Summary
Denne protokol beskriver de kirurgiske trin af murin fælles iliac arteriovenøs fistel skabelse. Vi udviklede denne model til at studere hæmodialyseadgangsrelateret patofysiologi i lemmer.
Abstract
Kronisk nyresygdom er et stort folkesundhedsproblem, og forekomsten af nyresygdom i slutstadiet (ESRD), der kræver kronisk nyresubstitutionsterapi, såsom hæmodialyse, fortsætter med at stige. Autogen arteriovenøs fistel (AVF) placering forbliver en primær vaskulær adgangsmulighed for ESRD-patienter. Desværre oplever ca. halvdelen af hæmodialysepatienterne dialyseadgangsrelateret hånddysfunktion (ARHD), der spænder fra subtil paræstesi til digital koldbrand. Især er de underliggende biologiske drivkræfter, der er ansvarlige for ARHD, dårligt forstået, og der findes ingen passende dyremodel til at belyse mekanismerne og / eller udvikle nye lægemidler til forebyggelse / behandling af ARHD. Heri beskriver vi en ny musemodel, hvor der oprettes en AVF mellem venstre fælles iliacarterie og vene, hvilket letter vurderingen af lemmernes patofysiologi. Mikrokirurgien omfatter karisolering, langsgående venotomi, skabelse af arteriovenøs anastomose og venøs rekonstruktion. Falske operationer inkluderer alle de kritiske trin undtagen AVF-oprettelse. Iliac AVF-placering resulterer i klinisk relevante ændringer i central hæmodynamik, perifer iskæmi og svækkelser i bagbenets neuromotoriske ydeevne. Denne nye prækliniske AVF-model giver en nyttig platform, der rekapitulerer almindelige neuromotoriske forstyrrelser rapporteret af hæmodialysepatienter, så forskere kan undersøge mekanismerne i ARHD-patofysiologi og teste potentielle behandlinger.
Introduction
Etablering og bevarelse af funktionel vaskulær adgang er fortsat et vigtigt primært mål for patienter med nyresygdom i slutstadiet (ESRD), der får nyresubstitutionsterapi via hæmodialyse1. Gentagne hæmodialysebehandlinger er nødvendige for at fjerne affaldsprodukter, normalisere elektrolytter og opretholde væskebalancen, når nyrefunktionen bliver utilstrækkelig, og er derfor nødvendige for langsigtet overlevelse2. Derfor repræsenterer vaskulær adgang en "livline" for patienter med ESRD, og autogen arteriovenøs fistelplacering (AVF) forbliver en foretrukken dialyseadgangsmulighed blandt denne kohorte3. Imidlertid oplever ca. 30%-60% af hæmodialysepatienter et spektrum af håndhandicap, klinisk defineret som adgangsrelateret hånddysfunktion (ARHD). Symptomerne på ARHD kan variere fra svaghed og diskoordination til monoplegi og digital koldbrand, som kan forekomme tidligt efter AVF-dannelse eller udvikle sig gradvist med fistelmodning. Endvidere komplicerer ARHD ESRD-behandlingsplanen, som er forbundet med dårlig livskvalitet, høj risiko for hjerte-kar-sygdomme og øget dødelighed 2,3,4.
Flere dyremodeller er blevet udviklet til at studere vaskulær remodellering induceret af hæmodynamiske ændringer efter AVF-skabelse 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Store dyremodeller med iliac eller femoral AVF 16,17,18,19,20 og gnavermodeller, der anvender enten halspulsåre-jugulær veneanastomose eller infrarenal aorta-inferior vena cava-fisteldannelse, er veletablerede til at undersøge de ovennævnte aspekter af AVF-modning og patency 21 . For eksempel er venøs hypertension, større luminal diameter og øget venevægtykkelse signaturer for vellykket AVF-modning, mens betydelig fibrose i medierne og intim hyperplasi eller tromboseudvikling uden ændringer i flow ofte karakteriserer AVF-fejl 6,15. Imidlertid mangler store dyremodeller den eksperimentelle fleksibilitet eller transgene evner i murine modeller, mens nuværende gnavermodeller ikke let letter undersøgelsen af ARHD på grund af enten den anatomiske placering og / eller mangel på tilknyttet lemmerpatologi. På grund af manglen på en etableret præklinisk dyremodel, der rekapitulerer den relevante kliniske fænotype, er forskningsfremskridtene med at belyse de patobiologiske mekanismer og udvikle nye terapeutiske strategier forblevet stagnerende på trods af en progressiv stigning i antallet af symptomatiske ARHD-patienter. Derfor er det primære mål med denne undersøgelse at introducere en unik musemodel af ARHD, der giver proceduremæssige trin i AVF-mikrokirurgi og karakterisering af AVF-relateret patofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Florida og Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.
BEMÆRK: Unge voksne (8-10 uger gamle) C57BL/6J-hanmus blev købt fra The Jackson Laboratory og anbragt i en lys (12 timers lys: 12 timers mørk cyklus), temperatur (22 °C ± 1 °C) og fugtighed (50% ± 10%) kontrolleret dyrefacilitet. Fem mus fik lov til at bo pr. bur (B:18 cm x L:29 cm x H:12,5 cm), hvor redematerialer, mad og vand blev stillet til rådighed ad libitum. Efter 7 dages habitatakklimatisering med standard chow blev musene ændret til en kaseinbaseret chow-diæt i 7 dage som en diætovergangsfase. Derefter blev mus fodret med kaseinbaseret chow med 0,2% -0,15% adenintilskud i 2-3 uger for at fremkalde nyredysfunktion (CKD) før AVF-operationen som tidligere beskrevet22,23,24. Kontrolmus modtog en kaseinbaseret chow-diæt uden adenintilskud (kontrol). Kontrol- og CKD-diæterne blev opretholdt i hele den postoperative restitutionsperiode (POD).
1. Præoperative målinger
- Vurder baseline / præoperative resultatmålinger, aortoiliac kardiametre og hæmodynamiske strømningsparametre ved hjælp af duplex ultralydsbilleddannelse og bagbenets perfusion via laser Doppler som tidligere beskrevet25.
- Bestem den ensidige bagbens grebsstyrke og løbebåndets gangart for at etablere baseline bagbensfunktion som tidligere beskrevet25,26.
- Vurder nyrefunktionen ved at måle glomerulær filtreringshastighed (GFR) via FITC-inulinclearance og/eller serum blodurinstofnitrogen (BUN) niveau som tidligere beskrevet22,24,27.
2. Kirurgisk forberedelse
- Forbered følgende kirurgiske værktøjer og forsyninger (materialetabel): en varm perlesterilisator, øjensmøremiddel, en pentrimmer, alkoholpreps, chlorhexidinservietter, ekstra fine Graefe tang, steriliseret 0,9% saltvand, 29 G og 31 G nålesprøjter, 2 x 2 ikke-vævede svampe, medium single-ended runde (SC-9) og små dobbeltendede hårde, skarpe, spidse (SC-4) vatpinde, lav temperatur cautery, lige Dumont tang, 45 ° vinklet Dumont tang, lige Vannas fjedersaks, buet Vannas fjedersaks, runde håndtag nåleholdere, flere størrelser suturer (4-0 silke, 5-0 PGA, 6-0 silke og 10-0 nylonsuturer), heparin, absorberbar gelatinesvamp, en lige nåleholder og buprenorphin.
BEMÆRK: Ekstremitetsfastgørelsesgummibånd og retraktorer til maven og benene blev håndlavet. - Steriliser kirurgiske præparater ved hjælp af autoklave med dampsterilisering ved 120-125 °C i 30 minutter efterfulgt af tørring i 30 minutter før operationen. Brug 70% ethanolrensning efterfulgt af sterilisering af varme perler (240-270 °C i 3 min) mellem hver dyreoperation.
- Forbered steriliseret 0,9% normalt saltvand, hepariniseret saltvand (100 IE / ml) og buprenorphin (0,01 mg / ml) ved hjælp af 29-31 G nålesprøjter.
3. Anæstesi og positionering
- Start musebedøvelse i induktionskammeret (0,8 ml/min, 2,5 % isofluran). Når musen er tilstrækkeligt bedøvet, skal du placere musen i liggende stilling på operationsstationen, der er dækket af en steril gardin. Nedtrapning af isoflurankoncentrationen til ~1,2 % under barbering og positionering.
- Påfør det okulære smøremiddel for at beskytte øjnene mod tørring under operationen.
- Brug en pentrimmer til at barbere mavehårene til operationen og benhårene til postoperative perfusionsmålinger. Ryd håret væk fra det kirurgiske felt.
- Fastgør de øvre og nedre ekstremiteter med elastikker og stifter, kontroller dybden af anæstesi ved at overvåge tåklemmerefleksen, og titrer anæstesi efter behov. Udfør respiratorisk mønsterevaluering hvert 3-5 minut under hele den kirurgiske procedure for at kalibrere anæstesiniveauet.
4. Udforskning af det kirurgiske målområde
- Rens det barberede hudområde flere gange, skiftevis mellem alkoholprep og chlorhexidinservietter i et cirkulært mønster for at desinficere det kirurgiske felt.
- Lav en midterlinje laparotomi fra den nederste kant af brystmargenen til pubis symphysis. Disseker pubis fedtpuden for at opnå et bredere operativt felt.
- Åbn celiotomien for at få adgang til peritonealindholdet med retraktorer og udtag tyndtarmen ved hjælp af mellemstore, runde bomuldspindler med en enkelt ende. Dæk tarmene med en saltvandsgennemblødt ikke-vævet svamp.
- Når tilstrækkelig eksponering af retroperitoneal vaskulatur er opnået, dække de resterende tarm, nyrer og urinledere med små saltvand-gennemblødt ikke-vævede svampe. Evakuer en udspilet blære ved forsigtigt at klemme blærekuplen med mellemstore, runde vatpinde med en enkelt ende efter behov.
- Dissekere forsigtigt den perivaskulære fascia og fedtvæv fra ca. 1 cm proksimalt til aortabifurkationen, der strækker sig til niveauet for venstre iliac bifurcation ved hjælp af lige Dumont-tang og små dobbeltendede hårde, skarpe, spidse vatpinde.
BEMÆRK: Den venstre iliac arterie og vene efterlades klæbende til hinanden, mens de arteriovenøse strukturer isoleres en masse. Dette trin vil give tilstrækkelig fartøjsmobilisering til at lette AVF-oprettelsen. - Hvis der opstår små venøse grene, der stammer fra eller konvergerer med den venstre fælles iliac vene, ligeres dem ved hjælp af lavtemperaturkauteri med eller uden 6-0 silkesutur efter behov.
- Før spidsen af de vinklede tang under det venstre fælles iliac vaskulære bundt og spred forsigtigt flere gange for at mobilisere karrene fra den underliggende retroperitoneale muskulatur (figur 1A).
5. Oprettelse af en fælles iliac arteriovenøs fistelanastomose
- Placer to 4-0 silkesuturer omkring det isolerede venstre fælles iliac arteriovenøse bundt og brug dem som ligaturer (f.eks. Tværklemmer) til det vaskulære bundt. Opret en enkelt knude med hvert 4-0 silkeslips og påfør dem sekventielt fra proksimalt til distal.
- Sørg for, at silkebåndets tværklemmer er placeret tilstrækkeligt langt fra hinanden til at isolere ~ 2 mm af beholderlængden, og den sekventielle påføring af suturligaturerne vil udfælde venstre iliac veneoverfyldning.
- Brug 4-0 silkesuturstrengene som håndtag til at dreje det venstre iliac arteriovenøse vaskulære bundt med uret og finjustere positionen for midlertidigt at lokalisere venen foran arterien (figur 1B).
- Lav en langsgående venotomi (~ 1 mm) med lige Vannas fjedersaks og skyl forsigtigt resterende blod ud af det venøse lumen med 0,9% saltvand (figur 1C). Vær forsigtig under dette trin, da en højtrykssaltvandsskylning kan forårsage venøs forstyrrelse.
BEMÆRK: Området med rød farve, der forbliver i iliacarterien efter venøs skylning, giver et visuelt vindue til følgende trin. - Placer en imbricating 10-0 nylonsutur gennem venens bagvæg.
BEMÆRK: Denne del af iliac venen skal være i umiddelbar apposition til den forreste væg af iliac arterien, og væggene er naturligt klæbende. Suturen skal gå gennem begge vægge og binde suturen ned med en enkelt knude (figur 1D). Bemærk, at en lille mængde blødning, der stammer fra det stillestående blod i iliacarterien, vises, når nålen passerer gennem begge vægge. Hvis intraluminal blødning fortsætter under dette trin, kan silkesuturtværklemmerne være for løse og skal strammes yderligere. - Tag fat i de imbrikerede suturender og læg dem under blid spænding for at forskyde den forreste væg fra iliacarteriens bagvæg. Lav et ~ 1,0 mm x 0,3 mm elliptisk snit ved hjælp af buet Vannas fjedersaks, fjern de klæbende vægge i både iliacarterien og venen.
BEMÆRK: Den arteriovenøse fistel dannes derved, når denne fælles kanal er etableret. Det er muligt at skade venens laterale vægge under dette trin, da det bageste iliac vene / forreste iliac arterievægssnit udføres gennem venotomieksponering. Der bør udvises forsigtighed for at undgå denne komplikation, da dette kan reducere fisteldiameteren betydeligt og føre til udvikling af trombose. - Skyl forsigtigt restblod af det eksponerede arterielle lumen ud med 0,9% saltvand og hepariniseret saltvand (100 IE/ml)28 (figur 1E).
- Efter oprettelsen af AVF repareres den oprindelige forreste vægvenotomi ved hjælp af to eller tre 10-0 nylonsuturer på en afbrudt måde (figur 1F).
- Gendan det vaskulære bundt til dets oprindelige anatomiske orientering og læg et lille stykke saltvandsgennemblødt absorberbar gelatinesvamp ved siden af den reparerede venotomi for at lette hæmostase.
- Løsn 4-0 enkeltknude krydsklemmeligaturer sekventielt fra distal til proksimal. Overvåg venotomistedet nøje for overdreven blødning, mens du løsner hver sutur.
- Hvis reparationen ikke er tilstrækkelig hæmostatisk, skal du genanvende tværklemmerne og placere en anden 10-0 nylonsutur på blødningsstedet. Hvis hæmostase er sikret, skal du fjerne suturerne og derefter den absorberbare gelatinesvamp.
- Gnid forsigtigt det vaskulære bundt med små dobbeltendede hårde, skarpe, spidse bomuldspinde, hvilket yderligere letter genoprettelsen af blodgennemstrømningen. Bekræft teknisk succes med operationen ved hjælp af visualisering af pulserende, lyst rødt iltet blod, der kommer ind i iliacvenen og blandes med mørkt venøst blod, der vender tilbage fra bagbenet.
- Injicer hepariniseret saltvand (0,2 IE / g)15 i IVC for systemisk antikoagulation for at forbedre AVF patency resultater.
BEMÆRK: Selvom dette trin forekommer efter den vaskulære rekonstruktion (i modsætning til den humane analog, hvor heparinisering forekommer før krydsklemme af karret), blev der observeret en reduktion i intraoperativ blødning og forbedret AVF-patency, når den blev udført på dette stadium af proceduren. Injektion på et sted, der er dækket af fascia og / eller fedt, foretrækkes for at forhindre blødning fra punkteringsstedet. - Kontroller det kirurgiske sted igen for hæmostase efter injektion af hepariniseret saltvand. Hvis der ikke er nogen blødningsproblemer, skal du lukke midterlinjen fascia og derefter hudsnittet med absorberbare 5-0 PGA suturer på en løbende måde.
- For skinoperationer skal du følge alle de vigtigste trin i proceduren undtagen AVF-dannelse. Påfør en enkelt knude af 4-0 silkeligaturen i den proksimale ende af venstre iliac arteriovenøse bundt og match klemmetiderne til AVF-operationer (f.eks. ~ 20 min, afhængigt af mikrokirurgens færdigheder).
6. Postoperativ pleje og måling
- Efter laparotomi lukning, måle blod perfusion af den bilaterale tibialis forreste muskler og ventrale poter ved hjælp af laser Doppler billeddannelse.
BEMÆRK: Ensidige perfusionsunderskud vil bekræfte fistelomdirigering af arteriel strømning ("stjæle"). - Administrer 0,1 mg/kg buprenorphin subkutant og sæt musen tilbage i et forvarmet musebur med let absorberbart blødt strøelse med rede.
- Lad musen komme sig i det forvarmede musebur, indtil bedøvelsen aftager, hvilket vil være indlysende, når musen er ambulant og interaktiv (~ 2 timer). Under genopretning skal du give musen nem adgang til en fugtet, blød kost.
- Administrer buprenorphin og/eller subkutan saltvandshydrering hver 12. time op til 48 timer og udfør daglig overvågning i 5 dage postoperativt. Aflive dyr med en forværret tilstand eller overdreven vævsnekrose, klassificeret som en modificeret iskæmi score ≥229.
- Brug serielle duplex ultralydsvurderinger til at evaluere fistelpatency postoperativt; mus med fisteltrombose udelukkes fra efterfølgende analyser, medmindre formålet med forsøgene er at karakterisere AVF-modningssvigt.
- Bestem andre postoperative resultatmålinger såsom lokal hæmodynamik, grebstyrke og gangydelse i restitutionsperioden. Saml fistel og muskelvæv for at vurdere histomorfologi ved afslutningen af eksperimentet under ofringen25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyr, der udsættes for en adenindiæt, har reducerede glomerulære filtreringshastigheder (kontrol: 441,3 ± 54,2 μL / min vs. CKD: 165,1 ± 118,3 μL / min, p < 0,05 ) og øgede serum blod urinstof nitrogenniveauer (kontrol: 20,39 ± 4,2 μL / min vs. CKD: 38,20 ± 10,65 μL / min, p < 0,05) sammenlignet med de dyr, der modtog kaseinbaseret chow, hvilket bekræfter tilstedeværelsen af nyreinsufficiens før arteriovenøs fisteloperation.
Validering af AVF-åbenhed
Selvom intraoperativ visuel bekræftelse af teknisk succes er den første identifikation af fistelpatency, garanterer den ikke fuldt ud patency eller fysiologisk modning i hele undersøgelsesperioden. Postoperative patencyresultater (dvs. succes eller fiasko) blev bestemt ved hjælp af både duplex ultralydsbilleddannelse og histologisk undersøgelse, som vi tidligere har demonstreret25. Figur 2 viser henholdsvis den repræsentative B-tilstand, pulsbølge Doppler og farve Doppler ultralydsbilleder og morfologiske sektioner af en arteriovenøs fistelanastomose. En patentfistel visualiseres direkte på farve Doppler-analyse med turbulent hæmodynamik samt spektral udvidelse på fistelstedet. Adaptive flow-medierede ændringer af ind- og udstrømningsfartøjerne bekræfter også indirekte AVF-patency. Specifikt har aorta forhøjet maksimal systolisk og slutdiastolisk hastighed, IVC udvikler pulsatilitet med forhøjet tophastighed, og karudvidelse i både aorta og IVC er tydelig (figur 2A). I modsætning hertil har en mislykket eller tromboseret fistel næsten ingen ændringer i ind- eller udstrømningsmålinger og ingen turbulens eller spektral udvidelse inden for venstre iliac vaskulatur. Normalt udelukker fistelsvigt fra trombose helt eller delvist den venstre iliacarterie, som visualiseres som minimal eller ingen strømning på pulsbølge Doppler-analyse. Figur 2B viser serielle histologisektioner af en AVF 2 uger efter kirurgisk oprettelse. Sektionerne er 5 μm tykke og farvet med Massons trikrom. Kirurgisk anastomose af arterien og venen er indlysende, og tydelig venøs arterielisering er til stede (venøs vægfortykkelse og fibrose med neointim hyperplasi). Ultralydsbilleddannelse blev udført på postoperativ dag 3 for at udelukke mus med tidlig AVF-svigt, og derefter blev seriale, ikke-invasive målinger opnået i hele undersøgelsesperioden. Morfologisk vurdering giver periodespecifikke vaskulære remodelleringsdetaljer på tidspunktet for ofringen og blev brugt til at bekræfte ultralydsfund. En AVF-patensrate på ca. 50% (20%-30% af postoperativ død og 20%-30% af fistelsvigt)25 kan forventes oprindeligt, men den kirurgiske succesrate forbedres betydeligt (~ 5% -10% fejlrate) med praksis og øget færdighed.
Patofysiologiske egenskaber efter dannelse af iliac arteriovenøs fistel
Hemodynamisk ændring: Karakteristika for AVF-hæmodynamik og distal bagbenperfusion skal kvantificeres for at kontekstualisere adgangsrelateret lempatofysiologi. B-mode og pulsbølge Doppler ultralydsmålinger efter operationen afslørede indstrømning og udstrømningskarudvidelse (IVC: 1,4 gange ved POD3 og 1,6 gange ved POD13 og IRA: 1,4 gange ved POD3 og 1,7 gange ved POD13, p < 0,05) og stigninger i maksimal systolisk hastighed (IVC peak systolisk hastighed: 5,5 gange ved POD3 og 4,9 gange ved POD13 og IRA peak systolisk hastighed: 2,8 gange ved POD3 og 3,7 gange ved POD13, P < 0,05) sammenlignet med skindyrene (figur 3A-D). Endvidere var ensidig iskæmi i bagbenene tydelig postoperativt, hvilket bekræfter stjælemedieret arteriel hypoperfusion distal til fistelen. Venstre pote perfusion underskud forventes at være ~ 20% af det kontralaterale lem, og perfusionsunderskuddet i tibialis forreste muskel er ~ 60%. Mus genvandt delvist disse underskud i hele undersøgelsesperioden (figur 3E, F).
Bagbendysfunktion: Ipsilateral lemhandicap forventes efter AVF-oprettelse, hvilket involverer mild (de fleste tilfælde) til svær (få tilfælde) benhaltning, der kan vare i flere dage. Uløst lammelse af bagbenene og / eller potenekrose kan være tegn på en alvorlig iskæmisk fornærmelse forårsaget af fistelstørrelse uden for det normale område. Bagbenets neuromotoriske funktion blev kvantificeret via grebstyrketest og løbebåndets gangmønsteranalyse, som blev udført sekventielt i hele restitutionsperioden. Forventet ensidig grebstyrke er ~ 50% af det kontralaterale lem på postoperativ dag 4 med gradvis genopretning. AVF-mus kræver også reducerede løbebåndshastigheder under gangvurdering (<20 cm/min) (figur 3G,H).
Figur 1: Mikrokirurgiske trin af arteriovenøs fistelanastomose . (A) Eksponering af det kirurgiske målområde, herunder midterlinielaparotomi og venstre iliacarterie/veneisolering. (B) 4-0 suturligaturer (f.eks. brugt som midlertidige beholderklemmer) på venstre fælles iliac arteriovenøse bundt på proksimale og distale steder. (C) En langsgående venotomi på iliacvenens forreste væg. (D) 10-0 imbricating sutur via den bageste væg af iliac vene og den forreste væg af iliac arterie. (E) Elliptisk snit med den imbricaterende distension. (F) Indledende langsgående venotomi fra billede C repareres ved hjælp af en afbrudt 10-0 sutur. Vægtstang = 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Validering af arteriovenøs fistelpatency . (A) Doppler ultralyd bestemmelse af AVF patency. Karakteristika for en patentfistel inkluderer arteriel og venøs dilatation på B-mode billeddannelse, turbulent flow på farve Doppler-analyse af venstre iliac vaskulatur, pulsatil spektral udvidelse på pulsbølge Doppler-vurdering af venstre iliac-kar, stigninger i maksimal systolisk og endediastolisk hastighed af infrarenal aorta og pulsatilitet inden for IVC med stigninger i maksimal systolisk hastighed. Formindsket eller fraværende flow i iliackarrene tyder på AVF-svigt/trombose. Duplex ultralydsteknikken giver både morfologiske og fysiologiske data. Hastighedsmålinger er i millimeter pr. Sekund. (B) Morfologisk vurdering af AVF-anastomose 14 dage efter fisteldannelse. Billeder blev farvet med Massons trikrom. Der er anatomiske ændringer i seriel sektionsmikroskopi fra proksimal (venstre ende) til distal (højre ende) fælles iliac arteriovenøs anatomi. Okklusion af vaskulaturen på grund af blodpropper og / eller overdreven neointim hyperplasi bekræfter AVF-svigt. Billeder er 10x forstørrelse. A: Fælles iliac arterie, V: Fælles iliac vene. Skalabjælke = 500 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Patofysiologiske egenskaber før og efter AVF-dannelse. Kvantificering af ultralydsbilleddannelse i (A) infrarenal aortadiameter, (B) infrarenal aortatop systolisk hastighed, (C) ringere vena cava-diameter og (D) ringere vena cava-peak systolisk hastighed præoperativt og på postoperative dage 3 og 13. Lokal blodperfusion (laserdoppler) måling på (E) tibialis anterior og (F) ventral pote før operation og i hele 2 ugers restitutionsperiode. Neuromotorisk funktionstest omfattede (G) grebstyrke og (H) løbebåndstest før og efter operation. Data blev analyseret ved hjælp af en tovejs ANOVA, og Tukeys post-hoc test blev udført, når det var relevant. Værdier er middel ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs. Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ### #p < 0,0001 vs. CKD_Sham. N = 6-10/gruppe. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Prævalensen af hæmodialysepatienter med ARHD efter AVF-dannelse er fortsat med at stige30,31. Faktisk kan uløste symptomatiske komplikationer 4,32,33 såsom smerte, svaghed, paræstesi og / eller reduceret bevægelsesområde påvirke patientens velbefindendenegativt 4,32,33,34,35,36 og true deres evne til at modtage gentagen hæmodialysebehandling af høj kvalitet. Selvom opnåelsen af varig hæmodialyseadgang er en topprioritet for ESRD-patienter, skal disse potentielt svækkende symptomer behandles for at forbedre patientcentrerede resultater for forsøgspersoner, der er ramt af ARHD. I denne undersøgelse, som en vigtig præklinisk milepæl inden for ARHD-forskning, introducerer vi en detaljeret kirurgisk procedure for at generere en musemodel af iliac AVF, hvilket letter undersøgelsen af AVF-associeret lemmerpatofysiologi. Ud over de forventede ændringer i aorto-iliac og IVC hæmodynamik producerede iliac AVF-skabelse klinisk relevante træk ved lemmerdysfunktion, herunder perifer vævsiskæmi med grovmotorisk svækkelse.
Hvert mikrokirurgisk trin skal udføres med udsøgt omhu for at undgå potentielle fartøjstraumer, hvilket kan forårsage betydelige ændringer i både hæmodynamik og lemmerpatologi. Under ligeringen bør 4-0 silkeslipsknuden kun strammes nok til at forhindre blodgennemstrømning gennem det kirurgiske sted af interesse. Overdreven sutur ligatur knude spænding kan skade karvæggen, hvilket kan forårsage uønsket blødning og kan bidrage til intim hyperplasi, hvilket fører til nedsat AVF patency. Især er venotomireparation et af de vigtigste trin i den kirurgiske procedure. For stor bid i venevæggen kan føre til karstenose og i sidste ende trombose, mens for lav reparation kan forårsage dehiscens med blødning. På samme måde kan blødning også forekomme, hvis venotomireparationssuturerne er adskilt for langt fra hinanden. Efter vores erfaring er et ~ 0,025-0,03 mm interval mellem suturer nok til at skabe en hæmostatisk reparation.
Ud over reproducerbarheden af den kirurgiske teknik er brugen af en sygdoms- eller symptomspecifik dyremodel et af de vigtigste bidrag i det nuværende arbejde. I denne undersøgelse blev dyr udsat for en 0,2% -0,15% adenindiæt i 2-3 uger før og efter AVF-operation for at etablere nyredysfunktion og et uræmisk miljø svarende til ESRD-patienter. Sammenlignet med kirurgiske CKD-modeller (f.eks. 5/6 nefrektomi) har en adenindiætmodel flere fordele, herunder meget lav dødelighed og mindre variation mellem observatører27,37. Især kan sværhedsgraden og patofysiologiske konsekvenser ændres baseret på koncentrationen og/eller varigheden af adenindiet38,39. Sammen med den diætinducerede nefropati kan den nuværende dyremodel, der er beskrevet heri, sætte scenen for forskere til at studere de patofysiologiske mekanismer, hvormed uræmi påvirker ARHD. Endvidere kan yderligere dyremodeller for sygdom føjes til den kirurgiske model for at teste indflydelsen af meget udbredte comorbide tilstande, såsom diabetes, hypertension eller koronararteriesygdom.
Selvom den præsenterede iliac AVF-procedure reproducerbart modellerer nøgleaspekter af lemmernes patofysiologi, der er relevant for hæmodialysepatienter med ARHD, er der nogle begrænsninger og komplikationer, der er værd at diskutere. For det første har mus, der udsættes for denne procedure, ikke ægte "vaskulær adgang"; Således er eksperimenter, der involverer eksperimentelle hæmodialysebehandlinger, ikke mulige. For det andet påvirkes sværhedsgraden af lemmerdysfunktion af størrelsen af den arteriovenøse kommunikation, så konsekvent AVF-oprettelse er afgørende for reproducerbare resultater. For eksempel kan oprettelsen af en stor AVF producere alvorlig iskæmi i bagbenene, som kan kulminere i lemmernekrose. Nye mikrokirurger, der begynder proceduren, opfordres til at bruge histologiske analyser af de oprettede AVF'er til at analysere størrelsen for konsistens. Hos mus udsat for andre AVF-modeller er hjertemodellering, herunder hypertrofi og muligvis hjertesvigt, rapporteret 40,41,42. Hjerteændringer i den nuværende model er ikke blevet nøje vurderet, selvom vi kvalitativt har observeret hjertehypertrofi sammenlignet med falske dyr. Desuden er fremtidige langsigtede analyser nødvendige for at evaluere, hvordan det murine kardiovaskulære system tilpasser sig iliac AVF dannelse og modning. En yderligere bekymring er, at yngre C57BL6-mus har en evne til at generere arteriogenese og angiogeneseresponser på iskæmiske stimuli, hvilket fører til dannelse af sikkerhedskar, som det fremgår af den beskedne genopretning i laser Doppler lemperfusion i denne undersøgelse. Det er således muligt, at mus fuldstændigt vil komme sig efter AVF-lempatologi, når der er dannet mere robuste sikkerhedsnetværk; Imidlertid er fremtidige undersøgelser nødvendige for at kortlægge sikkerhedsvækst og distale vaskulaturændringer.
Til dato er de underliggende mekanismer, hvormed håndfunktionen er nedsat og/eller forværret af AVF-placering, ufuldstændigt forstået. I betragtning af at musegenomet er velkarakteriseret, og der er let adgang til en bred vifte af transgene modeller til genmanipulation i mus, giver denne iliac AVF kirurgiske model et nyttigt værktøj til biomedicinsk opdagelse omkring ARHD. Sammenlignet med andre AVF-modeller for gnavere, der anvender central vaskulaturkirurgi (f.eks. Aorto-cavalfistelmodel) eller store dyremodeller med lårbens- eller iliac AVF, giver den nuværende iliac AVF-model med eller uden adenindiætinduceret uræmi efterforskere en robust eksperimentel platform, der kan bruges til at forhøre de underliggende biologiske mekanismer forbundet med hæmodialyse ARHD og generere nye målrettede terapier. Desuden anses prækliniske modeller generelt for at være afgørende for tidlig udvikling og validering af farmaceutiske terapier, hvoraf ingen i øjeblikket er tilgængelige til behandling / forebyggelse af ARHD. Især er denne model også modtagelig for ændringer i både størrelsen af AVF og sværhedsgraden af nyresvigt, hvilket gør det muligt for efterforskere omhyggeligt at modulere sværhedsgraden af patologien. Afslutningsvis kan denne unikke prækliniske AVF-musemodel tjene som en praktisk platform til at lette præklinisk terapeutisk udvikling med det formål at reducere håndhandicap efter AVF-placering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker oprigtigt Dr. Guanyi Lu fra afdelingen for vaskulær kirurgi og endovaskulær terapi ved University of Florida for den tekniske support til udviklingen af iliac AVF-modellen samt kirurgisk træning og Ravi Kumar fra Institut for Anvendt Fysiologi og Kinesiologi ved University of Florida for den tekniske support til at få de levende mikrokirurgiske billeder.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health og National Heart, Lung and Blood, Institute numre R01-HL148697 (til STS) samt American Heart Association bevillingsnummer POST903198 (til K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
- Gameiro, J., Ibeas, J. Factors affecting arteriovenous fistula dysfunction: a narrative review. The Journal of Vascular Access. 21 (2), 134-147 (2020).
- Culleton, B. F., Asola, M. R. The impact of short daily and nocturnal hemodialysis on quality of life, cardiovascular risk and survival. Journal of Nephrology. 24 (4), 405 (2011).
- Huber, T. S., et al. Access-related hand ischemia and the hemodialysis fistula maturation study. Journal of Vascular Surgery. 64 (4), 1050-1058 (2016).
- Rehfuss, J. P., et al. The spectrum of hand dysfunction after hemodialysis fistula placement. Kidney International Reports. 2 (3), 332-341 (2017).
- Caplice, N. M., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), 470-475 (2007).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
- Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Kojima, T., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Misra, S., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Nath, K. A., et al. The murine dialysis fistula model exhibits a senescence phenotype: pathobiological mechanisms and therapeutic potential. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (5), 1493-1499 (2018).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), 1718-1725 (2013).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50472 (2015).
- Wong, C. Y., et al. A novel murine model of arteriovenous fistula failure: the surgical procedure in detail. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53294 (2016).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Anatomic configuration affects the flow rate and diameter of porcine arteriovenous fistulae. Kidney International. 81 (8), 745-750 (2012).
- Wang, Y., et al. Venous stenosis in a pig arteriovenous fistula model-anatomy, mechanisms and cellular phenotypes. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (2), 525-533 (2008).
- Loveland-Jones, C. E., et al. A new model of arteriovenous fistula to study hemodialysis access complications. The Journal of Vascular Access. 15 (5), 351-357 (2014).
- Nugent, H. M., et al. Perivascular endothelial implants inhibit intimal hyperplasia in a model of arteriovenous fistulae: a safety and efficacy study in the pig. Journal of Vascular Research. 39 (6), 524-533 (2002).
- Butterfield, A. B., et al. Inverse effect of chronically elevated blood flow on atherogenesis in miniature swine. Atherosclerosis. 26 (2), 215-224 (1977).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. The American Journal of Pathology. 164 (1), 81-89 (2004).
- Berru, F. N., et al. Chronic kidney disease exacerbates ischemic limb myopathy in mice via altered mitochondrial energetics. Scientific Reports. 9 (1), 15547 (2019).
- Khattri, R. B., Thome, T., Ryan, T. E. Tissue-specific 1H-NMR metabolomic profiling in mice with adenine-induced chronic kidney disease. Metabolites. 11 (1), 45 (2021).
- Thome, T., et al. Impaired muscle mitochondrial energetics is associated with uremic metabolite accumulation in chronic kidney disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (1), 139826 (2021).
- Kim, K., et al. Development of a murine iliac arteriovenous fistula model for examination of hemodialysis access-related limb pathophysiology. Journal of Vascular Surgery-Vascular Science. 2, 247-259 (2021).
- Castro, B., Kuang, S. Evaluation of muscle performance in mice by treadmill exhaustion test and whole-limb grip strength assay. Bio-protocol. 7 (8), 2237 (2017).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: a comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 321 (1), 106-119 (2021).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 20 (7), 946-950 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Bello, A. K., et al. Assessment of global kidney health care status. Journal of the American Medical Association. 317 (18), 1864-1881 (2017).
- Levin, A., et al. Global kidney health 2017 and beyond: a roadmap for closing gaps in care, research, and policy. The Lancet. 390 (10105), 1888-1917 (2017).
- Hassabi, M., et al. Comparing strength and range of motion of the upper limb with AV fistula access with the contralateral upper limb among patients treated with hemodialysis. Researcher Bulletin of Medical Sciences. 22 (1), 1 (2017).
- Capitanini, A., Galligani, C., Lange, S., Cupisti, A. Upper limb disability in hemodialysis patients: evaluation of contributing factors aside from amyloidosis. Therapeutic Apheresis and Dialysis. 16 (3), 242-247 (2012).
- Altintepe, L., et al. Physical disability, psychological status, and health-related quality of life in older hemodialysis patients and age-matched controls. Hemodialysis International. 10 (3), 260-266 (2006).
- Castaneda, C., et al. Resistance training to reduce the malnutrition-inflammation complex syndrome of chronic kidney disease. American Journal of Kidney Diseases. 43 (4), 607-616 (2004).
- Hurton, S., et al. Upper extremity complications in patients with chronic renal failure receiving haemodialysis. Journal of Renal Care. 36 (4), 203-211 (2010).
- Mazumder, M. K., Giri, A., Kumar, S., Borah, A. A highly reproducible mice model of chronic kidney disease: Evidences of behavioural abnormalities and blood-brain barrier disruption. Life Sciences. 161, 27-36 (2016).
- Jia, T., et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice. BioMed Central Nephrology. 14, 116 (2013).
- Kieswich, J. E., et al. A novel model of reno-cardiac syndrome in the C57BL/ 6 mouse strain. BioMed Central Nephrology. 19 (1), 346 (2018).
- Abassi, Z., Goltsman, I., Karram, T., Winaver, J., Hoffman, A. Aortocaval fistula in rat: a unique model of volume-overload congestive heart failure and cardiac hypertrophy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 729497 (2011).
- Brower, G. L., Levick, S. P., Janicki, J. S. Inhibition of matrix metalloproteinase activity by ACE inhibitors prevents left ventricular remodeling in a rat model of heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3057-3064 (2007).
- Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).
