Summary
Med hjälp av den billiga katjoniska polymeren polyetylenimin (PEI) producerade vi lentivirala partiklar för stabilt uttryck av shRNA i H9 humana embryonala stamceller (hESCs) och övergående transducerade H9-härledda neurala stamceller (NPC) med hög effektivitet.
Abstract
Det nuvarande protokollet beskriver användningen av lentivirala partiklar för leverans av korta hårnåls-RNA (shRNA) till både mänskliga embryonala stamceller (hESC) och neurala stamceller (NPC) härledda från hESC med hög effektivitet. Lentivirala partiklar genererades genom att samtransfektera HEK293T-celler med hjälp av ingångsvektorer (bärande shRNA) tillsammans med förpackningsplasmider (pAX och pMD2.G) med användning av den billiga katjoniska polymeren polyetylenimine (PEI). Virala partiklar koncentrerades med hjälp av ultracentrifugering, vilket resulterade i genomsnittliga titrar över 5 x 107. Både hESC och NPC kan infekteras med hög effektivitet med hjälp av dessa lentivirala partiklar, vilket framgår av puromycinval och stabilt uttryck i hESC, samt övergående GFP-uttryck i NPC. Dessutom visade western blot-analys en signifikant minskning av uttrycket av gener riktade mot shRNA. Dessutom behöll cellerna sin pluripotens såväl som differentieringspotential, vilket framgår av deras efterföljande differentiering i olika linjer av CNS. Det nuvarande protokollet behandlar leverans av shRNA; samma tillvägagångssätt kan dock användas för ektopiskt uttryck av cDNA för överuttrycksstudier.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESC) som härrör från blastocystens inre cellmassa är pluripotenta och kan differentieras till olika celltyper beroende på yttre faktorer under in vitro-förhållanden 1,2. För att fullt ut utnyttja potentialen hos hESC är det absolut nödvändigt att ha snabba och pålitliga genleveransmetoder för dessa celler. Konventionellt kan de använda teknikerna i stort sett klassificeras i två typer: icke-virala och virala genleveranssystem 3,4. De vanligaste icke-bilaterala genleveranssystemen är lipofektion, elektroporering och nukleofektion. Icke-dödliga leveranssystem är fördelaktiga på grund av färre insättningsmutationer och en total minskning av immunogeniciteten 5,6. Dessa metoder resulterar dock i låg transfektionseffektivitet och en kort varaktighet av övergående genuttryck, vilket är en stor begränsning för långsiktiga differentieringsstudier7. Elektroporering resulterar i bättre transfektionseffektivitet jämfört med lipofektion; det resulterar dock i mer än 50% celldöd 8,9,10. Med hjälp av nukleofsektion kan cellöverlevnad och transfektionseffektivitet förbättras genom att kombinera lipofektion och elektroporering, men tillvägagångssättet behöver cellspecifika buffertar och specialutrustning och blir därmed ganska kostsamt för uppskalade applikationer11,12.
Däremot har virala vektorer visat förbättrad transfektionseffektivitet, liksom övergripande låg cytotoxicitet, efter transduktion. Dessutom är de levererade generna stabilt uttryckta och gör därför denna metod idealisk för långtidsstudier13. Bland de vanligaste virusvektorerna för genleverans till hESC är lentivirala vektorer (LVS), vilket kan ge mer än 80% transduktionseffektivitet med hjälp av viruspartiklar med hög titer 14,15. Lipofektion och CaPO 4-utfällning är bland de vanligaste metoderna för att övergående transfektera HEK293T-celler eller dess derivat med genöverföringsvektorer tillsammans med förpackningsplasmider för att ge lentivirala partiklar16. Även om lipofektion resulterar i god transfektionseffektivitet och låg cytotoxicitet, hindras tekniken av dess kostnad, och att skala upp för att få höga titer lentivirala partiklar skulle vara mycket kostsamt. CaPO 4-utfällning resulterar i relativt liknande transfektionseffektivitet som de som erhålls med lipofektion. Även om det är kostnadseffektivt resulterar CaPO4-nederbörd i betydande celldöd efter transfektioner, vilket gör det svårt att standardisera och undvika batch-till-batch-variationer17. I detta scenario är det avgörande att utveckla en metod som ger hög transfektionseffektivitet, låg cytotoxicitet och kostnadseffektivitet för produktionen av hög titer lentivirala partiklar som ska användas i hESC.
Polyetylenimin (PEI) är en katjonisk polymer som kan transfektera HEK293T-celler med hög effektivitet utan mycket cytotoxicitet och har en försumbar kostnad jämfört med lipofektionsbaserade metoder18. I denna situation kan PEI användas för uppskalade applikationer av LVS-produktion med hög titer genom koncentrationen av lentivirala partiklar från odlingssupnatanter med hjälp av olika tekniker. Den presenterade artikeln beskriver användningen av PEI för att transfektera HEK293T-celler och lentivirral vektorkoncentration med hjälp av ultracentrifugering genom en sackaroskudde. Med hjälp av denna metod får vi regelbundet titrar långt över 5 x 107 IE / ml med låga batch-till-batch-variationer. Metoden är enkel, okomplicerad och kostnadseffektiv för uppskalade applikationer för genleverans till hESCs och hESCs-härledda celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Transfektion av HEK293T-celler med antingen PEI- eller Lipofectamine 3000-reagens
- Odla HEK293T-celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin vid 37 ° C i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5% CO2 och 21%O2 tills de är 90% sammanflytande före sådd för transfektion. Använd ett relativt lågt passageantal celler för hög titervirusproduktion (helst mindre än P30).
- Frö 4 x 106 celler i 10 ml fullständigt tillväxtmedium i en 100 mm vävnadsodlingsplatta och växer över natten i en fuktad vävnadsodlingsinkubator med en atmosfär av 5%CO2 och 21%O2.
- För varje transfektion, späd plasmid-DNA (1 mg/ml lager) i 1 ml serumfria DMEM-medier i 1,5 ml centrifugrör med användning av följande förhållande mellan ingångs- och förpackningsplasmider:
Ingångsvektor = 10 μg
psPAX2,0 = 7,5 μg
pMD2.G = 5 μg - Vortex i 10 s och snurra röret vid 10 000 x g i 30 s vid rumstemperatur för att samla upp.
- Tillsätt 70 μl (1 mg/ml stamlösning) PEI till röret och virvla och snurra kort enligt beskrivningen ovan för att samla upp. Volymen PEI som används baseras på förhållandet 1:3 mellan totalt DNA (μg):P EI (μg).
- För lipofektaminbaserad transfektion, späd ovanstående vektorer i 500 μL serumfria DMEM-medier innehållande 45 μL reagens P som medföljer i satsen och inkubera vid rumstemperatur i 5 min.
- Späd 70 μL reagens L som medföljer i satsen med 500 μL serumfritt DMEM-medium och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Kombinera innehållet i båda rören och inkubera rören vid rumstemperatur i 20 minuter för att möjliggöra komplex bildning.
- Tillsätt droppvis 1 ml DNA/PEI eller 1 ml DNA/lipofektaminkomplex till den platta som innehåller celler och inkubera i 6 timmar vid 37 °C i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5 %CO2 och 21 %O2.
- Efter 6 h, byt till färskt komplett tillväxtmedium (10 ml) och återför cellerna tillbaka till den fuktade inkubatorn med en atmosfär av 5%CO2 och 21%O2.
2. Lvs-uppsamling och ultracentrifugering
- Efter 2 dagars transfektion, samla det virusinnehållande mediet och överlagra cellerna igen med 10 ml färskt komplett tillväxtmedium.
- Efter 3 dagars transfektion, samla det virusinnehållande mediet och kombinera det med det virusinnehållande mediet som samlats in vid 2 dagars tidpunkt.
- Centrifugera virussupernatanten vid 2 000 x g i 10 minuter vid 4 °C för att pelletera cellrester.
- Filtrera supernatanten med ett 0,45 μm lågproteinbindningsfilter med en porstorlek (antingen PES eller SFCA) och förvara vid 4 °C tills det är klart för ultracentrifugering. Den filtrerade supernatanten som innehåller lentivirala partiklar kan förvaras vid 4 °C i 5 dagar utan signifikant förlust av virustitrar.
- Sterilisera de ultracentrifugrör som håller kopparna genom att tvätta dem med 70% etanol i 10 minuter, lufttorka, stäng och håll vid 4 °C.
- Tillsätt 36 ml filtrerat medium innehållande lentivirala partiklar till ett sterilt ultracentrifugrör.
- Fyll 5 ml steril stripett med 4 ml steril 20% sackaroslösning (beredd i PBS) och dispensera den direkt till botten av ultracentrifugröret (UC) som innehåller LVS. Det är viktigt att sackaroslösningen inte blandas med mediet och gör en lutning längst ner på röret.
- Balansera alla ultracentrifugrör med serumfria DMEM-medier, placera i de kalla ultracentrifugrörshållkopparna och stäng locken.
- Snurra rören vid 125 000 x g i 2 timmar vid 4 °C.
- Efter snurrningen, kassera försiktigt supernatanten genom att invertera rörets innehåll i en behållare som innehåller blekmedel utan att störa pelleten. Markera pelleten om den är synlig.
- Placera ultracentrifugröret i ett 50 ml sterilt rör och tillsätt 200 μl steril DPBS exakt högst upp på pelleten. Förvaras ostört vid 4 °C över natten.
- Dagen efter, blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner 40x.
- Snurra kort vid 13 000 x g i en bordscentrifug för att pelletera eventuellt skräp.
- Överför supernatanten till ett nytt rör och alikvotera viruspreparatet som 20 μL alikvoter. Förvaras vid −80 °C.
- Lägg åt sidan 5 μL av preparatet för virustitermätningar.
3. LVS titermätning för pLKO.1-baserade vektorer
- Bestäm titer för lentivirala partiklar med hjälp av en qPCR enligt tillverkarens rekommendationer.
- För en standardkurva, förbered fem 10-faldiga seriella utspädningar av Standard Control DNA (finns i satsen) genom att späda ut 5 μL DNA till 45 μL nukleasfrittH2Oi varje steg. Använd utspädningar på 1:100 till 1:100 000 för att generera en standardkurva.
- Ställ in reaktioner på is i dubbletter på följande sätt:
2x qPCR master mix 10 μL
Primerblandning 2 μl
Prov eller standard-DNA 2 μL
NukleasfriH2O6μl - Utför qPCR med de cykelförhållanden som nämns i satsens manual i totalt 35 cykler.
- Plotta cykeltröskelvärden (Ct) på Y-axeln jämfört med virustitern på X-axeln.
- Generera en logaritmisk regression med hjälp av fyra standard-DNA-utspädningar (1:100 till 1:100 000) för att bestämma den okända virusprovtiteraren med hjälp av en trendlinjeekvation.
4. LVS titermätning för pll3,7-baserade vektorer
- Frö 1 x 105 HEK293T-celler i varje brunn på en P12-brunnsplatta i 1 ml komplett tillväxtmedium 24 timmar före infektioner.
- Komplettera mediet med 8 μg/ml polybren och tillsätt 1 ml i varje sterilt 1,5 ml rör.
- Späd viruspartiklarna genom att använda 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL och 0,1 μL koncentrerade lentivirala partiklar i var och en av de 1 ml polybreninnehållande medierna.
- Ersätt mediet från HEK293T-celler med ett medium som innehåller angivna mängder lentivirala partiklar tillsammans med 8 μg/ml polybren och inkubera i 24 timmar vid 37 °C i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5 %CO2 och 21 %O2.
- Nästa dag, byt till färska medier och fortsätt kulturen i 72 timmar vid 37 ° C i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5%CO2 och 21%O2.
- Tvätta cellerna efter 72 timmar med PBS, trypsinisera vid 37 °C enligt tillverkarens protokoll och återsuspendera i 1 ml PBS.
- Utför FACS-cellsortering med hjälp av en cellsorterare enligt tillverkarens rekommendationer. Ställ in grinden på 0% GFP-positiva celler med icke-infekterade HEK293T-celler och räkna 50 000 händelser för varje prov för att bestämma procentandelen positiva celler för varje viral utspädning.
- Använd endast de volymer av lentivirala partiklar som ger %GFP-positiva celler i intervallet 2%-20% för att beräkna titer för lentivirala partiklar.
5. Infektion av hESC och stabilt urval
- Tvätta cellerna med 2 ml PBS som växer i varje brunn i en 6-brunns cellodlingsmultibueringsplatta.
- Lossa cellerna från cellodlingsplattan med 1 ml 1x celldissociationsreagens genom inkubation vid 37 °C i 5 minuter.
- Samla cellerna i DMEM/F12-media och centrifugera vid 1 500 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att samla upp cellpelleten.
- Aspirera, resuspendera cellerna i 1 ml och räkna med hjälp av en hemocytometer.
- Gör en cellsuspension med 2 x 105 celler/ml komplett tillväxtmedium innehållande mTeSR1 kompletterat med 10 ng/ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), penicillin/streptomycin (P/S) och 10 μM ROCK-hämmare (RI).
- Frö 1 x 105 celler på 50x utspädda kompletta källarmembranmatrisbelagda P24-brunnsplattor i 500 μL komplett tillväxtmedium och odla cellerna vid 37 °C i en fuktad inkubator med en atmosfär av 5%CO2 och 21%O2.
- Följande dag, infektera hESC vid en mängd infektion (MOI) på 10 med 8 μg/ml polybren och inkubera vid 37 °C i 8 timmar.
- Efter 8 timmar, byt ut det virusinnehållande mediet med färskt tillväxtmedium (-RI) och fortsätt kulturen tills cellerna är 90% konfluenta.
- Starta puromycinval (0,8 μg / ml) när cellerna når 90% sammanflöde, vilket vanligtvis är 48-72 h efter infektion.
- När urvalet är klart (vanligtvis 4-6 dagar), dela de stabila cellerna (1: 4) och expandera cellerna för kryokonservering och vidare analys.
6. Transduktion av H9-härledda neurala stamceller (NPC)
OBS: NPC härleddes från H9-celler med hjälp av ett dual-Smad-hämningsprotokoll, som beskrivits tidigare19.
- Behandla i korthet H9-celler med celldissociationsreagens vid 37 °C i 5 minuter för att generera enstaka celler och återsuspendera i kompletta tillväxtmedier innehållande mTeSR1 kompletterat med 10 ng/ml basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF), penicillin/streptomycin (P/S) och 10 μM ROCK-hämmare (RI). Frö på 1:50 utspädda Matrigel-belagda 6-brunns cellodlingsrätter med en densitet av 60 000 celler / cm2 (dag 0).
- Initiera differentiering när cellerna når 95% -100% sammanflöde genom att byta till 100% KSR-media innehållande LDN193189 (200 nM) och SB431542 (10 μM) (dag1).
- På dag 2, byt media igen med 100% KSR kompletterat med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) och XAV939 (5 μM).
- På dag 4 av differentiering, byt till en blandning av KSR-medium (75%) och N2-medium (25%) med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) och XAV939 (5 μM).
- Från dag 6 till dag 12, byt gradvis media till 100% N2 kompletterat med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) och XAV939 (5 μM) genom att öka N2-mediet 25% varje dag och byta media efter var 2: e dag.
- Kulturdag 12 NPC i N2:B27 media kompletterat med 20 ng/ml bFGF.
- Frö 2 x 105 celler i varje brunn i en 1:50 utspädd komplett källarmembranmatrisbelagd P6-platta i 2 ml NPC-odlingsmedier och inkubera för att låta cellerna fästa.
- Nästa dag infektera cellerna med lentivirala partiklar vid en MOI 6 i närvaro av 8 μg / ml polybren.
- Efter 8 timmar, byt ut det virusinnehållande mediet med färskt NPC-tillväxtmedium.
- Nästa dag, upprepa infektionerna och byt media vid 8 h.
- Håll cellerna i odling i 72 timmar före skörd för vidare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter genöverföring krävs oundvikligen hög livskraft hos hESC. Trots ansträngningar och optimering av protokoll för att minska celldöd efter elektroporering av hESC observeras fortfarande mer än 50% celldöd efter elektroporering av dessa celler, tillsammans med låg transfektionseffektivitet20. Lentivirral medierad genöverföring resulterar inte bara i hög effektivitet av genöverföring utan visar också höga nivåer av cellviabilitet efter transduktion. Resultaten nedan presenterar två tillvägagångssätt: en som använder GFP som reporter och övergående uttryck i hESCs-härledda NPC och den andra som använder puromycin för stabilt urval av hESC för långsiktiga differentieringsexperiment.
I den första uppsättningen experiment producerades lentivirala partiklar genom att samtransfektera shRNA som bär pll3.7-vektorn med GFP som reporter tillsammans med andra generationens lentivirala förpackningsplasmider psPAX2.0 och pMD2.G. Lentivirala partiklar samlades upp efter 48 h och 72 h efter transfektion och koncentrerades med användning av ultracentrifugering. Figur 1A visar det rikliga GFP-uttrycket i HEK293T-celler efter 72 timmars transfektion. Uttrycket av virala proteiner resulterade också i syncytiabildning av HEK293T-celler där enskilda celler smälts samman, vilket visas av pilar i figur 1A. Titrarna bestämdes med hjälp av FACS-analys. Vi jämförde också de lentivirala titrarna med billiga PEI- och Lipofectamine 3000-reagens och fann ingen signifikant skillnad mellan de två när det gäller virala titrar (figur 2A). Därefter infekterades H9 hESCs-härledda NPC två gånger med dessa GFP-innehållande lentivirala partiklar vid en MOI på 6 och skördades för analys efter 72 h. Figur 1B visar markant uttryck av GFP i NPC efter infektion. Som diskuterats ovan är det för långsiktiga differentieringsexperiment absolut nödvändigt att ha hESC som stabilt uttrycker shRNA. I ett försök att skapa stabila cellinjer som uttrycker shRNA för olika gener använde vi plKO.1-baserade vektorer och klonade shRNA enligt tillverkarens rekommendationer. Därefter producerades lentivirala partiklar enligt beskrivningen ovan, och titrar bestämdes med hjälp av ett kommersiellt lentivirralt titermätningskit med användning av qPCR-baserade metoder (figur 2B). hESC infekterades med lentivirala partiklar vid en MOI av 10 och valdes med användning av puromycinval. Figur 3 visar resultaten av stabilt urval av hESC efter transduktion. Efter 5 dagars selektion med 0,8 μg/ml puromycin visade lentivirala transfekterade celler mer än 80% cellviabilitet jämfört med icke-transducerade celler, där inga celler överlevde behandlingen. Efter urvalet expanderades de stabilt transducerade H9-cellerna ytterligare, kryokonserverades och analyserades med hjälp av western blot för att analysera för effektiv gen knockdown.
I vårt laboratorium har vi skapat flera stabila cellinjer av H9 hESC som uttrycker shRNA för olika gener med hjälp av ovanstående tillvägagångssätt. Här har vi presenterat resultaten av en av dessa, som är L-2-hydroxyglutaratdehydrogenas (L2HGDH) genen med hjälp av western blot-analys. Rikligt uttryck av L2HGDH observeras i celler som transduceras med tom vektorstam. Inget uttryck av L2HGDH observeras emellertid i celler som transduceras med en vektor som bär shRNA för L2HGDH, vilket visar effekten av den stabila genereringen av en H9 hESCs-cellinje med reducerat uttryck av L2HGDH, som kan användas för ytterligare differentieringsstudier (figur 4).
Figur 1: Uttryck av GFP i HEK293T-celler och virusinfekterade NPC: er. Det höga GFP-uttrycket visar effektiv transfektionseffektivitet efter 72 timmars transfektion. Pilar indikerar syncytiabildning i HEK293T-cellerna, där grupper av enskilda HEK293T-celler har smält samman på grund av uttrycket av virala proteiner. (B) H9-härledda NPC infekterades två gånger vid en MOI på 6 med lentivirala partiklar innehållande GFP som reporter, och GFP-uttryck observerades vid 72 timmar efter infektion. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
(A) Virala titrar för pll3.7-baserade vektorer mättes med FACS-analys genom att kvantifiera% GFP-positiva celler för de virala utspädningarna som gav 2% -20% GFP-positiva celler. (B) Virala titrar för pLKO.1-baserade vektorer bestämdes med hjälp av ett kommersiellt qPCR lentivirus titerkit, enligt tillverkarens rekommendationer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Etablering av stabila shRNA-uttryckande H9 hESC-linjer. H9 hESC infekterades med lentivirala partiklar vid en MOI på 10 och valdes med användning av puromycin. Med användning av 0,8 μg / ml puromycin i 5 dagar dödades 100% av de icke-infekterade cellerna, medan de flesta cellerna överlevde behandlingen i den virusinfekterade gruppen. Dessa celler expanderades utan klonalt urval för kryokonservering och vidare analys. Skalstreck = 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: En representativ western blot-analys för stabil knockdown av L2HGDH-genen i H9 hESCs. Totala celllysater från negativa kontrollceller (H9, puro oklippta) samt celler som stabilt uttrycker shRNA mot L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) utsattes för western blot med hjälp av anti-L2HGDH-antikroppen. Som visas i figuren observerades inget uttryck av L2HGDH i H9 hESC som stabilt uttryckte shRNA för L2HGDH. Ett icke-specifikt band observerades strax ovanför det specifika bandet som motsvarar den korrekta molekylvikten 46-48 kDa (indikerad med en triangel) för L2HGDH-antikroppen. Anti-GAPDH användes som lastkontroll. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förmågan att genetiskt modifiera stamceller för studier eller kliniska ändamål begränsas både av teknik och den grundläggande förståelsen för hESCs biologi. Tekniker som har visat betydande potential i mus-ESC, som lipofektion och elektroporering, är inte särskilt effektiva för hESC, som är notoriskt svåra för genleverans med konventionella metoder20. Denna uppfattning har lett till inte bara optimering av befintliga tekniker utan också utveckling av nya metoder för ökad transfektionseffektivitet i hESC. Fokus för denna nya utveckling har varit effektiv och stabil genleverans till hESC samtidigt som minimal effekt på hESC: s tillväxt, pluripotens och differentieringspotential bibehålls under längre perioder. Bland de olika nya utvecklingar som uppfyller dessa strikta kriterier är lentiviral medierad genöverföring till hESCs21,22. För produktion av lentivirala partiklar som uttrycker en viss gen klonas den önskade genen i en av överföringsvektorerna och transfekteras i HEK293T-celler tillsammans med förpackningsplasmider för att skörda en cellodlingssupnatant innehållande lentivirala partiklar. För att användas i hESC är det viktigt att koncentrera dessa viruspartiklar med hjälp av olika tekniker för att ge höga titrar av virus åtminstone i intervallet 1 x 107-1 x 108 IE / ml. I allmänhet koncentreras stora volymer LVS från 200x-500x den ursprungliga volymen för att uppnå dessa titrar. Detta innebär att användning av en mycket kostnadseffektiv metod utan att kompromissa med transfektionseffektiviteten i HEK293T-celler är en förutsättning för att dessa metoder rutinmässigt ska kunna användas i labbet. Den nuvarande metoden beskriver användningen av den katjoniska polymeren PEI som en kostnadseffektiv metod för att producera stora volymer LVS med en transfektionseffektivitet som liknar lipofektionsbaserade metoder, som anses vara guldstandard. Med hjälp av den presenterade metoden kan vi få genomsnittliga LVS-titrar långt över 5 x 107 IE / ml efter en koncentrationsfaktor på 200x den ursprungliga volymen. Med hjälp av dessa LVS-partiklar har vi kunnat etablera flera stabila cellinjer av H9 hESC som uttrycker shRNA för flera gener genom att infektera cellerna vid höga MOIs. Metoden som presenteras här kringgår användningen av tråkiga och tidskrävande metoder för klonalt urval och expansion samtidigt som den får knockdown-effektivitet nära 100%, vilket visas av ett av de representativa western blot-resultaten för L2HGDH-gen knockdown i figur 4. Nedan följer några av rekommendationerna för ett framgångsrikt tillvägagångssätt.
Användning av ett lågt passageantal HEK293T-celler krävs (helst under 30) för höga virala titrar. Sammanflödet av HEK293T-celler är en annan viktig faktor i detta avseende. HEK293T-celler måste vara minst 80% sammanflytande före transfektion eftersom cell-cellkontakt kraftigt minskar cytotoxiciteten och förbättrar virusproduktionen. De vektorer som används skall beredas med hjälp av endotoxinfria plasmidisoleringssatser följt av etanolutfällning och rekonstitueras med en lägsta koncentration på 1 mg/ml före användning för transfektion. Det kan finnas batch-till-batch-variationer av PEI-lösningar som framställts vid olika datum. Därför måste varje sats pei-lösning först testas för prestanda med hjälp av GFP-vektorer, och lösningen måste förvaras vid −20 °C i alikvoter för engångsbruk för att undvika upprepade frys-tö-cykler. För höga titrar rekommenderas endast insamling av LVS-supernatant efter 72 timmars transfektion av HEK293T-celler förutsatt att cellerna är friska och fästa. Filtrering av den LVS-innehållande supernatanten ökar kraftigt lösligheten hos LVS efter ultracentrifugering. Det rekommenderas inte att förvara LVS-supernatanten vid 4 °C i mer än 5 dagar eftersom det kommer att resultera i en signifikant minskning av virustitrar. Sackarosgradient under ultracentrifugering krävs för optimala titrar. Temperaturen skall hållas nära 4 °C under alla steg av ultracentrifugering. Inkubation över natten av koncentrerade LVS-partiklar i DPBS krävs för fullständig resuspension. Centrifugering efter återupplivning av LVS tar bort cellulärt skräp (om något) eftersom det kan orsaka cytotoxicitet när det används på målceller. Efter infektionen av H9-celler är det viktigt att ersätta det virusinnehållande mediet med färskt tillväxtmedium efter 8 timmar eftersom långvarig inkubation med viruset skulle leda till signifikant celldöd hos H9 hESC. Puromycinvalet bör endast startas när sammanflödet är mer än 80%.
Metoden som beskrivs ovan var ursprungligen anpassad för uttryck av shRNA. Ett liknande tillvägagångssätt skulle kunna användas för ektopiskt uttryck av cDNA som ska klonas till uttrycksvektorer. En stor begränsning av lentivirral medierad genleverans är dock storleksbegränsningen. När storleken ökar är förpackningen av lentivirala vektorer inte optimal, vilket resulterar i minskade virustiter23. Framtida forskning bör riktas för att optimera protokollet för att övervinna dessa begränsningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsbidrag från Förenade Arabemiratens universitet (UAEU), bidrag # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) och # 12R010 (UAEU-AUA-bidrag). Vi tackar prof Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) för att ha hjälpt oss att redigera manuskriptet för stil och grammatik.
Alla uppgifter är tillgängliga på begäran.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C.
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
