Summary
このプロトコルは、マウスの総腸骨動静脈瘻作成の外科的ステップを詳述しています。我々は、血液透析アクセス関連の四肢の病態生理を研究するためにこのモデルを開発しました。
Abstract
慢性腎臓病は公衆衛生上の大きな問題であり、血液透析などの慢性腎代替療法を必要とする末期腎疾患(ESRD)の有病率は増加し続けています。自家動静脈瘻(AVF)の配置は、ESRD患者にとって依然として主要な血管アクセスオプションです。残念ながら、血液透析患者の約半数は、微妙な感覚異常からデジタル壊疽に至るまで、透析アクセス関連手機能障害(ARHD)を経験しています。特に、ARHDの原因となる根本的な生物学的要因は十分に理解されておらず、ARHDの予防/治療のためのメカニズムを解明したり、新しい治療法を開発したりするための適切な動物モデルは存在しません。ここでは、左総腸骨動脈と静脈の間にAVFを作成し、四肢の病態生理の評価を容易にする新しいマウスモデルについて説明します。顕微手術には、血管の隔離、縦方向の静脈切開、動静脈吻合の作成、および静脈再建が含まれます。偽の手術には、AVFの作成を除くすべての重要なステップが含まれます。腸骨AVF配置は、中枢血行動態、末梢虚血、および後肢神経運動能力の障害に臨床的に関連する変化をもたらします。.この新しい前臨床AVFモデルは、血液透析患者によって報告された一般的な神経運動摂動を再現する有用なプラットフォームを提供し、研究者がARHD病態生理学のメカニズムを調査し、潜在的な治療法をテストすることを可能にします。
Introduction
機能的な血管アクセスの確立と保存は、血液透析による腎代替療法を受けている末期腎疾患(ESRD)患者にとって依然として重要な主要な目標です1。腎機能が不十分になった後、老廃物の除去、電解質の正常化、体液バランスの維持には血液透析治療の繰り返しが必要であり、長期生存に必要です2。したがって、血管アクセスはESRD患者の「ライフライン」であり、自家動静脈瘻(AVF)の配置は、このコホート3の間で依然として好ましい透析アクセスオプションです。しかし、血液透析患者の約30%〜60%は、臨床的にアクセス関連手機能障害(ARHD)として定義される一連の手の障害を経験しています。ARHDの症状は、脱力感や協調障害から単麻痺や指神経疽までさまざまであり、AVFの作成後早期に発生するか、瘻孔の成熟とともに徐々に発症する可能性があります。さらに、ARHDはESRD治療スケジュールを複雑にし、生活の質の低下、心血管疾患のリスクの高さ、および死亡率の増加に関連しています2,3,4。
AVF作成後の血行力学的変化によって誘発される血管リモデリングを研究するために、いくつかの動物モデルが開発されています5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。腸骨または大腿骨AVF 16,17,18,19,20の大型動物モデル、および頸動脈頸静脈吻合または腎下大動脈-下大静脈瘻形成のいずれかを使用するげっ歯類モデルは、AVFの成熟と開存性の前述の側面を調べるために十分に確立されています21.たとえば、静脈高血圧、管腔径の増加、および静脈壁の厚さの増加は、AVF成熟の成功の兆候ですが、流れの変化のない中膜の実質的な線維症および内膜過形成または血栓の発達は、AVF障害を特徴付けることがよくあります6,15。しかし、大型動物モデルはマウスモデルの実験的柔軟性またはトランスジェニック能力を欠いているが、現在のげっ歯類モデルは、解剖学的位置および/または関連する四肢病理の欠如のいずれかのためにARHDの調査を容易に促進しない。実際、関連する臨床表現型を再現する確立された前臨床動物モデルがないため、症候性ARHD患者の数が徐々に増加しているにもかかわらず、病態生物学的メカニズムを解明し、新しい治療戦略を開発するための研究の進歩は停滞したままです。したがって、この研究の主な目的は、ARHDのユニークなマウスモデルを導入し、AVF顕微手術の手順とAVF関連の病態生理学の特性評価を提供することです。
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Protocol
すべての手順は、フロリダ大学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)およびマルコムランドール退役軍人医療センターによって承認されました。
注:若年成人(8〜10週齢)のオスC57BL / 6Jマウスは、ジャクソン研究所から購入し、光(12時間の光:12時間の暗サイクル)、温度(22°C±1°C)、および湿度(50%±10%)の制御された動物施設に収容しました。ケージ(幅:18 cm x 長さ:29 cm x 高さ:12.5 cm)ごとに5匹のマウスを住まわせ、巣作り材料、餌、水を自由に利用できるようにしました。標準的なチョウで7日間の生息地順応の後、マウスは食餌移行段階として7日間カゼインベースの飼料に変更されました。その後、マウスに、カゼインベースの固形飼料に0.2%〜0.15%のアデニン補給を2〜3週間与えて、前述のようにAVF手術の前に腎機能障害(CKD)を誘発した22、23、24。対照マウスは、アデニン補給なしでカゼインベースの飼料を受けた(対照)。対照食およびCKD食は、術後回復期間(POD)を通して維持された。
1.術前測定
- ベースライン/術前の転帰測定値、大動脈腸血管の直径、および血行動態フローパラメータを評価します 前述のように、二重超音波画像とレーザードップラーを介した後肢灌流を使用します25。
- 片側後肢の握力とトレッドミルの歩行評価を決定して、前述のようにベースラインの後肢機能を確立します25,26。
- 前述のように、FITCイヌリンクリアランスおよび/または血清血中尿素窒素(BUN)レベルを介して糸球体濾過率(GFR)を測定することにより、腎機能を評価します22,24,27。
2.手術の準備
- 次の手術器具と消耗品を準備します(材料表):ホットビーズ滅菌器、目の潤滑剤、ペントリマー、アルコール準備、クロルヘキシジンワイプ、極細グレーフェ鉗子、滅菌0.9%生理食塩水、29 Gおよび31 G針注射器、2 x 2不織布スポンジ、中型シングルエンドラウンド(SC-9)および小型ダブルエンドハード、シャープ、先のとがった(SC-4)綿棒、低温焼灼、 ストレートデュモン鉗子、45°角度デュモン鉗子、ストレートバンナスプリングはさみ、湾曲したバンナスプリングはさみ、丸ハンドルニードルホルダー、複数のサイズの縫合糸(4-0シルク、5-0PGA、6-0シルク、10-0ナイロン縫合糸)、ヘパリン、吸収性ゼラチンスポンジ、ストレートニードルホルダー、ブプレノルフィン。
注:腹部と脚の四肢固定輪ゴムと開創器は手作りでした。 - オートクレーブを使用して、120〜125°Cで30分間蒸気滅菌し、その後30分間乾燥させてから手術準備を滅菌します。70%エタノールクレンジングとそれに続く各動物手術の間にホットビーズ滅菌(240-270°Cで3分間)を利用します。
- 29〜31 Gの針注射器を使用して、滅菌した0.9%生理食塩水、ヘパリン化生理食塩水(100 IU / mL)、およびブプレノルフィン(0.01 mg / mL)を準備します。.
3.麻酔とポジショニング
- 誘導チャンバー(0.8 mL /分、2.5%イソフルラン)でマウス麻酔を開始します。マウスが適切に麻酔されたら、滅菌ドレープで覆われた手術ステーションの仰臥位にマウスを置きます。シェービングおよび位置決めステップ中にイソフルラン濃度を~1.2%までテーパリングします。
- 手術中の乾燥から目を保護するために、眼の潤滑剤を塗布します。
- ペントリマーを使用して、手術用の腹毛と術後の灌流測定用の脚毛を剃ります。手術野から髪を取り除きます。
- 輪ゴムと鋲で上肢と下肢を固定し、つま先のつまみ反射を監視して麻酔の深さを確認し、必要に応じて麻酔を滴定します。麻酔レベルを調整するために、外科的処置を通して3〜5分ごとに呼吸パターン評価を実行します。
4. 手術対象領域の探索
- 剃った皮膚領域を数回洗浄し、アルコール調製とクロルヘキシジンワイプを円形に交互に繰り返して、手術野を消毒します。
- 胸骨縁の下端から恥骨結合まで正中線開腹術を行います。恥骨脂肪パッドを解剖して、より広い手術野を取得します。
- 腹腔切開術を開き、開創器で腹膜の内容物にアクセスし、中程度のシングルエンドの丸い綿棒を使用して小腸と大腸を骨抜きにします。生理食塩水に浸した不織布スポンジで腸を覆います。
- 後腹膜血管系の適切な露出が得られたら、残りの腸、腎臓、尿管を生理食塩水に浸した小さな不織布スポンジで覆います。必要に応じて、中程度のシングルエンドの丸い綿棒で膀胱ドームをそっと絞って、膨張した膀胱を排出します。
- まっすぐなデュモン鉗子と小さな両端の硬くて鋭い先のとがった綿棒を使用して、左腸骨分岐部のレベルまで伸びる大動脈分岐部まで約1 cm近位の血管周囲筋膜と脂肪組織を注意深く解剖します。
注:左腸骨動脈と静脈は、動静脈構造をまとめて隔離しながら、互いに接着したままになります。このステップは、AVFの作成を容易にするのに十分な船舶動員を提供します。 - 左総腸骨静脈に由来する、または左総腸骨静脈と収束する小さな静脈枝に遭遇した場合は、必要に応じて6-0シルク縫合糸の有無にかかわらず低温焼灼を使用して結紮します。
- 角度の付いた鉗子の先端を左の総腸骨血管束の下に通し、ゆっくりと複数回広げて、下にある後腹膜筋組織から血管を動員します(図1A)。
5.総腸骨動静脈瘻合の作成
- 孤立した左総腸骨動静脈束の周りに2本の4-0シルク縫合糸を配置し、血管束への結紮糸(クロスクランプなど)として使用します。各4-0シルクタイで単一の結び目を作成し、近位から遠位まで順番に適用します。
- シルクタイクロスクランプが血管長~2mmを分離するのに十分な距離に配置され、縫合糸結紮糸を順次適用すると左腸骨静脈充血が促進されることを確認してください。
- 4-0絹縫合糸をハンドルとして使用し、左腸骨動静脈血管束を時計回りに回転させ、位置を微調整して静脈を動脈の前方に一時的に配置します(図1B)。
- まっすぐなVannasスプリングハサミで縦方向の静脈切開(~1 mm)を行い、0.9%生理食塩水で静脈内腔から残留血液を穏やかに洗い流します(図1C)。高圧生理食塩水フラッシュは静脈破壊を引き起こす可能性があるため、このステップでは注意してください。
注:静脈紅潮後に腸骨動脈に残る赤色の領域は、次のステップの視覚的なウィンドウを提供します。 - 静脈の後壁に10-0ナイロン縫合糸を埋め込みます。
注:腸骨静脈のこの部分は、腸骨動脈の前壁にすぐに配置されている必要があり、壁は自然に接着しています。縫合糸は両方の壁を通過し、縫合糸を単一の結び目で縛る必要があります(図1D)。腸骨動脈の停滞した血液に由来する少量の出血は、針が両方の壁を通過すると現れることに注意してください。このステップ中に管腔内出血が続く場合は、絹縫合クロスクランプが緩すぎる可能性があり、さらに締め付ける必要があります。 - 埋入した縫合糸の端をつかみ、穏やかな張力下に置いて、腸骨動脈の後壁から前壁を移動させます。湾曲したバンナススプリングハサミを使用して~1.0 mm x 0.3 mmの楕円形の切開を行い、腸骨動脈と静脈の両方の接着壁を取り除きます。
注:動静脈瘻は、この共通のチャネルが確立されると作成されます。静脈切開による後腸骨静脈/前腸骨動脈壁切開が行われるため、このステップ中に静脈の側壁を損傷する可能性があります。この合併症は瘻孔の直径を大幅に減少させ、血栓の発生につながる可能性があるため、注意が必要です。. - 露出した動脈内腔の残留血液を0.9%生理食塩水とヘパリン化生理食塩水(100 IU / mL)で穏やかに洗い流します28 (図1E)。
- AVFの作成後、中断された方法で2つまたは3つの10-0ナイロン縫合糸を使用して最初の前壁切開術を修復します(図1F)。
- 血管束を元の解剖学的方向に復元し、生理食塩水に浸した吸収性ゼラチンスポンジの小片を修復された静脈切開術の隣に置き、止血を促進します。
- 4-0シングルノットクロスクランプ結紮糸を遠位から近位まで順番に緩めます。各縫合糸を緩めながら、過度の出血がないか静脈切開部位を注意深く監視します。
- 修復が適切に止血していない場合は、クロスクランプを再適用し、出血部位に別の10-0ナイロン縫合糸を配置します。止血が保証されている場合は、縫合糸を取り除き、次に吸収性ゼラチンスポンジを取り外します。
- 血管束を小さな両端の硬くて鋭利な先のとがった綿棒でそっとこすり、血流の回復をさらに促進します。腸骨静脈に入り、後肢から戻ってくる暗色静脈血と混合する拍動性の真っ赤な酸素化血液を可視化し、手術の技術的成功を確認します。
- ヘパリン化生理食塩水(0.2 IU / g)15 をIVCに注入して全身抗凝固を行い、AVF開存性の結果を改善します。.
注:このステップは血管再建後に発生しますが(血管クロスクランプの前にヘパリン化が起こるヒトアナログとは対照的に)、手順のこの段階で実行すると、術中出血の減少とAVF開存性の改善が観察されました。筋膜および/または脂肪で覆われた部位への注射は、穿刺部位からの出血を防ぐために好ましい。 - ヘパリン化生理食塩水の注射後の止血について手術部位を再検査する。出血の懸念がない場合は、正中線筋膜を閉じてから、吸収性の5-0PGA縫合糸で皮膚切開部をランニング方式で閉じます。
- 偽の操作の場合は、AVF フォーメーションを除く手順のすべての重要な手順に従います。左腸骨動静脈束の近位端に4-0シルク結紮糸の単一の結び目を適用し、クランプ時間をAVF手術に合わせます(たとえば、マイクロ外科医の習熟度に応じて~20分)。
6.術後のケアと測定
- 開腹閉鎖後、レーザードップラーイメージングを使用して両側脛骨筋の前筋と腹側足の血液灌流を測定します。
注:片側灌流欠損は、動脈流の瘻孔転換(「盗む」)を確認します。 - 0.1 mg / kgのブプレノルフィンを皮下投与し、マウスを巣のある吸収性の高い柔らかい寝具を備えた予熱したマウスケージに戻します。.
- 麻酔が切れるまで、予熱したマウスケージでマウスを回復させますが、これはマウスが歩行可能でインタラクティブであるときに明らかになります(~2時間)。回復中は、マウスに保湿された柔らかい食事に簡単にアクセスできるようにします。
- ブプレノルフィンおよび/または皮下生理食塩水和を12時間ごとに最大48時間投与し、術後5日間毎日モニタリングを実行します。.悪化状態または過度の組織壊死を有する動物を安楽死させ、修正虚血スコア≥229として分類する。
- シリアルデュプレックス超音波評価を使用して、術後の瘻孔開存性を評価します。瘻孔血栓症のマウスは、実験の目的がAVF成熟障害を特徴付けることでない限り、その後の分析から除外されます。
- 回復期間中の局所血行動態、握力、歩行パフォーマンスなどの他の術後転帰測定値を決定します。瘻孔および筋肉組織を収集して、犠牲中の実験終了時に組織形態を評価する25,27。
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Representative Results
アデニン食に曝露された動物は、カゼインベースの固形飼料を投与された動物と比較して、糸球体濾過率が低下し(対照:441.3±54.2μL/分対CKD:165.1±118.3μL /分、p < 0.05)、血清血中尿素窒素レベルが上昇した(対照:20.39 ± 4.2 μL/分 対 CKD:38.20 ± 10.65 μL/min、p < 0.05)カゼインベースの固形物を投与された動物と比較して、動静脈瘻手術前の腎不全の存在が確認されました。
AVF開存性の検証
技術的成功の術中の視覚的確認は瘻孔の開存性の最初の識別ですが、研究期間を通じて開存性または生理学的成熟を完全に保証するものではありません。術後の開存性の結果(すなわち、成功または失敗)は、以前に実証したように、二重超音波画像と組織学的検査の両方を使用して決定されました25。 図2 は、動静脈瘻合の代表的なBモード、脈波ドップラー、カラードップラー超音波画像及び形態切片をそれぞれ示す。特許瘻孔は、乱流血行動態を伴うカラードップラー分析、および瘻孔部位でのスペクトル拡大で直接視覚化されます。流入血管と流出血管の適応的な流れを介した変化も、AVFの開存性を間接的に確認します。具体的には、大動脈はピーク収縮期および拡張末期速度の上昇を示し、IVCはピーク速度の上昇とともに拍動を発達させ、大動脈とIVCの両方で血管拡張が明らかになります(図2A)。対照的に、瘻孔の失敗または血栓は、流入または流出の測定値にほとんど変化がなく、左腸骨血管系内の乱流またはスペクトルの広がりもありません。通常、血栓症による瘻孔不全は左腸骨動脈を部分的または完全に閉塞し、脈波ドップラー分析では流れが最小限またはまったくないとして視覚化されます。 図2B は、外科的作成から2週間後のAVFの連続組織学切片を示す。切片の厚さは5μmで、マッソンのトリクロームで染色されています。動脈および静脈の外科的吻合は明らかであり、明確な静脈動脈形成が存在する(静脈壁肥厚および新内膜過形成を伴う線維症)。術後3日目に超音波イメージングを行い、早期AVF障害のマウスを除外し、その後、研究期間を通じて連続した非侵襲的測定値を取得しました。形態学的評価は、屠殺時の期間特異的血管リモデリングの詳細を提供し、超音波所見を確認するために使用されました。AVF開存率は当初約50%(術後死亡の20%-30%、瘻孔不全の20%-30%)25 と予想されますが、手術の成功率は練習と習熟度の向上によって大幅に向上します(~5%-10%の失敗率)。
腸骨動静脈瘻形成後の病態生理学的特徴
血行動態の変化:AVF血行動態と遠位後肢灌流の特徴を定量化して、アクセス関連の四肢の病態生理学を文脈化する必要があります。手術後のBモードおよび脈波ドップラー超音波測定では、流入および流出血管拡張(IVC:POD3で1.4倍、POD13およびIRAで1.6倍:POD3で1.4倍、POD13で1.7倍、p<0.05)およびピーク収縮期速度の増加(IVCピーク収縮期速度:POD3で5.5倍、POD13およびIRAピーク収縮期速度で4.9倍): POD3で2.8倍、POD13で3.7倍、P<0.05)を偽動物と比較した(図3A-D)。また,術後に片側後肢虚血を認め,瘻孔の遠位に盗みを介在する動脈低灌流を認めた.左足灌流欠損は対側肢の~20%、前脛骨筋の灌流欠損は~60%と予想されている。マウスは、研究期間を通じてこれらの欠損を部分的に回復しました(図3E、F)。
後肢機能障害:AVFの作成後に同側肢障害が予想され、軽度(ほとんどの場合)から重度の(少数の症例)脚の足を引きずり、数日間続くことがあります。未解決の後肢麻痺および/または足の壊死は、正常範囲外の瘻孔サイズによって引き起こされる重度の虚血性傷害を示している可能性があります。後肢の神経運動機能は、回復期間を通じて順次実施された握力テストとトレッドミル歩行パターン分析によって定量化されました。予想される片側握力は術後4日目の対側肢の~50%であり、徐々に回復します。AVFマウスはまた、歩行評価中にトレッドミル速度を低下させる必要があります(<20 cm / min)(図3G、H)。
図1:動静脈瘻吻合の顕微手術ステップ 。 (A)正中線開腹術および左腸骨動脈/静脈隔離を含む手術対象領域の露出。(B)4-0縫合糸結紮糸(例えば、一時的な血管クランプとして使用される)の近位部位および遠位部位の左総腸骨動静脈束。(C)腸骨静脈の前壁の縦方向の静脈切開術。(D)腸骨静脈の後壁および腸骨動脈の前壁を介して10-0を埋め込む縫合糸。(E)内挿膨満を伴う楕円形切開。(F)画像Cからの最初の縦静脈切開術は、中断された10-0縫合糸を使用して修復されます。スケールバー= 1 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:動静脈瘻開存性の検証 。 (A)AVF開存性のドップラー超音波測定。特許瘻の特徴には、Bモードイメージングでの動脈および静脈拡張、左腸骨血管系のカラードップラー解析での乱流、左腸骨血管の脈波ドップラー評価での拍動スペクトルの広がり、腎下大動脈のピーク収縮期および拡張末期速度の増加、およびピーク収縮期速度の増加に伴うIVC内の拍動が含まれます。腸骨血管内の流れの減少または欠如は、AVF障害/血栓症を示唆しています。二重超音波技術は、形態学的および生理学的データの両方を提供する。速度測定値はミリメートル/秒です。(B)瘻孔作成から14日後のAVF吻合の形態学的評価。画像はマッソンのトリクロームで染色されました。シリアルセクション顕微鏡検査には、近位(左端)から遠位(右端)の総腸骨動静脈解剖学的解剖学的構造への解剖学的変化があります。血栓および/または過度の新内膜過形成による血管系の閉塞は、AVF障害を確認します。画像は10倍の倍率です。A:総腸骨動脈、V:総腸骨静脈。スケールバー= 500μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:AVF形成前後の病態生理学的特徴。(A)腎下大動脈径、(B)腎下大動脈ピーク収縮期速度、(C)下大静脈径、および(D)下大静脈ピーク収縮期速度における超音波画像の定量化術前および術後3日目および13日目。手術前および2週間の回復期間中の(E)前脛骨筋および(F)腹側足の局所血液灌流(レーザードップラー)測定。神経運動機能検査には、(G)握力と(H)術前および術後のトレッドミルテストが含まれていました。データは二元配置ANOVAを用いて分析され、必要に応じてテューキーの事後検定が実施された。値は SD. *p ±< 0.05、**p < 0.01、****p < 0.001、****p < 0.0001 対 Control_Sham #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001, ####p < 0.0001 対 CKD_Sham. N = 6-10 /グループ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
AVF作成後のARHDの血液透析患者の有病率は増加し続けています30,31。実際、痛み、脱力感、感覚異常、および/または可動域の減少などの未解決の症状性合併症4,32,33は、患者の健康に悪影響を及ぼし4、32、33、34、35、36、高品質の反復血液透析治療を受ける能力を脅かす可能性があります。持続的な血液透析アクセスの達成はESRD患者にとって最優先事項ですが、ARHDに苦しむ被験者にとって、これらの潜在的に衰弱させる症状は、患者中心の結果を改善するために対処する必要があります。本研究では、ARHD研究の分野における重要な前臨床マイルストーンとして、腸骨AVFのマウスモデルを生成するための詳細な外科的処置を導入し、AVF関連肢の病態生理学の検査を容易にします。大動脈腸骨およびIVC血行動態の予想される変化に加えて、腸骨AVFの作成は、肉眼的運動障害を伴う末梢組織虚血を含む四肢機能障害の臨床的に関連する特徴を生み出しました。
各顕微手術のステップは、血行動態と四肢の病状の両方に実質的な変化を引き起こす可能性のある潜在的な血管外傷を避けるために、絶妙な注意を払って実行する必要があります。結紮中、4-0シルクタイノットは、目的の手術部位を通る血流を防ぐのに十分なだけ締める必要があります。縫合糸結紮の結び目の張力が過剰になると、血管壁が損傷する可能性があり、望ましくない出血を引き起こし、内膜過形成の一因となり、AVF開存性が低下する可能性があります。特に、静脈切開術の修復は外科的処置の最も重要なステップの1つです。静脈壁の咬傷が大きすぎると血管狭窄を引き起こし、最終的には血栓症を引き起こす可能性がありますが、修復が浅すぎると出血を伴う裂開を引き起こす可能性があります。同様に、静脈切開修復縫合糸の間隔が離れすぎている場合にも出血が発生する可能性があります。私たちの経験では、縫合糸間の~0.025-0.03 mmの間隔は止血修復を作成するのに十分です。
手術手技の再現性に加えて、疾患または症状特異的な動物モデルを利用することは、現在の研究の最も重要な貢献の1つです。本研究では、動物はAVF手術の前後に0.2%〜0.15%のアデニン食に曝露され、腎機能障害とESRD患者に類似した尿毒症環境を確立しました。外科的CKDモデル(例えば、5/6腎摘出術)と比較して、アデニン食モデルには、死亡率が非常に低く、観察者間の変動が少ないなど、いくつかの利点があります27,37。特に、重症度および病態生理学的結果は、アデニン食の濃度および/または持続時間に基づいて変更することができる38,39。食事誘発性腎症と相まって、本明細書に記載される現在の動物モデルは、研究者が尿毒症がARHDに影響を及ぼす病態生理学的メカニズムを研究するための段階を設定することができる。さらに、疾患のさらなる動物モデルを外科モデルに追加して、糖尿病、高血圧、または冠状動脈疾患などの非常に蔓延している併存疾患の影響を試験することができる。
提示された腸骨AVF手順は、ARHDの血液透析患者に関連する四肢の病態生理学の重要な側面を再現可能にモデル化していますが、議論に値するいくつかの制限と合併症があります。第一に、この手順を受けたマウスは真の「血管アクセス」を持たない。したがって、実験的な血液透析治療を含む実験は不可能です。第二に、四肢機能障害の重症度は動静脈コミュニケーションのサイズに影響されるため、再現性のある結果を得るには、一貫したAVFの作成が重要です。例えば、大きなAVFの作成は、重度の後肢虚血を引き起こす可能性があり、それは四肢壊死に至る可能性がある。手順を開始する新しいマイクロ外科医は、作成されたAVFの組織学的分析を使用して、一貫性のためにサイズを分析することをお勧めします。他のAVFモデルに供されたマウスでは、肥大およびおそらく心不全を含む心臓リモデリングが報告されている40、41、42。現在のモデルにおける心臓の変化は厳密に評価されていませんが、偽の動物と比較して心肥大を定性的に観察しています。さらに、マウスの心血管系が腸骨AVFの形成と成熟にどのように適応するかを評価するには、将来の長期解析が必要です。もう1つの懸念は、若いC57BL6マウスが虚血性刺激に対して動脈形成および血管新生応答を生成し、側副血管形成につながる能力を持っていることです。したがって、マウスは、より堅牢な側副ネットワークが形成されると、AVF四肢の病理から完全に回復する可能性があります。ただし、側副次成長と遠位血管系の変化をマッピングするには、今後の研究が必要です。
今日まで、AVFの配置によって手の機能が損なわれたり悪化したりする根本的なメカニズムは完全には理解されていません。マウスゲノムが十分に特徴付けられており、マウスの遺伝子操作のための幅広いトランスジェニックモデルにすぐにアクセスできることを考えると、この腸骨AVF手術モデルは、ARHDを取り巻く生物医学的発見のための有用なツールを提供します。中枢血管系手術を採用する他のげっ歯類AVFモデル(例:大動脈騎骨瘻モデル)、または大腿骨または腸骨AVFの大型動物モデルと比較して、アデニン食餌誘発性尿毒症の有無にかかわらず、現在の腸骨AVFモデルは、血液透析ARHDに関連する根底にある生物学的メカニズムを調査し、新しい標的療法を生成するために使用できる堅牢な実験プラットフォームを研究者に提供します。さらに、前臨床モデルは一般に、ARHDの治療/予防に利用できる医薬品療法の早期開発と検証に重要であると考えられています。特に、このモデルは、AVFのサイズと腎機能障害の重症度の両方の変化にも適しており、研究者は病状の重症度を注意深く調整することができます。結論として、このユニークな前臨床マウスAVFモデルは、AVF配置後の手の障害を軽減することを目的とした前臨床治療薬開発を促進するための実用的なプラットフォームとして役立つ可能性があります。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
腸骨AVFモデルの開発と外科トレーニングに関する技術サポートを提供してくれたフロリダ大学血管外科および血管内治療部門のGuanyi Lu博士と、ライブ顕微手術画像を取得するための技術サポートを提供してくれたフロリダ大学応用生理学および運動学部のRaviKumarに心から感謝します。
この研究は、国立衛生研究所および国立心臓、肺、血液、研究所番号R01-HL148697(STSへ)、および米国心臓協会の助成金番号POST903198(KKへ)からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
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