Summary
Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Schritte der Bildung einer musinen gemeinen iliakalen arteriovenösen Fistel. Wir haben dieses Modell entwickelt, um die Pathophysiologie der Gliedmaßen zu untersuchen, die mit dem Zugang zur Hämodialyse zusammenhängt.
Abstract
Chronische Nierenerkrankungen sind ein großes Problem für die öffentliche Gesundheit, und die Prävalenz der terminalen Niereninsuffizienz (ESRD), die chronische Nierenersatztherapien wie die Hämodialyse erfordert, nimmt weiter zu. Die Platzierung einer autogenen arteriovenösen Fistel (AVF) ist nach wie vor eine primäre Gefäßzugangsoption für ESRD-Patienten. Leider leidet etwa die Hälfte der Hämodialysepatienten an einer dialysezugangsbedingten Handfunktionsstörung (ARHD), die von subtilen Parästhesien bis hin zu digitalem Wundbrand reicht. Insbesondere die zugrunde liegenden biologischen Treiber, die für die ARHD verantwortlich sind, sind nur unzureichend verstanden und es gibt kein adäquates Tiermodell, um die Mechanismen aufzuklären und/oder neue Therapeutika für die Prävention/Behandlung der ARHD zu entwickeln. In dieser Arbeit beschreiben wir ein neues Mausmodell, in dem eine AVF zwischen der linken A. iliaca communis und der Vena communis gebildet wird, was die Beurteilung der Pathophysiologie der Gliedmaßen erleichtert. Die Mikrochirurgie umfasst die Isolierung von Gefäßen, die longitudinale Venotomie, die Schaffung einer arteriovenösen Anastomose und die venöse Rekonstruktion. Scheinoperationen umfassen alle kritischen Schritte mit Ausnahme der AVF-Erstellung. Die Platzierung der Becken-AVF führt zu klinisch relevanten Veränderungen der zentralen Hämodynamik, der peripheren Ischämie und einer Beeinträchtigung der neuromotorischen Leistungsfähigkeit der Hintergliedmaßen. Dieses neuartige präklinische AVF-Modell bietet eine nützliche Plattform, die häufige neuromotorische Störungen rekapituliert, die von Hämodialysepatienten berichtet werden, und ermöglicht es Forschern, die Mechanismen der ARHD-Pathophysiologie zu untersuchen und potenzielle Therapeutika zu testen.
Introduction
Die Etablierung und Erhaltung eines funktionellen Gefäßzugangs ist nach wie vor ein wichtiges primäres Ziel für Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz (ESRD), die eine Nierenersatztherapie mittels Hämodialyseerhalten 1. Wiederholte Hämodialysebehandlungen sind notwendig, um Abfallprodukte zu entfernen, Elektrolyte zu normalisieren und den Flüssigkeitshaushalt aufrechtzuerhalten, sobald die Nierenfunktion unzureichend wird, und sind daher für das langfristige Überleben notwendig2. Daher stellt der Gefäßzugang eine "Lebensader" für Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz dar, und die Platzierung autogener arteriovenöser Fisteln (AVF) ist nach wie vor eine bevorzugte Dialysezugangsoption in dieser Kohorte3. Etwa 30 % bis 60 % der Hämodialysepatienten leiden jedoch an einem Spektrum von Handbehinderungen, die klinisch als zugangsbedingte Handfunktionsstörung (ARHD) definiert sind. Die Symptome der ARHD können von Schwäche und Koordinationsstörungen bis hin zu Monoplegie und digitalem Gangrän reichen, die früh nach der AVF-Bildung auftreten oder sich allmählich mit der Fistelreifung entwickeln können. Darüber hinaus erschwert die ARHD den Behandlungsplan der chronischen Niereninsuffizienz, der mit einer schlechten Lebensqualität, einem hohen Risiko für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und einer erhöhten Mortalität verbunden ist 2,3,4.
Es wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um den Gefäßumbau zu untersuchen, der durch hämodynamische Veränderungen nach der Bildung von AVF induziert wird 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Großtiermodelle mit iliakaler oder femoraler AVF 16,17,18,19,20 und Nagetiermodelle, die entweder eine Anastomose der Halsschlagader-Jugularvene oder eine infrarenale Aorta-inferiore Vena-cava-Fistelbildung verwenden, sind gut etabliert, um die oben genannten Aspekte der AVF-Reifung und -Durchgängigkeit zu untersuchen21 . Zum Beispiel sind venöse Hypertonie, ein größerer luminaler Durchmesser und eine erhöhte Venenwanddicke Signaturen für eine erfolgreiche AVF-Reifung, während eine erhebliche Fibrose des Mediums und eine Intimalhyperplasie oder Thrombusentwicklung ohne Flussveränderungen häufig AVF-Versagen charakterisieren 6,15. Großtiermodellen fehlt jedoch die experimentelle Flexibilität oder die transgenen Fähigkeiten von Mausmodellen, während aktuelle Nagetiermodelle die Untersuchung der ARHD aufgrund der anatomischen Lage und/oder des Fehlens einer assoziierten Gliedmaßenpathologie nicht ohne weiteres erleichtern. Aufgrund des Fehlens eines etablierten präklinischen Tiermodells, das den relevanten klinischen Phänotyp rekapituliert, stagnieren die Forschungsfortschritte zur Aufklärung der pathobiologischen Mechanismen und zur Entwicklung neuer therapeutischer Strategien, trotz eines fortschreitenden Anstiegs der Zahl symptomatischer ARHD-Patienten. Das primäre Ziel dieser Studie ist es daher, ein einzigartiges Mausmodell der ARHD vorzustellen, das prozedurale Schritte der AVF-Mikrochirurgie und die Charakterisierung der AVF-bezogenen Pathophysiologie ermöglicht.
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Protocol
Alle Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Florida und dem Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center genehmigt.
HINWEIS: Junge erwachsene (8-10 Wochen alt) männliche C57BL/6J-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory gekauft und in einer Licht- (12 h Licht: 12 h Dunkelzyklus), Temperatur- (22 °C ± 1 °C) und Luftfeuchtigkeit (50 % ± 10 %) kontrollierten Tierhaltung untergebracht. Pro Käfig (B:18 cm x L:29 cm x H:12,5 cm) durften fünf Mäuse wohnen, wobei Nistmaterial, Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt wurden. Nach 7-tägiger Habitatakklimatisierung mit Standardfutter wurden die Mäuse als Ernährungsumstellungsphase für 7 Tage auf eine kaseinbasierte Futternahrung umgestellt. Danach wurden die Mäuse 2-3 Wochen lang mit einer Supplementierung mit 0,2 % bis 0,15 % Adenin gefüttert, um vor der AVF-Operation eine Nierenfunktionsstörung (CKD) zu induzieren, wie zuvor beschrieben22,23,24. Kontrollmäuse erhielten eine Casein-basierte Chow-Diät ohne Adenin-Supplementierung (Kontrolle). Die Kontroll- und CKD-Diäten wurden während der gesamten postoperativen Erholungsphase (POD) beibehalten.
1. Präoperative Messungen
- Beurteilung der Ausgangs-/präoperativen Ergebnismessungen, der Gefäßdurchmesser der Aorten und der hämodynamischen Flussparameter mittels Duplex-Ultraschallbildgebung und der Perfusion der Hintergliedmaßen mittels Laser-Doppler wie zuvor beschrieben25.
- Bestimmen Sie die einseitige Griffkraft der Hintergliedmaßen und die Gangbeurteilung des Laufbands, um die Grundfunktion der Hintergliedmaßen wie zuvor beschriebenfestzustellen 25,26.
- Beurteilung der Nierenfunktion durch Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) über die FITC-Inulin-Clearance und/oder den Harnstoffstickstoffspiegel (BUN) im Serum, wie zuvor beschrieben22,24,27.
2. Chirurgische Vorbereitung
- Bereiten Sie die folgenden chirurgischen Instrumente und Verbrauchsmaterialien vor (Materialtabelle): einen Heißperlensterilisator, Augengleitmittel, einen Pen-Trimmer, Alkoholpräparate, Chlorhexidin-Tücher, extrafeine Graefe-Pinzette, sterilisierte 0,9%ige Kochsalzlösung, 29-G- und 31-G-Nadelspritzen, 2 x 2 Vliesschwämme, mittelgroße einseitige runde (SC-9) und kleine doppelseitige harte, scharfe, spitze (SC-4) Wattestäbchen, Niedertemperatur-Kauterisation, gerade Dumont-Pinzette, 45° abgewinkelte Dumont-Pinzette, gerade Vannas-Federschere, gebogene Vannas-Federschere, Nadelhalter mit rundem Griff, Nähte in verschiedenen Größen (4-0 Seide, 5-0 PGA, 6-0 Seide und 10-0 Nylonnähte), Heparin, resorbierbarer Gelatineschwamm, ein gerader Nadelhalter und Buprenorphin.
HINWEIS: Gummibänder zur Befestigung der Extremitäten und Retraktoren für Bauch und Beine wurden von Hand gefertigt. - Sterilisieren Sie die chirurgischen Präparate im Autoklaven mit Dampfsterilisation bei 120-125 °C für 30 Minuten und trocknen Sie sie anschließend 30 Minuten lang vor der Operation. Verwenden Sie eine 70%ige Ethanolreinigung, gefolgt von einer Heißperlensterilisation (240-270 °C für 3 Minuten) zwischen jeder Tieroperation.
- Bereiten Sie sterilisierte 0,9%ige Kochsalzlösung, heparinisierte Kochsalzlösung (100 I.E./ml) und Buprenorphin (0,01 mg/ml) mit 29-31 g Nadelspritzen vor.
3. Anästhesie und Lagerung
- Einleitung der Mausanästhesie in der Induktionskammer (0,8 ml/min, 2,5 % Isofluran). Sobald die Maus ausreichend betäubt ist, legen Sie die Maus in Rückenlage auf die Operationsstation, die mit einem sterilen Tuch bedeckt ist. Reduzieren Sie die Isoflurankonzentration während der Rasier- und Positionierungsschritte auf ~1,2 %.
- Tragen Sie das Augengleitmittel auf, um die Augen während der Operation vor dem Austrocknen zu schützen.
- Rasieren Sie mit einem Pen-Trimmer die Bauchhaare für die Operation und die Beinhaare für postoperative Perfusionsmessungen. Entfernen Sie die Haare vom Operationsfeld.
- Fixieren Sie die oberen und unteren Extremitäten mit Gummibändern und Reißzwecken, überprüfen Sie die Anästhesietiefe, indem Sie den Zehenquetschreflex überwachen, und titrieren Sie die Anästhesie nach Bedarf. Führen Sie die Bewertung des Atemmusters während des gesamten chirurgischen Eingriffs alle 3-5 Minuten durch, um den Anästhesiegrad zu kalibrieren.
4. Erkundung des chirurgischen Zielgebietes
- Reinigen Sie den rasierten Hautbereich mehrmals und wechseln Sie zwischen Alkoholzubereitung und Chlorhexidin-Tüchern in einem kreisförmigen Muster, um das Operationsfeld zu desinfizieren.
- Führen Sie eine Laparotomie in der Mittellinie vom unteren Rand des Sternumrandes bis zur Schambeinfuge durch. Präparieren Sie das Schambeinpolster, um ein breiteres Operationsfeld zu erhalten.
- Öffnen Sie die Zöliotomie, um mit Retraktoren auf den Peritonealinhalt zuzugreifen, und weiden Sie den Dünn- und Dickdarm mit mittelgroßen, einseitigen runden Wattestäbchen aus. Decken Sie den Darm mit einem mit Kochsalzlösung getränkten Vliesschwamm ab.
- Sobald eine ausreichende Freilegung der retroperitonealen Gefäße erreicht ist, bedecken Sie den verbleibenden Darm, die Nieren und die Harnleiter mit kleinen, mit Kochsalzlösung getränkten Vliesschwämmen. Entleeren Sie eine aufgeblähte Blase, indem Sie die Blasenkuppel bei Bedarf vorsichtig mit mittelgroßen, einseitigen runden Wattestäbchen zusammendrücken.
- Präparieren Sie die perivaskulären Faszien und das Fettgewebe vorsichtig von ca. 1 cm proximal zur Aortenbifurkation bis zur Höhe der linken Beckengabelung mit einer geraden Dumont-Pinzette und kleinen doppelseitigen harten, scharfen, spitzen Wattestäbchen.
HINWEIS: Die linke Beckenarterie und die Vene bleiben aneinander haften, während die arteriovenösen Strukturen en masse isoliert werden. Dieser Schritt sorgt für eine ausreichende Mobilisierung der Gefäße, um die AVF-Erstellung zu erleichtern. - Wenn kleine venöse Äste gefunden werden, die von der linken Vena iliaca communis ausgehen oder mit ihr konvergieren, ligieren Sie sie je nach Bedarf mit einer Niedertemperaturkauter mit oder ohne 6-0-Seidennaht.
- Führen Sie die Spitze der abgewinkelten Zange unter das linke Beckengefäßbündel und spreizen Sie sie sanft mehrmals, um die Gefäße aus der darunter liegenden retroperitonealen Muskulatur zu mobilisieren (Abbildung 1A).
5. Bildung einer gemeinsamen iliakalen arteriovenösen Fistelanastomose
- Legen Sie zwei 4-0-Seidennähte um das isolierte linke gemeinsame arteriovenöse Bündel und verwenden Sie sie als Ligaturen (z. B. Kreuzklemmen) zum Leitbündel. Bilden Sie mit jeder 4-0-Seidenkrawatte einen einzelnen Knoten und bringen Sie sie nacheinander von proximal nach distal an.
- Stellen Sie sicher, dass die Kreuzklemmen der Seidenbinde ausreichend weit voneinander entfernt sind, um ~ 2 mm Gefäßlänge zu isolieren, und die sequentielle Anwendung der Nahtligaturen wird eine Schwellung der linken Beckenvene auslösen.
- Drehen Sie mit den 4-0-Seidennahtsträngen als Griffe das linke arteriovenöse Leitbündel des Beckens im Uhrzeigersinn und passen Sie die Position an, um die Vene vorübergehend vor der Arterie zu lokalisieren (Abbildung 1B).
- Führen Sie eine longitudinale Venotomie (~1 mm) mit einer geraden Vannas-Federschere durch und spülen Sie das Restblut vorsichtig mit 0,9%iger Kochsalzlösung aus dem venösen Lumen aus (Abbildung 1C). Seien Sie bei diesem Schritt vorsichtig, da eine Hochdruckspülung mit Kochsalzlösung zu einer Venenstörung führen kann.
HINWEIS: Der rot gefärbte Bereich, der nach der venösen Spülung in der Beckenarterie verbleibt, bietet ein Sichtfenster für den folgenden Schritt. - Legen Sie eine 10-0 Nylonnaht durch die hintere Wand der Vene.
HINWEIS: Dieser Teil der Beckenvene sollte sich in unmittelbarer Apposition zur Vorderwand der Beckenarterie befinden, und die Wände sind von Natur aus adhärent. Das Nahtmaterial sollte durch beide Wände gehen und das Nahtmaterial mit einem einzigen Knoten festbinden (Abbildung 1D). Beachten Sie, dass eine kleine Blutung, die aus dem stagnierenden Blut in der Beckenarterie stammt, auftritt, sobald die Nadel beide Wände durchdrungen hat. Wenn die intraluminale Blutung während dieses Schritts anhält, sind die Kreuzklemmen der Seidennaht möglicherweise zu locker und müssen weiter angezogen werden. - Fassen Sie die eingeklemmten Nahtenden und setzen Sie sie unter sanfte Spannung, um die Vorderwand von der Hinterwand der Arteria iliaca zu verdrängen. Machen Sie einen ~1,0 mm x 0,3 mm großen elliptischen Schnitt mit einer gebogenen Vannas-Federschere und entfernen Sie die adhärenten Wände sowohl der Beckenarterie als auch der Vene.
HINWEIS: Die arteriovenöse Fistel entsteht dabei, sobald dieser gemeinsame Kanal etabliert ist. Es ist möglich, die Seitenwände der Vene während dieses Schritts zu verletzen, da die Inzision der hinteren Beckenvene/der vorderen Beckenarterie durch Venotomie-Exposition durchgeführt wird. Es ist darauf zu achten, dass diese Komplikation vermieden wird, da dies den Fisteldurchmesser erheblich verringern und zur Entwicklung eines Thrombus führen kann. - Spülen Sie das Restblut des freiliegenden arteriellen Lumens vorsichtig mit 0,9 % Kochsalzlösung und heparinisierter Kochsalzlösung (100 I.E./ml)28 aus (Abbildung 1E).
- Nach der Erstellung des AVF wird die anfängliche Vorderwandvenotomie mit zwei oder drei 10-0-Nylonnähten unterbrochen repariert (Abbildung 1F).
- Stellen Sie das Leitbündel wieder in seine ursprüngliche anatomische Ausrichtung zurück und legen Sie ein kleines Stück mit Kochsalzlösung getränkter, resorbierbarer Gelatineschwamm neben die reparierte Gift, um die Blutstillung zu erleichtern.
- Lösen Sie die 4-0 Einzelknoten-Kreuzklemmligaturen nacheinander von distal nach proximal. Überwachen Sie die Venotomiestelle genau auf übermäßige Blutungen, während Sie jede Naht lockern.
- Wenn die Reparatur nicht ausreichend blutstillend ist, bringen Sie die Kreuzklemmen erneut an und platzieren Sie eine weitere 10-0-Nylonnaht an der Blutungsstelle. Wenn die Blutstillung gesichert ist, entfernen Sie die Fäden und dann den resorbierbaren Gelatineschwamm.
- Reiben Sie das Leitbündel sanft mit kleinen, doppelseitigen, harten, scharfen, spitzen Wattestäbchen ein, die die Wiederherstellung der Durchblutung weiter erleichtern. Bestätigen Sie den technischen Erfolg der Operation durch die Visualisierung von pulsierendem, hellrotem, sauerstoffreichem Blut, das in die Beckenvene eintritt und sich mit dunklem venösem Blut vermischt, das aus der Hintergliedmaße zurückkehrt.
- Injizieren Sie heparinisierte Kochsalzlösung (0,2 I.E./g)15 in den IVC zur systemischen Antikoagulation, um die Ergebnisse der AVF-Durchgängigkeit zu verbessern.
HINWEIS: Obwohl dieser Schritt nach der Gefäßrekonstruktion erfolgt (im Gegensatz zum humanen Analogon, bei dem die Heparinisierung vor der Gefäßkreuzklemmung erfolgt), wurde in diesem Stadium des Verfahrens eine Verringerung der intraoperativen Blutung und eine verbesserte AVF-Durchgängigkeit beobachtet. Eine Injektion in eine Stelle, die von Faszien und/oder Fett bedeckt ist, ist vorzuziehen, um Blutungen aus der Einstichstelle zu verhindern. - Untersuchen Sie die Operationsstelle nach der Injektion von heparinisierter Kochsalzlösung erneut auf Hämostase. Wenn es keine Blutungsprobleme gibt, schließen Sie die Mittellinienfaszie und dann den Hautschnitt mit resorbierbaren 5-0 PGA-Nähten in laufender Manier.
- Befolgen Sie bei Scheinoperationen alle wichtigen Schritte des Verfahrens mit Ausnahme der AVF-Bildung. Legen Sie einen einzelnen Knoten der 4-0-Seidenligatur am proximalen Ende des linken arteriovenösen Beckenbündels an und passen Sie die Klemmzeiten an AVF-Operationen an (z. B. ~20 Minuten, abhängig von den Kenntnissen des Mikrochirurgen).
6. Nachsorge und Messung
- Nach dem Verschluss der Laparotomie wird die Blutdurchblutung der beidseitigen vorderen Muskulatur des Tibialis und der ventralen Pfoten mittels Laser-Doppler-Bildgebung gemessen.
HINWEIS: Einseitige Perfusionsdefizite bestätigen die Fistelumleitung des arteriellen Flusses ("Steal"). - Verabreichen Sie 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan und bringen Sie die Maus in einen vorgewärmten Mäusekäfig mit hoch resorbierbarer, weicher Einstreu mit Nest zurück.
- Lassen Sie die Maus sich im vorgewärmten Mauskäfig erholen, bis die Anästhesie nachlässt, was offensichtlich ist, wenn die Maus gehfähig und interaktiv ist (~2 h). Geben Sie der Maus während der Genesung einfachen Zugang zu einer feuchtigkeitsspendenden, weichen Ernährung.
- Verabreichen Sie Buprenorphin und/oder subkutane Kochsalzlösung alle 12 h bis zu 48 h und führen Sie eine tägliche Überwachung für 5 Tage postoperativ durch. Euthanasieren Sie Tiere mit einem sich verschlechternden Zustand oder einer übermäßigen Gewebenekrose, die als modifizierter Ischämie-Score klassifiziert wird ≥229.
- Verwenden Sie serielle Duplex-Ultraschalluntersuchungen, um die Durchgängigkeit der Fistel postoperativ zu beurteilen. Mäuse mit Fistelthrombose werden von nachfolgenden Analysen ausgeschlossen, es sei denn, der Zweck der Experimente besteht darin, das Versagen der AVF-Reifung zu charakterisieren.
- Bestimmen Sie andere postoperative Ergebnismessungen wie lokale Hämodynamik, Griffkraft und Gangleistung während der Genesungszeit. Sammeln Sie Fisteln und Muskelgewebe, um die Histomorphologie am Ende des Experiments während des Opfers zu beurteilen25,27.
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Representative Results
Tiere, die einer Adenin-Diät ausgesetzt waren, wiesen im Vergleich zu den Tieren, die eine Adenin-Diät erhielten, reduzierte glomeruläre Filtrationsraten (Kontrolle: 441,3 ± 54,2 μl/min vs. CKD: 165,1 ± 118,3 μl/min, p < 0,05) und erhöhte Harnstoffstickstoffspiegel im Serumblut (Kontrolle: 20,39 ± 4,2 μl/min vs. CKD: 38,20 ± 10,65 μl/min, p < 0,05) auf, was das Vorliegen einer Niereninsuffizienz vor einer arteriovenösen Fisteloperation bestätigt.
Validierung der AVF-Durchgängigkeit
Obwohl die intraoperative visuelle Bestätigung des technischen Erfolgs die initiale Feststellung der Fisteldurchgängigkeit ist, garantiert sie nicht die vollständige Durchgängigkeit oder physiologische Reifung während des gesamten Studienzeitraums. Die postoperativen Durchgängigkeitsergebnisse (d. h. Erfolg oder Misserfolg) wurden sowohl mittels Duplex-Ultraschallbildgebung als auch mit histologischer Untersuchung bestimmt, wie wir bereits gezeigt haben25. Abbildung 2 zeigt die repräsentativen B-Mode-, Pulswellen-Doppler- und Farbdoppler-Ultraschallbilder bzw. morphologischen Schnitte einer arteriovenösen Fistelanastomose. Eine Patentfistel wird direkt in der Farbdoppleranalyse mit turbulenter Hämodynamik sowie spektraler Verbreiterung an der Stelle der Fistel visualisiert. Adaptive strömungsvermittelte Veränderungen der Zu- und Abflussgefäße bestätigen indirekt auch die AVF-Durchgängigkeit. Insbesondere hat die Aorta eine erhöhte systolische und enddiastolische Spitzengeschwindigkeit, die IVC entwickelt eine Pulsatilität mit erhöhter Spitzengeschwindigkeit und eine Gefäßdilatation sowohl in der Aorta als auch in der IVC ist offensichtlich (Abbildung 2A). Im Gegensatz dazu weist eine fehlgeschlagene oder thrombosierte Fistel fast keine Veränderungen in den Ein- oder Ausflussmessungen und keine Turbulenzen oder spektrale Verbreiterungen innerhalb des linken Beckengefäßes auf. In der Regel wird bei einem Fistelversagen aufgrund einer Thrombose die linke Beckenarterie teilweise oder vollständig verschlossen, was in der Pulswellen-Doppler-Analyse als minimaler bis gar kein Fluss dargestellt wird. Abbildung 2B zeigt serielle histologische Schnitte einer AVF 2 Wochen nach der chirurgischen Erstellung. Die Schnitte sind 5 μm dick und mit Masson-Trichrom gefärbt. Eine chirurgische Anastomose der Arterie und Vene ist offensichtlich, und es liegt eine ausgeprägte venöse Arterialisierung vor (venöse Wandverdickung und Fibrose mit neointimaler Hyperplasie). Am postoperativen Tag 3 wurde eine Ultraschallbildgebung durchgeführt, um Mäuse mit frühem AVF-Versagen auszuschließen, und dann wurden während des gesamten Studienzeitraums serielle, nicht-invasive Messungen durchgeführt. Die morphologische Beurteilung liefert periodenspezifische Details zum Gefäßumbau zum Zeitpunkt der Tötung und wurde verwendet, um die Ultraschallbefunde zu bestätigen. Eine AVF-Durchgängigkeitsrate von ca. 50 % (20 %-30 % des postoperativen Todes und 20 %-30 % des Fistelversagens)25 ist zunächst zu erwarten, aber die chirurgische Erfolgsrate verbessert sich mit zunehmender Übung und zunehmender Kompetenz signifikant (~5%-10 % Misserfolgsrate).
Pathophysiologische Merkmale nach Bildung einer arteriovenösen Fistel des Beckens
Hämodynamische Veränderung: Die Charakteristika der AVF-Hämodynamik und der distalen Perfusion der Hintergliedmaßen müssen quantifiziert werden, um die zugangsbezogene Pathophysiologie der Extremitäten zu kontextualisieren. B-Mode- und Pulswellen-Doppler-Ultraschallmessungen nach der Operation zeigten eine Ein- und Ausflussgefäßdilatation (IVC: 1,4-fach an POD3 und 1,6-fach an POD13 und IRA: 1,4-fach an POD3 und 1,7-fach an POD13, p < 0,05) und eine Zunahme der maximalen systolischen Geschwindigkeit (IVC-Spitzengeschwindigkeit systolischer Geschwindigkeit: 5,5-fach an POD3 und 4,9-fach an POD13 und IRA-Spitzengeschwindigkeit systolischer Geschwindigkeit: 2,8-fach an POD3 und 3,7-fach an POD13, P < 0,05) im Vergleich zu den Scheintieren (Abbildung 3A-D). Weiterhin zeigte sich postoperativ eine einseitige Ischämie der Hintergliedmaßen, was eine steal-vermittelte arterielle Hypoperfusion distal der Fistel bestätigt. Es wird erwartet, dass die Perfusionsdefizite der linken Pfote ~20% der kontralateralen Extremität betragen, und das Perfusionsdefizit des vorderen Musculus tibialis ~60%. Die Mäuse erholten sich teilweise von diesen Defiziten während des gesamten Untersuchungszeitraums (Abbildung 3E,F).
Dysfunktion der Hintergliedmaßen: Nach der Entstehung einer AVF ist eine ipsilaterale Behinderung der Gliedmaßen zu erwarten, die mit leichtem (in den meisten Fällen) bis schwerem (wenige Fälle) Hinken der Beine einhergeht, das mehrere Tage andauern kann. Eine ungeklärte Lähmung der Hintergliedmaßen und/oder eine Pfotennekrose können auf einen schweren ischämischen Insult hinweisen, der durch eine Fistelgröße außerhalb des normalen Bereichs verursacht wird. Die neuromotorische Funktion der Hintergliedmaßen wurde durch Griffkrafttests und die Analyse von Laufbandgangmustern quantifiziert, die während der gesamten Erholungsphase sequenziell durchgeführt wurden. Die erwartete einseitige Griffkraft beträgt ~50% der kontralateralen Extremität am 4. postoperativen Tag mit allmählicher Genesung. AVF-Mäuse benötigen auch reduzierte Laufbandgeschwindigkeiten während der Gangbeurteilung (<20 cm/min) (Abbildung 3G,H).
Abbildung 1: Mikrochirurgische Schritte der arteriovenösen Fistelanastomose . (A) Exposition des chirurgischen Zielbereichs, einschließlich Laparotomie in der Mittellinie und Isolierung der linken Beckenarterie/Vene. (B) 4-0-Nahtligaturen (z. B. als provisorische Gefäßklemmen) am linken gemeinsamen arteriovenösen Beckenbündel an proximalen und distalen Stellen. (C) Eine longitudinale Venotomie an der Vorderwand der Beckenvene. (D) 10-0 Schuppennaht über die Hinterwand der Beckenvene und die Vorderwand der Beckenarterie. (E) Elliptischer Schnitt mit der Schuppendehnung. (F) Die initiale longitudinale Venotomie aus Bild C wird mit einer unterbrochenen 10-0-Naht repariert. Maßstabsleiste = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Validierung der Durchgängigkeit der arteriovenösen Fistel . (A) Doppler-Ultraschall-Bestimmung der AVF-Durchgängigkeit. Zu den Merkmalen einer Patentfistel gehören die arterielle und venöse Dilatation bei der B-Bildgebung, der turbulente Fluss bei der Farbdoppleranalyse des linken Beckengefäßes, die pulsatile spektrale Verbreiterung bei der Pulswellen-Doppler-Beurteilung der linken Beckengefäße, die Erhöhung der systolischen und enddiastolischen Spitzengeschwindigkeit der infrarenalen Aorta und die Pulsatilität innerhalb der IVC mit Zunahme der maximalen systolischen Geschwindigkeit. Ein verminderter oder fehlender Fluss in den Beckengefäßen deutet auf ein AVF-Versagen/eine Thrombose hin. Die Duplex-Ultraschalltechnik liefert sowohl morphologische als auch physiologische Daten. Geschwindigkeitsmessungen erfolgen in Millimetern pro Sekunde. (B) Morphologische Beurteilung der AVF-Anastomose 14 Tage nach Fistelbildung. Die Bilder wurden mit Massons Trichrom befleckt. In der Serienschnittmikroskopie gibt es anatomische Veränderungen von der proximalen (linkes Ende) bis zur distalen (rechtes Ende) gemeinsamen arteriovenösen Anatomie des Beckens. Ein Verschluss des Gefäßsystems aufgrund eines Gerinnsels und/oder einer übermäßigen neointimalen Hyperplasie bestätigt ein AVF-Versagen. Die Bilder haben eine 10-fache Vergrößerung. A: Arteria iliaca communis, V: Vena iliaca communis. Maßstabsbalken = 500 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Pathophysiologische Merkmale vor und nach der AVF-Bildung. Quantifizierung der Ultraschallbildgebung in (A) infrarenalem Aortendurchmesser, (B) infrarenaler Aortenpeak-systolischer Geschwindigkeit, (C) unterem Vena-cava-Durchmesser und (D) unterer Vena-cava-Peak-systolischer Geschwindigkeit präoperativ und an postoperativen Tagen 3 und 13. Messung der lokalen Blutperfusion (Laserdoppler) an (E) Tibialis anterior und (F) ventraler Pfote vor der Operation und während der gesamten 2-wöchigen Erholungsphase. Die neuromotorischen Funktionstests umfassten (G) Griffkraft und (H) Laufbandtest prä- und postoperativ. Die Daten wurden mit einer zweifachen ANOVA analysiert, und gegebenenfalls wurde der Post-hoc-Test von Tukey durchgeführt. Die Werte sind Mittelwerte ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs. Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ####p < 0,0001 vs. CKD_Sham. N = 6-10/Gruppe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die Prävalenz von Hämodialysepatienten mit ARHD nach AVF-Bildung ist weiter gestiegen30,31. In der Tat können sich ungelöste symptomatische Komplikationen 4,32,33 wie Schmerzen, Schwäche, Parästhesien und/oder eingeschränkter Bewegungsumfang negativ auf das Wohlbefinden der Patientenauswirken 4,32,33,34,35,36 und ihre Fähigkeit bedrohen, eine qualitativ hochwertige repetitive Hämodialysebehandlung zu erhalten. Obwohl das Erreichen eines dauerhaften Zugangs zur Hämodialyse für ESRD-Patienten oberste Priorität hat, müssen diese potenziell schwächenden Symptome für Patienten, die an ARHD leiden, angegangen werden, um die patientenzentrierten Ergebnisse zu verbessern. In der vorliegenden Arbeit stellen wir als wichtigen präklinischen Meilenstein auf dem Gebiet der ARHD-Forschung ein detailliertes chirurgisches Verfahren vor, um ein Mausmodell der iliakalen AVF zu generieren, das die Untersuchung der AVF-assoziierten Pathophysiologie der Extremitäten erleichtert. Zusätzlich zu den erwarteten Veränderungen der aorto-iliakalen und IVC-Hämodynamik führte die Bildung von iliakalen AVF zu klinisch relevanten Merkmalen einer Dysfunktion der Gliedmaßen, einschließlich einer peripheren Gewebeischämie mit grobmotorischer Beeinträchtigung.
Jeder mikrochirurgische Schritt sollte mit größter Sorgfalt durchgeführt werden, um ein potenzielles Gefäßtrauma zu vermeiden, das zu erheblichen Veränderungen sowohl der Hämodynamik als auch der Pathologie der Gliedmaßen führen kann. Während der Ligatur sollte der 4-0-Seidenknoten nur so fest angezogen werden, dass der Blutfluss durch die zu untersuchende Operationsstelle verhindert wird. Eine übermäßige Spannung des Nahtligaturknotens kann die Gefäßwand verletzen, was zu unerwünschten Blutungen führen und zu einer Intimahyperplasie beitragen kann, was zu einer verminderten AVF-Durchgängigkeit führt. Insbesondere die Venotomie-Reparatur ist einer der wichtigsten Schritte des chirurgischen Eingriffs. Ein zu großer Biss in der Venenwand kann zu einer Gefäßstenose und schließlich zu einer Thrombose führen, während eine zu flache Reparatur zu einer Dehiszenz mit Blutung führen kann. In ähnlicher Weise kann es auch zu Blutungen kommen, wenn die Nähte für die Venotomiereparatur zu weit voneinander entfernt sind. Unserer Erfahrung nach reicht ein Intervall von ~0,025-0,03 mm zwischen den Nähten aus, um eine hämostatische Reparatur zu erstellen.
Neben der Reproduzierbarkeit der Operationstechnik ist die Verwendung eines krankheits- oder symptomspezifischen Tiermodells einer der wichtigsten Beiträge der aktuellen Arbeit. In der vorliegenden Studie wurden die Tiere 2-3 Wochen vor und nach der AVF-Operation einer 0,2%-0,15%igen Adenindiät ausgesetzt, um eine Nierenfunktionsstörung und ein urämisches Milieu analog zu ESRD-Patienten festzustellen. Im Vergleich zu chirurgischen CKD-Modellen (z. B. 5/6-Nephrektomie) hat ein Adenin-Diätmodell mehrere Vorteile, darunter sehr niedrige Mortalitätsraten und eine geringere Variation zwischen den Beobachtern27,37. Insbesondere der Schweregrad und die pathophysiologischen Konsequenzen können je nach Konzentration und/oder Dauer der Adenin-Diät modifiziert werden38,39. In Verbindung mit der ernährungsinduzierten Nephropathie kann das hier beschriebene aktuelle Tiermodell die Voraussetzungen für Forscher schaffen, um die pathophysiologischen Mechanismen zu untersuchen, durch die Urämie die ARHD beeinflusst. Darüber hinaus können dem chirurgischen Modell zusätzliche Tiermodelle der Krankheit hinzugefügt werden, um den Einfluss von weit verbreiteten komorbiden Erkrankungen wie Diabetes, Bluthochdruck oder koronarer Herzkrankheit zu testen.
Obwohl das vorgestellte Becken-AVF-Verfahren reproduzierbar Schlüsselaspekte der Gliedmaßenpathophysiologie modelliert, die für Hämodialysepatienten mit ARHD relevant sind, gibt es einige Einschränkungen und Komplikationen, die es wert sind, diskutiert zu werden. Erstens haben Mäuse, die dieser Prozedur unterzogen werden, keinen echten "vaskulären Zugang"; Experimente mit experimentellen Hämodialysebehandlungen sind daher nicht möglich. Zweitens wird der Schweregrad der Gliedmaßenfunktionsstörung durch die Größe der arteriovenösen Kommunikation beeinflusst, so dass eine konsistente AVF-Erstellung für reproduzierbare Ergebnisse entscheidend ist. Zum Beispiel kann die Bildung einer großen AVF eine schwere Ischämie der Hintergliedmaßen hervorrufen, die in einer Nekrose der Gliedmaßen gipfeln kann. Neue Mikrochirurgen, die mit dem Eingriff beginnen, werden ermutigt, histologische Analysen der erstellten AVFs zu verwenden, um die Größe auf Konsistenz zu analysieren. Bei Mäusen, die anderen AVF-Modellen unterzogen wurden, wurde über einen kardialen Umbau, einschließlich Hypertrophie und möglicherweise Herzinsuffizienz, berichtet 40,41,42. Die kardialen Veränderungen im aktuellen Modell wurden nicht streng untersucht, obwohl wir eine kardiale Hypertrophie im Vergleich zu Scheintieren qualitativ beobachtet haben. Darüber hinaus sind zukünftige Langzeitanalysen erforderlich, um zu beurteilen, wie sich das murine Herz-Kreislauf-System an die Bildung und Reifung der Becken-AVF anpasst. Ein weiteres Problem ist, dass jüngere C57BL6-Mäuse in der Lage sind, Arteriogenese- und Angiogenese-Reaktionen auf ischämische Reize zu erzeugen, was zur Bildung von Kollateralgefäßen führt, wie die bescheidene Erholung der Laser-Doppler-Perfusion der Gliedmaßen in dieser Studie zeigt. Daher ist es möglich, dass sich Mäuse vollständig von der Pathologie der AVF-Gliedmaßen erholen, sobald sich robustere Kollateralnetzwerke gebildet haben. Zukünftige Studien sind jedoch erforderlich, um das kollaterale Wachstum und die Veränderungen der distalen Gefäße zu kartieren.
Bis heute sind die zugrunde liegenden Mechanismen, durch die die Handfunktion durch die AVF-Platzierung beeinträchtigt und/oder verschlimmert wird, nur unzureichend verstanden. Angesichts der Tatsache, dass das Mausgenom gut charakterisiert ist und es einen einfachen Zugang zu einer breiten Palette von transgenen Modellen für die Genmanipulation bei Mäusen gibt, bietet dieses chirurgische Modell der Becken-AVF ein nützliches Werkzeug für die biomedizinische Entdeckung von ARHD. Im Vergleich zu anderen AVF-Modellen von Nagetieren, die zentrale Gefäßchirurgie (z. B. Aorto-caval-Fistelmodell) verwenden, oder Großtiermodellen mit femoraler oder iliaker AVF, bietet das vorliegende iliakale AVF-Modell mit oder ohne Adenin-Diät-induzierte Urämie den Forschern eine robuste experimentelle Plattform, die verwendet werden kann, um die zugrunde liegenden biologischen Mechanismen im Zusammenhang mit der Hämodialyse ARHD zu untersuchen und neue zielgerichtete Therapien zu entwickeln. Darüber hinaus werden präklinische Modelle allgemein als entscheidend für die frühe Entwicklung und Validierung von pharmazeutischen Therapien angesehen, von denen derzeit keine zur Behandlung bzw. Vorbeugung von ARHD zur Verfügung stehen. Bemerkenswert ist, dass dieses Modell auch für Veränderungen sowohl in der Größe der AVF als auch in der Schwere der Nierenfunktionsstörung geeignet ist, was es den Forschern ermöglicht, den Schweregrad der Pathologie sorgfältig zu modulieren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses einzigartige präklinische Maus-AVF-Modell als praktische Plattform dienen kann, um die präklinische therapeutische Entwicklung zu erleichtern, die darauf abzielt, die Handbehinderung nach der AVF-Platzierung zu reduzieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken Dr. Guanyi Lu von der Abteilung für Gefäßchirurgie und endovaskuläre Therapie an der University of Florida für die technische Unterstützung bei der Entwicklung des Becken-AVF-Modells sowie für die chirurgische Ausbildung und Ravi Kumar von der Abteilung für Angewandte Physiologie und Kinesiologie an der University of Florida für die technische Unterstützung bei der Erstellung der mikrochirurgischen Live-Bilder.
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health und National Heart, Lung, and Blood, Institutsnummern R01-HL148697 (an S.T.S.) sowie der American Heart Association Grant-Nummer POST903198 (an K.K.) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
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