Summary
باستخدام البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI) ، أنتجنا جزيئات فيروسية لينتيفيروسية للتعبير المستقر عن shRNAs في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية H9 (hESCs) والخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs) بكفاءة عالية.
Abstract
يصف البروتوكول الحالي استخدام الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية لتوصيل الحمض النووي الريبي قصير الدبوس الشعري (shRNAs) إلى كل من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وكذلك الخلايا السلفية العصبية (NPCs) المشتقة من hESCs بكفاءة عالية. تم توليد جزيئات الفيروس العاصف عن طريق النقل المشترك لخلايا HEK293T باستخدام ناقلات الدخول (التي تحمل shRNAs) جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف (pAX و pMD2.G) باستخدام بوليمر البوليمر الكاتيوني منخفض التكلفة بولي إيثيلينيمين (PEI). وتركزت الجسيمات الفيروسية باستخدام الطرد المركزي الفائق، مما أدى إلى متوسط عيارات أعلى من 5 × 107. يمكن أن تصاب كل من hESCs و NPCs بكفاءة عالية باستخدام هذه الجسيمات الفيروسية ، كما هو موضح في اختيار puromycin والتعبير المستقر في hESCs ، وكذلك تعبير GFP العابر في NPCs. علاوة على ذلك ، أظهر تحليل اللطخة الغربية انخفاضا كبيرا في التعبير عن الجينات التي تستهدفها shRNAs. بالإضافة إلى ذلك ، احتفظت الخلايا بتعدد قدراتها وكذلك إمكانات التمايز ، كما يتضح من تمايزها اللاحق إلى سلالات مختلفة من الجهاز العصبي المركزي. ويتناول البروتوكول الحالي تسليم الحمض النووي الريبوزي المرسال؛ ومع ذلك ، يمكن استخدام نفس النهج للتعبير خارج الرحم عن cDNAs لدراسات التعبير المفرط.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) المشتقة من كتلة الخلايا الداخلية للكيسة الأريمية متعددة القدرات ويمكن تمييزها إلى أنواع مختلفة من الخلايا اعتمادا على العوامل الخارجية في ظل ظروف المختبر 1,2. من أجل تسخير إمكانات hESCs بشكل كامل ، من الضروري أن يكون لديك طرق سريعة وموثوقة لتوصيل الجينات لهذه الخلايا. تقليديا ، يمكن تصنيف التقنيات المستخدمة على نطاق واسع إلى نوعين: أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية والفيروسية 3,4. أنظمة توصيل الجينات غير الفيروسية الأكثر استخداما هي lipofection و electroporation و nucleofection. تعد أنظمة التوصيل غير الفيروسية مفيدة بسبب عدد أقل من طفرات الإدخال وانخفاض إجمالي في المناعة 5,6. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق تؤدي إلى انخفاض كفاءة النقل ومدة قصيرة من التعبير الجيني العابر ، وهو قيد رئيسي لدراسات التمايز طويلة الأجل7. يؤدي النقل الكهربائي إلى تحسين كفاءة النقل مقارنة ب lipofection. ومع ذلك ، فإنه يؤدي إلى أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا8،9،10. باستخدام nucleofection ، يمكن تحسين بقاء الخلية وكفاءة النقل من خلال الجمع بين lipofection و electroporation ، ولكن النهج يحتاج إلى مخازن مؤقتة خاصة بالخلايا ومعدات متخصصة ، وبالتالي ، يصبح مكلفا للغاية للتطبيقات الموسعة11,12.
وعلى النقيض من ذلك، أظهرت النواقل الفيروسية تحسنا في كفاءة نقل العدوى، فضلا عن انخفاض السمية الخلوية عموما، بعد النقل. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التعبير عن الجينات التي يتم تسليمها بثبات ، وبالتالي ، تجعل هذه الطريقة مثالية للدراسات طويلة الأجل13. من بين النواقل الفيروسية الأكثر استخداما لتوصيل الجينات إلى hESCs هي ناقلات الفيروسات الليفية (LVS) ، والتي يمكن أن تعطي أكثر من 80٪ من كفاءة النقل باستخدام جزيئات فيروسية عالية العيار14,15. يعد Lipofection و CaPO4 هطول الأمطار من بين الطرق الأكثر استخداما لنقل خلايا HEK293T أو مشتقاتها بشكل عابر مع ناقلات نقل الجينات جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف لإنتاج جزيئات فيروسية16. على الرغم من أن lipofection يؤدي إلى كفاءة نقل جيدة وسمية خلوية منخفضة ، إلا أن هذه التقنية تعوقها تكلفتها ، وسيكون التوسع للحصول على جزيئات عالية العيار lentiviral مكلفا للغاية. ينتج عن هطول الأمطار CaPO4 كفاءة نقل مماثلة نسبيا لتلك التي تم الحصول عليها باستخدام lipofection. على الرغم من فعالية التكلفة ، إلا أن هطول الأمطار CaPO4 يؤدي إلى موت كبير للخلايا بعد عمليات النقل ، مما يجعل من الصعب توحيد وتجنب الاختلافات من دفعة إلى دفعة17. في هذا السيناريو ، يعد تطوير طريقة تعطي كفاءة نقل عالية ، وسمية خلوية منخفضة ، وفعالية من حيث التكلفة أمرا بالغ الأهمية لإنتاج جزيئات عالية التيتر lentiviral لاستخدامها في hESCs.
البولي إيثيلينيمين (PEI) هو بوليمر كاتيوني يمكنه نقل خلايا HEK293T بكفاءة عالية دون الكثير من السمية الخلوية وله تكلفة ضئيلة مقارنة بالطرق القائمة على lipofection18. في هذه الحالة ، يمكن استخدام جزيرة برنس إدوارد للتطبيقات الموسعة لإنتاج LVS عالي العيار من خلال تركيز جزيئات lentiviral من supernatants المستنبتة باستخدام تقنيات مختلفة. تصف المقالة المقدمة استخدام جزيرة برنس إدوارد لنقل خلايا HEK293T وتركيز ناقلات الفيروسات الوعائية باستخدام الطرد المركزي الفائق من خلال وسادة السكروز. باستخدام هذه الطريقة ، نحصل بانتظام على عيارات أعلى بكثير من 5 × 107 وحدة دولية / مل مع اختلافات منخفضة من دفعة إلى دفعة. هذه الطريقة بسيطة ومباشرة وفعالة من حيث التكلفة للتطبيقات الموسعة لتوصيل الجينات إلى hESCs والخلايا المشتقة من hESCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نقل خلايا HEK293T باستخدام كاشف جزيرة الأمير إدوارد أو ليبوفيكتامين 3000
- استزرع خلايا HEK293T في DMEM + 10٪ FBS + 1x البنسلين / الستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2 حتى تصبح ملتقية بنسبة 90٪ قبل البذر للنقل. استخدم عددا منخفضا نسبيا من الخلايا لإنتاج فيروس عيار مرتفع (من الناحية المثالية أقل من P30).
- البذور 4 × 106 خلايا في 10 مل من متوسط النمو الكامل في لوحة زراعة الأنسجة 100 ملم وتنمو بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة الرطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2.
- لكل عملية نقل، قم بتخفيف الحمض النووي البلازميدي (مخزون 1 ملغم/مل) في 1 مل من وسائط DMEM الخالية من المصل في أنابيب أجهزة طرد مركزي سعة 1.5 مل باستخدام النسبة التالية من بلازميدات الدخول والتعبئة:
متجه الدخول = 10 ميكروغرام
psPAX2.0 = 7.5 ميكروغرام
pMD2.G = 5 ميكروغرام - دوامة لمدة 10 ثانية وتدور الأنبوب في 10000 × غرام لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة لجمع.
- أضف 70 ميكرولتر من (محلول مخزون 1 ملغم / مل) PEI إلى الأنبوب ، ودوامة وتدور لفترة وجيزة كما هو موضح أعلاه للجمع. يعتمد حجم جزيرة الأمير إدوارد المستخدمة على نسبة 1: 3 من إجمالي الحمض النووي (ميكروغرام):P EI (ميكروغرام).
- بالنسبة للنقل القائم على الليبوفيكتامين، قم بتخفيف المتجهات المذكورة أعلاه في 500 ميكرولتر من وسائط DMEM الخالية من المصل التي تحتوي على 45 ميكرولتر من الكاشف P المزود في المجموعة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- قم بتخفيف 70 ميكرولتر من الكاشف L المزود في المجموعة باستخدام 500 ميكرولتر من وسائط DMEM الخالية من المصل واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- الجمع بين محتويات كل من الأنابيب واحتضان الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة للسماح بتكوين معقد.
- أضف 1 مل من الحمض النووي / جزيرة الأمير إدوارد أو 1 مل من مجمعات الحمض النووي / ليبوفيكتامين إلى الصفيحة التي تحتوي على خلايا واحتضنها لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2.
- بعد 6 ساعات ، قم بالتغيير إلى وسائط نمو كاملة جديدة (10 مل) وأعد الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة الرطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2.
2. جمع LVS والطرد المركزي الفائق
- بعد يومين من النقل ، قم بجمع الوسائط المحتوية على الفيروس وتراكب الخلايا مرة أخرى مع 10 مل من وسائط النمو الكاملة الطازجة.
- بعد 3 أيام من النقل ، قم بجمع الوسائط المحتوية على الفيروس ودمجها مع الوسائط المحتوية على الفيروس التي تم جمعها في نقطة زمنية 2 يوم.
- جهاز الطرد المركزي للغاز الخارق الفيروسي عند 2000 × g لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية لتكسير الحطام الخلوي.
- قم بتصفية المادة الفائقة باستخدام فلتر منخفض البروتين بحجم 0.45 ميكرومتر (إما PES أو SFCA) وخزنه عند 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للطرد المركزي الفائق. يمكن تخزين المادة الفائقة المصفاة التي تحتوي على جزيئات فيروسية لينتيفيرية عند 4 درجات مئوية لمدة 5 أيام دون خسارة كبيرة في عيارات الفيروسات.
- قم بتعقيم أنابيب الطرد المركزي الفائقة التي تحمل الأكواب عن طريق غسلها بالإيثانول بنسبة 70٪ لمدة 10 دقائق ، وتجفيفها في الهواء ، وإغلاقها ، والحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية.
- أضف 36 مل من الوسائط المصفاة التي تحتوي على جزيئات فيروسية عدسية إلى أنبوب طرد مركزي فائق معقم.
- املأ 5 مل من شريط معقم ب 4 مل من محلول السكروز المعقم بنسبة 20٪ (المحضر في PBS) وقم بتوزيعه مباشرة على الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الفائق (UC) الذي يحتوي على LVS. من المهم ألا يتم خلط محلول السكروز مع الوسائط ويجعل التدرج في أسفل الأنبوب.
- قم بموازنة جميع أنابيب أجهزة الطرد المركزي الفائقة باستخدام وسائط DMEM الخالية من المصل ، وضعها في أنبوب الطرد المركزي البارد الذي يحمل الأكواب ، وأغلق الأغطية.
- قم بتدوير الأنابيب عند 125000 × g لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- بعد الدوران ، تخلص بعناية من supernatant عن طريق عكس محتويات الأنبوب في حاوية تحتوي على التبييض دون إزعاج الكرية. ضع علامة على الكريات إذا كانت مرئية.
- ضع أنبوب الطرد المركزي الفائق في أنبوب معقم سعة 50 مل وأضف 200 ميكرولتر من DPBS المعقم بالضبط في الجزء العلوي من الكرية. يحفظ عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها دون عائق.
- في اليوم التالي ، اخلطي بلطف عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 40x.
- تدور لفترة وجيزة عند 13000 × g في جهاز طرد مركزي على الطاولة لرمي أي حطام.
- نقل supernatant إلى أنبوب جديد و aliquot إعداد الفيروس كما 20 ميكرولتر aliquots. يخزن في درجة حرارة -80 درجة مئوية.
- ضع جانبا 5 ميكرولتر من التحضير لقياسات عيار الفيروسات.
3. قياس عيار LVS للمتجهات المستندة إلى pLKO.1
- حدد عيار الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية باستخدام qPCR باتباع توصيات الشركة المصنعة.
- للحصول على منحنى قياسي ، قم بإعداد خمسة تخفيفات تسلسلية 10 أضعاف من الحمض النووي للتحكم القياسي (المتوفر في المجموعة) عن طريق تخفيف 5 ميكرولتر من الحمض النووي إلى 45 ميكرولتر من H2O الخالي من النوكليز في كل خطوة. استخدم التخفيفات من 1:100 إلى 1:100,000 لإنشاء منحنى قياسي.
- قم بإعداد ردود الفعل على الجليد في تكرارات بالطريقة التالية:
2x qPCR ماستر ميكس 10 ميكرولتر
مزيج التمهيدي 2 ميكرولتر
عينة أو الحمض النووي القياسي 2 ميكرولتر
خالية من النوكليز H2O 6 ميكرولتر - قم بإجراء qPCR باستخدام شروط ركوب الدراجات المذكورة في دليل المجموعة لما مجموعه 35 دورة.
- قيم عتبة دورة الرسم (Ct) على المحور Y مقابل عيار الفيروسات على المحور X.
- قم بإنشاء انحدار لوغاريتمي باستخدام أربعة تخفيفات قياسية للحمض النووي للتحكم (1:100 إلى 1:100,000) لتحديد عيار عينة الفيروس غير المعروف باستخدام معادلة خط الاتجاه.
4. قياس عيار LVS للمتجهات المستندة إلى pll3.7
- البذور 1 × 105 خلايا HEK293T في كل بئر من صفيحة البئر P12 في 1 مل من وسائط النمو الكاملة قبل 24 ساعة من العدوى.
- استكمل الوسائط ب 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين وأضف 1 مل إلى كل أنبوب معقم 1.5 مل.
- قم بتخفيف الجسيمات الفيروسية باستخدام 4 ميكرولتر و 2 ميكرولتر و 1 ميكرولتر و 0.5 ميكرولتر و 0.1 ميكرولتر من جزيئات الفيروسة المركزة في كل من 1 مل من الوسائط المحتوية على البوليبرين.
- استبدل الوسائط من خلايا HEK293T بالوسائط التي تحتوي على كميات محددة من جزيئات lentiviral جنبا إلى جنب مع 8 ميكروغرام / مل من البولي برين واحتضنها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2.
- في اليوم التالي ، قم بالتغيير إلى وسائط جديدة واستمر في الثقافة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من 5٪ CO 2 و 21٪ O2.
- بعد 72 ساعة ، اغسل الخلايا باستخدام PBS ، والتربسين عند 37 درجة مئوية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، وأعد التعليق في 1 مل من PBS.
- قم بإجراء فرز خلايا FACS باستخدام فارز خلايا، باتباع توصيات الشركة المصنعة. اضبط البوابة على 0٪ من الخلايا الإيجابية GFP باستخدام خلايا HEK293T غير المصابة وقم بحساب 50000 حدث لكل عينة لتحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية لكل تخفيف فيروسي.
- استخدم فقط أحجام الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية التي تعطي خلايا إيجابية GFP في حدود 2٪ -20٪ لحساب عيار الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية.
5. عدوى hESCs واختيار مستقر
- اغسل الخلايا ب 2 مل من PBS تنمو في كل بئر من لوحة متعددة الآبار لزراعة الخلايا المكونة من 6 آبار.
- افصل الخلايا عن لوحة زراعة الخلايا باستخدام 1 مل من كاشف تفكك الخلية 1x عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- اجمع الخلايا في وسائط DMEM/F12 وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 1500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لجمع حبيبات الخلايا.
- الشفط ، وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل ، والعد باستخدام مقياس الدم.
- قم بعمل تعليق خلوي يحتوي على 2 × 105 خلايا / مل من وسائط النمو الكاملة التي تحتوي على mTeSR1 مع 10 نانوغرام / مل من عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي (bFGF) والبنسلين / الستربتومايسين (P / S) و 10 ميكرومتر من مثبطات الصخور (RI).
- البذور 1 × 10 5 خلايا على 50x مخففة كاملة غشاء الطابق السفلي المغلفة بمصفوفة P24-well لوحات في 500 ميكرولتر من وسائط النمو الكاملة وزراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة مع جو من5 ٪ CO 2 و 21 ٪ O2.
- في اليوم التالي ، تصيب hESCs عند تعدد العدوى (MOI) من 10 مع 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين وتحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 8 ساعات.
- بعد 8 ساعات ، استبدل الوسائط المحتوية على الفيروس بوسائط نمو جديدة (-RI) واستمر في الثقافة حتى تلتقي الخلايا بنسبة 90٪.
- ابدأ اختيار البيروميسين (0.8 ميكروغرام / مل) عندما تصل الخلايا إلى 90٪ من الالتقاء ، والذي عادة ما يكون 48-72 ساعة بعد الإصابة.
- بعد اكتمال الاختيار (عادة 4-6 أيام) ، قم بتقسيم الخلايا المستقرة (1: 4) وقم بتوسيع الخلايا للحفظ بالتبريد والمزيد من التحليل.
6. نقل الخلايا السلفية العصبية المشتقة من H9 (NPCs)
ملاحظة: تم اشتقاق NPCs من خلايا H9 باستخدام بروتوكول تثبيط Smad مزدوج ، كما هو موضح سابقا19.
- باختصار ، عالج خلايا H9 بكاشف تفكك الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتوليد خلايا مفردة وإعادة التعليق في وسائط نمو كاملة تحتوي على mTeSR1 مكمل بعامل نمو الخلايا الليفية الأساسي 10 نانوغرام / مل (bFGF) ، البنسلين / الستربتومايسين (P / S) ، ومثبط 10 ميكرومتر ROCK (RI). البذور على 1:50 أطباق مستزرعة مخففة مغلفة ب 6 خلايا بكثافة 60000 خلية / سم2 (اليوم 0).
- ابدأ التمايز عندما تصل الخلايا إلى التقاء 95٪ -100٪ عن طريق التغيير إلى وسائط KSR بنسبة 100٪ التي تحتوي على LDN193189 (200 نانومتر) ، و SB431542 (10 ميكرومتر) (يوم1).
- في اليوم 2 ، قم بتغيير الوسائط مرة أخرى باستخدام 100٪ KSR مكملة ب LDN193189 (200 nM) و SB431542 (10 μM) و XAV939 (5 μM).
- في اليوم 4 من التمايز ، انتقل إلى مزيج من وسط KSR (75٪) ووسط N2 (25٪) مع LDN193189 (200 nM) و SB431542 (10 μM) و XAV939 (5 ميكرومتر).
- من اليوم 6 إلى اليوم 12 ، قم بتبديل الوسائط تدريجيا إلى N2 بنسبة 100٪ مكملة ب LDN193189 (200 nM) و SB431542 (10 μM) و XAV939 (5 μM) عن طريق زيادة وسائط N2 بنسبة 25٪ كل يوم وتغيير الوسائط بعد كل يومين.
- اليوم الثقافي 12 NPCs في وسائط N2: B27 تستكمل ب 20 نانوغرام / مل bFGF.
- البذور 2 × 105 خلايا في كل بئر من 1:50 مخفف كامل غشاء سفلي مغلفة بمصفوفة P6 لوحة في 2 مل من وسائط ثقافة NPCs وحضانتها للسماح للخلايا بالتعلق.
- في اليوم التالي ، تصيب الخلايا بجزيئات lentiviral في MOI 6 في وجود 8 ميكروغرام / مل بوليبرين.
- بعد 8 ساعات ، استبدل الوسائط المحتوية على الفيروسات بوسائط نمو NPC جديدة.
- في اليوم التالي ، كرر العدوى وقم بتغيير الوسائط في الساعة 8.
- احتفظ بالخلايا في المزرعة لمدة 72 ساعة قبل الحصاد لمزيد من التحليل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد نقل الجينات ، هناك حاجة حتمية إلى جدوى عالية من hESCs. على الرغم من الجهود المبذولة وتحسين البروتوكولات للحد من موت الخلايا بعد الكهربية من hESCs ، لا يزال أكثر من 50 ٪ من موت الخلايا يلاحظ بعد الكهربية لهذه الخلايا ، جنبا إلى جنب مع انخفاض كفاءة النقل20. لا يؤدي نقل الجينات بوساطة الفيروس العدسي إلى كفاءة عالية في نقل الجينات فحسب ، بل يوضح أيضا مستويات عالية من صلاحية الخلايا بعد النقل. تقدم النتائج أدناه نهجين: أحدهما يستخدم GFP كمراسل وتعبير عابر في NPCs المشتقة من hESCs والآخر يستخدم البيوروميسين للاختيار المستقر ل hESCs لتجارب التمايز طويلة الأجل.
في المجموعة الأولى من التجارب ، تم إنتاج جزيئات lentiviral عن طريق المشاركة في نقل shRNAs التي تحمل ناقل pll3.7 مع GFP كمراسل إلى جانب الجيل الثاني من بلازميدات التعبئة والتغليف lentiviral psPAX2.0 و pMD2.G. تم جمع جزيئات الفيروس العاصف بعد 48 ساعة و 72 ساعة بعد النقل وتركزت باستخدام الطرد المركزي الفائق. يوضح الشكل 1A تعبير GFP الوفير في خلايا HEK293T بعد 72 ساعة من النقل. أدى التعبير عن البروتينات الفيروسية أيضا إلى تكوين خلايا HEK293T حيث يتم دمج الخلايا المفردة معا ، كما هو موضح في الأسهم في الشكل 1A. تم تحديد العيار باستخدام تحليل FACS. كما قارنا عيارات الفيروسات اللينتيفرية باستخدام كاشف PEI منخفض التكلفة وكاشف Lipofectamine 3000 ولم نجد فرقا كبيرا بين الاثنين من حيث العيار الفيروسي (الشكل 2A). بعد ذلك ، أصيبت NPCs المشتقة من H9 hESCs مرتين بهذه الجسيمات الفيروسية اللينتيفيروسية المحتوية على GFP في MOI من 6 وتم حصادها للتحليل بعد 72 h. يوضح الشكل 1B تعبيرا ملحوظا عن GFP في NPCs بعد الإصابة. كما نوقش أعلاه ، بالنسبة لتجارب التمايز طويلة الأجل ، من الضروري أن يكون لديك hESCs التي تعبر بثبات عن shRNAs. في محاولة لإنشاء خطوط خلايا مستقرة تعبر عن shRNA لمختلف الجينات ، استخدمنا ناقلات قائمة على plKO.1 واستنساخ shRNAs وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. بعد ذلك ، تم إنتاج جزيئات lentiviral كما هو موضح أعلاه ، وتم تحديد العيار باستخدام مجموعة قياس عيار lentiviral التجارية باستخدام الطرق القائمة على qPCR (الشكل 2B). أصيبت hESCs بجزيئات فيروسية lentivirus في MOI من 10 وتم اختيارها باستخدام اختيار puromycin. ويبين الشكل 3 نتائج الاختيار المستقر للمركبات الهيدروكلورية فلورية والأوعية الدموية بعد النقل. بعد 5 أيام من الاختيار مع 0.8 ميكروغرام / مل بوروميسين ، أظهرت الخلايا المنقولة الفيروسية أكثر من 80 ٪ من صلاحية الخلايا مقارنة بالخلايا غير المنقولة ، حيث لم تنجو أي خلايا من العلاج. بعد الاختيار ، تم توسيع خلايا H9 المحولة بثبات ، وحفظها بالتجميد ، وتحليلها باستخدام اللطخة الغربية لفحص الضربة القاضية الفعالة للجينات.
في مختبرنا ، أنشأنا خطوط خلايا مستقرة متعددة من H9 hESCs تعبر عن shRNAs لجينات مختلفة باستخدام النهج أعلاه. هنا ، قدمنا نتائج واحدة من تلك ، وهو جين نازعة هيدروجيناز L-2-hydroxyglutarate (L2HGDH) باستخدام تحليل اللطخة الغربية. لوحظ التعبير الوفير عن L2HGDH في الخلايا المحولة مع العمود الفقري المتجه الفارغ. ومع ذلك، لم يلاحظ أي تعبير عن L2HGDH في الخلايا المحولة مع ناقل يحمل shRNAs ل L2HGDH، مما يدل على فعالية الجيل المستقر لخط خلية H9 hESCs مع انخفاض التعبير عن L2HGDH، والتي يمكن استخدامها لمزيد من دراسات التمايز (الشكل 4).
الشكل 1: التعبير عن GFP في خلايا HEK293T و NPCs المصابة بالفيروسات. (A) تم استنساخ shRNAs في ناقل pll3.7 يحمل GFP كمراسل وشارك في نقله مع بلازميدات التعبئة والتغليف في خلايا HEK293T باستخدام جزيرة برنس إدوارد. يظهر تعبير GFP العالي كفاءة النقل بعد 72 ساعة من النقل. تشير الأسهم إلى تكوين syncytia في خلايا HEK293T ، حيث اندمجت مجموعات من خلايا HEK293T الفردية معا بسبب التعبير عن البروتينات الفيروسية. (ب) أصيبت ال NPCs المشتقة من H9 مرتين في وزارة الداخلية من 6 بجسيمات فيروسية عدسية تحتوي على GFP كمراسل ، ولوحظ تعبير GFP في الساعة 72 بعد الإصابة. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: قياسات عيار LVS. (أ) تم قياس العيار الفيروسي للناقلات القائمة على pll3.7 باستخدام تحليل FACS عن طريق تحديد كمية الخلايا الإيجابية GFP ٪ لتلك التخفيفات الفيروسية التي أعطت 2٪ -20٪ من الخلايا الإيجابية GFP. (ب) تم تحديد العيار الفيروسي للنواقل القائمة على pLKO.1 باستخدام مجموعة عيار فيروس qPCR lentivirus التجارية، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إنشاء خطوط H9 hESC مستقرة تعبر عن shRNA . تم استنساخ shRNAs إلى ناقلات فيروسية عدسية قائمة على pLKO.1 تحمل جين اختيار البيروميسين. وأصيبت H9 hESCs بجسيمات فيروسية عدية في 10 MOI وتم اختيارها باستخدام البيروميسين. باستخدام 0.8 ميكروغرام / مل بوروميسين لمدة 5 أيام ، تم قتل 100٪ من الخلايا غير المصابة ، في حين نجت معظم الخلايا من العلاج في المجموعة المصابة بالفيروس. تم توسيع هذه الخلايا دون اختيار نسيلي للحفظ بالتبريد والمزيد من التحليل. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تحليل لطخة غربية تمثيلية للضربة القاضية المستقرة للجين L2HGDH في H9 hESCs. تم إخضاع إجمالي التحلل الخلوي من خلايا التحكم السلبي (H9 ، puro uncut) ، وكذلك الخلايا التي تعبر بثبات عن shRNAs ضد L2HGDH (H9 ، sh-L2HGDH) لطخة غربية باستخدام الجسم المضاد L2HGDH. وكما هو مبين في الشكل، لم يلاحظ أي تعبير عن L2HGDH في H9 hESCs يعبر بشكل ثابت عن shRNAs ل L2HGDH. وقد لوحظ وجود نطاق غير محدد فوق النطاق المحدد المقابل للوزن الجزيئي الصحيح البالغ 46-48 كيلو دالو (المشار إليه بمثلث) للجسم المضاد L2HGDH. تم استخدام Anti-GAPDH كعنصر تحكم في التحميل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
القدرة على تعديل الخلايا الجذعية وراثيا لأغراض الدراسة أو السريرية محدودة من خلال التكنولوجيا والفهم الأساسي لبيولوجيا hESCs. التقنيات التي أظهرت إمكانات كبيرة في ESCs الفئران ، مثل lipofection و electroporation ، ليست فعالة للغاية بالنسبة ل hESCs ، والتي تشتهر بصعوبة توصيل الجينات بالطرق التقليدية20. وقد أدى هذا المفهوم ليس فقط إلى تحسين التقنيات القائمة ولكن أيضا إلى تطوير أساليب جديدة لزيادة كفاءة النقل في HESCs. كان تركيز هذه التطورات الجديدة على توصيل الجينات بكفاءة واستقرار إلى hESCs مع الحفاظ على الحد الأدنى من التأثير على نمو hESCs ، وتعدد القدرات ، وإمكانات التمايز على مدى فترات طويلة. من بين التطورات الجديدة المختلفة التي تلبي هذه المعايير الصارمة هو نقل الجينات بوساطة فيروسية إلى hESCs21,22. لإنتاج جزيئات lentiviral التي تعبر عن جين معين ، يتم استنساخ الجين المطلوب في أحد ناقلات النقل ويتم نقله في خلايا HEK293T جنبا إلى جنب مع بلازميدات التعبئة والتغليف لحصاد السوبرنات زراعة الخلايا التي تحتوي على جزيئات lentivirus. لاستخدامها في hESCs ، من الضروري تركيز هذه الجسيمات الفيروسية باستخدام تقنيات مختلفة لإنتاج عيارات عالية من الفيروسات على الأقل في نطاق 1 × 107-1 × 108 وحدة دولية / مل. بشكل عام ، تتركز كميات كبيرة من LVS من 200x-500x الحجم الأصلي لتحقيق هذه العيارات. وهذا يعني أن استخدام طريقة فعالة للغاية من حيث التكلفة دون المساس بكفاءة النقل في خلايا HEK293T هو شرط أساسي لاستخدام هذه الطرق بشكل روتيني في المختبر. تصف الطريقة الحالية استخدام البوليمر الكاتيوني PEI كطريقة فعالة من حيث التكلفة لإنتاج كميات كبيرة من LVS مع كفاءة نقل مماثلة للطرق القائمة على lipofection ، والتي تعتبر المعيار الذهبي. باستخدام الطريقة المقدمة ، يمكننا الحصول على متوسط عيارات LVS أعلى بكثير من 5 × 107 وحدة دولية / مل بعد عامل تركيز يبلغ 200 ضعف الحجم الأصلي. باستخدام جزيئات LVS هذه ، تمكنا من إنشاء العديد من خطوط الخلايا المستقرة من H9 hESCs التي تعبر عن shRNAs للعديد من الجينات عن طريق إصابة الخلايا في MOIs عالية. تتجاوز الطريقة المعروضة هنا استخدام الطرق المملة والمستهلكة للوقت للانتقاء والتوسع في النسيلة مع الاستمرار في الحصول على كفاءات ضربة قاضية قريبة من 100٪ ، كما هو موضح في إحدى نتائج اللطخة الغربية التمثيلية للضربة القاضية الجينية L2HGDH في الشكل 4. وفيما يلي بعض التوصيات المتعلقة باتباع نهج ناجح.
مطلوب استخدام عدد مرور منخفض من خلايا HEK293T (من الناحية المثالية أقل من 30) للعيارات الفيروسية العالية. يعد التقاء خلايا HEK293T عاملا مهما آخر في هذا الصدد. يجب أن تكون خلايا HEK293T ملتقية بنسبة 80٪ على الأقل قبل النقل لأن ملامسة الخلايا الخلوية تقلل بشكل كبير من السمية الخلوية وتحسن إنتاج الفيروس. ويجب تحضير النواقل المستخدمة باستخدام مجموعات عزل البلازميد الخالية من السموم الداخلية متبوعة بهطول الإيثانول وإعادة تشكيلها بتركيز لا يقل عن 1 ملغم/مل قبل استخدامها في النقل. يمكن أن تكون هناك اختلافات من دفعة إلى أخرى من حلول جزيرة الأمير إدوارد المعدة في تواريخ مختلفة. ولهذا السبب، يجب أولا اختبار كل دفعة من حلول جزيرة الأمير إدوارد للتأكد من أدائها باستخدام متجهات GFP، ويجب تخزين المحلول عند -20 درجة مئوية في أليكوتات تستخدم لمرة واحدة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. بالنسبة للعيارات العالية ، يوصى فقط بجمع LVS supernatant بعد 72 ساعة من نقل خلايا HEK293T فقط بشرط أن تكون الخلايا صحية ومرفقة. إن ترشيح المادة الفائقة المحتوية على LVSتزيد بشكل كبير من قابلية ذوبان LVS بعد الطرد المركزي الفائق. لا ينصح بتخزين supernatant LVS عند 4 درجات مئوية لأكثر من 5 أيام لأنه سيؤدي إلى انخفاض كبير في عيارات الفيروس. مطلوب تدرج السكروز أثناء الطرد المركزي الفائق للحصول على عيارات مثالية. يجب الحفاظ على درجات الحرارة بالقرب من 4 درجات مئوية خلال جميع خطوات الطرد المركزي الفائق. مطلوب حضانة بين عشية وضحاها لجزيئات LVS المركزة في DPBS لإعادة التعليق الكامل. يزيل الطرد المركزي بعد إعادة تعليق LVS الحطام الخلوي (إن وجد) لأنه يمكن أن يسبب السمية الخلوية عند استخدامه على الخلايا المستهدفة. بعد إصابة خلايا H9 ، من المهم استبدال الوسائط المحتوية على الفيروس بوسائط نمو جديدة بعد 8 ساعات لأن الحضانة المطولة بالفيروس ستؤدي إلى موت خلوي كبير ل H9 hESCs. يجب أن يبدأ اختيار البيروميسين فقط عندما يكون الالتقاء أكثر من 80٪.
تم تكييف الطريقة الموضحة أعلاه في الأصل للتعبير عن shRNAs. ويمكن استخدام نهج مماثل للتعبير خارج الرحم عن الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين ليتم استنساخه إلى متجهات تعبير. ومع ذلك ، فإن أحد القيود الرئيسية على توصيل الجينات بوساطة الفيروس الوليد هو قيد الحجم. مع زيادة الحجم ، فإن تغليف ناقلات الفيروسات اللينتيفيروسية ليس هو الأمثل ، مما يؤدي إلى انخفاض العيار الفيروسي23. وينبغي توجيه البحوث المستقبلية لتحسين البروتوكول للتغلب على هذه القيود.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ويعلن صاحبا البلاغ أنه لا يوجد تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال المنح البحثية من جامعة الإمارات العربية المتحدة (UAEU) ، والمنحة رقم 31R170 (مركز زايد للعلوم الصحية) و # 12R010 (منحة جامعة الإمارات العربية المتحدة). نشكر البروفيسور راندال مورس (مركز وادزورث، ألباني، نيويورك) على مساعدتنا في تحرير المخطوطة من حيث الأسلوب والقواعد.
جميع البيانات متاحة عند الطلب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C.
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
