Summary
Düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanarak, H9 insan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) shRNA'ların kararlı ekspresyonu için lentiviral parçacıklar ürettik ve geçici olarak dönüştürülmüş H9 türevi nöral progenitör hücreler (NPC'ler) yüksek verimlilikte.
Abstract
Mevcut protokol, kısa saç tokası RNA'larının (shRNA'lar) hem insan embriyonik kök hücrelerine (hESC'ler) hem de hESC'lerden türetilen nöral progenitör hücrelere (NPC'ler) yüksek verimlilikte verilmesi için lentiviral parçacıkların kullanımını açıklamaktadır. Lentiviral parçacıklar, düşük maliyetli katyonik polimer polietilenimin (PEI) kullanılarak ambalaj plazmidleri (pAX ve pMD2.G) ile birlikte giriş vektörleri (shRNA'lar taşıyan) kullanılarak HEK293T hücrelerinin birlikte transfekte edilmesiyle üretildi. Viral parçacıklar ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edildi, bu da ortalama titrelerin 5 x 107'nin üzerinde olmasına neden oldu. Hem hESC'ler hem de NPC'ler, püromisin seçimi ve hESC'lerde kararlı ekspresyonun yanı sıra NPC'lerde geçici GFP ekspresyonu ile gösterildiği gibi, bu lentiviral partiküller kullanılarak yüksek verimlilikte enfekte olabilir. Ayrıca, batı leke analizi, shRNA'lar tarafından hedeflenen genlerin ekspresyonunda önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Ek olarak, hücreler, CNS'nin farklı soylarına daha sonraki farklılaşmalarıyla kanıtlandığı gibi, pluripotensilerini ve farklılaşma potansiyellerini korudular. Mevcut protokol, shRNA'ların verilmesi ile ilgilidir; Bununla birlikte, aynı yaklaşım aşırı ekspresyon çalışmaları için cDNA'ların ektopik ekspresyonu için de kullanılabilir.
Introduction
Blastosist iç hücre kütlesinden türetilen insan embriyonik kök hücreleri (hESC'ler) pluripotenttir ve in vitro koşullar altında dış etkenlere bağlı olarak farklı hücre tiplerine ayrılabilir 1,2. hESC'lerin potansiyelini tam olarak kullanmak için, bu hücreler için hızlı ve güvenilir gen dağıtım yöntemlerine sahip olmak zorunludur. Geleneksel olarak, kullanılan teknikler genel olarak iki tipte sınıflandırılabilir: viral olmayan ve viral gen dağıtım sistemleri 3,4. Daha sık kullanılan nonviral gen taşıyıcı sistemler lipofeksiyon, elektroporasyon ve nükleofeksiyondur. Nonviral dağıtım sistemleri, daha az yerleştirme mutasyonu ve immünojenisitedeki genel azalma nedeniyle avantajlıdır 5,6. Bununla birlikte, bu yöntemler düşük transfeksiyon etkinliği ve kısa süreli geçici gen ekspresyonu ile sonuçlanır, bu da uzun süreli farklılaşma çalışmaları için önemli bir sınırlamadır7. Elektroporasyon, lipofeksiyona kıyasla daha iyi transfeksiyon verimliliği sağlar; ancak %50'den fazla hücre ölümüile sonuçlanır 8,9,10. Nükleofeksiyon kullanılarak, lipofeksiyon ve elektroporasyon birleştirilerek hücre sağkalımı ve transfeksiyon verimliliği artırılabilir, ancak yaklaşım hücreye özgü tamponlara ve özel ekipmanlara ihtiyaç duyar ve bu nedenle ölçeklendirilmiş uygulamalar için oldukça maliyetli hale gelir11,12.
Buna karşılık, viral vektörler, transdüksiyonu takiben transfeksiyon verimliliklerinin yanı sıra genel olarak düşük sitotoksisiteyi de göstermiştir. Ek olarak, verilen genler istikrarlı bir şekilde ifade edilir ve bu nedenle bu yöntemi uzun süreli çalışmalar için ideal kılar13. hESC'lere gen iletimi için en sık kullanılan viral vektörler arasında, yüksek titreli viral parçacıklar14,15 kullanarak% 80'den fazla transdüksiyon verimliliği sağlayabilen lentiviral vektörler (LVS) bulunmaktadır. Lipofeksiyon ve CaPO4 çökeltmesi, HEK293T hücrelerini veya türevlerini gen transfer vektörleri ile geçici olarak transfekte etmek için en yaygın kullanılan yöntemler arasındadır ve lentiviral parçacıklar üretmek için plazmidleri paketlemektedir16. Lipofeksiyon iyi transfeksiyon etkinliği ve düşük sitotoksisite ile sonuçlanmasına rağmen, teknik maliyeti nedeniyle engellenir ve yüksek titreli lentiviral parçacıklar elde etmek için ölçeklendirilmesi çok maliyetli olacaktır. CaPO4 çökelmesi, lipofeksiyon kullanılarak elde edilenlere nispeten benzer transfeksiyon verimlilikleri ile sonuçlanır. Uygun maliyetli olmasına rağmen, CaPO4 çökeltisi, transfeksiyonları takiben önemli hücre ölümü ile sonuçlanır, bu da standardizasyonu ve partiden partiye varyasyonlardan kaçınmayı zorlaştırır17. Bu senaryoda, yüksek transfeksiyon verimliliği, düşük sitotoksisite ve maliyet etkinliği sağlayan bir yöntem geliştirmek, hESC'lerde kullanılacak yüksek titreli lentiviral parçacıkların üretimi için çok önemlidir.
Polietilenimin (PEI), HEK293T hücrelerini fazla sitotoksisite olmadan yüksek verimlilikte transfekte edebilen ve lipofeksiyon bazlı yöntemlere kıyasla ihmal edilebilir bir maliyeti olan katyonik bir polimerdir18. Bu durumda, PEI, çeşitli teknikler kullanılarak kültür süpernatantlarından lentiviral parçacıkların konsantrasyonu yoluyla yüksek titreli LVS üretiminin ölçeklendirilmiş uygulamaları için kullanılabilir. Sunulan makalede, HEK293T hücrelerini ve lentiviral vektör konsantrasyonunu transfekte etmek için PEI'nin bir sakkaroz yastığı aracılığıyla ultrasantrifüjleme kullanılarak kullanımı açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, düzenli olarak 5 x 107 IU / mL'nin çok üzerinde, düşük partiden partiye varyasyonlara sahip titreler elde ediyoruz. Yöntem, hESC'lere ve hESC'lerden türetilmiş hücrelere gen iletimi için ölçeklendirilmiş uygulamalar için basit, basit ve uygun maliyetlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. HEK293T hücrelerinin PEI veya Lipofectamine 3000 reaktifi kullanılarak transfeksiyonu
- DMEM'deki kültür HEK293T hücreleri +% 10 FBS + 1x penisilin / streptomisin, transfeksiyon için tohumlamadan önce% 90 akıcıya kadar% 5 CO2 ve% 21O2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de. Yüksek titreli virüs üretimi için nispeten düşük bir geçiş hücresi sayısı kullanın (ideal olarak P30'dan daha az).
- 100 mm'lik bir doku kültürü plakasında 10 mL'lik tam büyüme ortamında tohum 4 x 106 hücre ve % 5 CO 2 ve%21 O 2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatöründe gece boyunca büyür.
- Her transfeksiyon için, plazmid DNA'sını (1 mg/mL stoklar) 1,5 mL santrifüj tüplerinde 1 mL serum içermeyen DMEM ortamında aşağıdaki giriş ve ambalaj plazmid oranını kullanarak seyreltin:
Giriş vektörü = 10 μg
psPAX2.0 = 7.5 μg
pMD2.G = 5 μg - 10 s vorteks ve toplamak için oda sıcaklığında 30 s için tüpü 10.000 x g'da döndürün.
- Tüpe 70 μL (1 mg / mL stok çözeltisi) PEI ekleyin ve toplamak için yukarıda açıklandığı gibi vorteks ve spin yapın. Kullanılan PEI hacmi, toplam DNA (μg):P EI (μg)'nin 1: 3 oranına dayanmaktadır.
- Lipofektamin bazlı transfeksiyon için, yukarıdaki vektörleri, kitte verilen 45 μL reaktif P içeren 500 μL serumsuz DMEM ortamında seyreltin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Kitte verilen 70 μL reaktif L'yi 500 μL serumsuz DMEM ortamı kullanarak seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
- Her iki tüpün içeriğini birleştirin ve karmaşık formasyona izin vermek için tüpleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
- Hücreleri içeren plakaya damla damla 1 mL DNA / PEI veya 1 mL DNA / lipofectamin kompleksleri ekleyin ve% 5 CO 2 ve%21 O 2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 6 saat boyunca inkübe edin.
- 6 saat sonra, taze tam büyüme ortamına (10 mL) geçin ve hücreleri% 5 CO 2 ve%21 O 2 atmosferi ile nemlendirilmiş inkübatöre geri döndürün.
2. LVS toplama ve ultrasantrifüjleme
- Transfeksiyondan 2 gün sonra, virüs içeren ortamı toplayın ve hücreleri tekrar 10 mL taze tam büyüme ortamı ile kaplayın.
- Transfeksiyondan 3 gün sonra, virüs içeren medyayı toplayın ve 2 günlük zaman noktasında toplanan virüs içeren medya ile birleştirin.
- Viral süpernatantı 2.000 x g'de 4 ° C'de 10 dakika boyunca hücresel kalıntıları pelet etmek için santrifüj edin.
- Süpernatantı 0,45 μm gözenek boyutunda düşük protein bağlayıcı filtre (PES veya SFCA) kullanarak filtreleyin ve ultrasantrifüjlemeye hazır olana kadar 4 °C'de saklayın. Lentiviral parçacıklar içeren filtrelenmiş süpernatant, viral titrelerde önemli bir kayıp olmadan 5 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
- Bardakları tutan ultrasantrifüj tüplerini 10 dakika boyunca% 70 etanol ile yıkayarak sterilize edin, hava kurutun, kapatın ve 4 ° C'de tutun.
- Steril bir ultrasantrifüj tüpüne lentiviral parçacıklar içeren 36 mL filtrelenmiş ortam ekleyin.
- 5 mL'lik steril bir stripeti 4 mL steril% 20 sakkaroz çözeltisi (PBS'de hazırlanmış) ile doldurun ve LVS içeren ultrasantrifüj tüpünün (UC) dibine doğru dağıtın. Sakkaroz çözeltisinin medya ile karıştırılmaması ve tüpün dibinde bir gradyan yapması önemlidir.
- Serumsuz DMEM ortamını kullanarak tüm ultrasantrifüj tüplerini dengeleyin, soğuk ultrasantrifüj tüp tutma kaplarına yerleştirin ve kapakları kapatın.
- Tüpleri 4 °C'de 2 saat boyunca 125.000 x g'de döndürün.
- Spinden sonra, peleti rahatsız etmeden tüpün içeriğini çamaşır suyu içeren bir kapta ters çevirerek süpernatantı dikkatlice atın. Görünürse peleti işaretleyin.
- Ultra santrifüj tüpünü 50 mL'lik steril bir tüpe yerleştirin ve peletin tam üstüne 200 μL steril DPBS ekleyin. Gece boyunca bozulmadan 4 ° C'de tutun.
- Ertesi gün, 40x yukarı ve aşağı pipetle çekerek yavaşça karıştırın.
- Herhangi bir enkazı peletlemek için bir masa üstü santrifüjünde kısaca 13.000 x g'de döndürün.
- Süpernatantı yeni bir tüpe aktarın ve virüs preparatını 20 μL alikot olarak alikot edin. −80 °C'de saklayın.
- Viral titre ölçümleri için preparatın 5 μL'sini bir kenara koyun.
3. pLKO.1 tabanlı vektörler için LVS titre ölçümü
- Üreticinin tavsiyelerini izleyerek bir qPCR kullanarak lentiviral parçacıkların titresini belirleyin.
- Standart bir eğri için, her adımda 5 μL DNA'yı 45 μL nükleaz içermeyenH2O'ya seyrelterek Standart Kontrol DNA'sının (kit içinde sağlanan) beş adet 10 katlı seri seyreltmesini hazırlayın. Standart bir eğri oluşturmak için 1:100 ila 1:100.000 arasındaki seyreltmeleri kullanın.
- Buz üzerindeki reaksiyonları aşağıdaki şekilde kopyalar halinde ayarlayın:
2x qPCR ana karışımı 10 μL
Astar karışımı 2 μL
Örnek veya standart DNA 2 μL
Nükleaz içermeyen H2O 6 μL - Kitin kılavuzunda belirtilen bisiklet koşullarını kullanarak toplam 35 döngü için qPCR gerçekleştirin.
- Y eksenindeki döngü eşiği (Ct) değerleri ile X eksenindeki virüs titresi değerlerini çizin.
- Bir eğilim çizgisi denklemi kullanarak bilinmeyen virüs numune titresini belirlemek için dört standart kontrol DNA seyreltmesi (1:100 ila 1:100.000) kullanarak logaritmik bir regresyon oluşturun.
4. pll3.7 tabanlı vektörler için LVS titre ölçümü
- Tohum 1 x 105 HEK293T hücreleri, enfeksiyonlardan 24 saat önce 1 mL tam büyüme ortamında bir P12 kuyucuk plakasının her bir kuyucuğunda.
- Ortamı 8 μg / mL polibren ile destekleyin ve her steril 1,5 mL tüpe 1 mL ekleyin.
- 1 mL polibren içeren ortamın her birinde 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0.5 μL ve 0.1 μL konsantre lentiviral partiküller kullanarak viral parçacıkları seyreltin.
- HEK293T hücrelerinden gelen ortamı, 8 μg / mL polibren ile birlikte belirtilen miktarda lentiviral partikül içeren ortamla değiştirin ve% 5 CO 2 ve% 21O2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de24 saat boyunca inkübe edin.
- Ertesi gün, taze medyaya geçin ve kültürü% 5 CO 2 ve% 21O 2 atmosferine sahip nemlendirilmiş bir inkübatörde 37 ° C'de 72 saat boyunca devam edin.
- 72 saat sonra, hücreleri PBS ile yıkayın, üreticinin protokolüne göre 37 ° C'de tripsinize edin ve 1 mL PBS'de yeniden askıya alın.
- Üreticinin önerilerini izleyerek bir hücre sıralayıcı kullanarak FACS hücre sıralama gerçekleştirin. Enfekte olmayan HEK293T hücrelerini kullanarak kapıyı% 0 GFP pozitif hücrelere ayarlayın ve her viral seyreltme için pozitif hücrelerin yüzdesini belirlemek üzere her örnek için 50.000 olay sayın.
- Lentiviral parçacıkların titresini hesaplamak için sadece% 2-20 aralığında% GFP pozitif hücreler veren lentiviral parçacıkların hacimlerini kullanın.
5. hESC'lerin enfeksiyonu ve stabil seçim
- Hücreleri, 6 delikli hücre kültürü çok kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğunda büyüyen 2 mL PBS ile yıkayın.
- 1 mL 1x hücre ayrışma reaktifi kullanarak hücreleri hücre kültürü plakasından 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübasyonla ayırın.
- DMEM / F12 ortamındaki hücreleri toplayın ve hücre peletini toplamak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.500 x g'de santrifüj yapın.
- Aspirat, hücreleri 1 mL'de yeniden askıya alın ve bir hemositometre kullanarak sayın.
- 10 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), penisilin / streptomisin (P / S) ve 10 μM ROCK İnhibitörü (RI) ile desteklenmiş mTeSR1 içeren 2 x 105 hücre / mL tam büyüme ortamı içeren bir hücre süspansiyonu yapın.
- Tohum 1 x 105 hücreler üzerinde 50x seyreltilmiş komple bazal membran matris kaplı P24-kuyucuk plakaları üzerinde 500 μL komple büyüme ortamı ve kültüründe hücreleri 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 CO 2 ve %21 O 2 atmosferine sahip bir inkübatörde kültürleyin.
- Ertesi gün, hESC'leri 8 μg / mL polibren ile 10 enfeksiyon çokluğunda (MOI) enfekte edin ve 8 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- 8 saat sonra, virüs içeren ortamı taze büyüme ortamı (-RI) ile değiştirin ve hücreler% 90 birleşene kadar kültüre devam edin.
- Püromisin seçimine (0.8 μg / mL) hücreler% 90 akıcılığa ulaştığında başlayın, bu genellikle enfeksiyondan 48-72 saat sonradır.
- Seçim tamamlandıktan sonra (genellikle 4-6 gün), kararlı hücreleri bölün (1: 4) ve kriyoprezervasyon ve daha fazla analiz için hücreleri genişletin.
6. H9 türevi nöral progenitör hücrelerin (NPC'ler) transdüksiyonu
NOT: NPC'ler, daha önce açıklandığı gibi bir dual-Smad inhibisyon protokolü kullanılarak H9 hücrelerinden türetilmiştir19.
- Kısaca, H9 hücrelerini, tek hücreler üretmek için 37 ° C'de hücre ayrışma reaktifi ile 5 dakika boyunca tedavi edin ve 10 ng / mL bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF), penisilin / streptomisin (P / S) ve 10 μM ROCK İnhibitörü (RI) ile desteklenmiş mTeSR1 içeren tam büyüme ortamında resüspend. 1:50 üzerinde tohum seyreltilmiş Matrigel kaplı 6 kuyucuklu hücre kültürü tabakları 60.000 hücre /cm2 yoğunluğunda (gün 0).
- LDN193189 (200 nM) ve SB431542 (10 μM) (gün1) içeren %100 KSR ortamına geçerek hücreler %95-%100 akıcılığa ulaştığında farklılaşmayı başlatın.
- 2. günde, LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile desteklenen %100 KSR ile ortamı tekrar değiştirin.
- Farklılaşmanın 4. gününde, LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile KSR ortamı (%75) ve N2 ortamı (%25) karışımına geçin.
- 6. günden 12. güne kadar, N2 ortamını her gün %25 artırarak ve her 2 günde bir medyayı değiştirerek LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) ve XAV939 (5 μM) ile desteklenmiş ortamları kademeli olarak %100 N2'ye geçirin.
- Kültür günü N2: B27 ortamındaki NPC'ler 20 ng / mL bFGF ile desteklenmiştir.
- Tohum 2 x 105 hücrenin her bir kuyucuğunda 1:50 seyreltilmiş komple bazal membran matris kaplı P6 plakası içinde 2 mL NPC kültür ortamı ve hücrelerin bağlanmasını sağlamak için inkübe edilir.
- Ertesi gün, hücreleri 8 μg / mL polibren varlığında bir MOI 6'da lentiviral parçacıklarla enfekte edin.
- 8 saat sonra, virüs içeren ortamı taze NPC büyüme ortamıyla değiştirin.
- Ertesi gün, enfeksiyonları tekrarlayın ve medyayı 8 saatte değiştirin.
- Daha fazla analiz için hasat etmeden önce hücreleri 72 saat kültürde tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gen transferini takiben, hESC'lerin yüksek canlılığı kaçınılmaz olarak gereklidir. hESC'lerin elektroporasyonunu takiben hücre ölümünü azaltmak için protokollerin çabalarına ve optimizasyonuna rağmen, bu hücrelerin elektroporasyonundan sonra% 50'den fazla hücre ölümü ve düşük transfeksiyon verimliliği20 ile birlikte gözlenmektedir. Lentiviral aracılı gen transferi sadece gen transferinin yüksek verimliliği ile sonuçlanmakla kalmaz, aynı zamanda transdüksiyonu takiben yüksek düzeyde hücre canlılığı gösterir. Aşağıdaki sonuçlar iki yaklaşım sunmaktadır: biri GFP'yi hESC'lerden türetilmiş NPC'lerde muhabir ve geçici ifade olarak kullanmak, diğeri ise uzun vadeli farklılaşma deneyleri için hESC'lerin kararlı seçimi için puromisin kullanmak.
İlk deney setinde, lentiviral parçacıklar, ikinci nesil lentiviral ambalaj plazmidleri psPAX2.0 ve pMD2.G ile birlikte GFP ile pll3.7 vektörünü taşıyan shRNA'ların birlikte transfekte edilmesiyle üretildi. Lentiviral partiküller transfeksiyon sonrası 48 saat ve 72 saat sonra toplandı ve ultrasantrifüjleme kullanılarak konsantre edildi. Şekil 1A, 72 saatlik transfeksiyondan sonra HEK293T hücrelerinde bol miktarda GFP ekspresyonunu göstermektedir. Viral proteinlerin ekspresyonu ayrıca, Şekil 1A'daki oklarla gösterildiği gibi, tek hücrelerin birbirine kaynaştığı HEK293T hücrelerinin sinsiti oluşumuna neden oldu. Titerler FACS analizi kullanılarak belirlendi. Ayrıca düşük maliyetli PEI ve Lipofectamine 3000 reaktifi kullanarak lentiviral titreleri karşılaştırdık ve viral titreler açısından ikisi arasında anlamlı bir fark bulamadık (Şekil 2A). Daha sonra, H9 hESC'lerden türetilmiş NPC'ler, 6'lık bir MOI'de bu GFP içeren lentiviral parçacıklarla iki kez enfekte edildi ve 72 saat sonra analiz için hasat edildi. Yukarıda tartışıldığı gibi, uzun vadeli farklılaşma deneyleri için, shRNA'ları istikrarlı bir şekilde ifade eden hESC'lere sahip olmak zorunludur. Çeşitli genler için shRNA'yı eksprese eden kararlı hücre hatları oluşturma girişiminde, üreticinin tavsiyelerine göre plKO.1 tabanlı vektörler ve klonlanmış shRNA'lar kullandık. Daha sonra, yukarıda tarif edildiği gibi lentiviral parçacıklar üretildi ve titreler, qPCR tabanlı yöntemler kullanılarak ticari bir lentiviral titre ölçüm kiti kullanılarak belirlendi (Şekil 2B). hESC'ler 10 MOI'de lentiviral partiküllerle enfekte edildi ve puromisin seçimi kullanılarak seçildi. Şekil 3, transdüksiyonu takiben hESC'lerin kararlı seçiminin sonuçlarını göstermektedir. 0.8 μg / mL puromisin ile 5 günlük seçimden sonra, lentiviral transfekte hücreler, hiçbir hücrenin tedaviden kurtulamadığı transdüsyen olmayan hücrelere kıyasla% 80'den fazla hücre canlılığı gösterdi. Seçimden sonra, kararlı bir şekilde dönüştürülmüş H9 hücreleri daha da genişletildi, kriyoprezerve edildi ve verimli gen nakavtını test etmek için batı lekesi kullanılarak analiz edildi.
Laboratuvarımızda, yukarıdaki yaklaşımı kullanarak farklı genler için shRNA'ları eksprese eden H9 hESC'lerin çoklu kararlı hücre hatlarını oluşturduk. Burada, bunlardan biri olan L-2-hidroksiglutarat dehidrogenaz (L2HGDH) geninin sonuçlarını batı leke analizini kullanarak sunduk. L2HGDH'nin bol ekspresyonu, boş vektör omurgası ile dönüştürülen hücrelerde gözlenir. Bununla birlikte, L2HGDH için shRNA'lar taşıyan bir vektörle dönüştürülen hücrelerde L2HGDH ekspresyonu gözlenmemiştir, bu da daha ileri farklılaşma çalışmaları için kullanılabilecek L2HGDH'nin azaltılmış ekspresyonuna sahip bir H9 hESC hücre hattının kararlı üretiminin etkinliğini göstermektedir (Şekil 4).
Şekil 1: HEK293T hücrelerinde ve viral enfekte NPC'lerde GFP'nin ekspresyonu. (A) shRNA'lar, GFP'yi muhabir olarak taşıyan bir pll3.7 vektörüne klonlandı ve PEI kullanılarak HEK293T hücrelerinde ambalaj plazmidleri ile birlikte transfekte edildi. Yüksek GFP ekspresyonu, 72 saatlik transfeksiyondan sonra etkili transfeksiyon verimliliğini gösterir. Oklar, bireysel HEK293T hücrelerinin gruplarının viral proteinlerin ekspresyonu nedeniyle birbirine kaynaştığı HEK293T hücrelerinde sinsiti oluşumunu gösterir. (B) H9 türevi NPC'ler, muhabir olarak GFP içeren lentiviral parçacıklarla 6'lık bir MOI'de iki kez enfekte edildi ve GFP ekspresyonu enfeksiyondan 72 saat sonra gözlendi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: LVS titre ölçümleri. (A) pll3.7 tabanlı vektörler için viral titreler, %2-20 GFP pozitif hücreler veren viral dilüsyonlar için %GFP pozitif hücreleri nicelleştirilerek FACS analizi kullanılarak ölçülmüştür. (B) pLKO.1 tabanlı vektörler için viral titreler, üreticinin tavsiyelerine uygun olarak ticari bir qPCR lentivirüs titre kiti kullanılarak belirlendi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Stabil shRNA-eksprese eden H9 hESC hatlarının oluşturulması. shRNA'lar, puromisin seçim genini taşıyan pLKO.1 bazlı lentiviral vektörlere klonlandı. H9 hESC'ler 10'luk bir MOI'de lentiviral partiküllerle enfekte edildi ve puromisin kullanılarak seçildi. 5 gün boyunca 0.8 μg / mL puromisin kullanılarak, enfekte olmayan hücrelerin% 100'ü öldürülürken, hücrelerin çoğu viral enfekte grupta tedaviden kurtuldu. Bu hücreler kriyoprezervasyon ve daha ileri analizler için klonal seçim yapılmadan genişletildi. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: H9 hESC'lerde L2HGDH geninin stabil nakavtı için temsili bir batı leke analizi. Negatif kontrol (H9, puro kesilmemiş) hücrelerinden total hücre lizatlarının yanı sıra L2HGDH'ye (H9, sh-L2HGDH) karşı shRNA'ları kararlı bir şekilde eksprese eden hücreler, anti-L2HGDH antikoru kullanılarak batı lekesine maruz bırakıldı. Şekilde gösterildiği gibi, L2HGDH için shRNA'ları kararlı bir şekilde eksprese eden H9 hESC'lerde L2HGDH ekspresyonu gözlenmemiştir. L2HGDH antikoru için 46-48 kDa'lık (üçgen ile belirtilen) doğru moleküler ağırlığa karşılık gelen spesifik bandın hemen üzerinde spesifik olmayan bir bant gözlendi. Anti-GAPDH yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kök hücreleri çalışma veya klinik amaçlar için genetik olarak değiştirme yeteneği, hem teknoloji hem de hESC'lerin biyolojisinin temel anlayışı ile sınırlıdır. Lipofeksiyon ve elektroporasyon gibi fare ESC'lerinde önemli potansiyel gösteren teknikler, geleneksel yöntemlerle gen iletimi için oldukça zor olan hESC'ler için oldukça verimli değildir20. Bu kavram sadece mevcut tekniklerin optimizasyonuna değil, aynı zamanda hESC'lerde transfeksiyon verimliliğinin arttırılması için yeni yöntemlerin geliştirilmesine de yol açmıştır. Bu yeni gelişmelerin odak noktası, hESC'lerin büyümesi, pluripotensi ve farklılaşma potansiyeli üzerinde uzun süreler boyunca minimum etkiyi korurken, hESC'lere verimli ve kararlı gen iletimi olmuştur. Bu katı kriterleri karşılayan çeşitli yeni gelişmeler arasında, hESC'lere lentiviral aracılı gen transferi21,22 bulunmaktadır. Belirli bir geni ifade eden lentiviral parçacıkların üretimi için, istenen gen transfer vektörlerinden birinde klonlanır ve lentiviral parçacıklar içeren bir hücre kültürü süpernatanı toplamak için ambalaj plazmidleri ile birlikte HEK293T hücrelerinde transfekte edilir. hESC'lerde kullanılmak üzere, en az 1 x 107-1 x 108 IU / mL aralığında yüksek virüs titreleri elde etmek için bu viral parçacıkların çeşitli teknikler kullanılarak konsantre edilmesi esastır. Genel olarak, bu titreleri elde etmek için büyük hacimli LVS'ler orijinal hacmin 200x-500 katı arasında yoğunlaşır. Bu, HEK293T hücrelerinde transfeksiyon verimliliğinden ödün vermeden oldukça uygun maliyetli bir yöntem kullanmak, bu yöntemlerin laboratuvarda rutin olarak kullanılması için bir ön koşuldur. Bu yöntem, katyonik polimer PEI'nin, altın standart olarak kabul edilen lipofeksiyon bazlı yöntemlere benzer bir transfeksiyon verimliliğine sahip büyük miktarlarda LVS üretmek için uygun maliyetli bir yöntem olarak kullanımını açıklamaktadır. Sunulan yöntemi kullanarak, orijinal hacmin 200 katı konsantrasyon faktöründen sonra 5 x 107 IU / mL'nin üzerinde ortalama LVS titreleri elde edebiliriz. Bu LVS parçacıklarını kullanarak, yüksek MOI'lerdeki hücreleri enfekte ederek birkaç gen için shRNA'ları eksprese eden H9 hESC'lerin birkaç kararlı hücre hattını oluşturabildik. Burada sunulan yöntem, Şekil 4'teki L2HGDH gen nakavtı için temsili batı lekesi sonuçlarından birinde gösterildiği gibi, sıkışık ve zaman alıcı klonal seleksiyon ve genişleme yöntemlerinin kullanımını atlarken, hala% 100'e yakın nakavt verimliliği elde etmektedir. Aşağıda, başarılı bir yaklaşım için önerilerden bazıları verilmiştir.
Yüksek viral titreler için düşük pasaj sayıda HEK293T hücresinin kullanılması gerekir (ideal olarak 30'un altında). HEK293T hücrelerinin akıcılığı bu konuda bir diğer önemli faktördür. HEK293T hücreleri, transfeksiyondan önce en az% 80 oranında kaynaşmalıdır, çünkü hücre-hücre teması sitotoksisiteyi büyük ölçüde azaltır ve virüs üretimini iyileştirir. Kullanılan vektörler, endotoksin içermeyen plazmid izolasyon kitleri ve ardından etanol çökeltmesi kullanılarak hazırlanmalı ve transfeksiyon için kullanılmadan önce minimum 1mg / mL konsantrasyonda yeniden oluşturulmalıdır. Farklı tarihlerde hazırlanan PEI çözümlerinin partiden partiye varyasyonları olabilir. Bu nedenle, PEI çözeltisinin her bir partisi önce GFP vektörleri kullanılarak performans açısından test edilmeli ve tekrarlanan donma-çözülme döngülerini önlemek için çözelti tek kullanımlık alikotlarda -20 ° C'de saklanmalıdır. Yüksek titreler için, HEK293T hücrelerinin 72 saatlik transfeksiyonundan sonra LVS süpernatant toplanması, yalnızca hücrelerin sağlıklı ve bağlı olması koşuluyla önerilir. LVS içeren süpernatantın filtrasyonu, ultrasantrifüjleme sonrası LVS'nin çözünürlüğünü büyük ölçüde arttırır. LVS süpernatantının 4 ° C'de 5 günden fazla saklanması tavsiye edilmez, çünkü virüs titrelerinde önemli bir azalmaya neden olur. Optimal titreler için ultrasantrifüjleme sırasında sakkaroz gradyanı gereklidir. Ultrasantrifüjlemenin tüm aşamalarında sıcaklıklar 4 ° C'ye yakın tutulmalıdır. Tam yeniden süspansiyon için DPBS'deki konsantre LVS partiküllerinin gece boyunca inkübasyonu gereklidir. LVS'nin yeniden süspansiyonunu takiben santrifüjleme, hedef hücrelerde kullanıldığında sitotoksisiteye neden olabileceğinden hücresel kalıntıları (varsa) uzaklaştırır. H9 hücrelerinin enfeksiyonundan sonra, virüs içeren ortamın 8 saat sonra taze büyüme ortamı ile değiştirilmesi önemlidir, çünkü virüsle uzun süreli inkübasyon, H9 hESC'lerin önemli hücre ölümüne neden olur. Puromisin seçimi sadece% 80'den fazla olduğunda başlatılmalıdır.
Yukarıda açıklanan yöntem başlangıçta shRNA'ların ekspresyonu için uyarlanmıştır. Benzer bir yaklaşım, cDNA'ların ektopik ekspresyonunun ekspresyon vektörlerine klonlanması için de kullanılabilir. Bununla birlikte, lentiviral aracılı gen iletiminin önemli bir sınırlaması, boyut kısıtlamasıdır. Boyut arttıkça, lentiviral vektörlerin ambalajlanması optimal değildir, bu da viral titrelerin azalmasına neden olur23. Gelecekteki araştırmalar, bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için protokolü optimize etmeye yönlendirilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Birleşik Arap Emirlikleri Üniversitesi'nden (BAEÜ), hibe # 31R170 (Zayed Sağlık Bilimleri Merkezi) ve # 12R010'dan (UAEU-AUA hibesi) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Prof. Randall Morse'a (Wadsworth Center, Albany, NY) makaleyi stil ve dilbilgisi açısından düzenlememize yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Tüm veriler talep üzerine temin edilebilir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| bFGF Recombinant human | Invitrogen | PHG0261 | |
| Bovine serum albumin FRAC V | Invitrogen | 15260037 | |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free | Corning | 354234 | |
| Cyclopamine | Stem Cell Technologies | 72074 | |
| DMEM media | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM Nutrient mix F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| DPBS w/o: Ca and Mg | PAN Biotech | P04-36500 | |
| Fetal bovie serum | Invitrogen | 10270106 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody | CST | 2118S | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | Stem Cell Technologies | 7174 | |
| HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution | GE healthcare | SH30238.01 | |
| L Glutamine, 100X | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2HGDH Polyclonal antibody | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH shRNA | Macrogen | Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT | |
| Lipofectamine 3000 kit | Thermo Fisher | L3000001 | |
| mTesR1 complete media | Stem Cell Technologies | 85850 | |
| Neurobasal medium 1X CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 Supplement 100x | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 Supplement 50x | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Penicillin streptomycin SOL | Invitrogen | 15140122 | |
| pLKO.1 TRC vector | Addgene | 10878 | |
| pLL3.7 vector | Addgene | 11795 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene infection reagent | Sigma | TR1003- G | |
| Polyethylenimine, branched | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| Purmorphamine | Tocris | 4551/10 | |
| Puromycin | Invitrogen | A1113802 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 dihydrochloride |
Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Trypsin .05% EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
- Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
- Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
- Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
- Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
- Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
- Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
- Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
- Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
- Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
- Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
- Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
- Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
- Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
- Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
- Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C.
- Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
- Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
- Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
- Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
- Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
- Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).
