Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Lentiviralmediert levering av shRNA til hESC og NPC ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI)

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63953
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

Summary

Ved hjelp av lavkost kationisk polymerpolyetylenimine (PEI) produserte vi lentivirale partikler for stabilt uttrykk av shRNA i H9 humane embryonale stamceller (hESCs) og forbigående transducerte H9-avledede nevrale stamceller (NPC) ved høy effektivitet.

Abstract

Den nåværende protokollen beskriver bruken av lentivirale partikler for levering av kort hårnålsRNA (shRNA) til både humane embryonale stamceller (hESC) samt nevrale stamceller (NPC) avledet fra hESCs ved høy effektivitet. Lentivirale partikler ble generert ved å co-transfektere HEK293T-celler ved hjelp av inngangsvektorer (bærer shRNA) sammen med emballasjeplasmider (pAX og pMD2.G) ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI). Viruspartikler ble konsentrert ved hjelp av ultrasentrifugering, noe som resulterte i gjennomsnittlige titere over 5 x 107. Både hESC og NPC kan infiseres med høy effektivitet ved bruk av disse lentivirale partiklene, som vist ved puromycinvalg og stabilt uttrykk i hESC, samt forbigående GFP-uttrykk i NPCer. Videre viste western blot-analyse en signifikant reduksjon i uttrykket av gener målrettet av shRNA. I tillegg beholdt cellene sin pluripotens så vel som differensieringspotensial, som det fremgår av deres etterfølgende differensiering i forskjellige linjer av CNS. Den nåværende protokollen omhandler levering av shRNA; Den samme tilnærmingen kan imidlertid brukes til ektopisk ekspresjon av cDNA for overekspresjonsstudier.

Introduction

Humane embryonale stamceller (hESC) avledet fra blastocystens indre cellemasse er pluripotente og kan differensieres til forskjellige celletyper avhengig av eksterne faktorer under in vitro-tilstander 1,2. For å fullt ut utnytte potensialet til hESCs, er det viktig å ha raske og pålitelige genleveringsmetoder for disse cellene. Konvensjonelt kan teknikkene som brukes grovt klassifiseres i to typer: ikke-smittsomme og virale genleveringssystemer 3,4. De hyppigere brukte ikke-smittsomme genleveringssystemene er fettinfeksjon, elektroporering og nukleofeksjon. Ikke-miljømessige leveringssystemer er fordelaktige på grunn av færre innsettingsmutasjoner og en generell reduksjon i immunogenisitet 5,6. Imidlertid resulterer disse metodene i lav transfeksjonseffektivitet og kort varighet av forbigående genuttrykk, noe som er en stor begrensning for langsiktige differensieringsstudier7. Elektroporering resulterer i bedre transfeksjonseffektivitet sammenlignet med fettinfeksjon; Det resulterer imidlertid i mer enn 50% celledød 8,9,10. Ved hjelp av nukleofeksjon kan celleoverlevelsen og transfeksjonseffektiviteten forbedres ved å kombinere fettinfeksjon og elektroporering, men tilnærmingen trenger cellespesifikke buffere og spesialutstyr og blir dermed ganske kostbar for oppskalerte applikasjoner11,12.

I motsetning til dette har virale vektorer vist forbedret transfeksjonseffektivitet, samt generell lav cytotoksisitet, etter transduksjon. I tillegg er genene som leveres stabilt uttrykt og dermed gjør denne metoden ideell for langsiktige studier13. Blant de mest brukte virale vektorene for genlevering i hESC er lentivirale vektorer (LVS), som kan gi mer enn 80% transduksjonseffektivitet ved bruk av høye titerviruspartikler14,15. Fettinfeksjon og CaPO 4-utfelling er blant de mest brukte metodene for å forbigående transfektere HEK293T-celler eller dets derivater med genoverføringsvektorer sammen med emballasjeplasmider for å gi lentivirale partikler16. Selv om fettinfeksjon resulterer i god transfeksjonseffektivitet og lav cytotoksisitet, hindres teknikken av kostnadene, og oppskalering for å få høye titer lentivirale partikler vil være svært kostbart. CaPO 4-utfelling resulterer i relativt lik transfeksjonseffektivitet som de som oppnås ved bruk av fettinfeksjon. Selv omdet er kostnadseffektivt, resulterer CaPO 4-utfelling i betydelig celledød etter transfeksjoner, noe som gjør det vanskelig å standardisere og unngå batch-til-batch-variasjoner17. I dette scenariet er utvikling av en metode som gir høy transfeksjonseffektivitet, lav cytotoksisitet og kostnadseffektivitet avgjørende for produksjon av lentivirale partikler med høy titer som skal brukes i hESC.

Polyetylenimine (PEI) er en kationisk polymer som kan transfektere HEK293T-celler med høy effektivitet uten mye cytotoksisitet og har en ubetydelig kostnad sammenlignet med lipofeksjonsbaserte metoder18. I denne situasjonen kan PEI brukes til oppskalerte anvendelser av høy titer LVS-produksjon gjennom konsentrasjon av lentivirale partikler fra kultursupernatanter ved hjelp av forskjellige teknikker. Den presenterte artikkelen beskriver bruken av PEI til å transfektere HEK293T-celler og lentivirale vektorkonsentrasjon ved bruk av ultrasentrifugering gjennom en sukrosepute. Ved hjelp av denne metoden får vi regelmessig titere godt over 5 x 107 IE / ml med lave batch-til-batch-variasjoner. Metoden er enkel, rett frem og kostnadseffektiv for oppskalerte applikasjoner for genlevering til hESCs og hESCs-avledede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Transfeksjon av HEK293T-celler ved bruk av enten PEI eller Lipofectamine 3000 reagens

  1. Kultur HEK293T-celler i DMEM + 10% FBS + 1x penicillin / streptomycin ved 37 ° C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2 til de er 90% sammenflytende før såing for transfeksjon. Bruk et relativt lavt passasje antall celler for høy titervirusproduksjon (ideelt mindre enn P30).
  2. Frø 4 x 106 celler i 10 ml komplett vekstmedium i en 100 mm vevskulturplate og vokser over natten i en fuktet vevskulturinkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2.
  3. For hver transfeksjon fortynnes plasmid-DNA (1 mg/ml lagerbeholdning) i 1 ml serumfritt DMEM-medium i 1,5 ml sentrifugerør ved bruk av følgende forhold mellom inngangs- og emballasjeplasmider:
    Inngangsvektor = 10 μg
    psPAX2.0 = 7,5 μg
    pMD2.G = 5 μg
  4. Vortex i 10 s og spinn røret ved 10 000 x g i 30 s ved romtemperatur for å samle seg.
  5. Tilsett 70 μL (1 mg/ml stamløsning) PEI i slangen, virvel og spinn kort som beskrevet ovenfor for å samle opp. Volumet av PEI som brukes er basert på et 1: 3-forhold mellom totalt DNA (μg) :P EI (μg).
  6. For lipofectamine-basert transfeksjon, fortynn de ovennevnte vektorene i 500 μL serumfrie DMEM-medier som inneholder 45 μL reagens P levert i settet og inkuberes ved romtemperatur i 5 minutter.
  7. Fortynn 70 μL reagens L som følger med i settet ved hjelp av 500 μL serumfrie DMEM-medier og inkuberes ved romtemperatur i 5 minutter.
  8. Kombiner innholdet i begge rørene og inkuber rørene ved romtemperatur i 20 minutter for å tillate kompleksdannelse.
  9. Tilsett dråpevis 1 ml DNA/PEI eller 1 ml DNA/lipofektaminkomplekser til platen som inneholder celler og inkuberes i 6 timer ved 37 °C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5 % CO2 og 21 % O2.
  10. Etter 6 timer, bytt til ferske komplette vekstmedier (10 ml) og returner cellene tilbake til den fuktede inkubatoren med en atmosfære på 5% CO2 og 21%O2.

2. LVS-innsamling og ultrasentrifugering

  1. Etter 2 dager med transfeksjon, samle det virusholdige mediet og legg over cellene igjen med 10 ml fersk komplett vekstmedium.
  2. Etter 3 dager med transfeksjon, samle det virusholdige mediet og kombiner det med det virusholdige mediet samlet på 2 dagers tidspunkt.
  3. Sentrifuger den virale supernatanten ved 2000 x g i 10 minutter ved 4 ° C til pelletscellulært rusk.
  4. Filtrer supernatanten med et 0,45 μm porestørrelsesfilter med lav proteinbinding (enten PES eller SFCA) og oppbevar ved 4 °C til det er klart for ultrasentrifugering. Den filtrerte supernatanten som inneholder lentivirale partikler kan lagres ved 4 °C i 5 dager uten signifikant tap av virustitere.
  5. Steriliser ultracentrifugerørene som holder kopper ved å vaske dem med 70% etanol i 10 minutter, lufttørk, lukk og hold ved 4 ° C.
  6. Tilsett 36 ml filtrerte medier som inneholder lentivirale partikler til et sterilt ultracentrifugerør.
  7. Fyll 5 ml av en steril stripette med 4 ml steril 20 % sukroseoppløsning (tilberedt i PBS) og dispenser den helt til bunnen av ultracentrifugerøret (UC) som inneholder LVS. Det er viktig at sukroseoppløsningen ikke blandes med mediet og gir en gradient i bunnen av røret.
  8. Balanser alle ultracentrifugerørene ved hjelp av serumfrie DMEM-medier, plasser i det kalde ultracentrifugerøret som holder kopper, og lukk lokkene.
  9. Spinn rørene ved 125 000 x g i 2 timer ved 4 °C.
  10. Etter spinnet, kast forsiktig supernatanten ved å invertere innholdet i røret i en beholder som inneholder blekemiddel uten å forstyrre pelleten. Merk pelleten hvis den er synlig.
  11. Plasser ultracentrifugerøret i et 50 ml sterilt rør og tilsett 200 μL steril DPBS nøyaktig på toppen av pelleten. Oppbevares uforstyrret ved 4 °C over natten.
  12. Dagen etter blandes forsiktig ved å pipettere opp og ned 40x.
  13. Spinn kort ved 13 000 x g i en bordplate sentrifuge for å pelletere eventuelle rusk.
  14. Overfør supernatanten til et nytt rør og aliquot viruspreparatet som 20 μL aliquots. Oppbevares ved −80 °C.
  15. Sett til side 5 μL av preparatet for virale titermålinger.

3. LVS titer måling for pLKO.1-baserte vektorer

  1. Bestem titeren av lentivirale partikler ved å bruke en qPCR etter produsentens anbefalinger.
  2. For en standardkurve, lag fem 10 ganger serielle fortynninger av Standard Control DNA (levert i settet) ved å fortynne 5 μL DNA til 45 μL nukleasefri H2O i hvert trinn. Bruk fortynninger på 1:100 til 1:100 000 for å generere en standardkurve.
  3. Sett opp reaksjoner på is i duplikater på følgende måte:
    2x qPCR master blanding 10 μL
    Primer blanding 2 μL
    Prøve eller standard DNA 2 μL
    Nukleasefri H2O 6 μL
  4. Utfør qPCR ved hjelp av sykkelforholdene nevnt i håndboken til settet i totalt 35 sykluser.
  5. Plottsyklusterskelverdier (Ct) på Y-aksen vs. virustiter på X-aksen.
  6. Generer en logaritmisk regresjon ved hjelp av fire standard kontroll-DNA-fortynninger (1: 100 til 1: 100 000) for å bestemme den ukjente virusprøvetiteren ved hjelp av en trendlinjeligning.

4. LVS titer måling for pll3.7-baserte vektorer

  1. Frø 1 x 105 HEK293T celler i hver brønn av en P12-brønnplate i 1 ml komplett vekstmedium 24 timer før infeksjoner.
  2. Suppler mediet med 8 mikrogram / ml polybren og tilsett 1 ml i hvert sterile 1,5 ml rør.
  3. Fortynn viruspartiklene ved å bruke 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL og 0,1 μL konsentrerte lentivirale partikler i hver av de 1 ml polybrenholdige mediene.
  4. Erstatt mediet fra HEK293T-celler med mediet som inneholder angitte mengder lentivirale partikler sammen med 8 μg/ml polybren og inkuberes i 24 timer ved 37 °C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5 % CO2 og 21 % O2.
  5. Neste dag, bytt til ferske medier og fortsett kulturen i 72 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5% CO2 og 21% O2.
  6. Etter 72 timer vasker du cellene med PBS, trypsiner ved 37 °C i henhold til produsentens protokoll og resuspenderer i 1 ml PBS.
  7. Utfør FACS-cellesortering ved hjelp av en cellesorterer, i henhold til produsentens anbefalinger. Sett porten til 0% GFP-positive celler ved hjelp av ikke-infiserte HEK293T-celler og tell 50 000 hendelser for hver prøve for å bestemme prosentandelen av positive celler for hver viral fortynning.
  8. Bruk bare volumene av lentivirale partikler som gir % GFP-positive celler i området 2 % -20 % for å beregne titeren av lentivirale partikler.

5. Infeksjon av hESC og stabilt utvalg

  1. Vask cellene med 2 ml PBS som vokser i hver brønn av en 6-brønns cellekultur multiwell plate.
  2. Løsne cellene fra cellekulturplaten ved hjelp av 1 ml 1x celledissosiasjonsreagens ved inkubering ved 37 °C i 5 minutter.
  3. Samle cellene i DMEM /F12-medier og sentrifuger ved 1,500 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å samle cellepelleten.
  4. Aspirere, resuspendere cellene i 1 ml, og telle ved hjelp av et hemocytometer.
  5. Lag en cellesuspensjon med 2 x 105 celler/ml komplett vekstmedium som inneholder mTeSR1 supplert med 10 ng/ml basisk fibroblastvekstfaktor (bFGF), penicillin/streptomycin (P/S) og 10 μM ROCK-hemmer (RI).
  6. Frø 1 x 105 celler på 50x fortynnede komplette kjellermembranmatrisebelagte P24-brønnplater i 500 μL komplette vekstmedier og dyrker cellene ved 37 °C i en fuktet inkubator med en atmosfære på 5 % CO2 og 21 % O2.
  7. Dagen etter infiserer hESC med et infeksjonsmangfold (MOI) på 10 med 8 μg/ml polybrens og inkuberes ved 37 °C i 8 timer.
  8. Etter 8 timer, erstatt det virusholdige mediet med friske vekstmedier (-RI) og fortsett kulturen til cellene er 90% sammenflytende.
  9. Start puromycin seleksjon (0,8 μg / ml) når cellene når 90% sammenløp, som vanligvis er 48-72 timer etter infeksjon.
  10. Etter at utvelgelsen er fullført (vanligvis 4-6 dager), del de stabile cellene (1:4) og utvid cellene for kryopreservering og videre analyse.

6. Transduksjon av H9-avledede nevrale stamceller (NPC)

MERK: NPC ble avledet fra H9-celler ved hjelp av en dual-Smad-inhiberingsprotokoll, som beskrevet tidligere19.

  1. Kort sagt, behandle H9-celler med celledissosiasjonsreagens ved 37 ° C i 5 minutter for å generere enkeltceller og resuspendere i komplette vekstmedier som inneholder mTeSR1 supplert med 10 ng / ml grunnleggende fibroblastvekstfaktor (bFGF), penicillin / streptomycin (P / S) og 10 μM ROCK Inhibitor (RI). Frø på 1:50 fortynnede Matrigel-belagte 6-brønns cellekulturretter med en tetthet på 60 000 celler / cm2 (dag 0).
  2. Initier differensiering når cellene når 95%-100% konfluens ved å bytte til 100% KSR-medier som inneholder LDN193189 (200 nM) og SB431542 (10 μM) (dag1).
  3. På dag 2, bytt media igjen med 100% KSR supplert med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) og XAV939 (5 μM).
  4. På dag 4 av differensiering, bytt til en blanding av KSR-medium (75%) og N2-medium (25%) med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) og XAV939 (5 μM).
  5. Fra dag 6 til dag 12 bytter du gradvis mediet til 100 % N2 supplert med LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) og XAV939 (5 μM) ved å øke N2-mediet 25 % hver dag og endre mediet etter hver 2.
  6. Kulturdag 12 NPCer i N2:B27 media supplert med 20 ng/ml bFGF.
  7. Frø 2 x 105 celler i hver brønn av en 1:50 fortynnet komplett kjellermembranmatrisebelagt P6-plate i 2 ml NPC-kulturmedier og inkubere for å la cellene feste seg.
  8. Neste dag infiserer cellene med lentivirale partikler ved en MOI 6 i nærvær av 8 μg / ml polybné.
  9. Etter 8 timer, erstatt det virusholdige mediet med ferske NPC-vekstmedier.
  10. Neste dag, gjenta infeksjonene og bytt media ved 8 timer.
  11. Hold cellene i kultur i 72 timer før høsting for videre analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter genoverføring er det uunngåelig nødvendig med høy levedyktighet av hESCs. Til tross for innsatsen og optimaliseringen av protokoller for å redusere celledød etter elektroporering av hESCs, observeres fortsatt mer enn 50% celledød etter elektroporering av disse cellene, sammen med lav transfeksjonseffektivitet20. Lentiviralmediert genoverføring resulterer ikke bare i høy effektivitet av genoverføring, men demonstrerer også høye nivåer av celle levedyktighet etter transduksjon. Resultatene nedenfor presenterer to tilnærminger: en som bruker GFP som reporter og forbigående uttrykk i hESCs-avledede NPCer og den andre bruker puromycin for stabilt utvalg av hESCs for langsiktige differensieringseksperimenter.

I det første settet av eksperimenter ble lentivirale partikler produsert av co-transfekterende shRNA som bærer pll3.7-vektoren med GFP som reporter sammen med andre generasjons lentivirale emballasjeplasmider psPAX2.0 og pMD2.G. Lentivirale partikler ble samlet inn etter 48 timer og 72 timer etter transfeksjon og konsentrert ved hjelp av ultrasentrifugering. Figur 1A viser det rikelige GFP-uttrykket i HEK293T-celler etter 72 timers transfeksjon. Ekspresjonen av virale proteiner resulterte også i synkytidannelse av HEK293T-celler der enkeltceller smeltes sammen, som vist med piler i figur 1A. Titerne ble bestemt ved hjelp av FACS-analyse. Vi sammenlignet også lentivirale titere ved hjelp av lavpris PEI og Lipofectamine 3000 reagens og fant ingen signifikant forskjell mellom de to når det gjelder virale titere (figur 2A). Deretter ble H9 hESCs-avledede NPCer infisert to ganger med disse GFP-holdige lentivirale partiklene ved en MOI på 6 og høstet for analyse etter 72 h. Figur 1B viser markert uttrykk for GFP i NPC etter infeksjon. Som diskutert ovenfor, for langsiktige differensieringseksperimenter, er det viktig å ha hESCs som stabilt uttrykker shRNA. I et forsøk på å lage stabile cellelinjer som uttrykker shRNA for ulike gener, brukte vi plKO.1-baserte vektorer og klonede shRNA i henhold til produsentens anbefalinger. Deretter ble lentivirale partikler produsert som beskrevet ovenfor, og titere ble bestemt ved hjelp av et kommersielt lentiviralt titermålesett ved bruk av qPCR-baserte metoder (figur 2B). hESC ble infisert med lentivirale partikler ved en MOI på 10 og valgt ved puromycin seleksjon. Figur 3 viser resultatene av stabilt utvalg av hESC etter transduksjon. Etter 5 dagers seleksjon med 0,8 mikrog/ml puromycin viste lentivirale transfekterte celler mer enn 80 % celle levedyktighet sammenlignet med ikke-transducerte celler, hvor ingen celler overlevde behandlingen. Etter seleksjonen ble de stabilt transducerte H9-cellene ytterligere utvidet, kryopreservert og analysert ved hjelp av western blot for å analysere for effektiv gen knockdown.

I vårt laboratorium har vi opprettet flere stabile cellelinjer av H9 hESCs som uttrykker shRNA for forskjellige gener ved hjelp av ovennevnte tilnærming. Her har vi presentert resultatene av en av disse, som er L-2-hydroksyglutarat dehydrogenase (L2HGDH) genet ved hjelp av western blot-analyse. Rikelig ekspresjon av L2HGDH observeres i celler transducert med tom vektorryggrad. Det observeres imidlertid ikke noe uttrykk for L2HGDH i celler transducert med en vektorbærende shRNA for L2HGDH, som viser effekten av den stabile genereringen av en H9 hESCs cellelinje med redusert ekspresjon av L2HGDH, som kan brukes til videre differensieringsstudier (figur 4).

Figure 1
Figur 1: Ekspresjon av GFP i HEK293T-celler og virusinfiserte NPCer. (A) shRNA ble klonet til en pll3.7-vektor som bærer GFP som reporter og samtransfisert med emballasjeplasmider i HEK293T-celler ved bruk av PEI. Det høye GFP-uttrykket viser effektiv transfeksjonseffektivitet etter 72 timer transfeksjon. Piler indikerer syncytidannelse i HEK293T-cellene, hvor grupper av individuelle HEK293T-celler har smeltet sammen på grunn av ekspresjon av virale proteiner. (B) H9-avledede NPCer ble infisert to ganger ved en MOI på 6 med lentivirale partikler som inneholdt GFP som reporter, og GFP-uttrykk ble observert ved 72 timer etter infeksjon. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: LVS-titermålinger. (A) Virale titere for pll3.7-baserte vektorer ble målt ved hjelp av FACS-analyse ved å kvantifisere de% GFP-positive cellene for de virale fortynningene som ga 2% -20% GFP-positive celler. (B) Virale titere for pLKO.1-baserte vektorer ble bestemt ved hjelp av et kommersielt qPCR lentivirus titer kit, etter produsentens anbefalinger. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Etablering av stabile shRNA-uttrykkende H9 hESC-linjer. shRNA ble klonet til pLKO.1-baserte lentivirale vektorer som bærer puromycin seleksjonsgenet. H9 hESC ble infisert med lentivirale partikler ved en MOI på 10 og valgt ved bruk av puromycin. Ved bruk av 0,8 μg/ml puromycin i 5 dager ble 100 % av de ikke-infiserte cellene drept, mens de fleste cellene overlevde behandlingen i den virusinfiserte gruppen. Disse cellene ble utvidet uten klonal seleksjon for kryopreservering og videre analyse. Skalalinje = 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: En representativ western blot-analyse for stabil knockdown av L2HGDH-genet i H9 hESCs. Totalcellelysater fra negative kontrollceller (H9, puro uncut), samt celler som stabilt uttrykker shRNA mot L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) ble utsatt for western blot ved bruk av anti-L2HGDH antistoffet. Som vist i figuren ble det ikke observert noe uttrykk for L2HGDH i H9 hESC som stabilt uttrykker shRNA for L2HGDH. Et ikke-spesifikt bånd ble observert like over det spesifikke båndet som tilsvarer riktig molekylvekt på 46-48 kDa (indikert med en trekant) for L2HGDH-antistoffet. Anti-GAPDH ble brukt som lastekontroll. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Evnen til å genmodifisere stamceller for studier eller kliniske formål er begrenset både av teknologi og grunnleggende forståelse av biologien til hESCs. Teknikker som har vist betydelig potensial i muse-ESC, som fettinfeksjon og elektroporering, er ikke svært effektive for hESCs, som er notorisk vanskelig for genlevering ved konvensjonelle metoder20. Denne oppfatningen har ført til ikke bare optimalisering av eksisterende teknikker, men også utvikling av nye metoder for økt transfeksjonseffektivitet i hESCs. Fokuset for disse nye utviklingene har vært effektiv og stabil genlevering til hESC, samtidig som den opprettholder minimal effekt på hESCs vekst, pluripotens og differensieringspotensial over lengre perioder. Blant de ulike nye utviklingene som oppfyller disse strenge kriteriene, er lentiviralmediert genoverføring til hESCs21,22. For produksjon av lentivirale partikler som uttrykker et bestemt gen, klones det ønskede genet i en av overføringsvektorene og transfekteres i HEK293T-celler sammen med emballasjeplasmider for å høste en cellekultur supernatant som inneholder lentivirale partikler. For å brukes i hESCs er det viktig å konsentrere disse viruspartiklene ved hjelp av forskjellige teknikker for å gi høye titere av virus minst i området 1 x 107-1 x 108 IE / ml. Generelt er store mengder LVS konsentrert fra 200x-500x det opprinnelige volumet for å oppnå disse titerne. Dette betyr at bruk av en svært kostnadseffektiv metode uten at det går ut over transfeksjonseffektiviteten i HEK293T-celler, er en forutsetning for at disse metodene rutinemessig kan brukes i laboratoriet. Den nåværende metoden beskriver bruken av kationisk polymer PEI som en kostnadseffektiv metode for å produsere store mengder LVS med en transfeksjonseffektivitet som ligner lipofeksjonsbaserte metoder, som betraktes som gullstandard. Ved hjelp av den presenterte metoden kan vi få gjennomsnittlige LVS-titere godt over 5 x 107 IE / ml etter en konsentrasjonsfaktor på 200 ganger det opprinnelige volumet. Ved hjelp av disse LVS-partiklene har vi vært i stand til å etablere flere stabile cellelinjer av H9 hESCs som uttrykker shRNA for flere gener ved å infisere cellene ved høye MOIer. Metoden som presenteres her omgår bruken av kjedelige og tidkrevende metoder for klonal seleksjon og ekspansjon, samtidig som den får knockdown-effektivitet nær 100%, som vist av et av de representative western blot-resultatene for L2HGDH-gen knockdown i figur 4. Følgende er noen av anbefalingene for en vellykket tilnærming.

Bruk av et lavt passasjenummer av HEK293T-celler er nødvendig (ideelt under 30) for høye virale titere. Samløpet av HEK293T-celler er en annen viktig faktor i denne forbindelse. HEK293T-celler må være minst 80% konfluente før transfeksjon, da cellecellekontakt reduserer cytotoksisiteten sterkt og forbedrer virusproduksjonen. Vektorene som brukes må fremstilles ved bruk av endotoksinfrie plasmidisolasjonssett etterfulgt av etanolutfelling og rekonstituert ved en minimumskonsentrasjon på 1 mg / ml før bruk for transfeksjon. Det kan være batch-til-batch-varianter av PEI-løsninger utarbeidet på forskjellige datoer. Av den grunn må hvert parti PEI-løsning først testes for ytelse ved hjelp av GFP-vektorer, og løsningen må lagres ved -20 °C i engangs aliquots for å unngå gjentatte fryse-tine-sykluser. For høye titere anbefales kun innsamling av LVS supernatant etter 72 timers transfeksjon av HEK293T-celler forutsatt at cellene er sunne og festet. Filtrering av den LVS-holdige supernatanten øker oppløseligheten av LVS etter ultrasentrifugering. Det anbefales ikke å oppbevare LVS supernatant ved 4 °C i mer enn 5 dager, da det vil resultere i en betydelig reduksjon av virustitere. Sukrosegradient under ultrasentrifugering er nødvendig for optimale titere. Temperaturene må holdes nær 4 °C under alle trinnene med ultrasentrifugering. Inkubering over natten av konsentrerte LVS-partikler i DPBS er nødvendig for fullstendig resuspendering. Sentrifugering etter resuspendering av LVS fjerner cellulært avfall (hvis aktuelt), da det kan forårsake cytotoksisitet når det brukes på målceller. Etter infeksjon av H9-celler er det viktig å erstatte det virusholdige mediet med friske vekstmedier etter 8 timer, da langvarig inkubasjon med viruset vil resultere i betydelig celledød av H9 hESCs. Puromycinvalget bør bare startes når sammenløpet er over 80%.

Metoden beskrevet ovenfor ble opprinnelig tilpasset for uttrykk av shRNA. En lignende tilnærming kan brukes til at ektopisk ekspresjon av cDNA-er klones til ekspresjonsvektorer. Imidlertid er en stor begrensning av lentiviral mediert genlevering størrelsesbegrensningen. Etter hvert som størrelsen øker, er emballasjen til lentivirale vektorer ikke optimal, noe som resulterer i reduserte virale titere23. Fremtidig forskning bør rettes for å optimalisere protokollen for å overvinne disse begrensningene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at det ikke er noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av forskningsstipend fra De forente arabiske emirater University (UAEU), stipend # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) og # 12R010 (UAEU-AUA stipend). Vi takker professor Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) for å hjelpe oss med å redigere manuskriptet for stil og grammatikk.

Alle data er tilgjengelig på forespørsel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Invitrogen 31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes Beckman Coulter C14292
Accutase Stem Cell Technologies 7920
bFGF Recombinant human Invitrogen PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V Invitrogen 15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234
Cyclopamine Stem Cell Technologies 72074
DMEM media Invitrogen 11995073
DMEM Nutrient mix F12  Invitrogen 11320033
DPBS w/o: Ca and Mg PAN Biotech P04-36500
Fetal bovie serum Invitrogen 10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody CST 2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution GE healthcare SH30238.01
L Glutamine, 100X  Invitrogen 2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody Proteintech 15707-1-AP
L2HGDH shRNA Macrogen Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit Thermo Fisher L3000001
mTesR1 complete media Stem Cell Technologies 85850
Neurobasal medium 1X CTS Invitrogen A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x PAN Biotech P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x PAN Biotech P07-07200
Penicillin streptomycin SOL Invitrogen 15140122
pLKO.1 TRC vector Addgene 10878
pLL3.7 vector  Addgene 11795
pMD2.G Addgene 12259
Polybrene infection reagent Sigma TR1003- G
Polyethylenimine, branched Sigma 408727
psPAX2.0 Addgene 12260
Purmorphamine Tocris 4551/10
Puromycin Invitrogen A1113802
ROCK inhibitor Y-27632
dihydrochloride 		 Tocris 1254
SB 431542 Tocris 1614/10
Trypsin .05% EDTA  Invitrogen 25300062
XAV 939 Tocris 3748/10

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
  4. Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
  5. Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
  6. Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
  7. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  8. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
  9. Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
  10. Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
  12. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
  13. Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
  14. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  15. Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
  16. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
  17. Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
  18. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  19. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
  20. Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
  21. Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
  22. Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
  23. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).

Tags

Biologi utgave 183 lentivirus shRNA hESCs NPCs polyetylenimine HEK293T celler
Lentiviralmediert levering av shRNA til hESC og NPC ved bruk av lavpris kationisk polymerpolyetylenimine (PEI)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sheikh, M. A., Ansari, S. A.… More

Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI). J. Vis. Exp. (183), e63953, doi:10.3791/63953 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter