Summary
Questo protocollo descrive in dettaglio le fasi chirurgiche della creazione della fistola artero-venosa iliaca comune murina. Abbiamo sviluppato questo modello per studiare la fisiopatologia degli arti correlata all'emodialisi.
Abstract
La malattia renale cronica è un grave problema di salute pubblica e la prevalenza della malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che richiede terapie sostitutive renali croniche come l'emodialisi continua ad aumentare. Il posizionamento della fistola artero-venosa autogena (AVF) rimane un'opzione di accesso vascolare primaria per i pazienti con ESRD. Sfortunatamente, circa la metà dei pazienti in emodialisi sperimenta una disfunzione della mano correlata alla dialisi (ARHD), che va dalla parestesia sottile alla cancrena digitale. In particolare, i driver biologici sottostanti responsabili dell'ARHD sono poco conosciuti e non esiste un modello animale adeguato per chiarire i meccanismi e / o sviluppare nuove terapie per la prevenzione / trattamento dell'ARHD. Qui, descriviamo un nuovo modello murino in cui viene creato un AVF tra l'arteria iliaca comune sinistra e la vena, facilitando così la valutazione della fisiopatologia degli arti. La microchirurgia comprende l'isolamento dei vasi, la venotomia longitudinale, la creazione di anastomosi artero-venosa e la ricostruzione venosa. Gli interventi chirurgici fittizi includono tutti i passaggi critici ad eccezione della creazione di AVF. Il posizionamento dell'AVF iliaca determina alterazioni clinicamente rilevanti nell'emodinamica centrale, ischemia periferica e compromissione delle prestazioni neuromotorie degli arti posteriori. Questo nuovo modello preclinico di AVF fornisce un'utile piattaforma che ricapitola le comuni perturbazioni neuromotorie riportate dai pazienti in emodialisi, consentendo ai ricercatori di studiare i meccanismi della fisiopatologia ARHD e testare potenziali terapie.
Introduction
La creazione e la conservazione dell'accesso vascolare funzionale rimangono un importante obiettivo primario per i pazienti con malattia renale allo stadio terminale (ESRD) che ricevono una terapia sostitutiva renale tramite emodialisi1. Ripetuti trattamenti di emodialisi sono necessari per rimuovere i prodotti di scarto, normalizzare gli elettroliti e mantenere l'equilibrio dei liquidi una volta che la funzione renale diventa inadeguata, e quindi sono necessari per la sopravvivenza a lungo termine2. Pertanto, l'accesso vascolare rappresenta un'ancora di salvezza per i pazienti con ESRD e il posizionamento della fistola artero-venosa autogena (AVF) rimane un'opzione di accesso alla dialisi preferita tra questa coorte3. Tuttavia, circa il 30% -60% dei pazienti in emodialisi sperimenta uno spettro di disabilità della mano, clinicamente definito come disfunzione della mano correlata all'accesso (ARHD). I sintomi dell'ARHD possono variare da debolezza e discoordinazione alla monoplegia e alla cancrena digitale, che possono verificarsi precocemente dopo la creazione di AVF o svilupparsi gradualmente con la maturazione della fistola. Inoltre, l'ARHD complica il programma di trattamento ESRD, che è associato a scarsa qualità della vita, alto rischio di malattie cardiovascolari e aumento della mortalità 2,3,4.
Diversi modelli animali sono stati sviluppati per studiare il rimodellamento vascolare indotto da alterazioni emodinamiche dopo la creazione di AVF 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. I modelli animali di grandi dimensioni con AVF iliaca o femorale 16,17,18,19,20 e modelli di roditori che utilizzano anastomosi della vena carotide-giugulare o formazione di fistola infrarenale della vena cava inferiore dell'aorta sono ben consolidati per esaminare i suddetti aspetti della maturazione e della pervietà AVF 21 . Ad esempio, l'ipertensione venosa, il maggior diametro luminale e l'aumento dello spessore della parete venosa sono segni di successo della maturazione dell'AVF, mentre la fibrosi sostanziale della media e l'iperplasia intimale o lo sviluppo di trombi senza cambiamenti nel flusso spesso caratterizzano i fallimenti dell'AVF 6,15. Tuttavia, i modelli animali di grandi dimensioni mancano della flessibilità sperimentale o delle capacità transgeniche dei modelli murini, mentre gli attuali modelli di roditori non facilitano prontamente lo studio dell'ARHD a causa della posizione anatomica e / o della mancanza di patologia degli arti associata. Infatti, a causa della mancanza di un modello animale preclinico stabilito che riassuma il fenotipo clinico rilevante, i progressi della ricerca per chiarire i meccanismi patobiologici e sviluppare nuove strategie terapeutiche sono rimasti stagnanti, nonostante un progressivo aumento del numero di pazienti con ARHD sintomatici. Pertanto, l'obiettivo principale di questo studio è quello di introdurre un modello murino unico di ARHD, fornendo fasi procedurali della microchirurgia AVF e caratterizzazione della fisiopatologia correlata all'AVF.
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Protocol
Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Florida e dal Malcom Randall Veterans Affairs Medical Center.
NOTA: I topi maschi C57BL / 6J giovani adulti (8-10 settimane) sono stati acquistati dal Jackson Laboratory e ospitati in una struttura per animali controllata con luce (12 ore di luce: ciclo di buio di 12 ore), temperatura (22 ° C ± 1 ° C) e umidità (50% ± 10%). Cinque topi sono stati autorizzati a dimorare per gabbia (L: 18 cm x L: 29 cm x A: 12,5 cm) con materiali di nidificazione, cibo e acqua resi disponibili ad libitum. Dopo 7 giorni di acclimatazione dell'habitat con chow standard, i topi sono stati cambiati in una dieta a base di caseina per 7 giorni come fase di transizione della dieta. Successivamente, i topi sono stati alimentati con il chow a base di caseina con un'integrazione di adenina allo 0,2% -0,15% per 2-3 settimane per indurre disfunzione renale (CKD) prima dell'intervento chirurgico AVF come precedentemente descritto22,23,24. I topi di controllo hanno ricevuto una dieta a base di caseina senza supplementazione di adenina (controllo). Le diete di controllo e CKD sono state mantenute per tutto il periodo di recupero postoperatorio (POD).
1. Misurazioni preoperatorie
- Valutare le misurazioni degli esiti basali / preoperatori, i diametri dei vasi aortoiliaci e i parametri di flusso emodinamico utilizzando l'ecografia duplex e la perfusione degli arti posteriori tramite laser Doppler come descritto in precedenza25.
- Determinare la forza unilaterale dell'aderenza degli arti posteriori e la valutazione dell'andatura del tapis roulant per stabilire la funzione basale degli arti posteriori come descritto in precedenza25,26.
- Valutare la funzionalità renale misurando la velocità di filtrazione glomerulare (GFR) tramite clearance dell'inulina FITC e/o il livello di azoto ureico nel sangue sierico (BUN) come descritto in precedenza22,24,27.
2. Preparazione chirurgica
- Preparare i seguenti strumenti chirurgici e forniture (tabella dei materiali): uno sterilizzatore a perline calde, un lubrificante per gli occhi, un tagliapenne, preparazioni di alcool, salviette alla clorexidina, pinze Graefe extrafini, soluzione salina sterilizzata allo 0,9%, siringhe ad aghi da 29 G e 31 G, 2 spugne non tessute, tondi medi a un estremità singola (SC-9) e piccoli tamponi di cotone duri, affilati, appuntiti (SC-4), cauterizzazione a bassa temperatura, pinza Dumont dritta, pinza Dumont angolata a 45°, forbici a molla Vannas dritte, forbici a molla Vannas curve, portaaghi con manico rotondo, suture multiple (seta 4-0, 5-0 PGA, seta 6-0 e suture in nylon 10-0), eparina, spugna di gelatina assorbibile, un portaaghi dritto e buprenorfina.
NOTA: Gli elastici di fissaggio delle estremità e i divaricatori per l'addome e le gambe sono stati fatti a mano. - Sterilizzare le preps chirurgiche utilizzando l'autoclave con sterilizzazione a vapore a 120-125 °C per 30 minuti seguita da asciugatura per 30 minuti prima dell'intervento. Utilizzare una pulizia con etanolo al 70% seguita da sterilizzazione con perline calde (240-270 ° C per 3 minuti) tra ogni intervento chirurgico sugli animali.
- Preparare soluzione salina normale sterilizzata allo 0,9%, soluzione salina eparinizzata (100 UI / ml) e buprenorfina (0,01 mg / ml) utilizzando siringhe ad ago da 29-31 G.
3. Anestesia e posizionamento
- Iniziare l'anestesia del topo nella camera di induzione (0,8 ml/min, isoflurano al 2,5%). Una volta che il topo è adeguatamente anestetizzato, posizionare il topo in posizione supina sulla postazione chirurgica coperta da un drappeggio sterile. Ridurre la concentrazione di isoflurano fino a ~ 1,2% durante le fasi di rasatura e posizionamento.
- Applicare il lubrificante oculare per proteggere gli occhi dall'asciugatura durante l'intervento.
- Utilizzando un trimmer a penna, radersi i peli addominali per l'operazione e i peli delle gambe per le misurazioni della perfusione postoperatoria. Eliminare i capelli dal campo chirurgico.
- Fissare gli arti superiori e inferiori con elastici e chiodi, controllare la profondità dell'anestesia monitorando il riflesso del pizzicamento della punta e titolare l'anestesia se necessario. Eseguire la valutazione del modello respiratorio ogni 3-5 minuti durante la procedura chirurgica per calibrare il livello di anestesia.
4. Esplorazione dell'area bersaglio chirurgico
- Pulire più volte l'area della pelle rasata, alternando la preparazione dell'alcool e le salviette alla clorexidina in uno schema circolare per disinfettare il campo chirurgico.
- Fare una laparotomia della linea mediana dal bordo inferiore del margine sternale alla sinfisi pubica. Sezionare il cuscinetto adiposo pubico per ottenere un campo operatorio più ampio.
- Aprire la celiotomia per accedere al contenuto peritoneale con divaricatori ed eviscerare l'intestino tenue e crasso utilizzando tamponi di cotone rotondi medi a punta singola. Coprire le viscere con una spugna non tessuta imbevuta di soluzione salina.
- Una volta ottenuta un'adeguata esposizione della vascolarizzazione retroperitoneale, coprire l'intestino, i reni e gli ureteri rimanenti con piccole spugne non tessute imbevute di soluzione salina. Evacuare una vescica distesa schiacciando delicatamente la cupola della vescica con tamponi di cotone rotondi medi a terminazione singola, se necessario.
- Sezionare attentamente la fascia perivascolare e il tessuto adiposo da circa 1 cm prossimale alla biforcazione aortica che si estende fino al livello della biforcazione iliaca sinistra usando una pinza di Dumont dritta e piccoli tamponi di cotone duri, affilati e appuntiti a doppia estremità.
NOTA: L'arteria iliaca sinistra e la vena sono lasciate aderenti l'una all'altra mentre isolano le strutture artero-venose in massa. Questo passaggio fornirà una mobilitazione sufficiente dei vasi per facilitare la creazione di AVF. - Se si incontrano piccoli rami venosi originati o convergenti con la vena iliaca comune sinistra, ligarali usando cauterizzazione a bassa temperatura con o senza sutura di seta 6-0 secondo necessità.
- Passare la punta della pinza angolata sotto il fascio vascolare iliaco comune sinistro e distribuire delicatamente più volte per mobilizzare i vasi dalla muscolatura retroperitoneale sottostante (Figura 1A).
5. Creazione di una comune anastomosi della fistola arteriosa iliaca
- Posizionare due suture di seta 4-0 attorno al fascio arterioso iliaco comune isolato e usarli come legature (ad esempio, morsetti incrociati) al fascio vascolare. Crea un singolo nodo con ogni cravatta di seta 4-0 e applicali in sequenza da prossimale a distale.
- Assicurarsi che i morsetti incrociati della cravatta di seta siano posizionati sufficientemente distanti per isolare ~ 2 mm di lunghezza del vaso e l'applicazione sequenziale delle legature di sutura precipiterà l'ingorgo della vena iliaca sinistra.
- Utilizzando le corde di sutura di seta 4-0 come maniglie, ruotare il fascio vascolare arterioso iliaco sinistro in senso orario e mettere a punto la posizione per localizzare temporaneamente la vena anteriore all'arteria (Figura 1B).
- Effettuare una venotomia longitudinale (~1 mm) con forbici a molla Vannas dritte e lavare delicatamente il sangue residuo dal lume venoso con soluzione salina allo 0,9% (Figura 1C). Prestare attenzione durante questa fase, poiché un lavaggio salino ad alta pressione può causare interruzioni venose.
NOTA: la regione di colore rosso che rimane nell'arteria iliaca dopo il rossore venoso fornisce una finestra visiva per il passaggio successivo. - Posizionare una sutura di nylon 10-0 imbricante attraverso la parete posteriore della vena.
NOTA: Questa porzione della vena iliaca dovrebbe essere in apposizione immediata alla parete anteriore dell'arteria iliaca e le pareti sono naturalmente aderenti. La sutura dovrebbe passare attraverso entrambe le pareti e legare la sutura verso il basso con un singolo nodo (Figura 1D). Si noti che una piccola quantità di sanguinamento, che ha origine dal sangue stagnante nell'arteria iliaca, apparirà una volta che l'ago passa attraverso entrambe le pareti. Se il sanguinamento intra-luminale continua durante questa fase, i morsetti incrociati della sutura di seta potrebbero essere troppo allentati e devono essere ulteriormente serrati. - Afferrare le estremità di sutura imbricate e metterle sotto una leggera tensione per spostare la parete anteriore dalla parete posteriore dell'arteria iliaca. Fai un'incisione ellittica ~ 1,0 mm x 0,3 mm usando le forbici a molla Vannas curve, rimuovendo le pareti aderenti sia dell'arteria iliaca che della vena.
NOTA: La fistola artero-venosa viene così creata una volta stabilito questo canale comune. È possibile ferire le pareti laterali della vena durante questa fase poiché l'incisione della parete della vena iliaca posteriore / arteria iliaca anteriore viene eseguita attraverso l'esposizione alla venotomia. Si deve prestare attenzione per evitare questa complicanza in quanto ciò può ridurre considerevolmente il diametro della fistola e portare allo sviluppo di trombi. - Lavare delicatamente il sangue residuo del lume arterioso esposto con soluzione salina allo 0,9% ed eparinizzata (100 UI / ml)28 (Figura 1E).
- Dopo la creazione dell'AVF, riparare la venotomia iniziale della parete anteriore utilizzando due o tre suture di nylon 10-0 in modo interrotto (Figura 1F).
- Ripristinare il fascio vascolare al suo orientamento anatomico originale e posizionare un piccolo pezzo di spugna di gelatina assorbibile imbevuta di soluzione salina adiacente alla venotomia riparata per facilitare l'emostasi.
- Allenta le legature a nodo singolo 4-0 in sequenza da distale a prossimale. Monitorare attentamente il sito di venotomia per un eccessivo sanguinamento mentre si allenta ogni sutura.
- Se la riparazione non è adeguatamente emostatica, riapplicare i morsetti trasversali e posizionare un'altra sutura di nylon 10-0 nel sito di sanguinamento. Se l'emostasi è assicurata, rimuovere i punti di sutura e quindi la spugna di gelatina assorbibile.
- Strofinare delicatamente il fascio vascolare con piccoli tamponi di cotone duri, affilati e appuntiti a doppia estremità, che facilitano ulteriormente il ripristino del flusso sanguigno. Confermare il successo tecnico dell'operazione utilizzando la visualizzazione del sangue ossigenato rosso vivo pulsante che entra nella vena iliaca e si mescola con il sangue venoso scuro che ritorna dall'arto posteriore.
- Iniettare soluzione salina eparinizzata (0,2 UI / g) 15 nell'IVC per l'anticoagulazione sistemica per migliorare i risultati della pervietà AVF.
NOTA: Sebbene questa fase si verifichi dopo la ricostruzione vascolare (al contrario dell'analogo umano in cui l'eparinizzazione si verifica prima del cross-clampaggio dei vasi), una riduzione del sanguinamento intraoperatorio e una migliore pervietà AVF sono state osservate quando eseguite in questa fase della procedura. L'iniezione in un sito coperto da fascia e / o grasso è preferibile per prevenire il sanguinamento dal sito di puntura. - Ispezionare nuovamente il sito chirurgico per l'emostasi dopo l'iniezione di soluzione salina eparinizzata. Se non ci sono problemi di sanguinamento, chiudere la fascia mediana e quindi l'incisione cutanea con suture PGA 5-0 assorbibili in modo corrente.
- Per le operazioni fittizie, seguire tutti i passaggi chiave della procedura ad eccezione della formazione AVF. Applicare un singolo nodo della legatura della seta 4-0 all'estremità prossimale del fascio artero-venoso iliaco sinistro e abbinare i tempi di morsetto agli interventi chirurgici AVF (ad esempio, ~ 20 minuti, a seconda della competenza del microchirurgo).
6. Cura e misurazione postoperatoria
- Dopo la chiusura della laparotomia, misurare la perfusione sanguigna dei muscoli tibiali bilaterali anteriori e delle zampe ventrali utilizzando l'imaging laser Doppler.
NOTA: I deficit unilaterali di perfusione confermeranno la diversione della fistola del flusso arterioso ("steal"). - Somministrare 0,1 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea e riportare il topo in una gabbia di topo preriscaldata con lettiera morbida altamente assorbibile con nido.
- Lasciare che il topo si riprenda nella gabbia del topo preriscaldata fino a quando l'anestesia svanisce, il che sarà evidente quando il mouse è ambulatoriale e interattivo (~ 2 h). Durante il recupero, dare al mouse un facile accesso a una dieta idratata e morbida.
- Somministrare buprenorfina e/o idratazione salina sottocutanea ogni 12 h fino a 48 h ed eseguire il monitoraggio giornaliero per 5 giorni post-operatori. Eutanasia degli animali con una condizione di deterioramento o eccessiva necrosi tissutale, classificati come punteggio di ischemia modificata ≥ 229.
- Utilizzare valutazioni ecografiche duplex seriali per valutare la pervietà della fistola post-operatoria; i topi con trombosi della fistola sono esclusi dalle analisi successive, a meno che lo scopo degli esperimenti non sia quello di caratterizzare il fallimento della maturazione dell'AVF.
- Determinare altre misurazioni degli esiti postoperatori come l'emodinamica locale, la forza di presa e le prestazioni dell'andatura durante il periodo di recupero. Raccogliere fistola e tessuti muscolari per valutare l'istomorfologia al termine dell'esperimento durante il sacrificio25,27.
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Representative Results
Gli animali esposti a una dieta adenina hanno ridotto i tassi di filtrazione glomerulare (controllo: 441,3 ± 54,2 μL/min vs. CKD: 165,1 ± 118,3 μL/min, p < 0,05) e aumentato i livelli sierici di azoto ureico nel sangue (controllo: 20,39 ± 4,2 μL/min vs. CKD: 38,20 ± 10,65 μL/min, p < 0,05) rispetto agli animali che hanno ricevuto chow a base di caseina, confermando la presenza di insufficienza renale prima dell'intervento chirurgico alla fistola artero-venosa.
Validazione della pervietà AVF
Sebbene la conferma visiva intraoperatoria del successo tecnico sia l'identificazione iniziale della pervietà della fistola, non garantisce pienamente la pervietà o la maturazione fisiologica durante il periodo di studio. Gli esiti della pervietà postoperatoria (cioè successo o fallimento) sono stati determinati utilizzando sia l'ecografia duplex che l'esame istologico, come abbiamo precedentemente dimostrato25. La Figura 2 mostra rispettivamente le immagini rappresentative della modalità B, del Doppler ad onde di impulso e dell'ecodoppler a colori e le sezioni morfologiche di un'anastomosi della fistola artero-venosa. Una fistola pervio viene visualizzata direttamente sull'analisi color Doppler con emodinamica turbolenta, nonché sull'ampliamento spettrale nel sito della fistola. Anche i cambiamenti adattivi mediati dal flusso dei vasi di afflusso e deflusso confermano indirettamente la pervietà AVF. In particolare, l'aorta ha un'elevata velocità sistolica e diastolica di picco, l'IVC sviluppa pulsatilità con velocità di picco elevata e la dilatazione dei vasi sia nell'aorta che nell'IVC è evidente (Figura 2A). Al contrario, una fistola fallita o trombica non ha quasi cambiamenti nelle misurazioni di afflusso o deflusso e nessuna turbolenza o allargamento spettrale all'interno della vascolarizzazione iliaca sinistra. Di solito, il fallimento della fistola da trombosi occlude parzialmente o completamente l'arteria iliaca sinistra, che viene visualizzata come flusso minimo o nullo all'analisi Doppler a onde polso. La Figura 2B mostra le sezioni istologiche seriali di una AVF 2 settimane dopo la creazione chirurgica. Le sezioni sono spesse 5 μm e colorate con il tricromo di Masson. L'anastomosi chirurgica dell'arteria e della vena è evidente ed è presente un'arterializzazione venosa distinta (ispessimento della parete venosa e fibrosi con iperplasia neointimale). L'ecografia è stata eseguita il giorno 3 postoperatorio per escludere topi con insufficienza AVF precoce, quindi sono state ottenute misurazioni seriali e non invasive durante il periodo di studio. La valutazione morfologica fornisce dettagli di rimodellamento vascolare specifici del periodo al momento del sacrificio ed è stata utilizzata per confermare i risultati ecografici. Un tasso di pervietà AVF di circa il 50% (20% -30% della morte postoperatoria e 20% -30% del fallimento della fistola)25 è da aspettarsi inizialmente, ma il tasso di successo chirurgico migliora significativamente (~ 5% -10% tasso di fallimento) con la pratica e l'aumento della competenza.
Caratteristiche fisiopatologiche a seguito della formazione di fistola artero-venosa iliaca
Alterazione emodinamica: Le caratteristiche dell'emodinamica AVF e della perfusione distale degli arti posteriori devono essere quantificate per contestualizzare la fisiopatologia degli arti correlata all'accesso. Le misurazioni ecografiche Doppler in modalità B e ad onde pulsate dopo l'intervento chirurgico hanno rivelato la dilatazione dei vasi in entrata e in uscita (IVC: 1,4 volte a POD3 e 1,6 volte a POD13 e IRA: 1,4 volte a POD3 e 1,7 volte a POD13, p < 0,05) e aumenti della velocità sistolica di picco (velocità sistolica di picco IVC: 5,5 volte a POD3 e 4,9 volte a POD13 e velocità sistolica di picco IRA: 2,8 volte a POD3 e 3,7 volte a POD13, P < 0,05) rispetto agli animali fittizi (Figura 3A-D). Inoltre, l'ischemia unilaterale degli arti posteriori era evidente dopo l'intervento, il che conferma l'ipoperfusione arteriosa mediata dal furto distale alla fistola. I deficit di perfusione della zampa sinistra dovrebbero essere ~ 20% dell'arto controlaterale e il deficit di perfusione del muscolo anteriore tibiale è ~ 60%. I topi hanno parzialmente recuperato questi deficit durante il periodo di studio (Figura 3E,F).
Disfunzione degli arti posteriori: la disabilità degli arti omolaterali è prevista dopo la creazione di AVF, che comporta zoppia delle gambe da lieve (nella maggior parte dei casi) a grave (pochi casi) che può durare per diversi giorni. La paralisi irrisolta degli arti posteriori e/o la necrosi della zampa potrebbero essere indicative di un grave insulto ischemico causato da dimensioni della fistola al di fuori del range di normalità. La funzione neuromotoria degli arti posteriori è stata quantificata tramite test di forza di presa e analisi del modello di andatura del tapis roulant, che sono stati eseguiti in sequenza durante il periodo di recupero. La forza di presa unilaterale prevista è ~ 50% dell'arto controlaterale al giorno postoperatorio 4, con recupero graduale. I topi AVF richiedono anche velocità ridotte del tapis roulant durante la valutazione dell'andatura (<20 cm / min) (Figura 3G, H).
Figura 1: Fasi microchirurgiche dell'anastomosi della fistola artero-venosa . (A) Esposizione dell'area bersaglio chirurgico, compresa la laparotomia della linea mediana e l'isolamento dell'arteria iliaca sinistra / vena. (B) legature di sutura 4-0 (ad esempio, utilizzate come morsetti temporanei dei vasi) sul fascio artero-venoso iliaco comune sinistro nei siti prossimali e distali. (C) Una venotomia longitudinale sulla parete anteriore della vena iliaca. (D) 10-0 sutura imbricante attraverso la parete posteriore della vena iliaca e la parete anteriore dell'arteria iliaca. (E) Incisione ellittica con la distensione imbricante. (F) La venotomia longitudinale iniziale dell'immagine C viene riparata utilizzando una sutura 10-0 interrotta. Barra della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Validazione della pervietà della fistola artero-venosa . (A) Determinazione ecografica Doppler della pervietà AVF. Le caratteristiche di una fistola pervida includono la dilatazione arteriosa e venosa all'imaging B-mode, il flusso turbolento sull'analisi color Doppler della vascolarizzazione iliaca sinistra, l'allargamento spettrale pulsatile sulla valutazione Doppler a onde polsologiche dei vasi iliaci sinistri, l'aumento della velocità sistolica e diastolica di picco dell'aorta infrarenale e la pulsatilità all'interno dell'IVC con aumenti della velocità sistolica di picco. Il flusso diminuito o assente all'interno dei vasi iliaci è indicativo di fallimento/trombosi AVF. La tecnica ecografica duplex fornisce dati sia morfologici che fisiologici. Le misurazioni della velocità sono espresse in millimetri al secondo. (B) Valutazione morfologica dell'anastomosi AVF 14 giorni dopo la creazione della fistola. Le immagini erano macchiate con il tricromo di Masson. Ci sono cambiamenti anatomici nella microscopia a sezione seriale dall'anatomia arteriosa iliaca comune prossimale (estremità sinistra) a quella distale (estremità destra). L'occlusione della vascolarizzazione dovuta a coaguli e/o iperplasia neointimale eccessiva conferma il fallimento dell'AVF. Le immagini sono ingrandite 10x. A: Arteria iliaca comune, V: Vena iliaca comune. Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Caratteristiche fisiopatologiche prima e dopo la formazione di AVF. Quantificazione dell'imaging ecografico in (A) diametro aortico infrarenale, (B) velocità sistolica di picco dell'aorta infrarenale, (C) diametro della vena cava inferiore e (D) velocità sistolica di picco della vena cava inferiore pre-operatoria e nei giorni postoperatori 3 e 13. Misurazione della perfusione sanguigna locale (Laser doppler) sulla zampa (E) tibiale anteriore e (F) ventrale prima dell'intervento chirurgico e durante il periodo di recupero di 2 settimane. I test funzionali neuromotori includevano (G) forza di presa e (H) test del tapis roulant prima e dopo l'intervento. I dati sono stati analizzati utilizzando un ANOVA bidirezionale e il test post-hoc di Tukey è stato eseguito quando appropriato. I valori sono mezzi ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 rispetto a Control_Sham. #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001, ####p < 0,0001 contro CKD_Sham. N = 6-10/gruppo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La prevalenza dei pazienti in emodialisi con ARHD dopo la creazione di AVF ha continuato ad aumentare30,31. Infatti, le complicanze sintomatiche irrisolte 4,32,33 come dolore, debolezza, parestesia e/o ridotta gamma di movimento possono avere un impatto negativo sul benessere del paziente 4,32,33,34,35,36 e minacciare la loro capacità di ricevere un trattamento di emodialisi ripetitiva di alta qualità. Sebbene il raggiungimento di un accesso duraturo all'emodialisi sia una priorità assoluta per i pazienti con ESRD, per i soggetti affetti da ARHD, questi sintomi potenzialmente debilitanti devono essere affrontati per migliorare i risultati centrati sul paziente. Nel presente studio, come importante pietra miliare preclinica nel campo della ricerca ARHD, introduciamo una procedura chirurgica dettagliata per generare un modello murino di AVF iliaca, che facilita l'esame della fisiopatologia degli arti associata a AVF. Oltre alle alterazioni attese nell'emodinamica aorto-iliaca e IVC, la creazione di AVF iliaca ha prodotto caratteristiche clinicamente rilevanti della disfunzione degli arti, inclusa l'ischemia dei tessuti periferici con compromissione motoria macroscopica.
Ogni fase della microchirurgia deve essere eseguita con squisita cura per evitare potenziali traumi vascolari, che possono causare cambiamenti sostanziali sia nell'emodinamica che nella patologia degli arti. Durante la legatura, il nodo della cravatta di seta 4-0 dovrebbe essere stretto solo abbastanza da impedire il flusso di sangue attraverso il sito chirurgico di interesse. Un'eccessiva tensione del nodo della legatura di sutura può danneggiare la parete del vaso, che può causare sanguinamento indesiderato e potrebbe contribuire all'iperplasia intimale, portando a una diminuzione della pervietà AVF. In particolare, la riparazione della venotomia è uno dei passaggi più importanti della procedura chirurgica. Un morso troppo grande nella parete venosa può portare a stenosi dei vasi e, in definitiva, trombosi, mentre una riparazione troppo superficiale può causare deiscenza con emorragia. Allo stesso modo, il sanguinamento può verificarsi anche se le suture di riparazione della venotomia sono troppo distanziate. Nella nostra esperienza, un intervallo di ~ 0,025-0,03 mm tra le suture è sufficiente per creare una riparazione emostatica.
Oltre alla riproducibilità della tecnica chirurgica, l'utilizzo di un modello animale specifico per malattia o sintomo è uno dei contributi più importanti del lavoro attuale. Nel presente studio, gli animali sono stati esposti a una dieta adenina 0,2%-0,15% per 2-3 settimane prima e dopo l'intervento chirurgico AVF per stabilire una disfunzione renale e un ambiente uremico analogo ai pazienti con ESRD. Rispetto ai modelli chirurgici di CKD (ad esempio, 5/6 nefrectomia), un modello di dieta adenina presenta diversi vantaggi, tra cui tassi di mortalità molto bassi e una minore variazione inter-osservatore27,37. In particolare, la gravità e le conseguenze fisiopatologiche possono essere modificate in base alla concentrazione e/o alla durata della dieta adenina38,39. Accoppiato con la nefropatia indotta dalla dieta, l'attuale modello animale qui descritto può preparare il terreno per i ricercatori per studiare i meccanismi fisiopatologici attraverso i quali l'uremia colpisce l'ARHD. Inoltre, ulteriori modelli animali di malattia possono essere aggiunti al modello chirurgico per testare l'influenza di condizioni di comorbilità altamente prevalenti, come diabete, ipertensione o malattia coronarica.
Sebbene la procedura AVF iliaca presentata modelli in modo riproducibile aspetti chiave della fisiopatologia degli arti rilevanti per i pazienti in emodialisi con ARHD, ci sono alcune limitazioni e complicazioni degne di discussione. In primo luogo, i topi sottoposti a questa procedura non hanno un vero "accesso vascolare"; Pertanto, gli esperimenti che coinvolgono trattamenti sperimentali di emodialisi non sono possibili. In secondo luogo, la gravità della disfunzione degli arti è influenzata dalle dimensioni della comunicazione artero-venosa, quindi la creazione coerente di AVF è fondamentale per risultati riproducibili. Ad esempio, la creazione di una grande AVF può produrre una grave ischemia degli arti posteriori, che può culminare nella necrosi degli arti. I nuovi microchirurghi che iniziano la procedura sono incoraggiati a utilizzare analisi istologiche degli AVF creati per analizzare le dimensioni per la coerenza. Nei topi sottoposti ad altri modelli di AVF, è stato riportato rimodellamento cardiaco, inclusa ipertrofia e possibilmente insufficienza cardiaca, 40,41,42. Le alterazioni cardiache nel modello attuale non sono state valutate rigorosamente, sebbene abbiamo osservato qualitativamente l'ipertrofia cardiaca rispetto agli animali fittizi. Inoltre, sono necessarie future analisi a lungo termine per valutare come il sistema cardiovascolare murino si adatta alla formazione e alla maturazione dell'AVF iliaca. Un'ulteriore preoccupazione è che i topi C57BL6 più giovani hanno la capacità di generare risposte di arteriogenesi e angiogenesi agli stimoli ischemici, portando alla formazione di vasi collaterali, come dimostrato dal modesto recupero della perfusione laser Doppler in questo studio. Pertanto, è possibile che i topi si riprendano completamente dalla patologia degli arti AVF una volta che si sono formate reti collaterali più robuste; Tuttavia, sono necessari studi futuri per mappare la crescita collaterale e i cambiamenti vascolarizzari distali.
Ad oggi, i meccanismi sottostanti attraverso i quali la funzione della mano è compromessa e / o esacerbata dal posizionamento di AVF non sono completamente compresi. Dato che il genoma del topo è ben caratterizzato e vi è un facile accesso a una vasta gamma di modelli transgenici per la manipolazione genica nei topi, questo modello chirurgico iliaco AVF fornisce uno strumento utile per la scoperta biomedica che circonda l'ARHD. Rispetto ad altri modelli di AVF per roditori, che impiegano la chirurgia vascolare centrale (ad esempio, modello di fistola aorto-cavale), o modelli animali di grandi dimensioni con AVF femorale o iliaca, l'attuale modello AVF iliaco con o senza uremia indotta da dieta adenina fornisce ai ricercatori una solida piattaforma sperimentale che può essere utilizzata per interrogare i meccanismi biologici sottostanti associati all'ARHD in emodialisi e generare nuove terapie mirate. Inoltre, i modelli preclinici sono generalmente considerati cruciali per lo sviluppo precoce e la convalida di terapie farmaceutiche, di cui nessuna è attualmente disponibile per trattare / prevenire l'ARHD. In particolare, questo modello è anche suscettibile di alterazioni sia nelle dimensioni dell'AVF che nella gravità della disfunzione renale, che consente ai ricercatori di modulare attentamente la gravità della patologia. In conclusione, questo modello di AVF preclinico su topo unico può servire come piattaforma pratica per facilitare lo sviluppo terapeutico preclinico volto a ridurre la disabilità della mano dopo il posizionamento di AVF.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo sinceramente il Dr. Guanyi Lu della Divisione di Chirurgia Vascolare e Terapia Endovascolare dell'Università della Florida per il supporto tecnico sullo sviluppo del modello AVF iliaco, nonché la formazione chirurgica, e Ravi Kumar del Dipartimento di Fisiologia Applicata e Kinesiologia dell'Università della Florida per il supporto tecnico nell'ottenere le immagini microchirurgiche dal vivo.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institutes of Health e del National Heart, Lung, and Blood, numeri di Istituto R01-HL148697 (a S.T.S.), nonché dal numero di sovvenzione dell'American Heart Association POST903198 (a K.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.15% Adenine diet | ENVIGO | TD.130899 | 20% casein, 0.15% adenine, 0.9% P |
| 0.2% Adenine diet | ENVIGO | TD.130900 | 20% casein, 0.2% adenine, 0.9% P |
| 10-0 Nylon suture | AD surgical | XXS-N1005T4 | |
| 29 G needle syringes | Exel International | 14-841-32 | |
| 31 G needle syringes | Advocate | U-100 insulin syringe | |
| 4-0 silk suture | AD surgical | S-S41813 | |
| 45-degree angled dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | |
| 5-0 PGA suture | AD surgical | PSGU-518R13 | |
| 6-0 silk suture | AD surgical | S-S618R13 | |
| Absorbable gelatin sponge | ETHICON | 1975 | |
| Alcohol preps | Covidien | 5110-cs4000 | 70% isopropyl alcohol |
| Buprenorphine | NA | NA | 0.01 g/mL |
| C57BL6/J mice | Jaxon Laboratory | ||
| Casein diet | ENVIGO | TD.130898 | 20% casein, 0.9% P |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-9 | Medium single-ended round cotton swab |
| Cotton swabs | CONSTIX | SC-4 | Small double-ended hard, sharp, pointed cotton swab |
| Curity non-woven sponges (2x2) | Covidien | 9022 | |
| Curved Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15001-08 | |
| Doppler ultrasound | VisualSonics | Vevo 2100 | |
| Extra fine graefe forceps | Fine Science Tools | 11150-10 | 2 pairs |
| Eye lubricant | CLCMEDICA | Optixcare eye lube | |
| Heparin (5000 U/mL) | National Drug Codes List | 63739-953-25 | 100 IU/mL |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-50 | |
| Low-temperature cautery | Bovie | AA04 | |
| Pen trimmer | Wahl | 5640-600 | |
| Powder-free surgical gloves | Ansell | 7824PF | |
| Round handled needle holders | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Sterile towel drape | Dynarex | DY440-MI | |
| Sterilized 0.9% saline | National Drug Codes List | 46066-807-25 | |
| Straight dumont forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Straight needle holder | Fine Science Tools | FST 12001-13 | |
| Straight vannas spring scissors | Fine Science Tools | 25001-08 | |
| TrizChLOR4 | National Drug Codes List | 17033-279-50 |
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