suturene og deretter den absorberbare gelatinsvampen.
- Gni forsiktig det vaskulære buntet med små dobbeltendere harde, skarpe, spisse bomullspinne, noe som ytterligere letter restaureringen av blodstrømmen. Bekreft operasjonens tekniske suksess ved hjelp av visualisering av pulsatilt, rødt oksygenert blod som kommer inn i iliacvenen og blandes med mørkt venøst blod som kommer tilbake fra bakbenet.
- Injiser heparinisert saltvann (0,2 IE/g)15 i IVC for systemisk antikoagulasjon for å forbedre AVF-frekvensen.
MERK: Selv om dette trinnet oppstår etter vaskulær rekonstruksjon (i motsetning til den humane analogen der heparinisering oppstår før karets kryssklemming), ble det observert en reduksjon i intraoperativ blødning og forbedret AVF-patency når det ble utført på dette stadiet av prosedyren. Injeksjon på et sted dekket av fascie og/eller fett er å foretrekke for å forhindre blødning fra stikkstedet. - Re-inspiser operasjonsstedet for hemostase etter injeksjon av heparinisert saltvann. Hvis det ikke er noen blødningsproblemer, lukk midtlinjefascien og deretter hudsnittet med absorberbare 5-0 PGA-suturer på løpende måte.
- For svindeloperasjoner, følg alle de viktigste trinnene i prosedyren bortsett fra AVF-dannelse. Påfør en enkelt knute av 4-0 silkeligaturen i den proksimale enden av venstre iliac arteriovenøse bunt og match klemmetidene til AVF-operasjoner (f.eks. ~ 20 min, avhengig av mikrokirurgens ferdigheter).
6. Postoperativ omsorg og måling
- Etter laparotomi lukking, måle blodperfusjon av bilaterale tibialis fremre muskler og ventrale poter ved hjelp av laser Doppler imaging.
MERK: Ensidige perfusjonsutfall vil bekrefte fistelavledning av arteriell strømning ("stjele"). - Administrer 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant og sett musen tilbake til et forvarmet musebur med svært absorberbart mykt sengetøy med rede.
- La musen komme seg i det forvarmede museburet til anestesien slites av, noe som vil være tydelig når musen er ambulerende og interaktiv (~ 2 timer). Under utvinning, gi musen lett tilgang til et fuktig, mykt kosthold.
- Administrer buprenorfin og/eller subkutan saltvannshydrering hver 12. time opptil 48 timer og utfør daglig overvåking i 5 dager postoperativt. Avlive dyr med forverret tilstand eller overdreven vevnekrose, klassifisert som en modifisert iskemiscore ≥229.
- Bruk serielle dupleks-ultralydvurderinger for å evaluere fistelpatency postoperativt; Mus med fisteltrombose ekskluderes fra senere analyser med mindre hensikten med forsøkene er å karakterisere modningssvikt ved AVF.
- Bestem andre postoperative utfallsmålinger som lokal hemodynamikk, gripestyrke og gangytelse i restitusjonsperioden. Samle fistel og muskelvev for å vurdere histomorfologi på slutten av forsøket under ofringen25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyr utsatt for en adenin diett har reduserte glomerulære filtrasjonshastigheter (kontroll: 441,3 ± 54,2 μL / min vs. CKD: 165,1 ± 118,3 μL / min, p < 0,05) og økt serumblodurea nitrogennivå (kontroll: 20,39 ± 4,2 μL / min vs. CKD: 38,20 ± 10,65 μL / min, p < 0,05) sammenlignet med dyrene som fikk kaseinbasert chow, noe som bekrefter tilstedeværelsen av nyreinsuffisiens før arteriovenøs fistelkirurgi.
Validering av AVF-patency
Selv om intraoperativ visuell bekreftelse av teknisk suksess er den første identifiseringen av fistelpatency, garanterer den ikke fullt ut patency eller fysiologisk modning gjennom hele studieperioden. Postoperative patencyutfall (dvs. suksess eller fiasko) ble bestemt ved hjelp av både tosidig ultralydavbildning og histologisk undersøkelse, som vi tidligere har vist25. Figur 2 viser henholdsvis representative B-modus, pulsbølgedoppler og fargedoppler-ultralydbilder og morfologiske snitt av en arteriovenøs fistelanastomose. En patentfistel visualiseres direkte på fargedoppleranalyse med turbulent hemodynamikk, samt spektralutvidelse på fistelen. Adaptive strømningsmedierte endringer i innstrømnings- og utstrømningsbeholderne bekrefter også indirekte AVF-patency. Spesielt har aorta forhøyet topp systolisk og endediastolisk hastighet, IVC utvikler pulsatilitet med forhøyet topphastighet, og kardilatasjon i både aorta og IVC er tydelig (figur 2A). I motsetning til dette har en mislykket eller trombosert fistel nesten ingen endringer i innstrømnings- eller utstrømningsmålinger og ingen turbulens eller spektral utvidelse i venstre iliaca vaskulatur. Fistelsvikt ved trombose okkluderer vanligvis helt eller delvis venstre iliaca a. venstre, som visualiseres som minimal eller ingen flyt ved pulsbølgedoppleranalyse. Figur 2B viser seriehistologisnitt av AVF 2 uker etter operativ opprettelse. Seksjonene er 5 μm tykke og farget med Massons trichrome. Kirurgisk anastomose av arterie og vene er åpenbar, og tydelig venøs arterialisering foreligger (venøs veggfortykkelse og fibrose med neointimal hyperplasi). Ultralydavbildning ble utført på postoperativ dag 3 for å utelukke mus med tidlig AVF-svikt, og deretter ble det oppnådd serielle, ikke-invasive målinger gjennom hele studieperioden. Morfologisk vurdering gir periodespesifikke vaskulære remodelleringsdetaljer på offertidspunktet og ble brukt til å bekrefte ultralydfunn. En AVF-patencyrate på ca. 50 % (20 %-30 % av postoperativ død og 20 %-30 % av fistelsvikt)25 kan forventes til å begynne med, men den kirurgiske suksessraten forbedres betydelig (~5 %-10 % sviktrate) med øvelse og økt ferdighet.
Patofysiologiske karakteristika etter iliac arteriovenøs fisteldannelse
Hemodynamisk endring: Kjennetegn ved AVF-hemodynamikk og distal perfusjon i bakbenet må kvantifiseres for å kontekstualisere tilgangsrelatert patofysiologi i lemmer. B-modus og pulsbølgedoppler-ultralydmålinger etter kirurgi viste innstrømnings- og utstrømningskardilatasjon (IVC: 1,4 ganger ved POD3 og 1,6 ganger ved POD13 og IRA: 1,4 ganger ved POD3 og 1,7 ganger ved POD13, p < 0,05) og økning i maksimal systolisk hastighet (IVC maksimal systolisk hastighet: 5,5 ganger ved POD3 og 4,9 ganger ved POD13 og IRA maksimal systolisk hastighet: 2,8 ganger ved POD3 og 3,7 ganger ved POD13, P < 0,05) sammenlignet med narredyrene (figur 3A-D). Videre var det postoperativt ensidig bakekstremitetsiskemi, noe som bekrefter stealmediert arteriell hypoperfusjon distalt for fistelen. Perfusjonsunderskudd på venstre pote forventes å være ~ 20% av den kontralaterale lemmen, og perfusjonsunderskuddet til tibialis fremre muskel er ~ 60%. Mus gjenvunnet delvis disse underskuddene gjennom studieperioden (figur 3E,F).
Hindlimb dysfunksjon: Ipsilateral lem funksjonshemming forventes etter AVF opprettelse, som innebærer mild (de fleste tilfeller) til alvorlig (få tilfeller) ben limping som kan vare i flere dager. Uløst lammelse i bakbenet og/eller potenekrose kan indikere en alvorlig iskemisk fornærmelse forårsaket av fistelstørrelse utenfor normalområdet. Hindlimb nevromotorisk funksjon ble kvantifisert via testing av gripestyrke og analyse av tredemøllemønster, som ble utført sekvensielt gjennom restitusjonsperioden. Forventet ensidig gripestyrke er ~50% av kontralateral lem på postoperativ dag 4, med gradvis restitusjon. AVF-mus krever også redusert hastighet på tredemølle under gangvurdering (<20 cm/min) (figur 3G,H).
Figur 1 Mikrokirurgiske trinn ved arteriovenøs fistelanastomose. (A) Eksponering av det kirurgiske målområdet, inkludert laparotomi i midtlinjen og isolasjon av venstre iliaca arterie/vene. (B) 4-0 suturligaturer (f.eks. brukt som midlertidige karklemmer) på venstre arteriovenøse gruppe iliaca arteriovenøse bunt på proksimale og distale steder. (C) En langsgående venotomi på den fremre veggen av iliacvenen. (D) 10-0 imbricating sutur via bakre vegg av iliaca vena og fremre vegg av iliaca arterien. (E) Elliptisk snitt med imbricating distensjon. (F) Innledende langsgående venotomi fra bilde C repareres ved hjelp av en avbrutt 10-0 sutur. Skala bar = 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Validering av arteriovenøs fistelpatency. (A) Doppler ultralydbestemmelse av AVF patency. Kjennetegn ved en patentfistel inkluderer arteriell og venøs dilatasjon på B-modus avbildning, turbulent flyt på farge Doppler-analyse av venstre iliac vaskulatur, pulsatil spektral utvidelse på pulsbølgedopplervurdering av venstre iliac kar, økning i maksimal systolisk og endediastolisk hastighet av infrarenal aorta og pulsatilitet innen IVC med økning i maksimal systolisk hastighet. Redusert eller fraværende flow i iliaca karene tyder på AVF svikt / trombose. Den tosidige ultralydteknikken gir både morfologiske og fysiologiske data. Hastighetsmålinger er i millimeter per sekund. (B) Morfologisk vurdering av AVF-anastomose 14 dager etter opprettelse av fistel. Bildene ble farget med Massons trichrome. Det er anatomiske forandringer i seriesnittmikroskopi fra proksimal (venstre ende) til distal (høyre ende) arteriovenøs communiliaca arteriovenøs anatomi. Okklusjon av vaskulaturen på grunn av blodpropp og/eller overdreven neointimal hyperplasi bekrefter AVF-svikt. Bilder er 10x forstørrelse. A: Arteria iliaca communis, V: Vena iliaca communis. Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Patofysiologiske karakteristika før og etter AVF-dannelse. Kvantifisering av ultralydavbildning i (A) infrarenal aortadiameter, (B) infrarenal aorta topp systolisk hastighet, (C) dårligere vena cava diameter, og (D) dårligere vena cava topp systolisk hastighet preoperativt og ved postoperative dag 3 og 13. Lokal blodperfusjon (laserdoppler) måling på (E) tibialis anterior og (F) ventral pote før kirurgi og gjennom hele 2 ukers restitusjonsperioden. Nevromotorisk funksjonstesting inkluderte (G) gripestyrke og (H) tredemølletest pre- og postoperativt. Data ble analysert ved hjelp av en toveis ANOVA, og Tukeys post-hoc-test ble utført når det var hensiktsmessig. Verdier betyr ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, **** p < 0,0001 vs. Control_Sham. #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001, #### p < 0.0001 vs. CKD_Sham. N = 6-10/gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forekomsten av hemodialysepasienter med ARHD etter AVF-opprettelse har fortsatt å øke30,31. Faktisk kan uløste symptomatiske komplikasjoner 4,32,33 som smerte, svakhet, parestesi og / eller redusert bevegelsesutslag negativt påvirke pasientens velvære4,32,33,34,35,36 og true deres evne til å motta repeterende hemodialysebehandling av høy kvalitet. Selv om oppnåelse av varig hemodialysetilgang er en topp prioritet for ESRD-pasienter, for personer som er rammet av ARHD, må disse potensielt svekkende symptomene tas opp for å forbedre pasientsentrerte resultater. I denne studien, som en viktig preklinisk milepæl innen ARHD-forskning, introduserer vi en detaljert kirurgisk prosedyre for å generere en musemodell av iliac AVF, noe som letter undersøkelsen av AVF-assosiert patofysiologi i lemmer. I tillegg til de forventede endringene i aorto-iliac og IVC hemodynamikk, produserte iliac AVF-opprettelse klinisk relevante trekk ved dysfunksjon i lemmer, inkludert perifer vevsiskemi med grovmotorisk funksjonsnedsettelse.
Hvert mikrokirurgisk trinn bør utføres med utsøkt omsorg for å unngå potensielt kartrauma, noe som kan forårsake betydelige endringer i både hemodynamikk og lemmerpatologi. Under ligeringen bør 4-0 silkebåndsknuten bare strammes nok til å forhindre blodstrøm gjennom operasjonsstedet av interesse. Overdreven suturligaturknutespenning kan skade karveggen, noe som kan forårsake uønsket blødning og kan bidra til intimal hyperplasi, noe som fører til redusert AVF-patency. Spesielt er venotomi reparasjon en av de viktigste trinnene i den kirurgiske prosedyren. For stort bitt i veneveggen kan føre til karstenose og til slutt trombose, mens for grunne reparasjoner kan forårsake dehiscens med blødning. På samme måte kan blødning også oppstå hvis venotomi-reparasjonssuturene er fordelt for langt fra hverandre. Etter vår erfaring er et ~ 0,025-0,03 mm intervall mellom suturer nok til å skape en hemostatisk reparasjon.
I tillegg til reproduserbarheten av den kirurgiske teknikken, er bruk av en sykdoms- eller symptomspesifikk dyremodell et av de viktigste bidragene i det nåværende arbeidet. I denne studien ble dyrene utsatt for en 0.2%-0.15% adenin diett i 2-3 uker før og etter AVF-kirurgi for å etablere nyredysfunksjon og et uremisk miljø analogt med ESRD-pasienter. Sammenlignet med kirurgiske CKD-modeller (f.eks. 5/6 nefrektomi), har en adenin diettmodell flere fordeler, inkludert svært lav dødelighet og mindre interobservatørvariasjon27,37. Spesielt kan alvorlighetsgraden og patofysiologiske konsekvensene modifiseres basert på konsentrasjonen og / eller varigheten av adenindietten38,39. Sammen med diettindusert nefropati kan den nåværende dyremodellen beskrevet her sette scenen for forskere å studere de patofysiologiske mekanismene som uremi påvirker ARHD. Videre kan flere dyremodeller av sykdom legges til den kirurgiske modellen for å teste påvirkning av svært utbredte komorbide tilstander, som diabetes, hypertensjon eller koronararteriesykdom.
Selv om den presenterte iliac AVF-prosedyren reproduserbart modellerer viktige aspekter ved patofysiologi i lemmer som er relevante for hemodialysepasienter med ARHD, er det noen begrensninger og komplikasjoner som er verdt å diskutere. For det første har mus utsatt for denne prosedyren ikke ekte "vaskulær tilgang"; Dermed er eksperimenter som involverer eksperimentelle hemodialysebehandlinger ikke mulig. For det andre påvirkes alvorlighetsgraden av dysfunksjon i lemmer av størrelsen på arteriovenøs kommunikasjon, så konsekvent AVF-opprettelse er avgjørende for reproduserbare resultater. For eksempel kan opprettelsen av en stor AVF produsere alvorlig bakbensiskemi, som kan kulminere i lemmernekrose. Nye mikrokirurger som begynner prosedyren, oppfordres til å bruke histologiske analyser av de opprettede AVFene for å analysere størrelsen for konsistens. Hos mus utsatt for andre AVF-modeller er hjerteremodellering, inkludert hypertrofi og muligens hjertesvikt, rapportert 40,41,42. Hjerteforandringer i dagens modell er ikke grundig vurdert, selv om vi kvalitativt har observert hjertehypertrofi sammenlignet med narredyr. Videre er det behov for fremtidige langsiktige analyser for å evaluere hvordan murine kardiovaskulærsystemet tilpasser seg iliac AVF-dannelsen og modningen. En ekstra bekymring er at yngre C57BL6-mus har evne til å generere arteriogenese- og angiogeneseresponser på iskemiske stimuli, noe som fører til dannelse av sikkerhetskar, som vist ved den beskjedne utvinningen i laserdopplerperfusjon i denne studien. Dermed er det mulig at mus vil bli helt friske fra AVF lem patologi når mer robuste sikkerhetsnettverk har dannet seg; Det er imidlertid behov for fremtidige studier for å kartlegge sikkerhetsvekst og distale vaskulaturendringer.
Til dags dato er de underliggende mekanismene som gjør at håndfunksjonen svekkes og/eller forverres av AVF-plassering, ufullstendig forstått. Gitt at musegenomet er godt karakterisert og det er klar tilgang til et bredt spekter av transgene modeller for genmanipulering hos mus, gir denne iliac AVF kirurgiske modellen et nyttig verktøy for biomedisinsk oppdagelse rundt ARHD. Sammenlignet med andre AVF-modeller for gnagere, som benytter sentral vaskulaturkirurgi (f.eks. aorto-kaval fistelmodell), eller store dyremodeller med femoral eller iliac AVF, gir den nåværende iliac AVF-modellen med eller uten adenin diettindusert uremi etterforskere en robust eksperimentell plattform som kan brukes til å forhøre de underliggende biologiske mekanismene forbundet med hemodialyse ARHD og generere nye målrettede terapier. Videre anses prekliniske modeller generelt for å være avgjørende for tidlig utvikling og validering av farmasøytiske terapier, hvorav ingen for tiden er tilgjengelige for å behandle/forebygge ARHD. Spesielt er denne modellen også egnet til endringer i både størrelsen på AVF og alvorlighetsgraden av nyresvikt, noe som gjør det mulig for etterforskere å nøye modulere alvorlighetsgraden av patologien. Avslutningsvis kan denne unike prekliniske mus AVF-modellen tjene som en praktisk plattform for å lette preklinisk terapeutisk utvikling med sikte på å redusere håndfunksjonshemming etter AVF-plassering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker hjertelig Dr. Guanyi Lu fra Divisjon for vaskulær kirurgi og endovaskulær terapi ved University of Florida for teknisk støtte til utviklingen av iliac AVF-modellen, samt kirurgisk trening, og Ravi Kumar fra Institutt for anvendt fysiologi og kinesiologi ved University of Florida for teknisk støtte for å få levende mikrokirurgiske bilder.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health og National Heart, Lung and Blood, Institute numbers R01-HL148697 (til STS), samt American Heart Association tilskuddsnummer POST903198 (til K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
- Gameiro, J., Ibeas, J. Factors affecting arteriovenous fistula dysfunction: a narrative review. The Journal of Vascular Access. 21 (2), 134-147 (2020).
- Culleton, B. F., Asola, M. R. The impact of short daily and nocturnal hemodialysis on quality of life, cardiovascular risk and survival. Journal of Nephrology. 24 (4), 405 (2011).
- Huber, T. S., et al. Access-related hand ischemia and the hemodialysis fistula maturation study. Journal of Vascular Surgery. 64 (4), 1050-1058 (2016).
- Rehfuss, J. P., et al. The spectrum of hand dysfunction after hemodialysis fistula placement. Kidney International Reports. 2 (3), 332-341 (2017).
- Caplice, N. M., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), 470-475 (2007).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
- Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Kojima, T., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Misra, S., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Nath, K. A., et al. The murine dialysis fistula model exhibits a senescence phenotype: pathobiological mechanisms and therapeutic potential. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (5), 1493-1499 (2018).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), 1718-1725 (2013).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50472 (2015).
- Wong, C. Y., et al. A novel murine model of arteriovenous fistula failure: the surgical procedure in detail. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53294 (2016).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Anatomic configuration affects the flow rate and diameter of porcine arteriovenous fistulae. Kidney International. 81 (8), 745-750 (2012).
- Wang, Y., et al. Venous stenosis in a pig arteriovenous fistula model-anatomy, mechanisms and cellular phenotypes. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (2), 525-533 (2008).
- Loveland-Jones, C. E., et al. A new model of arteriovenous fistula to study hemodialysis access complications. The Journal of Vascular Access. 15 (5), 351-357 (2014).
- Nugent, H. M., et al. Perivascular endothelial implants inhibit intimal hyperplasia in a model of arteriovenous fistulae: a safety and efficacy study in the pig. Journal of Vascular Research. 39 (6), 524-533 (2002).
- Butterfield, A. B., et al. Inverse effect of chronically elevated blood flow on atherogenesis in miniature swine. Atherosclerosis. 26 (2), 215-224 (1977).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. The American Journal of Pathology. 164 (1), 81-89 (2004).
- Berru, F. N., et al. Chronic kidney disease exacerbates ischemic limb myopathy in mice via altered mitochondrial energetics. Scientific Reports. 9 (1), 15547 (2019).
- Khattri, R. B., Thome, T., Ryan, T. E. Tissue-specific 1H-NMR metabolomic profiling in mice with adenine-induced chronic kidney disease. Metabolites. 11 (1), 45 (2021).
- Thome, T., et al. Impaired muscle mitochondrial energetics is associated with uremic metabolite accumulation in chronic kidney disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (1), 139826 (2021).
- Kim, K., et al. Development of a murine iliac arteriovenous fistula model for examination of hemodialysis access-related limb pathophysiology. Journal of Vascular Surgery-Vascular Science. 2, 247-259 (2021).
- Castro, B., Kuang, S. Evaluation of muscle performance in mice by treadmill exhaustion test and whole-limb grip strength assay. Bio-protocol. 7 (8), 2237 (2017).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: a comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 321 (1), 106-119 (2021).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 20 (7), 946-950 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Bello, A. K., et al. Assessment of global kidney health care status. Journal of the American Medical Association. 317 (18), 1864-1881 (2017).
- Levin, A., et al. Global kidney health 2017 and beyond: a roadmap for closing gaps in care, research, and policy. The Lancet. 390 (10105), 1888-1917 (2017).
- Hassabi, M., et al. Comparing strength and range of motion of the upper limb with AV fistula access with the contralateral upper limb among patients treated with hemodialysis. Researcher Bulletin of Medical Sciences. 22 (1), 1 (2017).
- Capitanini, A., Galligani, C., Lange, S., Cupisti, A. Upper limb disability in hemodialysis patients: evaluation of contributing factors aside from amyloidosis. Therapeutic Apheresis and Dialysis. 16 (3), 242-247 (2012).
- Altintepe, L., et al. Physical disability, psychological status, and health-related quality of life in older hemodialysis patients and age-matched controls. Hemodialysis International. 10 (3), 260-266 (2006).
- Castaneda, C., et al. Resistance training to reduce the malnutrition-inflammation complex syndrome of chronic kidney disease. American Journal of Kidney Diseases. 43 (4), 607-616 (2004).
- Hurton, S., et al. Upper extremity complications in patients with chronic renal failure receiving haemodialysis. Journal of Renal Care. 36 (4), 203-211 (2010).
- Mazumder, M. K., Giri, A., Kumar, S., Borah, A. A highly reproducible mice model of chronic kidney disease: Evidences of behavioural abnormalities and blood-brain barrier disruption. Life Sciences. 161, 27-36 (2016).
- Jia, T., et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice. BioMed Central Nephrology. 14, 116 (2013).
- Kieswich, J. E., et al. A novel model of reno-cardiac syndrome in the C57BL/ 6 mouse strain. BioMed Central Nephrology. 19 (1), 346 (2018).
- Abassi, Z., Goltsman, I., Karram, T., Winaver, J., Hoffman, A. Aortocaval fistula in rat: a unique model of volume-overload congestive heart failure and cardiac hypertrophy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 729497 (2011).
- Brower, G. L., Levick, S. P., Janicki, J. S. Inhibition of matrix metalloproteinase activity by ACE inhibitors prevents left ventricular remodeling in a rat model of heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3057-3064 (2007).
- Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).
