Summary
Este protocolo detalha os passos cirúrgicos da criação da fístula arteriovenosa ilíaca comum murina. Desenvolvemos este modelo para estudar a fisiopatologia do membro relacionada ao acesso hemodialítico.
Abstract
A doença renal crônica é um importante problema de saúde pública, e a prevalência de doença renal terminal (DRT) que requer terapias renais substitutivas crônicas, como hemodiálise, continua a aumentar. A colocação de fístula arteriovenosa autógena (FAV) continua sendo uma opção de acesso vascular primário para pacientes com DRCT. Infelizmente, aproximadamente metade dos pacientes em hemodiálise apresenta disfunção da mão relacionada ao acesso dialítico (DRA), variando de parestesia sutil a gangrena digital. Notavelmente, os fatores biológicos subjacentes responsáveis pela DRA são pouco compreendidos, e não existe um modelo animal adequado para elucidar os mecanismos e/ou desenvolver novas terapêuticas para a prevenção/tratamento da DRSA. Descrevemos um novo modelo de camundongo no qual uma FAV é criada entre a artéria ilíaca comum esquerda e a veia, facilitando a avaliação da fisiopatologia do membro. A microcirurgia inclui isolamento de vasos, venotomia longitudinal, criação de anastomose arteriovenosa e reconstrução venosa. As cirurgias simuladas incluem todas as etapas críticas, exceto a criação de FAV. A colocação de FAV ilíaca resulta em alterações clinicamente relevantes na hemodinâmica central, isquemia periférica e prejuízos no desempenho neuromotor dos membros posteriores. Este novo modelo pré-clínico de FAV fornece uma plataforma útil que recapitula perturbações neuromotoras comuns relatadas por pacientes em hemodiálise, permitindo que os pesquisadores investiguem os mecanismos da fisiopatologia da DRA e testem potenciais terapêuticas.
Introduction
O estabelecimento e a preservação do acesso vascular funcional continuam sendo uma meta primária importante para pacientes com doença renal terminal (DRT) em terapia renal substitutiva via hemodiálise1. Tratamentos repetidos de hemodiálise são necessários para remover os resíduos, normalizar eletrólitos e manter o equilíbrio hídrico uma vez que a função renal se torne inadequada e, portanto, são necessários para a sobrevida em longo prazo2. Portanto, o acesso vascular representa uma "tábua de salvação" para pacientes com DRCT, e a colocação de fístula arteriovenosa autógena (FAV) continua sendo uma opção preferencial de acesso para diálise entre essa coorte3. No entanto, aproximadamente 30%-60% dos pacientes em hemodiálise experimentam um espectro de incapacidades da mão, clinicamente definidas como disfunção da mão relacionada ao acesso (DRA). Os sintomas da DRA podem variar de fraqueza e descoordenação a monoplegia e gangrena digital, que podem ocorrer precocemente após a criação da FAV ou desenvolver-se gradualmente com a maturação da fístula. Além disso, a DRA complica o esquema de tratamento da DRCT, que está associado a pior qualidade de vida, alto risco de doença cardiovascular e aumento da mortalidade 2,3,4.
Vários modelos animais têm sido desenvolvidos para estudar o remodelamento vascular induzido por alterações hemodinâmicas após a criação da FAV5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Modelos de animais de grande porte com FAV ilíaca ou femoral 16,17,18,19,20 e modelos de roedores utilizando anastomose artéria jugular carotídea ou formação de fístula aorta-veia cava inferior infrarrenal estão bem estabelecidos para examinar os aspectos acima mencionados da maturação e perviedade da FAV21 . Por exemplo, hipertensão venosa, maior diâmetro luminal e aumento da espessura da parede da veia são sinais de sucesso na maturação da FAV, enquanto fibrose substancial da camada média e hiperplasia intimal ou desenvolvimento de trombo sem alterações no fluxo frequentemente caracterizam falhas na FAV 6,15. No entanto, os modelos animais de grande porte não possuem a flexibilidade experimental ou as capacidades transgênicas dos modelos murinos, enquanto os modelos atuais de roedores não facilitam prontamente a investigação da DRA devido à localização anatômica e/ou à falta de patologia associada aos membros. De fato, devido à falta de um modelo animal pré-clínico estabelecido que recapitule o fenótipo clínico relevante, o progresso da pesquisa para elucidar os mecanismos patobiológicos e desenvolver novas estratégias terapêuticas permaneceu estagnado, apesar de um aumento progressivo no número de pacientes sintomáticos com DRA. Portanto, o objetivo primário deste estudo é apresentar um modelo único de DRA em camundongos, fornecendo etapas do procedimento de microcirurgia de FAV e caracterização da fisiopatologia relacionada à FAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade da Flórida e pelo Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.
NOTA: Camundongos C57BL/6J machos adultos jovens (8-10 semanas de idade) foram adquiridos do The Jackson Laboratory e alojados em um biotério controlado com luz (12 h de luz: ciclo de 12 h de escuro), temperatura (22 °C ± 1 °C) e umidade (50% ± 10%). Cinco camundongos foram autorizados a habitar por gaiola (W:18 cm x L:29 cm x H:12,5 cm) com materiais de nidificação, alimento e água sendo disponibilizados ad libitum. Após 7 dias de aclimatação do habitat com ração padrão, os camundongos foram alterados para uma dieta à base de caseína por 7 dias como uma fase de transição da dieta. Posteriormente, camundongos foram alimentados com ração à base de caseína com suplementação de adenina 0,2%-0,15% por 2-3 semanas para induzir disfunção renal (DRC) antes da cirurgia de FAV, conforme descrito anteriormente22,23,24. Camundongos controle receberam ração à base de caseína sem suplementação de adenina (controle). As dietas controle e DRC foram mantidas durante todo o período de recuperação pós-operatória (DPO).
1. Medidas pré-operatórias
- Avaliar os resultados basais/pré-operatórios, os diâmetros dos vasos aorto-ilíacos e os parâmetros de fluxo hemodinâmico usando imagens de ultrassom duplex e a perfusão do membro posterior via laser Doppler, conforme descrito anteriormente25.
- Determinar a força de preensão unilateral do membro pélvico e a avaliação da marcha em esteira para estabelecer a função basal do membro pélvico, conforme descritoanteriormente25,26.
- Avaliar a função renal medindo a taxa de filtração glomerular (TFG) via depuração de CTFI-inulina e/ou nível sérico de nitrogênio ureico (ureia) no sangue, conforme descrito anteriormente22,24,27.
2. Preparo cirúrgico
- Preparar as seguintes ferramentas e suprimentos cirúrgicos (Tabela de Materiais): esterilizador de contas quentes, lubrificante para os olhos, aparador de caneta, preparadores de álcool, lenços de clorexidina, pinças Graefe extrafinas, soro fisiológico 0,9% esterilizado, seringas de agulha 29 G e 31 G, esponjas não tecidas 2 x 2, cotonetes médios de ponta única (SC-9) e pequenos de ponta dupla, pontiagudos (SC-4), cautério a baixa temperatura, pinça Dumont reta, pinça Dumont angulada de 45°, tesoura de mola Vannas reta, tesoura de mola Vannas curva, porta-agulhas de cabo redondo, suturas de múltiplos tamanhos (4-0 de seda, 5-0 PGA, 6-0 de seda e 10-0 de nylon), heparina, esponja de gelatina absorvível, porta-agulha reto e buprenorfina.
OBS: Os elásticos de fixação das extremidades e afastadores para abdome e pernas foram feitos à mão. - Esterilizar os preparativos cirúrgicos em autoclave com esterilização a vapor a 120-125 °C por 30 min seguido de secagem por 30 min antes da cirurgia. Utilizar limpeza com etanol a 70% seguida de esterilização por esferas quentes (240-270 °C por 3 min) entre cada cirurgia animal.
- Preparar solução salina normal 0,9% esterilizada, solução salina heparinizada (100 UI/mL) e buprenorfina (0,01 mg/mL) usando seringas com agulha 29-31 G.
3. Anestesia e posicionamento
- Iniciar anestesia em camundongos na câmara de indução (0,8 mL/min, isoflurano a 2,5%). Uma vez que o camundongo esteja adequadamente anestesiado, coloque-o em decúbito dorsal no posto cirúrgico coberto por um campo estéril. Reduzir a concentração de isoflurano até ~1,2% durante as etapas de barbear e posicionamento.
- Aplique o lubrificante ocular para proteger os olhos do ressecamento durante a cirurgia.
- Usando um aparador de caneta, raspe os cabelos abdominais para a operação e os pelos da perna para as medidas de perfusão pós-operatórias. Limpe os cabelos do campo cirúrgico.
- Fixar os membros superiores e inferiores com elásticos e tachas, verificar a profundidade da anestesia monitorando o reflexo de pinça dos dedos dos pés e titular a anestesia conforme necessário. Realizar a avaliação do padrão respiratório a cada 3-5 min durante todo o procedimento cirúrgico para calibrar o nível de anestesia.
4. Exploração da área alvo cirúrgica
- Limpe a área da pele raspada várias vezes, alternando entre preparação de álcool e lenços umedecidos de clorexidina em um padrão circular para desinfetar o campo cirúrgico.
- Realizar laparotomia mediana desde a borda inferior da margem esternal até a sínfise púbica. Dissecar o coxim gorduroso do púbis para obter um campo operatório mais amplo.
- Abra a celiotomia para acessar o conteúdo peritoneal com afastadores e eviscere os intestinos delgado e grosso usando cotonetes redondos médios e de extremidade única. Cubra os intestinos com uma esponja não tecida embebida em soro fisiológico.
- Uma vez obtida a exposição adequada da vasculatura retroperitoneal, cubra o intestino remanescente, os rins e os ureteres com pequenas esponjas não tecidas embebidas em soro fisiológico. Evacue uma bexiga distendida apertando suavemente a cúpula da bexiga com cotonetes redondos médios e de extremidade única, conforme necessário.
- Dissecar cuidadosamente a fáscia perivascular e o tecido adiposo de aproximadamente 1 cm proximal à bifurcação aórtica estendendo-se até o nível da bifurcação ilíaca esquerda usando pinça Dumont reta e pequenos cotonetes duros, pontiagudos e pontiagudos.
NOTA: A artéria e a veia ilíaca esquerda são deixadas aderidas uma à outra enquanto isolam as estruturas arteriovenosas em massa. Essa etapa proporcionará mobilização suficiente dos vasos para facilitar a criação de FAV. - Se forem encontrados pequenos ramos venosos originados ou convergindo com a veia ilíaca comum esquerda, liga-os com cautério a baixa temperatura com ou sem fio de seda 6-0, conforme necessário.
- Passar a ponta da pinça angulada sob o feixe vascular ilíaco comum esquerdo e espalhar suavemente várias vezes para mobilizar os vasos da musculatura retroperitoneal subjacente (Figura 1A).
5. Criação de uma anastomose de fístula arteriovenosa ilíaca comum
- Coloque duas suturas de seda 4-0 ao redor do feixe arteriovenoso comum esquerdo isolado e use-as como ligaduras (por exemplo, pinças cruzadas) ao feixe vascular. Crie um único nó a cada gravata de seda 4-0 e aplique-os sequencialmente de proximal para distal.
- Certifique-se de que as pinças cruzadas de gravata de seda estejam suficientemente afastadas para isolar ~2 mm de comprimento do vaso, e a aplicação sequencial das ligaduras de sutura precipitará o ingurgitamento da veia ilíaca esquerda.
- Usando as cordas de sutura de seda 4-0 como alças, gire o feixe vascular arteriovenoso da ilíaca esquerda no sentido horário e ajuste fino da posição para localizar temporariamente a veia anterior à artéria (Figura 1B).
- Realizar venotomia longitudinal (~1 mm) com tesoura reta de mola Vannas e lavar suavemente o sangue residual da luz venosa com solução fisiológica a 0,9% (Figura 1C). Tenha cuidado durante esta etapa, pois uma descarga de soro fisiológico de alta pressão pode causar ruptura venosa.
NOTA: A região de cor vermelha que permanece na artéria ilíaca após o flushing venoso fornece uma janela visual para a etapa seguinte. - Coloque uma sutura de náilon 10-0 imbricante através da parede posterior da veia.
OBS: Esta porção da veia ilíaca deve estar em aposição imediata à parede anterior da artéria ilíaca, e as paredes são naturalmente aderentes. A sutura deve atravessar ambas as paredes e amarrá-la com um nó único (Figura 1D). Observe que uma pequena quantidade de sangramento, que se origina do sangue estagnado na artéria ilíaca, aparecerá quando a agulha passar por ambas as paredes. Se o sangramento intraluminal continuar durante essa etapa, as pinças cruzadas de sutura de seda podem estar muito soltas e precisam ser mais apertadas. - Segure as extremidades da sutura imbricada e coloque-as sob tensão suave para deslocar a parede anterior da parede posterior da artéria ilíaca. Faça uma incisão elíptica de ~1,0 mm x 0,3 mm usando tesoura curva de mola de Vannas, removendo as paredes aderentes da artéria e veia ilíacas.
NOTA: A fístula arteriovenosa é assim criada uma vez que este canal comum é estabelecido. É possível lesar as paredes laterais da veia durante essa etapa, pois a incisão da parede da veia ilíaca posterior/artéria ilíaca anterior é realizada através da exposição à venotomia. Deve-se ter cautela para evitar essa complicação, pois ela pode reduzir consideravelmente o diâmetro da fístula e levar ao desenvolvimento de trombo. - Lavar suavemente o sangue residual da luz arterial exposta com solução fisiológica a 0,9% e heparinizada (100 UI/mL)28 (Figura 1E).
- Após a confecção da FAV, reparar a venotomia inicial da parede anterior com duas ou três suturas de náilon 10-0 de forma interrompida (Figura 1F).
- Restaurar o feixe vascular à sua orientação anatômica original e colocar um pequeno pedaço de esponja de gelatina absorvível embebida em soro fisiológico adjacente à venotomia reparada para facilitar a hemostasia.
- Soltar as ligaduras de pinça cruzada de nó único 4-0 sequencialmente de distal para proximal. Monitore atentamente o local da venotomia quanto ao sangramento excessivo enquanto afrouxa cada sutura.
- Se o reparo não for adequadamente hemostático, reaplique as pinças cruzadas e coloque outra sutura de náilon 10-0 no local do sangramento. Se a hemostasia estiver assegurada, remova as suturas e, em seguida, a esponja de gelatina absorvível.
- Esfregue suavemente o feixe vascular com pequenos cotonetes duros, afiados e pontiagudos, que facilitam ainda mais a restauração do fluxo sanguíneo. Confirmar o sucesso técnico da operação usando a visualização de sangue oxigenado vermelho vivo pulsátil entrando na veia ilíaca e misturando-se com sangue venoso escuro retornando do membro posterior.
- Injetar solução salina heparinizada (0,2 UI/g)15 na VCI para anticoagulação sistêmica para melhorar os resultados de perviedade da FAV.
NOTA: Embora esta etapa ocorra após a reconstrução vascular (ao contrário do análogo humano, onde a heparinização ocorre antes do pinçamento do vaso), observou-se redução do sangramento intraoperatório e melhora da patência da FAV quando realizada nesta fase do procedimento. A injeção em um local coberto por fáscia e/ou gordura é preferível para evitar sangramento do local da punção. - Inspecionar novamente o sítio cirúrgico em busca de hemostasia após a injeção de solução salina heparinizada. Se não houver problemas de sangramento, feche a fáscia da linha média e, em seguida, a incisão da pele com suturas absorvíveis de PGA 5-0 de forma corrida.
- Para operações simuladas, siga todas as etapas principais do procedimento, exceto a formação de FAV. Aplicar um nó único da ligadura de seda 4-0 na extremidade proximal do feixe arteriovenoso ilíaco esquerdo e combinar os tempos de pinça com as cirurgias de FAV (por exemplo, ~20 min, dependendo da proficiência do microcirurgião).
6. Cuidados pós-operatórios e mensuração
- Após o fechamento da laparotomia, medir a perfusão sanguínea dos músculos tibial anterior bilateral e patas ventrais usando laser Doppler.
NOTA: Déficits de perfusão unilaterais confirmarão o desvio do fluxo arterial da fístula ("roubar"). - Administrar 0,1 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea e devolver o rato a uma gaiola pré-aquecida com cama macia altamente absorvível com ninho.
- Permita que o mouse se recupere na gaiola pré-aquecida até que a anestesia se desgaste, o que será óbvio quando o mouse estiver deambulando e interagindo (~2 h). Durante a recuperação, dê ao rato acesso fácil a uma dieta hidratada e suave.
- Administrar buprenorfina e/ou hidratação salina subcutânea a cada 12 h até 48 h e realizar monitorização diária por 5 dias de pós-operatório. Eutanásia de animais com deterioração ou necrose tecidual excessiva, classificada como escore de isquemia modificado ≥229.
- Utilizar ultrassonografia duplex seriada para avaliar a patência da fístula no pós-operatório; camundongos com trombose de fístula são excluídos de análises subsequentes, a menos que o objetivo dos experimentos seja caracterizar falha na maturação da FAV.
- Determinar outras medidas de desfecho pós-operatório, como hemodinâmica local, força de preensão manual e desempenho da marcha durante o período de recuperação. Coletar fístula e tecidos musculares para avaliação histomorfológica ao final do experimento durante o sacrifício25,27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Animais expostos à dieta com adenina apresentaram taxas de filtração glomerular reduzidas (controle: 441,3 ± 54,2 μL/min vs. DRC: 165,1 ± 118,3 μL/min, p < 0,05) e níveis séricos de nitrogênio ureico (controle: 20,39 ± 4,2 μL/min vs. DRC: 38,20 ± 10,65 μL/min, p < 0,05) em comparação aos animais que receberam ração à base de caseína, confirmando a presença de insuficiência renal prévia à cirurgia de fístula arteriovenosa.
Validação da perviedade da FAV
Embora a confirmação visual do sucesso técnico no intraoperatório seja a identificação inicial da perviedade da fístula, ela não garante totalmente a perviedade ou a maturação fisiológica durante todo o período do estudo. Os resultados de perviedade pós-operatória (sucesso ou falha) foram determinados tanto pela ultrassonografia duplex quanto pelo exame histológico, como demonstramos anteriormente25. A Figura 2 mostra as imagens representativas do modo B, do Doppler com onda de pulso e do Doppler colorido e os cortes morfológicos de uma anastomose arteriovenosa de fístula, respectivamente. Uma fístula pérvia é visualizada diretamente na análise do Doppler colorido com hemodinâmica turbulenta, bem como alargamento espectral no local da fístula. Alterações adaptativas mediadas pelo fluxo dos vasos de entrada e saída também confirmam indiretamente a perviedade da FAV. Especificamente, a aorta tem pico de velocidade sistólica e diastólica final elevados, a VCI desenvolve pulsatilidade com pico de velocidade elevado e a dilatação do vaso tanto na aorta quanto na VCI é aparente (Figura 2A). Em contraste, uma fístula falhada ou trombosada quase não tem alterações nas medidas de entrada ou saída e nenhuma turbulência ou alargamento espectral dentro da vasculatura ilíaca esquerda. Geralmente, a falência da fístula por trombose oclui parcial ou totalmente a artéria ilíaca esquerda, que é visualizada como fluxo mínimo ou nulo na análise do Doppler com onda de pulso. A Figura 2B mostra cortes histológicos seriados de uma FAV 2 semanas após a criação cirúrgica. Os cortes têm 5 μm de espessura e coloração com tricrômico de Masson. A anastomose cirúrgica da artéria e veia é óbvia, e há arterial venosa distinta (espessamento da parede venosa e fibrose com hiperplasia neointimal). Ultrassonografia foi realizada no 3º dia de pós-operatório para descartar camundongos com falha precoce da FAV e, em seguida, medidas seriadas e não invasivas foram obtidas durante todo o período do estudo. A avaliação morfológica fornece detalhes do remodelamento vascular específico do período no momento do sacrifício e foi usada para confirmar os achados ultrassonográficos. Uma taxa de perviedade da FAV de aproximadamente 50% (20%-30% de morte pós-operatória e 20%-30% de falha da fístula)25 é esperada inicialmente, mas a taxa de sucesso cirúrgico melhora significativamente (~5%-10% de falha) com a prática e o aumento da proficiência.
Características fisiopatológicas após formação de fístula arteriovenosa ilíaca
Alteração hemodinâmica: As características hemodinâmicas da FAV e da perfusão distal do membro pélvico devem ser quantificadas para contextualizar a fisiopatologia do membro relacionado ao acesso. As medidas de ultrassonografia com Doppler modo B e onda de pulso após a cirurgia revelaram dilatação dos vasos de entrada e saída (VCI: 1,4 vezes no DPO3 e 1,6 vezes no DPO13 e ARI: 1,4 vezes no DPO3 e 1,7 vez no DPO13, p < 0,05) e aumento da velocidade sistólica de pico (velocidade sistólica de pico da VCI: 5,5 vezes no DPO3 e 4,9 vezes no DPO13 e velocidade sistólica de pico da ARI: 2,8 vezes no POD3 e 3,7 vezes no POD13, P < 0,05) em comparação com os animais sham (Figura 3A-D). Além disso, a isquemia unilateral dos membros pélvicos foi aparente no pós-operatório, o que confirma hipoperfusão arterial mediada por roubo distal à fístula. Espera-se que o déficit de perfusão da pata esquerda seja de ~20% do membro contralateral, e o déficit de perfusão do músculo tibial anterior seja de ~60%. Os camundongos recuperaram parcialmente esses déficits durante todo o período de estudo (Figura 3E,F).
Disfunção dos membros posteriores: A incapacidade do membro ipsilateral é esperada após a criação da FAV, que envolve claudicação leve (na maioria dos casos) a grave (poucos casos) nas pernas que pode durar vários dias. Paralisia não resolvida dos membros posteriores e/ou necrose da pata podem ser indicativas de um insulto isquêmico grave causado pelo tamanho da fístula fora da faixa normal. A função neuromotora dos membros pélvicos foi quantificada por meio de testes de força de preensão manual e análise do padrão de marcha em esteira, que foram realizados sequencialmente durante todo o período de recuperação. A força de preensão unilateral esperada é de ~50% do membro contralateral no 4º dia de pós-operatório, com recuperação gradual. Camundongos com FAV também necessitam de velocidades reduzidas na esteira durante a avaliação da marcha (<20 cm/min) (Figura 3G,H).
Figura 1: Etapas da microcirurgia da anastomose da fístula arteriovenosa . (A) Exposição da área-alvo cirúrgica, incluindo laparotomia mediana e isolamento da artéria ilíaca esquerda/veia. (B) ligaduras de sutura 4-0 (por exemplo, usadas como pinças temporárias de vaso) no feixe arteriovenoso comum esquerdo nos locais proximal e distal. (C) Venotomia longitudinal na parede anterior da veia ilíaca. (D) sutura imbricante 10-0 através da parede posterior da veia ilíaca e parede anterior da artéria ilíaca. (E) Incisão elíptica com distensão imbricante. (F) A venotomia longitudinal inicial da Imagem C é reparada com sutura 10-0 interrompida. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Validação da perviedade da fístula arteriovenosa . (A) Determinação ultrassonográfica da perviedade da FAV. As características de uma fístula pérvia incluem dilatação arterial e venosa no modo B, fluxo turbulento na análise com Doppler colorido da vasculatura ilíaca esquerda, alargamento espectral pulsátil na avaliação com Doppler de onda pulsátil dos vasos ilíacos esquerdos, aumento da velocidade de pico sistólico e diastólico final da aorta infrarrenal e pulsatilidade dentro da VCI com aumento da velocidade sistólica de pico. Fluxo diminuído ou ausente dentro dos vasos ilíacos é sugestivo de falha/trombose da FAV. A técnica de ultrassom duplex fornece dados morfológicos e fisiológicos. As medidas de velocidade são em milímetros por segundo. (B) Avaliação morfológica da anastomose com FAV 14 dias após a confecção da fístula. As imagens foram coradas com tricrômico de Masson. Há alterações anatômicas na microscopia de cortes seriados da anatomia arteriovenosa comum proximal (extremidade esquerda) para distal (extremidade direita). A oclusão da vasculatura por coágulo e/ou hiperplasia neointimal excessiva confirma a falência da FAV. As imagens têm ampliação de 10x. A: Artéria ilíaca comum, V: Veia ilíaca comum. Barra de escala = 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Características fisiopatológicas anteriores e posteriores à formação da FAV. Quantificação da ultrassonografia em (A) diâmetro da aorta infrarrenal, (B) velocidade sistólica de pico da aorta infrarrenal, (C) diâmetro da veia cava inferior e (D) velocidade sistólica de pico da veia cava inferior no pré-operatório e no 3º e 13º dias de pós-operatório. Medida da perfusão sanguínea local (Laser doppler) na pata (E) tibial anterior e (F) ventral antes da cirurgia e durante todo o período de recuperação de 2 semanas. Os testes funcionais neuromotores incluíram (G) força de preensão manual e (H) teste em esteira rolante no pré e pós-operatório. Os dados foram analisados por meio de ANOVA two-way, e o teste post-hoc de Tukey foi realizado quando apropriado. Os valores são médios ± DP. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 vs. Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ####p < 0,0001 vs. CKD_Sham. N = 6-10/grupo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A prevalência de pacientes em hemodiálise com DRA após a criação de FAV continua a aumentar30,31. De fato, complicações sintomáticas não resolvidas 4,32,33 como dor, fraqueza, parestesia e/ou redução da amplitude de movimento podem afetar negativamente o bem-estar do paciente 4,32,33,34,35,36 e ameaçar sua capacidade de receber tratamento repetitivo de hemodiálise de alta qualidade. Embora a obtenção de acesso durável à hemodiálise seja uma prioridade máxima para pacientes com DRCT, para indivíduos afetados por TAR, esses sintomas potencialmente debilitantes devem ser abordados para melhorar os resultados centrados no paciente. No presente estudo, como um marco pré-clínico importante no campo da pesquisa da CARDA, apresentamos um procedimento cirúrgico detalhado para gerar um modelo murino de FAV ilíaca, o que facilita o exame da fisiopatologia do membro associada à FAV. Além das alterações esperadas na hemodinâmica aorto-ilíaca e da VCI, a criação de FAV ilíaca produziu características clinicamente relevantes de disfunção do membro, incluindo isquemia tecidual periférica com comprometimento motor grosseiro.
Cada passo da microcirurgia deve ser realizado com cuidado requintado para evitar possíveis traumas vasculares, que podem causar alterações substanciais tanto na hemodinâmica quanto na patologia do membro. Durante a ligadura, o nó de gravata de seda 4-0 só deve ser apertado o suficiente para evitar o fluxo sanguíneo através do sítio cirúrgico de interesse. A tensão excessiva do nó da ligadura da sutura pode lesar a parede do vaso, o que pode causar sangramento indesejável e contribuir para a hiperplasia intimal, levando à diminuição da patência da FAV. Em particular, a correção da venotomia é uma das etapas mais importantes do procedimento cirúrgico. Uma mordida muito grande na parede da veia pode levar à estenose do vaso e, em última análise, trombose, enquanto um reparo muito raso pode causar deiscência com hemorragia. Da mesma forma, o sangramento também pode ocorrer se as suturas de reparo da venotomia estiverem espaçadas demais. Em nossa experiência, um intervalo de ~0,025-0,03 mm entre as suturas é suficiente para criar um reparo hemostático.
Além da reprodutibilidade da técnica cirúrgica, a utilização de um modelo animal específico de doença ou sintoma é uma das mais importantes contribuições do trabalho atual. No presente estudo, os animais foram expostos a uma dieta de adenina de 0,2%-0,15% por 2-3 semanas antes e após a cirurgia de FAV para estabelecer disfunção renal e um ambiente urêmico análogo aos pacientes com DRCT. Comparado a modelos cirúrgicos de DRC (por exemplo, nefrectomia 5/6), um modelo de dieta com adenina apresenta várias vantagens, incluindo taxas de mortalidade muito baixas e menor variação interobservador27,37. Notadamente, a gravidade e as consequências fisiopatológicas podem ser modificadas com base na concentração e/ou duração da dieta com adenina38,39. Juntamente com a nefropatia induzida por dieta, o modelo animal atual aqui descrito pode preparar o terreno para os pesquisadores estudarem os mecanismos fisiopatológicos pelos quais a uremia afeta a DRA. Além disso, modelos animais adicionais de doença podem ser adicionados ao modelo cirúrgico para testar a influência de condições comórbidas altamente prevalentes, como diabetes, hipertensão ou doença arterial coronariana.
Embora o procedimento apresentado de FAV ilíaca modele de forma reprodutível aspectos chave da fisiopatologia do membro relevantes para pacientes em hemodiálise com TAR, existem algumas limitações e complicações que merecem discussão. Primeiro, camundongos submetidos a esse procedimento não possuem verdadeiro "acesso vascular"; Assim, experimentos envolvendo tratamentos experimentais em hemodiálise não são possíveis. Em segundo lugar, a gravidade da disfunção do membro é afetada pelo tamanho da comunicação arteriovenosa, de modo que a criação consistente de FAV é fundamental para resultados reprodutíveis. Por exemplo, a criação de uma grande FAV pode produzir isquemia grave dos membros posteriores, que pode culminar em necrose do membro. Novos microcirurgiões que iniciam o procedimento são encorajados a usar análises histológicas das FAVs criadas para analisar o tamanho quanto à consistência. Em camundongos submetidos a outros modelos de FAV, remodelação cardíaca, incluindo hipertrofia e possivelmente insuficiência cardíaca, tem sido relatada 40,41,42. As alterações cardíacas no modelo atual não foram rigorosamente avaliadas, embora tenhamos observado qualitativamente hipertrofia cardíaca em comparação com animais sham. Além disso, futuras análises de longo prazo são necessárias para avaliar como o sistema cardiovascular murino se adapta à formação e maturação de FAV ilíaca. Uma preocupação adicional é que camundongos C57BL6 mais jovens têm a capacidade de gerar respostas de arteriogênese e angiogênese a estímulos isquêmicos, levando à formação de vasos colaterais, como demonstrado pela modesta recuperação da perfusão de membros com laser Doppler neste estudo. Assim, é possível que camundongos se recuperem completamente da patologia dos membros da FAV uma vez que mais redes colaterais robustas tenham se formado; entretanto, estudos futuros são necessários para mapear o crescimento colateral e as alterações da vasculatura distal.
Até o momento, os mecanismos subjacentes pelos quais a função da mão é prejudicada e/ou exacerbada pela colocação de FAV são incompletamente compreendidos. Dado que o genoma de camundongos é bem caracterizado e há pronto acesso a uma ampla gama de modelos transgênicos para manipulação gênica em camundongos, este modelo cirúrgico de FAV ilíaca fornece uma ferramenta útil para a descoberta biomédica em torno da DRA. Em comparação com outros modelos de FAV em roedores, que empregam cirurgia de vasculatura central (por exemplo, modelo de fístula aorto-cava), ou modelos de animais de grande porte com FAV femoral ou ilíaca, o presente modelo de FAV ilíaca com ou sem uremia induzida por dieta com adenina fornece aos investigadores uma plataforma experimental robusta que pode ser usada para interrogar os mecanismos biológicos subjacentes associados à ARHD de hemodiálise e gerar novas terapias-alvo. Além disso, os modelos pré-clínicos são geralmente considerados cruciais para o desenvolvimento e validação precoce de terapias farmacêuticas, das quais nenhuma está atualmente disponível para tratar/prevenir a ARHD. Notadamente, esse modelo também é passível de alterações tanto no tamanho da FAV quanto na gravidade da disfunção renal, o que permite aos investigadores modular cuidadosamente a gravidade da patologia. Em conclusão, este modelo único de FAV pré-clínica em camundongos pode servir como uma plataforma prática para facilitar o desenvolvimento terapêutico pré-clínico com o objetivo de reduzir a incapacidade da mão após a colocação de FAV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente ao Dr. Guanyi Lu da Divisão de Cirurgia Vascular e Terapia Endovascular da Universidade da Flórida pelo apoio técnico no desenvolvimento do modelo de FAV ilíaca, bem como treinamento cirúrgico, e a Ravi Kumar do Departamento de Fisiologia Aplicada e Cinesiologia da Universidade da Flórida pelo suporte técnico na obtenção das imagens microcirúrgicas ao vivo.
Este trabalho foi apoiado por subsídios do National Institutes of Health e National Heart, Lung, and Blood, Institute números R01-HL148697 (para S.T.S.), bem como o número de concessão da American Heart Association POST903198 (para K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
References
- Gameiro, J., Ibeas, J. Factors affecting arteriovenous fistula dysfunction: a narrative review. The Journal of Vascular Access. 21 (2), 134-147 (2020).
- Culleton, B. F., Asola, M. R. The impact of short daily and nocturnal hemodialysis on quality of life, cardiovascular risk and survival. Journal of Nephrology. 24 (4), 405 (2011).
- Huber, T. S., et al. Access-related hand ischemia and the hemodialysis fistula maturation study. Journal of Vascular Surgery. 64 (4), 1050-1058 (2016).
- Rehfuss, J. P., et al. The spectrum of hand dysfunction after hemodialysis fistula placement. Kidney International Reports. 2 (3), 332-341 (2017).
- Caplice, N. M., et al. Neoangiogenesis and the presence of progenitor cells in the venous limb of an arteriovenous fistula in the rat. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 293 (2), 470-475 (2007).
- Castier, Y., et al. Characterization of neointima lesions associated with arteriovenous fistulas in a mouse model. Kidney International. 70 (2), 315-320 (2006).
- Croatt, A. J., et al. Characterization of a model of an arteriovenous fistula in the rat: the effect of L-NAME. The American Journal of Pathology. 176 (5), 2530-2541 (2010).
- Guzman, R. J., Krystkowiak, A., Zarins, C. K. Early and sustained medial cell activation after aortocaval fistula creation in mice. Journal of Surgical Research. 108 (1), 112-121 (2002).
- Kojima, T., et al. The relationship between venous hypertension and expression of vascular endothelial growth factor: hemodynamic and immunohistochemical examinations in a rat venous hypertension model. Surgical Neurology. 68 (3), 277-284 (2007).
- Misra, S., et al. The rat femoral arteriovenous fistula model: increased expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 at the venous stenosis. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 19 (4), 587-594 (2008).
- Nath, K. A., Kanakiriya, S. K., Grande, J. P., Croatt, A. J., Katusic, Z. S. Increased venous proinflammatory gene expression and intimal hyperplasia in an aorto-caval fistula model in the rat. The American Journal of Pathology. 162 (6), 2079-2090 (2003).
- Nath, K. A., et al. The murine dialysis fistula model exhibits a senescence phenotype: pathobiological mechanisms and therapeutic potential. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 315 (5), 1493-1499 (2018).
- Yamamoto, K., et al. The mouse aortocaval fistula recapitulates human arteriovenous fistula maturation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (12), 1718-1725 (2013).
- Yang, S. T., et al. Adult mouse venous hypertension model: common carotid artery to external jugular vein anastomosis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (95), e50472 (2015).
- Wong, C. Y., et al. A novel murine model of arteriovenous fistula failure: the surgical procedure in detail. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (108), e53294 (2016).
- Krishnamoorthy, M. K., et al. Anatomic configuration affects the flow rate and diameter of porcine arteriovenous fistulae. Kidney International. 81 (8), 745-750 (2012).
- Wang, Y., et al. Venous stenosis in a pig arteriovenous fistula model-anatomy, mechanisms and cellular phenotypes. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (2), 525-533 (2008).
- Loveland-Jones, C. E., et al. A new model of arteriovenous fistula to study hemodialysis access complications. The Journal of Vascular Access. 15 (5), 351-357 (2014).
- Nugent, H. M., et al. Perivascular endothelial implants inhibit intimal hyperplasia in a model of arteriovenous fistulae: a safety and efficacy study in the pig. Journal of Vascular Research. 39 (6), 524-533 (2002).
- Butterfield, A. B., et al. Inverse effect of chronically elevated blood flow on atherogenesis in miniature swine. Atherosclerosis. 26 (2), 215-224 (1977).
- Kwei, S., et al. Early adaptive responses of the vascular wall during venous arterialization in mice. The American Journal of Pathology. 164 (1), 81-89 (2004).
- Berru, F. N., et al. Chronic kidney disease exacerbates ischemic limb myopathy in mice via altered mitochondrial energetics. Scientific Reports. 9 (1), 15547 (2019).
- Khattri, R. B., Thome, T., Ryan, T. E. Tissue-specific 1H-NMR metabolomic profiling in mice with adenine-induced chronic kidney disease. Metabolites. 11 (1), 45 (2021).
- Thome, T., et al. Impaired muscle mitochondrial energetics is associated with uremic metabolite accumulation in chronic kidney disease. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (1), 139826 (2021).
- Kim, K., et al. Development of a murine iliac arteriovenous fistula model for examination of hemodialysis access-related limb pathophysiology. Journal of Vascular Surgery-Vascular Science. 2, 247-259 (2021).
- Castro, B., Kuang, S. Evaluation of muscle performance in mice by treadmill exhaustion test and whole-limb grip strength assay. Bio-protocol. 7 (8), 2237 (2017).
- Kim, K., et al. Skeletal myopathy in CKD: a comparison of adenine-induced nephropathy and 5/6 nephrectomy models in mice. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 321 (1), 106-119 (2021).
- Yang, B., Shergill, U., Fu, A. A., Knudsen, B., Misra, S. The mouse arteriovenous fistula model. Journal of Vascular and Interventional Radiology. 20 (7), 946-950 (2009).
- Brenes, R. A., et al. Toward a mouse model of hind limb ischemia to test therapeutic angiogenesis. Journal of Vascular Surgery. 56 (6), 1669-1679 (2012).
- Bello, A. K., et al. Assessment of global kidney health care status. Journal of the American Medical Association. 317 (18), 1864-1881 (2017).
- Levin, A., et al. Global kidney health 2017 and beyond: a roadmap for closing gaps in care, research, and policy. The Lancet. 390 (10105), 1888-1917 (2017).
- Hassabi, M., et al. Comparing strength and range of motion of the upper limb with AV fistula access with the contralateral upper limb among patients treated with hemodialysis. Researcher Bulletin of Medical Sciences. 22 (1), 1 (2017).
- Capitanini, A., Galligani, C., Lange, S., Cupisti, A. Upper limb disability in hemodialysis patients: evaluation of contributing factors aside from amyloidosis. Therapeutic Apheresis and Dialysis. 16 (3), 242-247 (2012).
- Altintepe, L., et al. Physical disability, psychological status, and health-related quality of life in older hemodialysis patients and age-matched controls. Hemodialysis International. 10 (3), 260-266 (2006).
- Castaneda, C., et al. Resistance training to reduce the malnutrition-inflammation complex syndrome of chronic kidney disease. American Journal of Kidney Diseases. 43 (4), 607-616 (2004).
- Hurton, S., et al. Upper extremity complications in patients with chronic renal failure receiving haemodialysis. Journal of Renal Care. 36 (4), 203-211 (2010).
- Mazumder, M. K., Giri, A., Kumar, S., Borah, A. A highly reproducible mice model of chronic kidney disease: Evidences of behavioural abnormalities and blood-brain barrier disruption. Life Sciences. 161, 27-36 (2016).
- Jia, T., et al. A novel model of adenine-induced tubulointerstitial nephropathy in mice. BioMed Central Nephrology. 14, 116 (2013).
- Kieswich, J. E., et al. A novel model of reno-cardiac syndrome in the C57BL/ 6 mouse strain. BioMed Central Nephrology. 19 (1), 346 (2018).
- Abassi, Z., Goltsman, I., Karram, T., Winaver, J., Hoffman, A. Aortocaval fistula in rat: a unique model of volume-overload congestive heart failure and cardiac hypertrophy. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 729497 (2011).
- Brower, G. L., Levick, S. P., Janicki, J. S. Inhibition of matrix metalloproteinase activity by ACE inhibitors prevents left ventricular remodeling in a rat model of heart failure. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 292 (6), 3057-3064 (2007).
- Francis, B. N., Abassi, Z., Heyman, S., Winaver, J., Hoffman, A. Differential regulation of ET (A) and ET (B) in the renal tissue of rats with compensated and decompensated heart failure. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 44, 362-365 (2004).
