Summary

عزل وتحديد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية المنقولة بالماء والتوصيف الجزيئي لجيناتها المقاومة للمضادات الحيوية

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

نقدم هنا بروتوكولا مفصلا لعزل وتحديد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية من الماء والتوصيف الجزيئي لجيناتها المقاومة للمضادات الحيوية (ARGs). يوفر استخدام التقنيات القائمة على الثقافة وغير القائمة على الثقافة (التحليل الميتاجينومي) معلومات كاملة حول التنوع البكتيري الكلي والمجموعة الإجمالية ل ARGs المختلفة الموجودة في المياه العذبة من مومباي ، الهند.

Abstract

يعد تطور وانتشار مقاومة المضادات الحيوية (AR) من خلال الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بأجسام المياه العذبة مصدر قلق صحي عالمي كبير. في هذه الدراسة ، تم جمع عينات المياه العذبة وتحليلها فيما يتعلق بالتنوع البكتيري الكلي وجينات AR (ARGs) باستخدام كل من التقنيات التقليدية القائمة على الثقافة ونهج metagenomic عالي الإنتاجية المستقل عن الزراعة. يقدم هذا البحث بروتوكولا منهجيا لتعداد البكتيريا الكلية والمقاومة للمضادات الحيوية من عينات المياه العذبة وتحديد مقاومة النمط الظاهري والوراثي في العزلات القابلة للزراعة. علاوة على ذلك ، أبلغنا عن استخدام التحليل الميتاجينومي الكامل للحمض النووي الميتاجينومي الكلي المستخرج من عينة المياه العذبة لتحديد التنوع البكتيري الكلي ، بما في ذلك البكتيريا غير القابلة للزراعة ، وتحديد المجموعة الإجمالية لمختلف ARGs (المقاومة) في الجسم المائي. باتباع هذه البروتوكولات التفصيلية ، لاحظنا حمولة بكتيريا عالية المقاومة للمضادات الحيوية في نطاق 9.6 × 10 5-1.2 × 109 CFU / mL. كانت معظم العزلات مقاومة للمضادات الحيوية المتعددة التي تم اختبارها ، بما في ذلك سيفوتاكسيم ، والأمبيسلين ، والليفوفلوكساسين ، والكلورامفينيكول ، والسيفترياكسون ، والجنتاميسين ، والنيومايسين ، والتريميثوبريم ، وسيبروفلوكساسين ، مع مؤشرات مقاومة متعددة للمضادات الحيوية (MAR) تبلغ ≥0.2 ، مما يشير إلى مستويات عالية من المقاومة في العزلات. حدد تسلسل 16S rRNA مسببات الأمراض البشرية المحتملة ، مثل Klebsiella pneumoniae ، والبكتيريا الانتهازية ، مثل Comamonas spp. ، Micrococcus spp. ، Arthrobacter spp. ، و Aeromonas spp. أظهر التوصيف الجزيئي للعزلات وجود العديد من ARGs ، مثل blaTEM و blaCTX-M (β-lactams) و aadA و aac (6 ‘) -Ib (أمينوغليكوزيدات) و dfr1 (trimethoprims) ، وهو ما تم تأكيده أيضا من خلال تحليل الحمض النووي الميتاجينومي بأكمله. كما تم الكشف عن ارتفاع معدل انتشار ARGs الأخرى المشفرة لمضخات تدفق المضادات الحيوية – mtrA و macB و mdtA و acrD و β-lactamases-SMB-1 و VIM-20 و ccrA و ampC و blaZ وجين الكلورامفينيكول أسيتيل ترانسفيراز catB10 ، وجين مقاومة الريفامبيسين rphB- في الحمض النووي الميتاجينومي. بمساعدة البروتوكولات التي تمت مناقشتها في هذه الدراسة ، أكدنا وجود بكتيريا MAR المنقولة بالماء مع سمات النمط الظاهري والوراثي AR المتنوعة. وبالتالي ، يمكن استخدام تحليل الحمض النووي الميتاجينومي الكامل كتقنية تكميلية للتقنيات التقليدية القائمة على الثقافة لتحديد الحالة العامة للواقع المعزز لجسم مائي.

Introduction

تم تحديد مقاومة مضادات الميكروبات (AMR) باعتبارها واحدة من أكثر المشاكل العالمية إلحاحا. يعد التطور السريع لمقاومة مضادات الميكروبات وانتشارها في جميع أنحاء العالم أحد أكبر التهديدات لصحة الإنسان والاقتصاد العالمي من حيث التكاليف الصحية المرتبطة بها1. أدى الإفراط في استخدام المضادات الحيوية وإساءة استخدامها إلى زيادة في الواقع المعزز. وقد تم تسليط الضوء على ذلك من خلال جائحة COVID-19 ، حيث تعرض علاج العدوى الثانوية المصاحبة ، في كثير من الحالات ، للخطر بشكل كبير بسبب مقاومة مضادات الميكروبات في المرضى المصابين2. إلى جانب الاستخدام المباشر / إساءة استخدام المضادات الحيوية من قبل البشر ، فإن الإفراط في استخدام المضادات الحيوية وإساءة استخدامها في الزراعة وتربية الحيوانات وتصريفها بشكل غير مناسب في البيئة ، بما في ذلك المسطحات المائية ، هي مصدر قلق كبير3. إن ظهور سمات مقاومة جديدة ومقاومة للأدوية المتعددة في البكتيريا يسلط الضوء بشكل عاجل على الحاجة إلى فهم أفضل للعوامل التي تؤدي إلى تطوير AR ونشره. يمكن للبكتيريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية ، والتي غالبا ما تحمل جينات AR متعددة (ARGs) على العناصر الجينية المتنقلة مثل البلازميدات ، نقل جينات المقاومة هذه إلى الكائنات الحية الدقيقة غير المقاومة ، بما في ذلك مسببات الأمراض البشرية المحتملة ، مما يؤدي إلى ظهور الجراثيم الخارقة التي لا يمكن علاجها حتى بالمضادات الحيوية كملاذ أخير4. يمكن لهذه البكتيريا المتعددة المقاومة للمضادات الحيوية ، إذا كانت موجودة في النظم الإيكولوجية للمياه ، أن تدخل الأمعاء البشرية مباشرة عن طريق استهلاك الأطعمة الملوثة القائمة على الماء مثل الأسماك وسرطان البحر والرخويات. أظهرت الدراسات السابقة أن انتشار بكتيريا AR في أنظمة المياه التي تحدث بشكل طبيعي يمكن أن يصل أيضا إلى إمدادات المياه الأخرى ، بما في ذلك مياه الشرب ، وبالتالي يمكن أن يدخل السلسلة الغذائية البشرية5،6،7.

الهدف من هذه الدراسة هو توفير بروتوكول شامل باستخدام مزيج من التقنيات القائمة على الثقافة وغير القائمة على الثقافة (التحليل الميتاجينومي الكامل) للحصول على معلومات كاملة حول التنوع البكتيري الكلي والمجموعة الإجمالية لمختلف ARGs الموجودة في جسم مائي في مومباي ، الهند. تقليديا ، تم استخدام التقنيات القائمة على الثقافة لدراسة التنوع البكتيري في المسطحات المائية. نظرا لأن الكائنات الحية الدقيقة القابلة للزراعة لا تشكل سوى نسبة صغيرة من إجمالي الكائنات الحية الدقيقة في أي مكان ، للحصول على فهم أفضل للحالة العامة للتنوع البكتيري والسمات المقاومة المختلفة السائدة في أي عينة ، يجب استخدام تقنيات مختلفة قائمة على الثقافة ومستقلة عن الثقافة جنبا إلى جنب. إحدى هذه التقنيات القوية والموثوقة المستقلة عن الثقافة هي تحليل الحمض النووي الميتاجينومي الكامل. تم استخدام هذه الطريقة عالية الإنتاجية بنجاح في دراسات مختلفة حول التنوع البكتيري أو التعليقات التوضيحية الوظيفية لمختلف ARGs 8,9. تستخدم هذه التقنية الميتاجينوم (المادة الوراثية الكلية في العينة) كمادة أولية لتحليلات مختلفة ، وبالتالي فهي مستقلة عن الثقافة. يمكن استخدام البروتوكولات في هذه الدراسة لتحليل الحمض النووي الميتاجينومي الكامل للحصول على معلومات حول التنوع البكتيري الكلي ومختلف ARGs (المقاومة) في عينات المياه.

Protocol

1. جمع العينات ومعالجتها جمع العيناتجمع الحجم المناسب من عينة المياه في حاوية (حاويات) عينة معقمة ، مع التأكد من عدم ملء أكثر من 3/4 من الحاوية. نقل العينات إلى المختبر تحت ظروف معقمة في أسرع وقت ممكن بعد جمعها ومعالجتها على الفور. معالجة العيناتقم بتص…

Representative Results

إجمالي الحمل البكتيري وعدد البكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية (AR)تم إجراء تعداد الحمل البكتيري الكلي عن طريق نشر 10−4 إلى 10−6 أضعاف التخفيفات لعينات المياه على R2A Agar ، الوسط المعدل. لتعداد عدد بكتيريا AR ، تم نشر 10−3 إلى 10−6 أضعاف التخفيفات على لوحات الوس?…

Discussion

يلعب جمع العينات ومعالجتها دورا مهما وقد يؤثر على نتائج الدراسة وتفسيرها. ومن ثم ، لاستبعاد التباين في العينات ، من المهم إجراء أخذ العينات في مواقع متعددة من جسم المياه العذبة قيد الدراسة. يمكن أن يؤدي الحفاظ على الظروف البيئية المعقمة المناسبة عند التعامل مع هذه العينات إلى منع التلوث. ع…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل جزئيا من خلال المنح المالية من قسم العلوم والتكنولوجيا – تعزيز البحث الجامعي والتميز العلمي (DST-PURSE) مخطط جامعة مومباي. عملت ديفيكا غاديغاونكار كزميلة مشروع في إطار المخطط. تم الاعتراف بالمساعدة الفنية التي قدمها Harshali Shinde ، زميل باحث أول في إطار مشروع مجلس أبحاث العلوم والتكنولوجيا والعلوم والهندسة (DST-SERB): CRG / 2018 / 003624.

Materials

100 bp DNA ladder Himedia MBT049-50LN For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix HiMedia MBT061-50R For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator GS-192, Gayatri Scientific NA For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer HiMedia ML015-1ML Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder Himedia MB229-50G For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc HiMedia SD002 For performing AST
Autoclave Equitron NA Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies NA To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet IMSET IMSET BSC-Class II Type B2 Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc HiMedia SD295E-5VL For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder HiMedia TC352-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc HiMedia SD065 For performing AST
Centrifuge Minispin Eppendorf Minispin Plus-5453 Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc HiMedia SD006-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc HiMedia SD060-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder HiMedia TC447-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter Quest NA For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator BTL41 Allied Scientific NA For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)  Haier DW40L, Haier Biomedicals For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NA Paired-end sequencing library preparation
EDTA HiMedia GRM1195-100G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus TechResource 15 cm gel casting tray For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis 
Electrophoresis Power pack with electrodes Genei NA For running the AGE 
Erythromycin antibiotic disc HiMedia SD222-5VL For performing AST
Erythromycin antibiotic powder HiMedia CMS528-1G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder HiMedia TC024-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922     HiMedia 0335X-1 Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide HiMedia MB071-1G Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer Qubit 2.0 NA For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System BioRad Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc HiMedia SD170-5x50DS For performing AST
Glacial Acetic Acid HiMedia AS119-500ML For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol HiMedia GRM1027-500ML For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc HiMedia SD073 For performing AST
Kaiju Database NA NA For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc HiMedia SD017-5x50DS For performing AST
Kanamycin antibiotic powder HiMedia MB105-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc HiMedia SD216-5VL For performing AST
Luria Bertani broth Himedia M1245-500G For enrichment of cultures
McFarland Standards Himedia R092-1No To compare density of culture suspension
Molecular Biology water HiMedia TCL018-500ML For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)  HiMedia M173-500G For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc HiMedia SD731-5x50DS For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz  Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers  Xcelris NA For PCR amplication 
R2A Agar, Modified HiMedia M1743 For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation CLC Genomics Workbench 6.0 NA For generation of scaffolds
Sequencer Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) NA Sequencing of amplified library
Sodium Chloride  HiMedia TC046-500G For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit Xcelgen NA For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 HiMedia 0365P Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification Kaiju ioinformatics tool NA For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level 
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) NA NA For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc HiMedia SD278 For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc HiMedia SD039-5x50DS For performing AST
Tris base HiMedia TC072-500G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder HiMedia CMS217 For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance Mettler Toledo ME204 Mettler Toledo Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA – Not Applicable

References

  1. Prestinaci, F., Pezzotti, P., Pantosti, A. Antimicrobial resistance: A global multifaceted phenomenon. Pathogens and Global Health. 109 (7), 309-318 (2015).
  2. Knight, G., et al. Antimicrobial resistance and COVID-19: Intersections and implications. Elife. 10, 64139 (2021).
  3. Ventola, C. L. The antibiotic resistance crisis: Part 1: Causes and threats. Pharmacy and Therapeutics. 40 (4), 277-283 (2015).
  4. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J. R., Rath, A. Metagenomic analysis of total microbial diversity and antibiotic resistance of culturable microorganisms in raw chicken meat and mung sprouts (Phaseolus aureus) sold in retail markets of Mumbai. India. Current Science. 113 (1), 71-79 (2017).
  5. Naik, O. A., Shashidhar, R., Rath, D., Bandekar, J., Rath, A. Characterization of multiple antibiotic resistance of culturable microorganisms and metagenomic analysis of total microbial diversity of marine fish sold in retail shops in Mumbai, India. Environmental Science and Pollution Research. 25 (7), 6228-6239 (2018).
  6. Czekalski, N., GascónDíez, E., Bürgmann, H. Wastewater as a point source of antibiotic-resistance genes in the sediment of a freshwater lake. The ISME Journal. 8 (7), 1381-1390 (2014).
  7. Kraemer, S., Ramachandran, A., Perron, G. Antibiotic pollution in the environment: From microbial ecology to public policy. Microorganisms. 7 (6), 180 (2019).
  8. Edmonds-Wilson, S., Nurinova, N., Zapka, C., Fierer, N., Wilson, M. Review of human hand microbiome research. Journal of Dermatological Science. 80 (1), 3-12 (2015).
  9. de Abreu, V., Perdigão, J., Almeida, S. Metagenomic approaches to analyze antimicrobial resistance: An overview. Frontiers in Genetics. 11, 575592 (2021).
  10. Carlson, S., et al. Detection of multiresistant Salmonella typhimurium DT104 using multiplex and fluorogenic PCR. Molecular and Cellular Probes. 13 (3), 213-222 (1999).
  11. Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters, Version 12.0. European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing Available from: https://www.eucast.org/fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/v_12.0_Breakpoint_Tables.pdf (2022)
  12. Bharti, R., Grimm, D. Current challenges and best-practice protocols for microbiome analysis. Briefings in Bioinformatics. 22 (1), 178-193 (2019).
  13. Choo, J., Leong, L., Rogers, G. Sample storage conditions significantly influence faecal microbiome profiles. Scientific Reports. 5, 16350 (2015).
  14. Clinical and Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically, 11th edition. , (2015).
  15. Bayot, M., Bragg, B. Antimicrobial Susceptibility Testing. StatPearls. , (2021).
  16. Joseph, A. A., Odimayo, M. S., Olokoba, L. B., Olokoba, A. B., Popoola, G. O. Multiple antibiotic resistance index of Escherichia coli isolates in a tertiary hospital in South-West Nigeria. Medical Journal of Zambia. 44 (4), 225-232 (2017).
  17. Lorenz, T. Polymerase chain reaction: Basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  18. Rolin, J. Food and human gut as reservoirs of transferable antibiotic resistance encoding genes. Frontiers in Microbiology. 4, 173 (2013).
  19. Racewicz, P., et al. Prevalence and characterisation of antimicrobial resistance genes and class 1 and 2 integrons in multiresistant Escherichia coli isolated from poultry production. Scientific Reports. 12, 6062 (2022).
  20. Gebreyes, W., Thakur, S. Multidrug-resistant Salmonella enterica serovar Muenchen from pigs and humans and potential interserovar transfer of antimicrobial resistance. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (2), 503-511 (2005).
  21. Li, L., et al. Prevalence and characteristics of extended-spectrum β-lactamase and plasmid-mediated fluoroquinolone resistance genes in Escherichia coli isolated from chickens in Anhui Province, China. PLoS One. 9 (8), 104356 (2014).
  22. Akers, K., et al. Aminoglycoside resistance and susceptibility testing errors in Acinetobacter baumannii-calcoaceticus complex. Journal Of Clinical Microbiology. 48 (4), 1132-1138 (2010).
  23. Ciesielczuk, H. . Extra-intestinal pathogenic Escherichia coli in the UK: The importance in bacteraemia versus urinary tract infection, colonisation of widespread clones and specific virulence factors. , (2015).

Play Video

Cite This Article
Ghadigaonkar, D., Rath, A. Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes. J. Vis. Exp. (193), e63934, doi:10.3791/63934 (2023).

View Video