Summary
Detta protokoll beskriver de kirurgiska stegen i murina vanliga iliac arteriovenös fistel skapande. Vi utvecklade denna modell för att studera hemodialysåtkomstrelaterad patofysiologi i extremiteter.
Abstract
Kronisk njursjukdom är ett stort folkhälsoproblem, och förekomsten av njursjukdom i slutstadiet (ESRD) som kräver kroniska njurersättningsterapier som hemodialys fortsätter att öka. Autogen arteriovenös fistelplacering (AVF) är fortfarande ett primärt vaskulärt åtkomstalternativ för ESRD-patienter. Tyvärr upplever ungefär hälften av hemodialyspatienterna dialysåtkomstrelaterad handdysfunktion (ARHD), allt från subtil parestesi till digital gangren. I synnerhet är de underliggande biologiska drivkrafterna som är ansvariga för ARHD dåligt förstådda, och ingen adekvat djurmodell finns för att belysa mekanismerna och / eller utveckla nya terapier för förebyggande / behandling av ARHD. Här beskriver vi en ny musmodell där en AVF skapas mellan vänster gemensam höftartär och ven, vilket underlättar bedömningen av lempatofysiologi. Mikrokirurgi inkluderar kärlisolering, longitudinell venotomi, skapande av arteriovenös anastomos och venös rekonstruktion. Skenoperationer inkluderar alla kritiska steg förutom AVF-skapande. Iliac AVF-placering resulterar i kliniskt relevanta förändringar i central hemodynamik, perifer ischemi och försämringar i bakbenens neuromotoriska prestanda. Denna nya prekliniska AVF-modell ger en användbar plattform som rekapitulerar vanliga neuromotoriska störningar som rapporterats av hemodialyspatienter, vilket gör det möjligt för forskare att undersöka mekanismerna för ARHD-patofysiologi och testa potentiella terapier.
Introduction
Etablering och bevarande av funktionell vaskulär access förblir ett viktigt primärt mål för patienter med njursjukdom i slutstadiet (ESRD) som får njurersättningsterapi via hemodialys1. Upprepade hemodialysbehandlingar är nödvändiga för att avlägsna avfallsprodukter, normalisera elektrolyter och upprätthålla vätskebalansen när njurfunktionen blir otillräcklig och är därför nödvändiga för långsiktig överlevnad2. Därför utgör vaskulär åtkomst en "livlina" för patienter med ESRD, och autogen arteriovenös fistelplacering (AVF) är fortfarande ett föredraget dialysåtkomstalternativ bland denna kohort3. Cirka 30% -60% av hemodialyspatienterna upplever dock ett spektrum av handhandikapp, kliniskt definierat som åtkomstrelaterad handdysfunktion (ARHD). Symtomen på ARHD kan sträcka sig från svaghet och diskoordinering till monoplegi och digital gangren, som kan inträffa tidigt efter AVF-skapandet eller utvecklas gradvis med fistelmognad. Vidare komplicerar ARHD ESRD-behandlingsschemat, vilket är förknippat med dålig livskvalitet, hög risk för hjärt-kärlsjukdom och ökad dödlighet 2,3,4.
Flera djurmodeller har utvecklats för att studera vaskulär remodellering inducerad av hemodynamiska förändringar efter AVF-skapande 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Stora djurmodeller med iliac eller femoral AVF 16,17,18,19,20 och gnagarmodeller som använder antingen halspulsåder-jugular venanastomos eller infrarenal aorta-inferior vena cava fistelbildning är väl etablerade för att undersöka de ovan nämnda aspekterna av AVF-mognad och patency 21 . Till exempel är venös hypertoni, större luminaldiameter och ökad venväggtjocklek signaturer för framgångsrik AVF-mognad, medan betydande fibros av media och intim hyperplasi eller trombutveckling utan förändringar i flödet ofta kännetecknar AVF-fel 6,15. Stora djurmodeller saknar emellertid experimentell flexibilitet eller transgen kapacitet hos murina modeller, medan nuvarande gnagarmodeller inte lätt underlättar undersökningen av ARHD på grund av antingen den anatomiska platsen och / eller bristen på associerad lempatologi. På grund av bristen på en etablerad preklinisk djurmodell som rekapitulerar den relevanta kliniska fenotypen har forskningsframstegen för att belysa de patobiologiska mekanismerna och utveckla nya terapeutiska strategier förblivit stillastående, trots en progressiv ökning av antalet symtomatiska patienter med akut respiratorisk artrit. Därför är det primära syftet med denna studie att introducera en unik musmodell av ARHD, vilket ger procedursteg för AVF-mikrokirurgi och karakterisering av AVF-relaterad patofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Florida och Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.
OBS: Unga vuxna (8-10 veckor gamla) manliga C57BL / 6J-möss köptes från The Jackson Laboratory och inrymdes i en ljus (12 h ljus: 12 h mörk cykel), temperatur (22 ° C ± 1 ° C) och fuktighet (50% ± 10%) kontrollerad djuranläggning. Fem möss fick bo per bur (B: 18 cm x L: 29 cm x H: 12.5 cm) med bomaterial, mat och vatten som gjordes tillgängliga ad libitum. Efter 7 dagars habitatacklimatisering med standard chow ändrades mössen till en kaseinbaserad chow-diet i 7 dagar som en dietövergångsfas. Därefter matades möss med kaseinbaserad chow med 0,2% -0,15% adenintillskott i 2-3 veckor för att inducera njurdysfunktion (CKD) före AVF-operationen som tidigare beskrivits22,23,24. Kontrollmöss fick en kaseinbaserad chow-diet utan adenintillskott (kontroll). Kontroll- och CKD-dieterna bibehölls under hela den postoperativa återhämtningsperioden (POD).
1. Preoperativa mätningar
- Bedöma baslinje-/preoperativa resultatmätningar, aortoiliakakärldiametrar och hemodynamiska flödesparametrar med hjälp av duplex ultraljudsavbildning och bakbensperfusion via laserdoppler som tidigare beskrivits25.
- Bestäm den ensidiga bakbensgreppstyrkan och bedömningen av löpbandets gång för att fastställa baslinjens bakbensfunktion enligt beskrivningeni 25,26.
- Bedöm njurfunktionen genom att mäta glomerulär filtrationshastighet (GFR) via FITC-inulinclearance och/eller serumureakväve (BUN) i serum enligt tidigare beskrivet:22,24,27.
2. Kirurgisk förberedelse
- Förbered följande kirurgiska verktyg och tillbehör (materialförteckning): en varm pärlsterilisator, ögonsmörjmedel, en penna trimmer, alkohol preps, klorhexidin våtservetter, extra fina Graefe pincett, steriliserad 0,9% saltlösning, 29 G och 31 G nålsprutor, 2 x 2 non-woven svampar, medium enkeländad rund (SC-9) och liten dubbeländad hård, skarp, spetsig (SC-4) bomullspinne, lågtemperatur cautery, raka Dumontpincett, 45 ° vinklade Dumont-pincett, rak Vannas fjädersax, böjd Vannas fjädersax, runda hanterade nålhållare, flera storlekar av suturer (4-0 siden, 5-0 PGA, 6-0 siden och 10-0 nylonsuturer), heparin, absorberbar gelatinsvamp, en rak nålhållare och buprenorfin.
OBS: Extremitetsfästande gummiband och upprullningsdon för buken och benen var handgjorda. - Sterilisera kirurgiska förberedelser med autoklav med ångsterilisering vid 120-125 °C i 30 minuter följt av torkning i 30 minuter före operationen. Använd 70% etanolrengöring följt av sterilisering av varm pärla (240-270 ° C i 3 min) mellan varje djuroperation.
- Bered steriliserad 0,9% normal saltlösning, hepariniserad saltlösning (100 IE / ml) och buprenorfin (0,01 mg / ml) med 29-31 G nålsprutor.
3. Anestesi och positionering
- Initiera musbedövning i induktionskammaren (0,8 ml/min, 2,5% isofluran). När musen är tillräckligt bedövad, placera musen i ryggläge på operationsstationen täckt av ett sterilt draperi. Minska isoflurankoncentrationen ner till ~1,2% under raknings- och positioneringsstegen.
- Applicera ögonsmörjmedlet för att skydda ögonen från att torka under operationen.
- Använd en penntrimmer, raka bukhåret för operationen och benhåret för postoperativa perfusionsmätningar. Rensa håret från det kirurgiska fältet.
- Fixera de övre och nedre extremiteterna med gummiband och klibb, kontrollera anestesidjupet genom att övervaka tåklämningsreflexen och titrera anestesi vid behov. Utför utvärderingen av andningsmönstret var 3-5: e minut under hela det kirurgiska ingreppet för att kalibrera anestesinivån.
4. Utforskning av det kirurgiska målområdet
- Rengör det rakade hudområdet flera gånger, alternerande mellan alkoholberedning och klorhexidinservetter i ett cirkulärt mönster för att desinficera det kirurgiska fältet.
- Gör en midline laparotomi från den nedre kanten av sternalmarginalen till pubis symphysis. Dissekera ut pubis fettkudde för att få ett bredare operativt fält.
- Öppna celiotomi för att komma åt peritonealinnehållet med retraktorer och avlägsna de små och stora tarmarna med medelstora, runda bomullspinnar med en ände. Täck tarmarna med en saltlösningsindränkt fiberduk.
- När adekvat exponering av retroperitoneal vaskulatur erhålls, täck återstående tarm, njurar och urinledare med små saltlösningsindränkta non-woven svampar. Evakuera en utspänd blåsa genom att försiktigt klämma blåskupolen med medelstora, runda bomullspinnar med en ände efter behov.
- Dissekera försiktigt perivaskulär fascia och fettvävnad från ca 1 cm proximalt till aortabifurkationen som sträcker sig till nivån för vänster iliacbifurkation med raka Dumont-pincett och små dubbeländade hårda, skarpa, spetsiga bomullspinne.
OBS: Den vänstra höftartären och venen lämnas vidhäftande mot varandra medan de isolerar de arteriovenösa strukturerna i massor. Detta steg kommer att ge tillräcklig fartygsmobilisering för att underlätta skapandet av AVF. - Om några små venösa grenar påträffas som härrör från eller konvergerar med den vänstra vanliga iliacvenen, ligera dem med lågtemperaturkauteri med eller utan 6-0 silkesutur efter behov.
- För spetsen på de vinklade pincetterna under den vänstra gemensamma iliacvaskulära bunten och sprid försiktigt flera gånger för att mobilisera kärlen från den underliggande retroperitoneala muskulaturen (figur 1A).
5. Skapande av en vanlig iliac arteriovenös fistelanastomos
- Placera två 4-0 silkesuturer runt den isolerade vänstra gemensamma iliac arteriovenösa bunten och använd dem som ligaturer (t.ex. korsklämmor) till kärlbunten. Skapa en enda knut med varje 4-0 sidenslips och applicera dem sekventiellt från proximal till distal.
- Se till att silkesbandets tvärklämmor placeras tillräckligt långt ifrån varandra för att isolera ~ 2 mm kärllängd, och den sekventiella appliceringen av suturligaturerna kommer att fälla ut vänster iliac venmjölkstockning.
- Använd 4-0 silkesutursträngar som handtag, rotera den vänstra iliac arteriovenösa vaskulära bunten medurs och finjustera positionen för att tillfälligt lokalisera venen främre till artären (figur 1B).
- Gör en längsgående venotomi (~1 mm) med rak Vannas fjädersax och spola försiktigt ut kvarvarande blod från venlumen med 0,9% saltlösning (Figur 1C). Var försiktig under detta steg, eftersom en högtrycks saltlösning kan orsaka venös störning.
OBS: Området med röd färg som förblir i iliacartären efter venös spolning ger ett visuellt fönster för följande steg. - Placera en imbricating 10-0 nylonsutur genom venens bakre vägg.
OBS: Denna del av iliacvenen bör vara i omedelbar apposition till den främre väggen i iliacartären, och väggarna är naturligt vidhäftande. Suturen ska gå igenom båda väggarna och binda suturen med en enda knut (figur 1D). Observera att en liten mängd blödning, som härrör från stillastående blod i iliacartären, kommer att visas när nålen passerar genom båda väggarna. Om intraluminal blödning fortsätter under detta steg kan silksuturens tvärklämmor vara för lösa och behöva dras åt ytterligare. - Ta tag i de imbricated suturändarna och placera dem under mild spänning för att förskjuta den främre väggen från iliacartärens bakre vägg. Gör ett ~ 1,0 mm x 0,3 mm elliptiskt snitt med böjda Vannas fjädersax, ta bort de vidhäftande väggarna i både höftartären och venen.
OBS: Den arteriovenösa fisteln skapas därmed när denna gemensamma kanal har etablerats. Det är möjligt att skada venens sidoväggar under detta steg eftersom den bakre iliacvenen/främre iliacartärväggssnittet utförs genom venotomiexponering. Försiktighet bör iakttas för att undvika denna komplikation eftersom detta avsevärt kan minska fisteldiametern och leda till trombutveckling. - Spola försiktigt ut kvarvarande blod från det exponerade arteriella lumen med 0,9% saltlösning och hepariniserad saltlösning (100 IE / ml)28 (figur 1E).
- Efter skapandet av AVF, reparera den ursprungliga främre väggvenotomin med två eller tre 10-0 nylonsuturer på ett avbrutet sätt (figur 1F).
- Återställ kärlbunten till sin ursprungliga anatomiska orientering och placera en liten bit saltlösningsindränkt absorberbar gelatinsvamp intill den reparerade venotomi för att underlätta hemostas.
- Lossa 4-0 enkelknuts korsklämma ligaturer sekventiellt från distalt till proximalt. Övervaka venotomiplatsen noggrant för överdriven blödning medan du lossar varje sutur.
- Om reparationen inte är tillräckligt hemostatisk, applicera korsklämmorna igen och placera en annan 10-0 nylonsutur på blödningsstället. Om hemostas är säker, ta bort suturerna och sedan den absorberbara gelatinsvampen.
- Gnid försiktigt kärlbunten med små dubbeländade hårda, skarpa, spetsiga bomullspinne, vilket ytterligare underlättar återställandet av blodflödet. Bekräfta operationens tekniska framgång med hjälp av visualisering av pulserande, ljusrött syresatt blod som kommer in i iliacvenen och blandas med mörkt venöst blod som återvänder från bakbenet.
- Injicera hepariniserad saltlösning (0,2 IE/g)15 i IVC för systemisk antikoagulation för att förbättra AVF-patencyresultaten.
OBS: Även om detta steg inträffar efter vaskulär rekonstruktion (i motsats till den humana analogen där heparinisering sker före korsklämning av kärl), observerades en minskning av intraoperativ blödning och förbättrad AVF-patency när den utfördes i detta skede av proceduren. Injektion på ett ställe täckt av fascia och/eller fett är att föredra för att förhindra blödning från punkteringsstället. - Inspektera operationsområdet för hemostas efter injektion av hepariniserad saltlösning. Om det inte finns några blödningsproblem, stäng mittlinjen fascia och sedan hudsnittet med absorberbara 5-0 PGA-suturer på ett löpande sätt.
- För skenoperationer, följ alla viktiga steg i proceduren förutom AVF-bildning. Applicera en enda knut av 4-0 silkeligaturen vid den proximala änden av vänster iliac arteriovenös bunt och matcha klämtiderna till AVF-operationer (t.ex. ~ 20 min, beroende på mikrokirurgens skicklighet).
6. Postoperativ vård och mätning
- Efter laparotomistängning, mät blodperfusionen i de bilaterala tibialis, främre musklerna och ventrala tassarna med hjälp av laser Doppler-avbildning.
OBS: Ensidiga perfusionsunderskott kommer att bekräfta fistelavledning av arteriellt flöde ("stjäla"). - Administrera 0,1 mg/kg buprenorfin subkutant och för tillbaka musen till en förvärmd musbur med mycket absorberbar mjuk bädd med bo.
- Låt musen återhämta sig i den förvärmda musburen tills anestesin avtar, vilket kommer att vara uppenbart när musen är ambulatorisk och interaktiv (~ 2 h). Under återhämtning, ge musen enkel tillgång till en fuktad, mjuk diet.
- Administrera buprenorfin och/eller subkutan saltlösning var 12:e timme upp till 48:e timme och utför daglig övervakning i 5 dagar postoperativt. Avliva djur med försämrat tillstånd eller överdriven vävnadsnekros, klassificerad som en modifierad ischemipoäng ≥229.
- Använd seriella duplex ultraljudsbedömningar för att utvärdera fistelpatency postoperativt; möss med fisteltrombos utesluts från efterföljande analyser såvida inte syftet med experimenten är att karakterisera AVF-mognadssvikt.
- Bestäm andra postoperativa resultatmätningar såsom lokal hemodynamik, greppstyrka och gångprestanda under återhämtningsperioden. Samla fistel och muskelvävnader för att bedöma histomorfologi i slutet av experimentet under offret25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Djur som exponerats för en adenindiet har reducerade glomerulära filtreringshastigheter (kontroll: 441,3 ± 54,2 μl/min jämfört med CKD: 165,1 ± 118,3 μl/min, p < 0,05) och ökade serumnivåer av ureakväve i blodet (kontroll: 20,39 ± 4,2 μl/min jämfört med CKD: 38,20 ± 10,65 μl/min, p < 0,05) jämfört med de djur som fick kaseinbaserad chow, vilket bekräftar förekomsten av njurinsufficiens före arteriovenös fistelkirurgi.
Validering av AVF-patency
Även om intraoperativ visuell bekräftelse av teknisk framgång är den första identifieringen av fistelpatency, garanterar den inte helt patency eller fysiologisk mognad under hela studieperioden. Postoperativa patencyresultat (dvs. framgång eller misslyckande) bestämdes med hjälp av både duplex ultraljudsavbildning och histologisk undersökning, som vi tidigare har visat25. Figur 2 visar det representativa B-läget, pulsvågdoppler- och färgdopplerultraljudsbilder respektive morfologiska sektioner av en arteriovenös fistelanastomos. En patentfistel visualiseras direkt på färgdoppleranalys med turbulent hemodynamik, liksom spektralbreddning vid fistelns plats. Adaptiva flödesmedierade förändringar av inflödes- och utflödeskärlen bekräftar också indirekt AVF-patency. Specifikt har aortan förhöjd topp systolisk och slutdiastolisk hastighet, IVC utvecklar pulsatilitet med förhöjd topphastighet och kärlutvidgning i både aorta och IVC är uppenbar (figur 2A). Däremot har en misslyckad eller tromboserad fistel nästan inga förändringar i inflödes- eller utflödesmätningar och ingen turbulens eller spektral breddning inom vänster iliacavulatur. Vanligtvis blockerar fistelfel från trombos helt eller delvis den vänstra iliacartären, vilket visualiseras som minimalt eller inget flöde vid pulsvågdoppleranalys. Figur 2B visar seriella histologisektioner av en AVF 2 veckor efter kirurgisk skapande. Sektionerna är 5 μm tjocka och betsade med Massons trikrom. Kirurgisk anastomos av artären och venen är uppenbar, och distinkt venös arterialisering är närvarande (venös väggförtjockning och fibros med neointim hyperplasi). Ultraljudsavbildning utfördes på postoperativ dag 3 för att utesluta möss med tidigt AVF-misslyckande, och sedan erhölls seriella, icke-invasiva mätningar under hela studieperioden. Morfologisk bedömning ger periodspecifika vaskulära remodelleringsdetaljer vid tidpunkten för offret och användes för att bekräfta ultraljudsfynd. En AVF-patency på cirka 50% (20% -30% av postoperativ död och 20% -30% av fistelfel)25 kan förväntas initialt, men den kirurgiska framgångsgraden förbättras avsevärt (~ 5% -10% misslyckande) med övning och ökad skicklighet.
Patofysiologiska egenskaper efter bildning av iliac arteriovenös fistel
Hemodynamisk förändring: Egenskaper hos AVF-hemodynamik och distal bakbensperfusion måste kvantifieras för att kontextualisera åtkomstrelaterad lempatofysiologi. B-mode och pulsvåg Doppler ultraljudsmätningar efter operation avslöjade inflöde och utflödeskärlutvidgning (IVC: 1,4 gånger vid POD3 och 1,6 gånger vid POD13 och IRA: 1,4 gånger vid POD3 och 1,7 gånger vid POD13, p < 0,05) och ökningar i maximal systolisk hastighet (IVC topp systolisk hastighet: 5,5 gånger vid POD3 och 4,9 gånger vid POD13 och IRA topp systolisk hastighet: 2,8 gånger vid POD3 och 3,7 gånger vid POD13, P < 0,05) jämfört med skendjuren (figur 3A-D). Vidare var ensidig ischemi i bakbenen uppenbar postoperativt, vilket bekräftar stear-medierad arteriell hypoperfusion distal till fisteln. Vänster tassperfusionsunderskott förväntas vara ~ 20% av den kontralaterala extremiteten, och perfusionsunderskottet i tibialis främre muskel är ~ 60%. Möss återhämtade delvis dessa underskott under hela studieperioden (figur 3E,F).
Hindlimb dysfunktion: Ipsilateral lem funktionshinder förväntas efter AVF skapande, vilket innebär mild (de flesta fall) till svår (få fall) ben haltning som kan pågå i flera dagar. Olöst förlamning av bakbenen och/eller tassnekros kan tyda på en allvarlig ischemisk förolämpning orsakad av fistelstorlek utanför det normala intervallet. Bakbenets neuromotoriska funktion kvantifierades via grepphållfasthetstestning och löpbandets gångmönsteranalys, som utfördes sekventiellt under hela återhämtningsperioden. Förväntad ensidig greppstyrka är ~ 50% av den kontralaterala lemmen på postoperativ dag 4, med gradvis återhämtning. AVF-möss kräver också reducerade löpbandshastigheter under gångbedömning (<20 cm / min) (figur 3G, H).
Figur 1: Mikrokirurgiska steg av arteriovenös fistelanastomos . (A) Exponering av det kirurgiska målområdet, inklusive laparotomi i mittlinjen och isolering av vänster höftartär/ven. (B) 4-0 suturligaturer (t.ex. används som tillfälliga kärlklämmor) på vänster gemensamma iliac arteriovenösa bunt på proximala och distala platser. (C) En längsgående venotomi på höftbensvenens främre vägg. (D) 10-0 imbricerande sutur via iliacvenens bakre vägg och iliacartärens främre vägg. (E) Elliptiskt snitt med den imbricating distensionen. (F) Initial longitudinell venotomi från bild C repareras med en avbruten 10-0 sutur. Skalstång = 1 mm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Validering av arteriovenös fistelpatency . (A) Doppler ultraljudsbestämning av AVF-patency. Egenskaper hos en patentfistel inkluderar arteriell och venös utvidgning på B-lägesavbildning, turbulent flöde på färg Doppleranalys av vänster iliacvaskulatur, pulserande spektral breddning vid pulsvågdopplerbedömning av vänster iliackärl, ökningar av maximal systolisk och enddiastolisk hastighet hos infrarenal aorta och pulsatilitet inom IVC med ökningar av maximal systolisk hastighet. Minskat eller uteblivet flöde i iliackärlen tyder på AVF-fel/trombos. Duplexultraljudstekniken ger både morfologiska och fysiologiska data. Hastighetsmätningar är i millimeter per sekund. (B) Morfologisk bedömning av AVF-anastomos 14 dagar efter fistelbildning. Bilder färgades med Massons trikrom. Det finns anatomiska förändringar i seriell sektionsmikroskopi från proximal (vänster ände) till distal (höger ände) vanlig iliac arteriovenös anatomi. Ocklusion av kärlen på grund av blodpropp och/eller överdriven neointim hyperplasi bekräftar AVF-fel. Bilder är 10x förstoring. A: Vanlig iliacartär, V: Vanlig iliacven. Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Patofysiologiska egenskaper före och efter AVF-bildning. Kvantifiering av ultraljudsavbildning i (A) infrarenal aortadiameter, (B) infrarenal aorta topp systolisk hastighet, (C) sämre vena cava diameter och (D) sämre vena cava topp systolisk hastighet preoperativt och vid postoperativa dagar 3 och 13. Lokal blodperfusion (laserdoppler) mätning på (E) tibialis främre och (F) ventral tass före operation och under hela 2 veckors återhämtningsperiod. Neuromotorisk funktionstestning inkluderade (G) greppstyrka och (H) löpbandstest pre- och postoperativt. Data analyserades med hjälp av en tvåvägs ANOVA, och Tukeys post-hoc-test utfördes när det var lämpligt. Värden är medel ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 jämfört med Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, #### p < 0,0001 jämfört med CKD_Sham. N = 6-10/grupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prevalensen av hemodialyspatienter med ARHD efter AVF-skapande har fortsatt att öka30,31. Faktum är att olösta symtomatiska komplikationer 4,32,33 såsom smärta, svaghet, parestesi och / eller minskat rörelseomfång kan påverka patientens välbefinnande negativt 4,32,33,34,35,36 och hota deras förmåga att få högkvalitativ repetitiv hemodialysbehandling. Även om uppnåendet av varaktig hemodialysåtkomst är högsta prioritet för ESRD-patienter, för patienter som drabbats av ARHD, måste dessa potentiellt försvagande symtom åtgärdas för att förbättra patientcentrerade resultat. I den aktuella studien, som en viktig preklinisk milstolpe inom ARHD-forskning, introducerar vi ett detaljerat kirurgiskt ingrepp för att generera en musmodell av iliac AVF, vilket underlättar undersökningen av AVF-associerad lempatofysiologi. Förutom de förväntade förändringarna i aorto-iliac och IVC-hemodynamik producerade iliac AVF-skapande kliniskt relevanta egenskaper hos extremitetsdysfunktion, inklusive perifer vävnadsischemi med grovmotoriskt nedsättning.
Varje mikrokirurgiskt steg bör utföras med utsökt försiktighet för att undvika potentiellt kärltrauma, vilket kan orsaka betydande förändringar i både hemodynamik och lempatologi. Under ligeringen bör 4-0 silkeslipsknuten endast dras åt tillräckligt för att förhindra blodflöde genom operationsområdet av intresse. Överdriven suturligaturknutspänning kan skada kärlväggen, vilket kan orsaka oönskad blödning och kan bidra till intim hyperplasi, vilket leder till minskad AVF-patency. I synnerhet är venotomireparation ett av de viktigaste stegen i det kirurgiska ingreppet. För stor en bit i venväggen kan leda till kärlstenos och i slutändan trombos, medan för grund reparation kan orsaka dehiscence med blödning. På samma sätt kan blödning också uppstå om de venotomireparationssuturerna är placerade för långt ifrån varandra. Enligt vår erfarenhet är ett ~ 0,025-0,03 mm intervall mellan suturer tillräckligt för att skapa en hemostatisk reparation.
Förutom reproducerbarheten av den kirurgiska tekniken är användning av en sjukdoms- eller symptomspecifik djurmodell ett av de viktigaste bidragen i det aktuella arbetet. I den aktuella studien utsattes djuren för en 0,2% -0,15% adenindiet i 2-3 veckor före och efter AVF-kirurgi för att etablera njurdysfunktion och en uremisk miljö analog med ESRD-patienter. Jämfört med kirurgiska CKD-modeller (t.ex. 5/6 nefrektomi) har en adenindietmodell flera fördelar, inklusive mycket låg dödlighet och mindre variation mellan observatörer27,37. I synnerhet kan svårighetsgraden och patofysiologiska konsekvenser modifieras baserat på koncentrationen och / eller varaktigheten av adenindieten38,39. Tillsammans med den dietinducerade nefropatin kan den nuvarande djurmodellen som beskrivs här sätta scenen för forskare att studera de patofysiologiska mekanismerna genom vilka uremi påverkar ARHD. Vidare kan ytterligare djurmodeller av sjukdom läggas till den kirurgiska modellen för att testa påverkan av mycket vanliga comorbida tillstånd, såsom diabetes, högt blodtryck eller kranskärlssjukdom.
Även om den presenterade iliac AVF-proceduren reproducerbart modellerar viktiga aspekter av lempatofysiologi som är relevanta för hemodialyspatienter med ARHD, finns det vissa begränsningar och komplikationer som är värda att diskutera. För det första har möss som utsätts för denna procedur inte sann "vaskulär åtkomst"; Således är experiment med experimentella hemodialysbehandlingar inte möjliga. För det andra påverkas svårighetsgraden av dysfunktion i lemmar av storleken på den arteriovenösa kommunikationen, så konsekvent AVF-skapande är avgörande för reproducerbara resultat. Till exempel kan skapandet av en stor AVF producera svår ischemi i bakbenen, vilket kan kulminera i nekros i extremiteterna. Nya mikrokirurger som påbörjar proceduren uppmuntras att använda histologiska analyser av de skapade AVF: erna för att analysera storleken för konsistens. Hos möss som utsatts för andra AVF-modeller har hjärtremodellering, inklusive hypertrofi och eventuellt hjärtsvikt, rapporterats 40,41,42. Hjärtförändringar i den nuvarande modellen har inte utvärderats noggrant, även om vi kvalitativt har observerat hjärthypertrofi jämfört med skendjur. Vidare behövs framtida långtidsanalyser för att utvärdera hur det murina kardiovaskulära systemet anpassar sig till iliac AVF-bildning och mognad. En ytterligare oro är att yngre C57BL6-möss har en förmåga att generera arteriogenes och angiogenessvar på ischemiska stimuli, vilket leder till kollateralkärlbildning, vilket framgår av den blygsamma återhämtningen i laser Doppler lemperfusion i denna studie. Således är det möjligt att möss helt kommer att återhämta sig från AVF-lempatologi när mer robusta säkerhetsnätverk har bildats; Framtida studier behövs dock för att kartlägga kollateraltillväxt och distala vaskulaturförändringar.
Hittills är de underliggande mekanismerna genom vilka handfunktionen försämras och / eller förvärras av AVF-placering ofullständigt förstådda. Med tanke på att musgenomet är väl karakteriserat och det finns tillgång till ett brett spektrum av transgena modeller för genmanipulation hos möss, ger denna iliac AVF-kirurgiska modell ett användbart verktyg för biomedicinsk upptäckt kring ARHD. Jämfört med andra gnagare AVF-modeller, som använder central vaskulaturkirurgi (t.ex. aorto-caval fistelmodell) eller stora djurmodeller med lårben eller iliac AVF, ger den nuvarande iliac AVF-modellen med eller utan adenindietinducerad uremi utredare en robust experimentell plattform som kan användas för att förhöra de underliggande biologiska mekanismerna associerade med hemodialys ARHD och generera nya riktade terapier. Vidare anses prekliniska modeller generellt vara avgörande för tidig utveckling och validering av läkemedelsterapier, av vilka inga för närvarande finns tillgängliga för att behandla/förebygga ARHD. I synnerhet är denna modell också mottaglig för förändringar i både storleken på AVF och svårighetsgraden av njursvikt, vilket gör det möjligt för utredare att noggrant modulera patologins svårighetsgrad. Sammanfattningsvis kan denna unika prekliniska AVF-modell för möss fungera som en praktisk plattform för att underlätta preklinisk terapeutisk utveckling som syftar till att minska handhandikapp efter AVF-placering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar uppriktigt Dr. Guanyi Lu från avdelningen för vaskulär kirurgi och endovaskulär terapi vid University of Florida för det tekniska stödet för utvecklingen av iliac AVF-modellen, liksom kirurgisk utbildning, och Ravi Kumar från Institutionen för tillämpad fysiologi och kinesiologi vid University of Florida för teknisk support för att få levande mikrokirurgiska bilder.
Detta arbete stöddes av bidrag från National Institutes of Health och National Heart, Lung and Blood, institutnummer R01-HL148697 (till STS), samt American Heart Association bidragsnummer POST903198 (till K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
- Gameiro, J., Ibeas, J. Factors affecting arteriovenous fistula dysfunction: a narrative review. The Journal of Vascular Access. 21 (2), 134-147 (2020).
- Culleton, B. F., Asola, M. R. The impact of short daily and nocturnal hemodialysis on quality of life, cardiovascular risk and survival. Journal of Nephrology. 24 (4), 405 (2011).
- Huber, T. S., et al. Access-related hand ischemia and the hemodialysis fistula maturation study. Journal of Vascular Surgery. 64 (4), 1050-1058 (2016).
- Rehfuss, J. P., et al. The spectrum of hand dysfunction after hemodialysis fistula placement. Kidney International Reports. 2 (3), 332-341 (2017).
- Caplice, N. M., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), 470-475 (2007).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
- Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Kojima, T., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Misra, S., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Nath, K. A., et al. The murine dialysis fistula model exhibits a senescence phenotype: pathobiological mechanisms and therapeutic potential. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (5), 1493-1499 (2018).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), 1718-1725 (2013).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50472 (2015).
- Wong, C. Y., et al. A novel murine model of arteriovenous fistula failure: the surgical procedure in detail. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53294 (2016).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Anatomic configuration affects the flow rate and diameter of porcine arteriovenous fistulae. Kidney International. 81 (8), 745-750 (2012).
- Wang, Y., et al. Venous stenosis in a pig arteriovenous fistula model-anatomy, mechanisms and cellular phenotypes. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (2), 525-533 (2008).
- Loveland-Jones, C. E., et al. A new model of arteriovenous fistula to study hemodialysis access complications. The Journal of Vascular Access. 15 (5), 351-357 (2014).
- Nugent, H. M., et al. Perivascular endothelial implants inhibit intimal hyperplasia in a model of arteriovenous fistulae: a safety and efficacy study in the pig. Journal of Vascular Research. 39 (6), 524-533 (2002).
- Butterfield, A. B., et al. Inverse effect of chronically elevated blood flow on atherogenesis in miniature swine. Atherosclerosis. 26 (2), 215-224 (1977).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. The American Journal of Pathology. 164 (1), 81-89 (2004).
- Berru, F. N., et al. Chronic kidney disease exacerbates ischemic limb myopathy in mice via altered mitochondrial energetics. Scientific Reports. 9 (1), 15547 (2019).
- Khattri, R. B., Thome, T., Ryan, T. E. Tissue-specific 1H-NMR metabolomic profiling in mice with adenine-induced chronic kidney disease. Metabolites. 11 (1), 45 (2021).
- Thome, T., et al. Impaired muscle mitochondrial energetics is associated with uremic metabolite accumulation in chronic kidney disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (1), 139826 (2021).
- Kim, K., et al. Development of a murine iliac arteriovenous fistula model for examination of hemodialysis access-related limb pathophysiology. Journal of Vascular Surgery-Vascular Science. 2, 247-259 (2021).
- Castro, B., Kuang, S. Evaluation of muscle performance in mice by treadmill exhaustion test and whole-limb grip strength assay. Bio-protocol. 7 (8), 2237 (2017).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: a comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 321 (1), 106-119 (2021).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 20 (7), 946-950 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Bello, A. K., et al. Assessment of global kidney health care status. Journal of the American Medical Association. 317 (18), 1864-1881 (2017).
- Levin, A., et al. Global kidney health 2017 and beyond: a roadmap for closing gaps in care, research, and policy. The Lancet. 390 (10105), 1888-1917 (2017).
- Hassabi, M., et al. Comparing strength and range of motion of the upper limb with AV fistula access with the contralateral upper limb among patients treated with hemodialysis. Researcher Bulletin of Medical Sciences. 22 (1), 1 (2017).
- Capitanini, A., Galligani, C., Lange, S., Cupisti, A. Upper limb disability in hemodialysis patients: evaluation of contributing factors aside from amyloidosis. Therapeutic Apheresis and Dialysis. 16 (3), 242-247 (2012).
- Altintepe, L., et al. Physical disability, psychological status, and health-related quality of life in older hemodialysis patients and age-matched controls. Hemodialysis International. 10 (3), 260-266 (2006).
- Castaneda, C., et al. Resistance training to reduce the malnutrition-inflammation complex syndrome of chronic kidney disease. American Journal of Kidney Diseases. 43 (4), 607-616 (2004).
- Hurton, S., et al. Upper extremity complications in patients with chronic renal failure receiving haemodialysis. Journal of Renal Care. 36 (4), 203-211 (2010).
- Mazumder, M. K., Giri, A., Kumar, S., Borah, A. A highly reproducible mice model of chronic kidney disease: Evidences of behavioural abnormalities and blood-brain barrier disruption. Life Sciences. 161, 27-36 (2016).
- Jia, T., et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice. BioMed Central Nephrology. 14, 116 (2013).
- Kieswich, J. E., et al. A novel model of reno-cardiac syndrome in the C57BL/ 6 mouse strain. BioMed Central Nephrology. 19 (1), 346 (2018).
- Abassi, Z., Goltsman, I., Karram, T., Winaver, J., Hoffman, A. Aortocaval fistula in rat: a unique model of volume-overload congestive heart failure and cardiac hypertrophy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 729497 (2011).
- Brower, G. L., Levick, S. P., Janicki, J. S. Inhibition of matrix metalloproteinase activity by ACE inhibitors prevents left ventricular remodeling in a rat model of heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3057-3064 (2007).
- Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).
