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Biology

कम लागत वाले केशनिक पॉलिमर पॉलीथीनिमाइन (पीईआई) का उपयोग करते हुए एचईएससी और एनपीसी को एसएचआरएनए की लेंटिवायरल मध्यस्थता डिलीवरी

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63953
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

Summary

कम लागत वाले धनायनिक बहुलक पॉलीथीलेनिमिन (पीईआई) का उपयोग करते हुए, हमने एच 9 मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में एसएचआरएनए की स्थिर अभिव्यक्ति के लिए लेंटिवायरल कणों का उत्पादन किया और उच्च दक्षता पर क्षणिक रूप से ट्रांसड्यूस्ड एच 9-व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी)।

Abstract

वर्तमान प्रोटोकॉल मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) के साथ-साथ उच्च दक्षता पर एचईएससी से प्राप्त तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) दोनों के लिए लघु हेयरपिन आरएनए (एसएचआरएनए) के वितरण के लिए लेंटिवायरल कणों के उपयोग का वर्णन करता है। लेंटिवायरल कणों को कम लागत वाले धनायनिक बहुलक पॉलीथीनिमिन (पीईआई) का उपयोग करके पैकेजिंग प्लास्मिड (पैक्स और पीएमडी 2.जी) के साथ प्रवेश वैक्टर (एसएचआरएनए ले जाने) का उपयोग करके एचईके 293 टी कोशिकाओं को सह-ट्रांसफेक्ट करके उत्पन्न किया गया था। वायरल कणों को अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके केंद्रित किया गया था, जिसके परिणामस्वरूप औसत टाइटर्स 5 x 107 से ऊपर थे। एचईएससी और एनपीसी दोनों को इन लेंटिवायरल कणों का उपयोग करके उच्च क्षमता पर संक्रमित किया जा सकता है, जैसा कि एचईएससी में प्यूरोमाइसिन चयन और स्थिर अभिव्यक्ति के साथ-साथ एनपीसी में क्षणिक जीएफपी अभिव्यक्ति द्वारा दिखाया गया है। इसके अलावा, पश्चिमी धब्बा विश्लेषण ने एसएचआरएनए द्वारा लक्षित जीन की अभिव्यक्ति में महत्वपूर्ण कमी दिखाई। इसके अलावा, कोशिकाओं ने अपनी प्लुरिपोटेंसी के साथ-साथ भेदभाव क्षमता को बनाए रखा, जैसा कि सीएनएस के विभिन्न वंशों में उनके बाद के भेदभाव से स्पष्ट है। वर्तमान प्रोटोकॉल एसएचआरएनए की डिलीवरी से संबंधित है; हालाँकि, ओवरएक्सप्रेशन अध्ययनों के लिए सीडीएनए की एक्टोपिक अभिव्यक्ति के लिए एक ही दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है।

Introduction

ब्लास्टोसिस्ट आंतरिक कोशिका द्रव्यमान से प्राप्त मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) प्लुरिपोटेंट हैं और इन विट्रो स्थितियों 1,2 के तहत बाहरी कारकों के आधार पर विभिन्न सेल प्रकारों में विभेदित किया जा सकता है। एचईएससी की क्षमता का पूरी तरह से दोहन करने के लिए, इन कोशिकाओं के लिए तेजी से और विश्वसनीय जीन वितरण विधियों का होना आवश्यक है। परंपरागत रूप से, उपयोग की जाने वाली तकनीकों को मोटे तौर पर दो प्रकारों में वर्गीकृत किया जा सकता है: नॉनवायरल और वायरल जीन डिलीवरी सिस्टम 3,4। अधिक बार उपयोग किए जाने वाले नॉनवायरल जीन डिलीवरी सिस्टम लिपोफेक्शन, इलेक्ट्रोपोरेशन और न्यूक्लियोफेक्शन हैं। कम सम्मिलन उत्परिवर्तन और इम्यूनोजेनेसिटी 5,6 में समग्र कमी के कारण नॉनवायरल डिलीवरी सिस्टम फायदेमंद हैं। हालांकि, इन विधियों के परिणामस्वरूप कम अभिकर्मक दक्षता और क्षणिक जीन अभिव्यक्ति की एक छोटी अवधि होती है, जो दीर्घकालिक भेदभाव अध्ययन7 के लिए एक प्रमुख सीमा है। लिपोफेक्शन की तुलना में इलेक्ट्रोपोरेशन के परिणामस्वरूप बेहतर अभिकर्मक क्षमता होती है; हालाँकि, इसके परिणामस्वरूप 50% से अधिक कोशिका मृत्यु 8,9,10 होती है। न्यूक्लियोफेक्शन का उपयोग करके, लिपोफेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन के संयोजन से सेल अस्तित्व और अभिकर्मक दक्षता में सुधार किया जा सकता है, लेकिन दृष्टिकोण को सेल-विशिष्ट बफर और विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है और इस प्रकार, स्केल-अप अनुप्रयोगों11,12 के लिए काफी महंगा हो जाता है।

इसके विपरीत, वायरल वैक्टर ने पारगमन के बाद अभिकर्मक क्षमता में सुधार दिखाया है, साथ ही समग्र कम साइटोटॉक्सिसिटी भी दिखाई है। इसके अलावा, वितरित जीन स्थिर रूप से व्यक्त किए जाते हैं और इसलिए, इस विधि को दीर्घकालिक अध्ययन के लिए आदर्श बनाते हैं13. एचईएससी में जीन वितरण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले वायरल वैक्टर में लेंटिवायरल वैक्टर (एलवीएस) हैं, जो उच्च टिटर वायरल कणों14,15 का उपयोग करके 80% से अधिक पारगमन दक्षता दे सकते हैं। लिपोफेक्शन और सीएपीओ4 वर्षा लेंटिवायरलकणों को उत्पन्न करने के लिए पैकेजिंग प्लास्मिड के साथ जीन ट्रांसफर वैक्टर के साथ एचईके 293 टी कोशिकाओं या इसके डेरिवेटिव को क्षणिक रूप से ट्रांसफेक्ट करने के लिए सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले तरीकों में से एक हैं। यद्यपि लिपोफेक्शन के परिणामस्वरूप अच्छी अभिकर्मक दक्षता और कम साइटोटॉक्सिसिटी होती है, तकनीक इसकी लागत से बाधित होती है, और उच्च टिटर लेंटिवायरल कणों को प्राप्त करने के लिए स्केलिंग बहुत महंगा होगा। सीएपीओ4 वर्षा के परिणामस्वरूप लिपोफेक्शन का उपयोग करके प्राप्त लोगों के लिए अपेक्षाकृत समान अभिकर्मक क्षमता होती है। यद्यपि लागत प्रभावी, सीएपीओ4 वर्षा के परिणामस्वरूप अभिकर्मकों के बाद महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु होती है, जिससे मानकीकृत करना और बैच-टू-बैच विविधताओं से बचना मुश्किल हो जाता है17. इस परिदृश्य में, एचईएससी में उपयोग किए जाने वाले उच्च टिटर लेंटिवायरल कणों के उत्पादन के लिए उच्च अभिकर्मक दक्षता, कम साइटोटॉक्सिसिटी और लागत-प्रभावशीलता देने वाली विधि विकसित करना महत्वपूर्ण है।

पॉलीइथिलेनिमिन (पीईआई) एक धनायनिक बहुलक है जो बिना किसी साइटोटॉक्सिसिटी के उच्च दक्षता पर एचईके 293 टी कोशिकाओं को ट्रांसफेक्ट कर सकता है और लिपोफेक्शन-आधारित विधियों की तुलना में नगण्य लागतहै 18. इस स्थिति में, पीईआई का उपयोग विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके संस्कृति सतह पर तैरनेवालों से लेंटिवायरल कणों की एकाग्रता के माध्यम से उच्च टिटर एलवीएस उत्पादन के स्केल-अप अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। प्रस्तुत लेख सुक्रोज कुशन के माध्यम से अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके एचईके 293 टी कोशिकाओं और लेंटिवायरल वेक्टर एकाग्रता को ट्रांसफेक्ट करने के लिए पीईआई के उपयोग का वर्णन करता है। इस पद्धति का उपयोग करके, हम नियमित रूप से कम बैच-टू-बैच विविधताओं के साथ 5 x 107 आईयू / एमएल से ऊपर टाइटर्स प्राप्त करते हैं। विधि एचईएससी और एचईएससी-व्युत्पन्न कोशिकाओं को जीन वितरण के लिए स्केल-अप अनुप्रयोगों के लिए सरल, सीधे-आगे और लागत प्रभावी है।

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Protocol

1. पीईआई या लिपोफेक्टामाइन 3000 अभिकर्मक का उपयोग करके एचईके 293 टी कोशिकाओं का अभिकर्मक

  1. डीएमईएम में संस्कृति एचईके 293 टी कोशिकाएं + 10% एफबीएस + 1 एक्स पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन 5% सीओ2 और 21% ओ 2 के वातावरण के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर जब तक कि वे अभिकर्मक के लिए बोने से पहले 90% संगम न हों। उच्च टिटर वायरस उत्पादन (आदर्श रूप से पी 30 से कम) के लिए कोशिकाओं की अपेक्षाकृत कम मार्ग संख्या का उपयोग करें।
  2. एक 100 मिमी ऊतक संस्कृति प्लेट में पूर्ण विकास माध्यम के 10 मिलीलीटर में बीज 4 x 106 कोशिकाओं और 5% सीओ2 और 21 % हे 2 के वातावरण के साथ एक आर्द्र ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में रात भर बढ़तेहैं।
  3. प्रत्येक अभिकर्मक के लिए, प्रवेश और पैकेजिंग प्लास्मिड के निम्नलिखित अनुपात का उपयोग करके 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में सीरम मुक्त डीएमईएम मीडिया के 1 एमएल में प्लास्मिड डीएनए (1 मिलीग्राम /
    प्रविष्टि वेक्टर = 10 μg
    पीएसपीएएक्स 2.0 = 7.5 μg
    पीएमडी 2.जी = 5 μg
  4. 10 एस के लिए भंवर और इकट्ठा करने के लिए कमरे के तापमान पर 30 एस के लिए 10,000 एक्स जी पर ट्यूब स्पिन।
  5. ट्यूब में 70 μL (1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान) पीईआई जोड़ें, और भंवर और स्पिन संक्षेप में जैसा कि ऊपर वर्णित है इकट्ठा करने के लिए। उपयोग किए गए पीईआई की मात्रा कुल डीएनए (μg) :P ईआई (μg) के 1: 3 अनुपात पर आधारित है।
  6. लिपोफेक्टामाइन-आधारित अभिकर्मक के लिए, किट में आपूर्ति की गई अभिकर्मक पी के 45 μL युक्त सीरम मुक्त डीएमईएम मीडिया के 500 μL में उपरोक्त वैक्टर को पतला करें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  7. सीरम मुक्त डीएमईएम मीडिया के 500 μL का उपयोग कर किट में आपूर्ति अभिकर्मक एल के 70 μL पतला और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
  8. दोनों ट्यूबों की सामग्री को मिलाएं और जटिल गठन की अनुमति देने के लिए 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों सेते हैं।
  9. लिपोफेक्टामाइन परिसरों के ड्रॉपवाइज 1 एमएल या डीएनए / लिपोफेक्टामाइन परिसरों के 1 एमएल को कोशिकाओं वाली प्लेट में जोड़ें और 5% सीओ2 और 21 % ओ 2 के वातावरण के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे के लिए सेतेहैं।
  10. 6 घंटे के बाद, ताजा पूर्ण विकास मीडिया (10 एमएल) में बदलें और कोशिकाओं को 5% सीओ2 और 21 % ओ 2 के वातावरण के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में वापसलौटाएं।

2. एलवीएस संग्रह और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन

  1. अभिकर्मक के 2 दिनों के बाद, वायरस युक्त मीडिया इकट्ठा करें और ताजा पूर्ण विकास मीडिया के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को फिर से ओवरले करें।
  2. अभिकर्मक के 3 दिनों के बाद, वायरस युक्त मीडिया एकत्र करें और इसे 2 दिन के समय बिंदु पर एकत्र किए गए वायरस युक्त मीडिया के साथ संयोजित करें।
  3. गोली सेलुलर मलबे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 2,000 एक्स जी पर वायरल सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र।
  4. 0.45 μm ताकना आकार कम प्रोटीन बाइंडिंग फ़िल्टर (या तो पीईएस या एसएफसीए) का उपयोग करके सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर करें और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। लेंटिवायरल कणों वाले फ़िल्टर किए गए सतह पर तैरनेवाला वायरल टाइटर्स में महत्वपूर्ण नुकसान के बिना 5 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  5. 10 मिनट के लिए 70% इथेनॉल के साथ धोने से कप रखने वाले अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को निष्फल करें, हवा सूखी, बंद करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  6. एक बाँझ अल्ट्रासेंट्रीफ्यूज ट्यूब में लेंटिवायरल कणों वाले फ़िल्टर किए गए मीडिया के 36 मिलीलीटर जोड़ें।
  7. बाँझ 20% सुक्रोज समाधान (पीबीएस में तैयार) के 4 मिलीलीटर के साथ एक बाँझ पट्टी के 5 मिलीलीटर भरें और इसे एलवीएस युक्त अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूब (यूसी) के नीचे दाईं ओर वितरित करें। यह महत्वपूर्ण है कि सुक्रोज समाधान मीडिया के साथ मिश्रित नहीं है और ट्यूब के तल पर एक ढाल बनाता है।
  8. सीरम मुक्त डीएमईएम मीडिया का उपयोग करके सभी अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूबों को संतुलित करें, ठंडे अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूब होल्डिंग कप में रखें, और ढक्कन बंद करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए 125,000 एक्स जी पर ट्यूबों स्पिन।
  10. स्पिन के बाद, ध्यान से गोली परेशान किए बिना ब्लीच युक्त कंटेनर में ट्यूब की सामग्री को उलटकर सतह पर तैरनेवाला त्यागें। दिखाई देने पर गोली को चिह्नित करें।
  11. एक 50 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में अल्ट्रासेंट्रिफ्यूज ट्यूब रखें और गोली के शीर्ष पर बाँझ डीपीबीएस के 200 μL जोड़ें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  12. अगले दिन, धीरे-धीरे 40x ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
  13. किसी भी मलबे को गोली देने के लिए टेबलटॉप अपकेंद्रित्र में 13,000 एक्स जी पर संक्षेप में स्पिन करें।
  14. सतह पर तैरनेवाला एक नई ट्यूब के लिए स्थानांतरण और 20 μL विभाज्य के रूप में वायरस की तैयारी विभाज्य। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  15. वायरल टिटर माप के लिए तैयारी के 5 μL अलग सेट करें।

3. पीएलकेओ.1-आधारित वैक्टर के लिए एलवीएस टिटर माप

  1. निर्माता की सिफारिशों के बाद क्यूपीसीआर का उपयोग करके लेंटिवायरल कणों के टिटर का निर्धारण करें।
  2. एक मानक वक्र के लिए, प्रत्येक चरण में न्यूक्लियस मुक्त एच2ओ के 45 μL में डीएनए के 5 μL को पतला करके मानक नियंत्रण डीएनए (किट में प्रदान की गई) के पांच 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करें। मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए 1: 100 से 1: 100,000 के कमजोर पड़ने का उपयोग करें।
  3. निम्नलिखित तरीके से डुप्लिकेट में बर्फ पर प्रतिक्रियाएं सेट करें:
    2x qPCR मास्टर मिश्रण 10 μL
    प्राइमर मिश्रण 2 μL
    नमूना या मानक डीएनए 2 μL
    न्यूक्लियस मुक्त एच2हे 6 μL
  4. कुल 35 चक्रों के लिए किट के मैनुअल में उल्लिखित साइकिल चलाने की स्थिति का उपयोग करके क्यूपीसीआर करें।
  5. एक्स-अक्ष पर वाई-अक्ष बनाम वायरस टिटर पर प्लॉट चक्र थ्रेशोल्ड (सीटी) मान।
  6. ट्रेंडलाइन समीकरण का उपयोग करके अज्ञात वायरस नमूना टिटर निर्धारित करने के लिए चार मानक नियंत्रण डीएनए कमजोर पड़ने (1: 100 से 1: 100,000) का उपयोग करके एक लघुगणक प्रतिगमन उत्पन्न करें।

4. पीएलएल 3.7-आधारित वैक्टर के लिए एलवीएस टिटर माप

  1. संक्रमण से पहले 24 घंटे पूर्ण विकास मीडिया के 1 एमएल में पी 12-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में बीज 1 एक्स 105 एचईके 2 9 3 टी कोशिकाएं।
  2. एमएल पॉलीब्रेन के साथ मीडिया को पूरक करें और प्रत्येक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब में 1 एमएल जोड़ें।
  3. पॉलीब्रेन युक्त मीडिया के 1 एमएल में से प्रत्येक में केंद्रित लेंटिवायरल कणों के 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0.5 μL और 0.1 μL का उपयोग करके वायरल कणों को पतला करें।
  4. एमएल पॉलीब्रेन के साथ लेंटिवायरल कणों की संकेतित मात्रा वाले मीडिया के साथ मीडिया को बदलें और 5% सीओ 2 और 21% ओ 2 के वातावरण के साथ आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर24 घंटे के लिए सेते हैं।
  5. अगले दिन, ताजा मीडिया में बदलें और 5% सीओ 2 और 21% ओ 2 के वातावरण के साथ एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर72 घंटे के लिए संस्कृति जारी रखें।
  6. 72 घंटे के बाद, पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रिप्सिनाइज करें, और पीबीएस के 1 एमएल में फिर से निलंबित करें।
  7. निर्माता की अनुशंसाओं का पालन करते हुए, कक्ष सॉर्टर का उपयोग करके FACS कक्ष सॉर्टिंग निष्पादित करें. गैर संक्रमित HEK293T कोशिकाओं का उपयोग कर 0% जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं के लिए गेट सेट करें और प्रत्येक वायरल कमजोर पड़ने के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए 50,000 घटनाओं की गिनती।
  8. लेंटिवायरल कणों के टिटर की गणना करने के लिए केवल लेंटिवायरल कणों की मात्रा का उपयोग करें जो 2% -20% की सीमा में% जीएफपी सकारात्मक कोशिकाएं देते हैं।

5. एचईएससी का संक्रमण और स्थिर चयन

  1. 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति मल्टीवेल प्लेट के प्रत्येक कुएं में बढ़ने वाले पीबीएस के 2 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
  2. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन द्वारा 1x सेल पृथक्करण अभिकर्मक के 1 एमएल का उपयोग कर सेल संस्कृति प्लेट से कोशिकाओं को अलग करें।
  3. एफ 12 मीडिया में कोशिकाओं को इकट्ठा करें और सेल गोली इकट्ठा करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 1,500 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
  4. एस्पिरेट, 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, और हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके गिनती करें।
  5. एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), और 10 μM रॉक इनहिबिटर (आरआई) के साथ पूरक एमटीईएसआर 1 युक्त पूर्ण विकास मीडिया के 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल के साथ एक सेल निलंबन बनाएं।
  6. 50x पतला पूर्ण तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स लेपित P24-अच्छी तरह से प्लेटों पर बीज 1 x 10 5 कोशिकाओं पूर्ण विकास मीडिया और संस्कृति के 500 μL में 5% सीओ2 और 21% हे 2 के वातावरण के साथ एक आर्द्र इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं।
  7. एमएल पॉलीब्रेन के साथ 10 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता पर एचईएससी को संक्रमित करें और 8 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  8. 8 घंटे के बाद, वायरस युक्त मीडिया को ताजा विकास मीडिया (-आरआई) के साथ बदलें और संस्कृति को तब तक जारी रखें जब तक कि कोशिकाएं 90% संगम न हों।
  9. एमएल) शुरू करें जब कोशिकाएं 90% संगम तक पहुंच जाती हैं, जो आमतौर पर संक्रमण के बाद 48-72 घंटे होती है।
  10. चयन पूरा होने के बाद (आमतौर पर 4-6 दिन), स्थिर कोशिकाओं (1: 4) को विभाजित करें और क्रायोप्रिजर्वेशन और आगे के विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का विस्तार करें।

6. एच 9-व्युत्पन्न तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं (एनपीसी) का पारगमन

नोट: एनपीसी एक दोहरी स्मैड निषेध प्रोटोकॉल का उपयोग कर एच 9 कोशिकाओं से प्राप्त किए गए थे, जैसा कि पहले19 वर्णित है।

  1. संक्षेप में, एकल कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल पृथक्करण अभिकर्मक के साथ एच 9 कोशिकाओं का इलाज करें और 10 एनजी / एमएल बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस), और 10 μM रॉक इनहिबिटर (आरआई) के साथ पूरक एमटीईएसआर 1 युक्त पूर्ण विकास मीडिया में पुन: निलंबित करें। सेमी2 (दिन 0) के घनत्व पर 1:50 पतला मैट्रिगेल-लेपित 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति व्यंजनों पर बीज।
  2. भेदभाव शुरू करें जब कोशिकाएं एलडीएन 193189 (200 एनएम), और एसबी 431542 (10 μM) (दिन 1) युक्त 100% केएसआर मीडिया में बदलकर 95% -100% संगम तक पहुंच जाती हैं।
  3. दूसरे दिन, एलडीएन 193189 (200 एनएम), एसबी 431542 (10 μM), और XAV939 (5 μM) के साथ पूरक 100% केएसआर के साथ मीडिया को फिर से बदलें।
  4. भेदभाव के दिन 4 पर, एलडीएन 193189 (200 एनएम), एसबी 431542 (10 μM), और XAV939 (5 μM) के साथ केएसआर माध्यम (75%) और N2 मध्यम (25%) के मिश्रण पर स्विच करें।
  5. दिन 6 से दिन 12 तक, धीरे-धीरे मीडिया को एलडीएन 193189 (200 एनएम), एसबी 431542 (10 μM), और XAV939 (5 μM) के साथ पूरक 100% एन 2 पर स्विच करें एन 2 मीडिया 25% प्रत्येक दिन बढ़ाकर और हर 2 दिनों के बाद मीडिया को बदलकर।
  6. संस्कृति दिवस एन 2 में एनपीसी: बी 27 मीडिया 20 एनजी / एमएल बीएफजीएफ के साथ पूरक है।
  7. एनपीसी संस्कृति मीडिया के 2 एमएल में 1:50 पतला पूर्ण तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स-लेपित पी 6-प्लेट के प्रत्येक कुएं में बीज 2 एक्स 10 5 कोशिकाएं और कोशिकाओं को संलग्न करने की अनुमति देने के लिए सेते हैं।
  8. एमएल पॉलीब्रेन की उपस्थिति में एमओआई 6 पर लेंटिवायरल कणों के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करें।
  9. 8 घंटे के बाद, ताजा एनपीसी विकास मीडिया के साथ वायरस युक्त मीडिया को बदलें।
  10. अगले दिन, संक्रमण दोहराएं और 8 घंटे में मीडिया बदलें।
  11. आगे के विश्लेषण के लिए कटाई से पहले 72 घंटे के लिए संस्कृति में कोशिकाओं रखें।

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Representative Results

जीन स्थानांतरण के बाद, एचईएससी की उच्च व्यवहार्यता अनिवार्य रूप से आवश्यक है। एचईएससी के इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद कोशिका मृत्यु को कम करने के प्रयासों और प्रोटोकॉल के अनुकूलन के बावजूद, कम अभिकर्मक दक्षता 20 के साथ इन कोशिकाओं के इलेक्ट्रोपोरेशन के बाद50% से अधिक कोशिका मृत्यु अभी भी देखी जाती है। लेंटिवायरल मध्यस्थता जीन हस्तांतरण के परिणामस्वरूप न केवल जीन हस्तांतरण की उच्च दक्षता होती है, बल्कि पारगमन के बाद सेल व्यवहार्यता के उच्च स्तर को भी प्रदर्शित करता है। नीचे दिए गए परिणाम दो दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं: एक एचईएससी-व्युत्पन्न एनपीसी में रिपोर्टर और क्षणिक अभिव्यक्ति के रूप में जीएफपी का उपयोग करना और दूसरा दीर्घकालिक भेदभाव प्रयोगों के लिए एचईएससी के स्थिर चयन के लिए प्यूरोमाइसिन का उपयोग करना।

प्रयोगों के पहले सेट में, दूसरी पीढ़ी के लेंटिवायरल पैकेजिंग प्लास्मिड पीएसपीएएक्स 2.0 और पीएमएमडी 2.जी के साथ रिपोर्टर के रूप में जीएफपी के साथ पीएलएल 3.7 वेक्टर ले जाने वाले एसएचआरएनए को सह-ट्रांसफेक्ट करके लेंटिवायरल कणों का उत्पादन किया गया था। लेंटिवायरल कणों को 48 घंटे और 72 घंटे के बाद अभिकर्मक के बाद एकत्र किया गया था और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके केंद्रित किया गया था। चित्रा 1 ए अभिकर्मक के 72 घंटे के बाद एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में जीएफपी अभिव्यक्ति दिखाता है। वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप एचईके 293 टी कोशिकाओं का सिंसाइटिया गठन भी हुआ जहां एकल कोशिकाओं को एक साथ जोड़ा जाता है, जैसा कि चित्रा 1 ए में तीर द्वारा दिखाया गया है। टाइटर्स को एफएसीएस विश्लेषण का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। हमने कम लागत वाले पीईआई और लिपोफेक्टामाइन 3000 अभिकर्मक का उपयोग करके लेंटिवायरल टाइटर्स की तुलना भी की और वायरल टाइटर्स (चित्रा 2 ए) के संदर्भ में दोनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया। इसके बाद, एच 9 एचईएससी-व्युत्पन्न एनपीसी 6 के एमओआई पर इन जीएफपी युक्त लेंटिवायरल कणों से दो बार संक्रमित थे और 72 घंटे के बाद विश्लेषण के लिए काटे गए थे। जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, दीर्घकालिक भेदभाव प्रयोगों के लिए, एचईएससी होना अनिवार्य है जो एसएचआरएनए को स्थिर रूप से व्यक्त करते हैं। विभिन्न जीनों के लिए एसएचआरएनए व्यक्त करने वाली स्थिर सेल लाइनें बनाने के प्रयास में, हमने निर्माता की सिफारिशों के अनुसार पीएलकेओ.1-आधारित वैक्टर और क्लोन किए गए एसएचआरएनए का उपयोग किया। अगला, ऊपर वर्णित के रूप में लेंटिवायरल कणों का उत्पादन किया गया था, और क्यूपीसीआर-आधारित विधियों (चित्रा 2 बी) का उपयोग करके एक वाणिज्यिक लेंटिवायरल टिटर माप किट का उपयोग करके टाइटर्स निर्धारित किए गए थे। एचईएससी 10 के एमओआई पर लेंटिवायरल कणों से संक्रमित थे और प्यूरोमाइसिन चयन का उपयोग करके चुने गए थे। चित्रा 3 पारगमन के बाद एचईएससी के स्थिर चयन के परिणामों को दर्शाता है। एमएल प्यूरोमाइसिन के साथ चयन के 5 दिनों के बाद, लेंटिवायरल ट्रांसफेक्टेड कोशिकाओं ने गैर-ट्रांसड्यूस्ड कोशिकाओं की तुलना में 80% से अधिक सेल व्यवहार्यता दिखाई, जहां कोई भी कोशिका उपचार से बच नहीं पाई। चयन के बाद, स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस्ड एच 9 कोशिकाओं को आगे बढ़ाया गया, क्रायोप्रिजर्व किया गया, और कुशल जीन नॉकडाउन के लिए परख करने के लिए पश्चिमी धब्बा का उपयोग करके विश्लेषण किया गया।

हमारी प्रयोगशाला में, हमने उपरोक्त दृष्टिकोण का उपयोग करके विभिन्न जीनों के लिए एसएचआरएनए व्यक्त करने वाले एच 9 एचईएससी की कई स्थिर सेल लाइनें बनाई हैं। यहां, हमने उनमें से एक के परिणाम प्रस्तुत किए हैं, जो पश्चिमी धब्बा विश्लेषण का उपयोग करके एल -2-हाइड्रॉक्सीग्लूटरेट डिहाइड्रोजनेज (एल 2 एचजीडीएच) जीन है। एल 2 एचजीडीएच की प्रचुर मात्रा में अभिव्यक्ति खाली वेक्टर रीढ़ की हड्डी के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं में देखी जाती है। हालांकि, एल 2 एचजीडीएच की कोई अभिव्यक्ति एल 2 एचजीडीएच के लिए एसएचआरएनए ले जाने वाले वेक्टर के साथ ट्रांसड्यूस की गई कोशिकाओं में नहीं देखी जाती है, जो एल 2 एचजीडीएच की कम अभिव्यक्ति के साथ एच 9 एचईएससी सेल लाइन की स्थिर पीढ़ी की प्रभावकारिता दिखाती है, जिसका उपयोग आगे भेदभाव अध्ययन (चित्रा 4) के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एचईके 293 टी कोशिकाओं और वायरल संक्रमित एनपीसी में जीएफपी की अभिव्यक्ति (ए) एसएचआरएनए को रिपोर्टर के रूप में जीएफपी ले जाने वाले पीएलएल 3.7 वेक्टर में क्लोन किया गया था और पीईआई का उपयोग करके एचईके 293 टी कोशिकाओं में पैकेजिंग प्लास्मिड के साथ सह-संक्रमित किया गया था। उच्च जीएफपी अभिव्यक्ति अभिकर्मक के 72 घंटे के बाद कुशल अभिकर्मक दक्षता दिखाती है। तीर एचईके 293 टी कोशिकाओं में सिंसाइटिया गठन का संकेत देते हैं, जहां वायरल प्रोटीन की अभिव्यक्ति के कारण व्यक्तिगत एचईके 293 टी कोशिकाओं के समूह एक साथ जुड़े हुए हैं। (बी) एच 9-व्युत्पन्न एनपीसी रिपोर्टर के रूप में जीएफपी युक्त लेंटिवायरल कणों के साथ 6 के एमओआई पर दो बार संक्रमित थे, और जीएफपी अभिव्यक्ति 72 घंटे बाद संक्रमण पर देखी गई थी। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: एलवीएस टिटर माप( ए) पीएलएल 3.7-आधारित वैक्टर के लिए वायरल टाइटर्स को एफएसीएस विश्लेषण का उपयोग करके उन वायरल कमजोर पड़ने के लिए% जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं को मापकर मापा गया था जो 2% -20% जीएफपी सकारात्मक कोशिकाओं को देते थे। (बी) निर्माता की सिफारिशों के बाद, एक वाणिज्यिक क्यूपीसीआर लेंटीवायरस टिटर किट का उपयोग करके पीएलकेओ.1-आधारित वैक्टर के लिए वायरल टाइटर्स निर्धारित किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: स्थिर एसएचआरएनए-व्यक्त एच 9 एचईएससी लाइनों की स्थापना एसएचआरएनए को पीएलकेओ.1-आधारित लेंटिवायरल वैक्टर में क्लोन किया गया था जो प्यूरोमाइसिन चयन जीन ले जा रहा था। एच 9 एचईएससी 10 के एमओआई पर लेंटिवायरल कणों से संक्रमित थे और प्यूरोमाइसिन का उपयोग करके चुने गए थे। एमएल प्यूरोमाइसिन का उपयोग करके 5 दिनों के लिए, 100% गैर-संक्रमित कोशिकाओं को मार दिया गया था, जबकि अधिकांश कोशिकाएं वायरल संक्रमित समूह में उपचार से बच गईं। इन कोशिकाओं को क्रायोप्रिजर्वेशन और आगे के विश्लेषण के लिए क्लोनल चयन के बिना विस्तारित किया गया था। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एच 9 एचईएससी में एल 2 एचजीडीएच जीन के स्थिर नॉकडाउन के लिए एक प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा विश्लेषण। नकारात्मक नियंत्रण (एच 9, प्यूरो अनकट) कोशिकाओं से कुल सेल लाइसेट्स, साथ ही एल 2 एचजीडीएच (एच 9, एसएच-एल 2 एचजीडीएच) के खिलाफ एसएचआरएनए को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को एंटी-एल 2 एचजीडीएच एंटीबॉडी का उपयोग करके पश्चिमी धब्बा के अधीन किया गया था। जैसा कि आकृति में दिखाया गया है, एच 9 एचईएससी में एल 2 एचजीडीएच की कोई अभिव्यक्ति नहीं देखी गई थी जो एल 2 एचजीडीएच के लिए एसएचआरएनए को स्थिर रूप से व्यक्त करती है। एल 2 एचजीडीएच एंटीबॉडी के लिए 46-48 केडीए (एक त्रिकोण द्वारा इंगित) के सही आणविक भार के अनुरूप विशिष्ट बैंड के ठीक ऊपर एक गैर-विशिष्ट बैंड देखा गया था। एंटी-जीएपीडीएच का उपयोग लोडिंग नियंत्रण के रूप में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अध्ययन या नैदानिक उद्देश्यों के लिए स्टेम कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से संशोधित करने की क्षमता प्रौद्योगिकी और एचईएससी के जीव विज्ञान की बुनियादी समझ दोनों द्वारा सीमित है। जिन तकनीकों ने माउस ईएससी में महत्वपूर्ण क्षमता दिखाई है, जैसे लिपोफेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन, एचईएससी के लिए अत्यधिक कुशल नहीं हैं, जो पारंपरिक तरीकों से जीन वितरण के लिए कुख्यात रूप से कठिन हैं20. इस धारणा ने न केवल मौजूदा तकनीकों के अनुकूलन का नेतृत्व किया है, बल्कि एचईएससी में अभिकर्मक दक्षता में वृद्धि के लिए उपन्यास विधियों का विकास भी किया है। इन नए घटनाक्रमों का फोकस एचईएससी को कुशल और स्थिर जीन वितरण रहा है, जबकि लंबे समय तक एचईएससी के विकास, प्लुरिपोटेंसी और भेदभाव क्षमता पर न्यूनतम प्रभाव बनाए रखा गया है। इन सख्त मानदंडों को पूरा करने वाले विभिन्न नए विकासों में एचईएससी21,22 में लेंटिवायरल मध्यस्थता जीन हस्तांतरण है। एक निश्चित जीन को व्यक्त करने वाले लेंटिवायरल कणों के उत्पादन के लिए, वांछित जीन को हस्तांतरण वैक्टर में से एक में क्लोन किया जाता है और लेंटिवायरल कणों वाले सेल कल्चर सतह पर तैरनेवाला फसल के लिए पैकेजिंग प्लास्मिड के साथ एचईके 293 टी कोशिकाओं में ट्रांसफेक्ट किया जाता है। एचईएससी में उपयोग किए जाने के लिए, कम से कम 1 x 107-1 x 108 आईयू / एमएल की सीमा में वायरस के उच्च टाइटर्स उत्पन्न करने के लिए विभिन्न तकनीकों का उपयोग करके इन वायरल कणों को केंद्रित करना आवश्यक है। सामान्य तौर पर, एलवीएस की बड़ी मात्रा इन टाइटर्स को प्राप्त करने के लिए मूल मात्रा से 200x-500x से केंद्रित होती है। इसका मतलब है कि एचईके 293 टी कोशिकाओं में अभिकर्मक दक्षता से समझौता किए बिना अत्यधिक लागत प्रभावी विधि का उपयोग करना प्रयोगशाला में नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले इन तरीकों के लिए एक शर्त है। वर्तमान विधि लिपोफेक्शन-आधारित विधियों के समान अभिकर्मक दक्षता के साथ एलवीएस की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने के लिए लागत प्रभावी विधि के रूप में धनायनिक बहुलक पीईआई के उपयोग का वर्णन करती है, जिसे स्वर्ण मानक माना जाता है। प्रस्तुत विधि का उपयोग करके, हम मूल मात्रा में 200x के एकाग्रता कारक के बाद 5 x 107 आईयू / एमएल से ऊपर औसत एलवीएस टाइटर्स प्राप्त कर सकते हैं। इन एलवीएस कणों का उपयोग करके, हम उच्च एमओआई पर कोशिकाओं को संक्रमित करके कई जीनों के लिए एसएचआरएनए व्यक्त करने वाले एच 9 एचईएससी की कई स्थिर सेल लाइनों को स्थापित करने में सक्षम हैं। यहां प्रस्तुत विधि क्लोनल चयन और विस्तार के थकाऊ और समय लेने वाली विधियों के उपयोग को दरकिनार करती है, जबकि अभी भी 100% के करीब नॉकडाउन क्षमता प्राप्त कर रही है, जैसा कि चित्रा 4 में एल 2 एचजीडीएच जीन नॉकडाउन के लिए प्रतिनिधि पश्चिमी धब्बा परिणामों में से एक द्वारा दिखाया गया है। एक सफल दृष्टिकोण के लिए कुछ सिफारिशें निम्नलिखित हैं।

उच्च वायरल टाइटर्स के लिए एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं की कम मार्ग संख्या का उपयोग आवश्यक है (आदर्श रूप से 30 से नीचे)। एचईके 293 टी कोशिकाओं की संगमता इस संबंध में एक और महत्वपूर्ण कारक है। एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं को अभिकर्मक से पहले कम से कम 80% संगम होना चाहिए क्योंकि सेल-सेल संपर्क साइटोटॉक्सिसिटी को बहुत कम करता है और वायरस उत्पादन में सुधार करता है। उपयोग किए जाने वाले वैक्टर को एंडोटॉक्सिन मुक्त प्लास्मिड अलगाव किट का उपयोग करके इथेनॉल वर्षा के बाद तैयार किया जाना चाहिए और अभिकर्मक के लिए उपयोग करने से पहले 1 मिलीग्राम / विभिन्न तिथियों में तैयार किए गए पीईआई समाधानों के बैच-टू-बैच विविधताएं हो सकती हैं। इस कारण से, पीईआई समाधान के प्रत्येक बैच को पहले जीएफपी वैक्टर का उपयोग करके प्रदर्शन के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, और बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचने के लिए समाधान को एकल-उपयोग विभाज्य में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाना चाहिए। उच्च टाइटर्स के लिए, एचईके 2 9 3 टी कोशिकाओं के अभिकर्मक के 72 घंटे के बाद एलवीएस सतह पर तैरनेवाला का संग्रह केवल अनुशंसित है बशर्ते कोशिकाएं स्वस्थ और संलग्न हों। एलवीएस युक्त सतह पर तैरनेवाला का निस्पंदन अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के बाद एलवीएस की घुलनशीलता को बहुत बढ़ाता है। एलवीएस सतह पर तैरनेवाला को 5 दिनों से अधिक समय तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने की सलाह नहीं दी जाती है क्योंकि इसके परिणामस्वरूप वायरस टाइटर्स की महत्वपूर्ण कमी होगी। इष्टतम टाइटर्स के लिए अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान सुक्रोज ढाल की आवश्यकता होती है। अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के सभी चरणों के दौरान तापमान को 4 डिग्री सेल्सियस के करीब बनाए रखा जाना चाहिए। पूर्ण पुनर्निलंबन के लिए डीपीबीएस में केंद्रित एलवीएस कणों की रात भर की इनक्यूबेशन की आवश्यकता होती है। एलवीएस के पुन: निलंबन के बाद सेंट्रीफ्यूजेशन सेलुलर मलबे (यदि कोई हो) को हटा देता है क्योंकि यह लक्ष्य कोशिकाओं पर उपयोग किए जाने पर साइटोटॉक्सिसिटी का कारण बन सकता है। एच 9 कोशिकाओं के संक्रमण के बाद, वायरस युक्त मीडिया को 8 घंटे के बाद ताजा विकास मीडिया के साथ बदलना महत्वपूर्ण है क्योंकि वायरस के साथ लंबे समय तक इनक्यूबेशन के परिणामस्वरूप एच 9 एचईएससी की महत्वपूर्ण कोशिका मृत्यु होगी। प्यूरोमाइसिन चयन केवल तभी शुरू किया जाना चाहिए जब संगम 80% से अधिक हो।

ऊपर वर्णित विधि मूल रूप से एसएचआरएनए की अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित की गई थी। अभिव्यक्ति वैक्टर में क्लोन किए जाने के लिए सीडीएनए की अस्थानिक अभिव्यक्ति के लिए एक समान दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, लेंटिवायरल मध्यस्थता जीन वितरण की एक प्रमुख सीमा आकार की बाधा है। जैसे-जैसे आकार बढ़ता है, लेंटिवायरल वैक्टर की पैकेजिंग इष्टतम नहीं होती है, जिसके परिणामस्वरूप वायरल टाइटर्स23 कम हो जाते हैं। भविष्य के अनुसंधान को इन बाधाओं को दूर करने के लिए प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने के लिए निर्देशित किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को संयुक्त अरब अमीरात विश्वविद्यालय (यूएईयू), अनुदान # 31 आर 170 (जायद सेंटर फॉर हेल्थ साइंसेज) और # 12 आर 010 (यूएईयू-एयूए अनुदान) से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। शैली और व्याकरण के लिए पांडुलिपि को संपादित करने में हमारी मदद करने के लिए हम प्रोफेसर रान्डेल मोर्स (वड्सवर्थ सेंटर, अल्बानी, एनवाई) को धन्यवाद देते हैं।

अनुरोध पर सभी डेटा उपलब्ध हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Invitrogen 31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes Beckman Coulter C14292
Accutase Stem Cell Technologies 7920
bFGF Recombinant human Invitrogen PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V Invitrogen 15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234
Cyclopamine Stem Cell Technologies 72074
DMEM media Invitrogen 11995073
DMEM Nutrient mix F12  Invitrogen 11320033
DPBS w/o: Ca and Mg PAN Biotech P04-36500
Fetal bovie serum Invitrogen 10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody CST 2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution GE healthcare SH30238.01
L Glutamine, 100X  Invitrogen 2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody Proteintech 15707-1-AP
L2HGDH shRNA Macrogen Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit Thermo Fisher L3000001
mTesR1 complete media Stem Cell Technologies 85850
Neurobasal medium 1X CTS Invitrogen A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x PAN Biotech P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x PAN Biotech P07-07200
Penicillin streptomycin SOL Invitrogen 15140122
pLKO.1 TRC vector Addgene 10878
pLL3.7 vector  Addgene 11795
pMD2.G Addgene 12259
Polybrene infection reagent Sigma TR1003- G
Polyethylenimine, branched Sigma 408727
psPAX2.0 Addgene 12260
Purmorphamine Tocris 4551/10
Puromycin Invitrogen A1113802
ROCK inhibitor Y-27632
dihydrochloride 		 Tocris 1254
SB 431542 Tocris 1614/10
Trypsin .05% EDTA  Invitrogen 25300062
XAV 939 Tocris 3748/10

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References

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जीव विज्ञान अंक 183 लेंटीवायरस एसएचआरएनए एचईएससी एनपीसी पॉलीथीनिलिन एचईके 293 टी कोशिकाएं
कम लागत वाले केशनिक पॉलिमर पॉलीथीनिमाइन (पीईआई) का उपयोग करते हुए एचईएससी और एनपीसी को एसएचआरएनए की लेंटिवायरल मध्यस्थता डिलीवरी
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Sheikh, M. A., Ansari, S. A.… More

Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI). J. Vis. Exp. (183), e63953, doi:10.3791/63953 (2022).

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