Summary

Aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos transmitidas por el agua y caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

Aquí, presentamos un protocolo detallado para el aislamiento e identificación de bacterias resistentes a antibióticos del agua y la caracterización molecular de sus genes de resistencia a antibióticos (ARG). El uso de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico) proporciona información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en aguas dulces de Mumbai, India.

Abstract

El desarrollo y la propagación de la resistencia a los antibióticos (RA) a través de la microbiota asociada con cuerpos de agua dulce es un importante problema de salud mundial. En el presente estudio, se recolectaron muestras de agua dulce y se analizaron con respecto a la diversidad bacteriana total y los genes AR (ARG) utilizando técnicas convencionales basadas en cultivos y un enfoque metagenómico independiente del cultivo de alto rendimiento. Este artículo presenta un protocolo sistemático para la enumeración de las bacterias cultivables totales y resistentes a antibióticos a partir de muestras de agua dulce y la determinación de la resistencia fenotípica y genotípica en los aislados cultivables. Además, informamos el uso de un análisis metagenómico completo del ADN metagenómico total extraído de la muestra de agua dulce para la identificación de la diversidad bacteriana general, incluidas las bacterias no cultivables, y la identificación del grupo total de diferentes ARG (resistoma) en el cuerpo de agua. Siguiendo estos protocolos detallados, observamos una alta carga de bacterias resistentes a los antibióticos en el rango de 9.6 × 10 5-1.2 × 109 UFC/mL. La mayoría de los aislamientos fueron resistentes a los múltiples antibióticos probados, incluyendo cefotaxima, ampicilina, levofloxacina, cloranfenicol, ceftriaxona, gentamicina, neomicina, trimetoprima y ciprofloxacina, con índices de resistencia a antibióticos múltiples (MAR) de ≥0,2, lo que indica altos niveles de resistencia en los aislados. La secuenciación del ARNr 16S identificó patógenos humanos potenciales, como Klebsiella pneumoniae, y bacterias oportunistas, como Comamonas spp., Micrococcus spp., Arthrobacter spp. y Aeromonas spp. La caracterización molecular de los aislados mostró la presencia de varios ARGs, como blaTEM, blaCTX-M (β-lactámicos), aadA, aac (6′)-Ib (aminoglucósidos) y dfr1 (trimetoprimas), lo que también fue confirmado por todo el análisis metagenómico de ADN. También se detectó una alta prevalencia de otros ARG que codifican para bombas de eflujo de antibióticos-mtrA, macB, mdtA, acrD, β-lactamasas-SMB-1, VIM-20, ccrA, ampC, blaZ, el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa catB10 y el gen de resistencia a la rifampicina rphB-. Con la ayuda de los protocolos discutidos en este estudio, confirmamos la presencia de bacterias SAM transmitidas por el agua con diversos rasgos fenotípicos y genotípicos de AR. Por lo tanto, el análisis de ADN metagenómico completo se puede utilizar como una técnica complementaria a las técnicas convencionales basadas en cultivos para determinar el estado general de AR de un cuerpo de agua.

Introduction

La resistencia a los antimicrobianos (RAM) se ha identificado como uno de los problemas mundiales más acuciantes. La rápida evolución de la RAM y su propagación mundial son una de las mayores amenazas para la salud humana y la economía mundial en términos de los costos de salud asociados con ella1. El uso excesivo y el mal uso de antibióticos han llevado a un aumento en AR. Esto ha sido destacado por la pandemia de COVID-19, durante la cual el tratamiento de infecciones secundarias asociadas, en muchos casos, se vio enormemente comprometido debido a la RAM en los pacientes afectados2. Además del uso directo / mal uso de antibióticos por parte de los seres humanos, el uso excesivo y el mal uso de antibióticos en la agricultura y la ganadería y su descarga inadecuada en el medio ambiente, incluidas las masas de agua, son una preocupación importante3. El aumento de nuevos rasgos de resistencia y resistencia a múltiples fármacos en bacterias resalta urgentemente la necesidad de una mejor comprensión de los factores que conducen al desarrollo de AR y su diseminación. Múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, que a menudo portan múltiples genes AR (ARG) en elementos genéticos móviles como los plásmidos, pueden transferir estos genes de resistencia a microorganismos no resistentes, incluidos los patógenos humanos potenciales, lo que lleva a la aparición de superbacterias que son intratables incluso con antibióticos de último recurso4. Estas múltiples bacterias resistentes a los antibióticos, si están presentes en los ecosistemas acuáticos, pueden ingresar directamente al intestino humano a través del consumo de alimentos contaminados a base de agua como peces, cangrejos y moluscos. Estudios previos han demostrado que la propagación de bacterias AR en sistemas de agua naturales también puede llegar a otros suministros de agua, incluida el agua potable, y, por lo tanto, puede ingresar a la cadena alimentaria humana 5,6,7.

El objetivo del presente estudio es proporcionar un protocolo integral utilizando una combinación de técnicas basadas en cultivos y no basadas en cultivos (análisis metagenómico completo) para obtener información completa sobre la diversidad bacteriana total y el conjunto total de diferentes ARG presentes en un cuerpo de agua en Mumbai, India. Convencionalmente, se han utilizado técnicas basadas en el cultivo para estudiar la diversidad bacteriana en cuerpos de agua. Como los microorganismos cultivables constituyen solo un pequeño porcentaje de la microbiota total en cualquier nicho, para tener una mejor comprensión del estado general de la diversidad bacteriana y los diversos rasgos resistentes que prevalecen en cualquier muestra, se deben utilizar varias técnicas basadas en el cultivo e independientes del cultivo en conjunto. Una de esas técnicas robustas y confiables independientes del cultivo es el análisis de ADN metagenómico completo. Este método de alto rendimiento ha sido utilizado con éxito en diversos estudios sobre diversidad bacteriana o anotaciones funcionales de varios ARG 8,9. Esta técnica utiliza el metagenoma (el material genético total en una muestra) como material de partida para varios análisis y, por lo tanto, es independiente del cultivo. Los protocolos del presente estudio se pueden utilizar para el análisis de ADN metagenómico completo para obtener información sobre la diversidad bacteriana total y varios ARG (resistoma) en muestras de agua.

Protocol

1. Recogida y procesamiento de muestras Recogida de muestrasRecoja el volumen apropiado de la muestra de agua en recipientes de muestras estériles, asegurándose de que no se llenen más de 3/4 del recipiente. Transportar las muestras al laboratorio en condiciones asépticas tan pronto como sea posible después de la recolección y procesarlas inmediatamente. Procesamiento de muestrasFiltrar asépticamente la muestra de agua a través de un pañ…

Representative Results

Carga bacteriana total y recuento de bacterias resistentes a los antibióticos (AR)La enumeración de la carga bacteriana total se llevó a cabo mediante la difusión de diluciones de 10−4 a 10−6 veces de las muestras de agua en agar R2A, medio modificado. Para la enumeración del recuento de bacterias AR, se distribuyeron diluciones de 10-3 a 10-6 veces en placas de medios que contenían antibióticos (Figura 3). Los recue…

Discussion

La recolección y el procesamiento de la muestra juegan un papel importante y pueden afectar los resultados y la interpretación del estudio. Por lo tanto, para descartar la variabilidad en las muestras, es importante llevar a cabo el muestreo en múltiples ubicaciones de la masa de agua dulce que se está estudiando. Mantener condiciones ambientales asépticas adecuadas al manipular dichas muestras puede prevenir la contaminación. Además, para evitar cambios en la composición bacteriana que puedan influir en la calid…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue parcialmente apoyado por subvenciones financieras del Departamento de Ciencia y Tecnología-Promoción de la Investigación Universitaria y el Esquema de Excelencia Científica (DST-PURSE) de la Universidad de Mumbai. Devika Ghadigaonkar trabajó como becaria de proyecto bajo el esquema. Se reconoce la ayuda técnica proporcionada por Harshali Shinde, investigador principal del Proyecto n.º de investigación del Departamento de Ciencia y Tecnología-Junta de Investigación de Ciencia e Ingeniería (DST-SERB): CRG / 2018 / 003624.

Materials

100 bp DNA ladder Himedia MBT049-50LN For estimation of size of the amplicons
2x PCR Taq mastermix HiMedia MBT061-50R For making PCR reaction mixture
37 °C Incubator GS-192, Gayatri Scientific NA For incubation of bacteria
6x Gel Loading Buffer HiMedia ML015-1ML Loading and Tracking dye which helps to weigh down the DNA sample and track the progress of electrophoresis
Agarose powder Himedia MB229-50G For resolving amplicons during Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Ampicillin antibiotic disc HiMedia SD002 For performing AST
Autoclave Equitron NA Required for sterilization of media, glass plates, test tubes, etc
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies NA To check the quality and quantity of the amplified library
Bisafety B2 Cabinet IMSET IMSET BSC-Class II Type B2 Used for microbiological work like bacterial culturing, AST etc.
Cefotaxime antibiotic disc HiMedia SD295E-5VL For performing AST
Cefotaxime antibiotic powder HiMedia TC352-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Ceftriaxone antibiotic disc HiMedia SD065 For performing AST
Centrifuge Minispin Eppendorf Minispin Plus-5453 Used to pellet the debris during crude DNA preparation
Chloramphenicol antibiotic disc HiMedia SD006-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic disc HiMedia SD060-5x50DS For performing AST
Ciprofloxacin antibiotic powder HiMedia TC447-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Colorimeter Quest NA For checking the OD of culture suspensions
Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) database functional annotation of ARGs; https://card.mcmaster.ca/
Cooling Shaker Incubator BTL41 Allied Scientific NA For incubation of media plates for culturing bacteria
Deep Freezer (-40 °C)  Haier DW40L, Haier Biomedicals For storage of glycerol stocks
DNA Library Prep Kit NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina NA Paired-end sequencing library preparation
EDTA HiMedia GRM1195-100G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Electrophoresis Apparatus TechResource 15 cm gel casting tray For making the agarose gel  and carrying out electrophoresis 
Electrophoresis Power pack with electrodes Genei NA For running the AGE 
Erythromycin antibiotic disc HiMedia SD222-5VL For performing AST
Erythromycin antibiotic powder HiMedia CMS528-1G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Erythromycin antibiotic powder HiMedia TC024-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Escherichia coli ATCC 25922     HiMedia 0335X-1 Used as a control while performing AST
Ethidium Bromide HiMedia MB071-1G Intercalating agent and visualizaion of DNA after electrophoresis under Gel Documentation System
Fluorometer Qubit 2.0 NA For determining concentration of extracted metagenomic DNA
Gel Documentation System BioRad Used for visualizing PCR amplicons after electrophoresis
Gentamicin antibiotic disc HiMedia SD170-5x50DS For performing AST
Glacial Acetic Acid HiMedia AS119-500ML For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Glycerol HiMedia GRM1027-500ML For making glycerol stocks
Imipenem antibiotic disc HiMedia SD073 For performing AST
Kaiju Database NA NA For taxonomical classification of reads; https://kaiju.binf.ku.dk/
Kanamycin antibiotic disc HiMedia SD017-5x50DS For performing AST
Kanamycin antibiotic powder HiMedia MB105-5G For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Levofloxacin antibiotic disc HiMedia SD216-5VL For performing AST
Luria Bertani broth Himedia M1245-500G For enrichment of cultures
McFarland Standards Himedia R092-1No To compare density of culture suspension
Molecular Biology water HiMedia TCL018-500ML For making PCR reaction mixture
Mueller-Hinton Agar (MHA)  HiMedia M173-500G For performing Antibiotc Susceptibility Testing (AST)
Neomycin antibiotic disc HiMedia SD731-5x50DS For performing AST
PCR Gradient Thermal Cycler Eppendorf Mastercycler Nexus Gradient 230V/50-60 Hz  Used for performing PCR for amplification of 16S rRNA region and various Antibiotic Resistance genes
Primers  Xcelris NA For PCR amplication 
R2A Agar, Modified HiMedia M1743 For preparation of media plates for isolation of total and antibiotic resistant (AR) bacterial load
Scaffold generation CLC Genomics Workbench 6.0 NA For generation of scaffolds
Sequencer Illumina platform (2 x 150 bp chemistry) NA Sequencing of amplified library
Sodium Chloride  HiMedia TC046-500G For preparation of 0.85% saline for serially diluting the water sample
Soil DNA isolation Kit Xcelgen NA For extraction of whole metagenomic DNA from the filtered water sample 
Staphylococcus aureus subsp. aureus ATCC 29213 HiMedia 0365P Used as a control while performing AST
Taxonomical Classification Kaiju ioinformatics tool NA For classification of reads into different taxonomic groups from phylum to genus level 
The Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) NA NA For functional annotation of ARGs
Tigecycline antibiotic disc HiMedia SD278 For performing AST
Trimethoprim antibiotic disc HiMedia SD039-5x50DS For performing AST
Tris base HiMedia TC072-500G For preparation of Gel running buffer for Agarose Gel Electrophoresis (AGE)
Vancomycin antibiotic powder HiMedia CMS217 For preparation of antibiotic stock solution required during isolation of antibiotic resistant bacteria
Weighing Balance Mettler Toledo ME204 Mettler Toledo Used for weighing media powders, reagent powders etc.
NA – Not Applicable

References

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Cite This Article
Ghadigaonkar, D., Rath, A. Isolation and Identification of Waterborne Antibiotic-Resistant Bacteria and Molecular Characterization of their Antibiotic Resistance Genes. J. Vis. Exp. (193), e63934, doi:10.3791/63934 (2023).

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