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Biology

Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)

Published: May 24, 2022 doi: 10.3791/63953
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine and Health Sciences, United Arab Emirates University, 2Zayed Center for Health Sciences, United Arab Emirates University

Summary

En utilisant le polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI), nous avons produit des particules lentivirales pour l’expression stable des shRNA dans les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) et les cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées de H9 transduites transitoirement à haute efficacité.

Abstract

Le protocole actuel décrit l’utilisation de particules lentivirales pour l’administration d’ARN courts en épingle à cheveux (shRNA) à la fois aux cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) ainsi qu’aux cellules progénitrices neurales (NPC) dérivées des CSEh à haute efficacité. Les particules lentivirales ont été générées en co-transfectant des cellules HEK293T à l’aide de vecteurs d’entrée (porteurs d’ARNh) ainsi que de plasmides d’emballage (pAX et pMD2.G) à l’aide du polymère cationique à faible coût polyéthylénimine (PEI). Les particules virales ont été concentrées par ultracentrifugation, ce qui a donné des titres moyens supérieurs à 5 x 107. Les CSEh et les CNP pourraient être infectés à des rendements élevés à l’aide de ces particules lentivirales, comme le montrent la sélection de la puromycine et l’expression stable dans les CSEh, ainsi que l’expression transitoire de GFP dans les CNP. De plus, l’analyse par transfert western a montré une réduction significative de l’expression des gènes ciblés par les shRNA. En outre, les cellules ont conservé leur pluripotence ainsi que leur potentiel de différenciation, comme en témoigne leur différenciation ultérieure en différentes lignées de SNC. Le protocole actuel traite de la livraison des shRNA; cependant, la même approche pourrait être utilisée pour l’expression ectopique des ADNc pour les études de surexpression.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste sont pluripotentes et peuvent être différenciées en différents types de cellules en fonction de facteurs externes dans des conditions in vitro 1,2. Afin d’exploiter pleinement le potentiel des CSEh, il est impératif de disposer de méthodes d’administration rapides et fiables des gènes pour ces cellules. Classiquement, les techniques utilisées peuvent être classées en deux types : les systèmes d’administration de gènes non viraux et viraux 3,4. Les systèmes d’administration de gènes non viraux les plus fréquemment utilisés sont la lipofection, l’électroporation et la nucléofection. Les systèmes d’administration non virale sont avantageux en raison de moins de mutations d’insertion et d’une diminution globale de l’immunogénicité 5,6. Cependant, ces méthodes entraînent une faible efficacité de transfection et une courte durée d’expression génique transitoire, ce qui est une limitation majeure pour les études de différenciation à long terme7. L’électroporation se traduit par une meilleure efficacité de transfection par rapport à la lipofection; cependant, il en résulte plus de 50% de mort cellulaire 8,9,10. En utilisant la nucléofection, la survie cellulaire et l’efficacité de la transfection peuvent être améliorées en combinant la lipofection et l’électroporation, mais l’approche nécessite des tampons spécifiques aux cellules et un équipement spécialisé et, par conséquent, devient assez coûteuse pour les applications à grande échelle11,12.

En revanche, les vecteurs viraux ont montré une amélioration de l’efficacité de la transfection, ainsi qu’une faible cytotoxicité globale, après la transduction. De plus, les gènes délivrés sont exprimés de manière stable et, par conséquent, rendent cette méthode idéale pour les études à long terme13. Parmi les vecteurs viraux les plus couramment utilisés pour l’administration de gènes dans les CSEh figurent les vecteurs lentiviraux (LVS), qui peuvent donner une efficacité de transduction de plus de 80% en utilisant des particules virales à titre élevé14,15. La lipofection et la précipitation de CaPO4 sont parmi les méthodes les plus couramment utilisées pour transfecter transitoirement les cellules HEK293T ou ses dérivés avec des vecteurs de transfert de gènes ainsi que des plasmides d’emballage pour produire des particules lentivirales16. Bien que la lipofection entraîne une bonne efficacité de transfection et une faible cytotoxicité, la technique est entravée par son coût, et la mise à l’échelle pour obtenir des particules lentivirales à titre élevé serait très coûteuse. La précipitation de CaPO4 entraîne des rendements de transfection relativement similaires à ceux obtenus à l’aide de la lipofection. Bien que rentables, les précipitations de CaPO4 entraînent une mort cellulaire importante après les transfections, ce qui rend difficile la normalisation et évite les variations d’un lot àl’autre 17. Dans ce scénario, le développement d’une méthode qui donne une efficacité de transfection élevée, une faible cytotoxicité et un rapport coût-efficacité est crucial pour la production de particules lentivirales à titre élevé à utiliser dans les CSEh.

La polyéthylèneénamine (PEI) est un polymère cationique qui peut transfecter les cellules HEK293T à haute efficacité sans trop de cytotoxicité et a un coût négligeable par rapport aux méthodes basées sur la lipofection18. Dans cette situation, PEI peut être utilisé pour des applications à grande échelle de la production de LVS à titre élevé grâce à la concentration de particules lentivirales provenant de surnageants de culture à l’aide de diverses techniques. L’article présenté décrit l’utilisation de l’Î.-P.-É. pour transfecter les cellules HEK293T et la concentration de vecteurs lentiviraux à l’aide de l’ultracentrifugation à travers un coussin de saccharose. En utilisant cette méthode, nous obtenons régulièrement des titres bien au-dessus de 5 x 107 UI / mL avec de faibles variations de lot à lot. La méthode est simple, simple et rentable pour les applications à grande échelle pour l’administration de gènes aux CSEh et aux cellules dérivées des CSEh.

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Protocol

1. Transfection de cellules HEK293T à l’aide d’un réactif PEI ou Lipofectamine 3000

  1. Culture de cellules HEK293T dans du DMEM + 10% FBS + 1x pénicilline/streptomycine à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21 % O2 jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 90% avant l’ensemencement pour la transfection. Utilisez un nombre relativement faible de cellules de passage pour une production élevée de virus à titre élevé (idéalement inférieur à P30).
  2. Ensemencez 4 x 106 cellules dans 10 mL de milieu de croissance complet dans une plaque de culture tissulaire de 100 mm et cultivez pendant la nuit dans un incubateur de culture tissulaire humidifié avec une atmosphère de 5% CO2 et 21% O2.
  3. Pour chaque transfection, diluer l’ADN plasmidique (stocks de 1 mg/mL) dans 1 mL de milieu DMEM libre de sérum dans des tubes centrifuges de 1,5 mL en utilisant le rapport suivant de plasmides d’entrée et d’emballage:
    Vecteur d’entrée = 10 μg
    psPAX2.0 = 7,5 μg
    pMD2.G = 5 μg
  4. Vortex pendant 10 s et rotation du tube à 10 000 x g pendant 30 s à température ambiante pour recueillir.
  5. Ajouter 70 μL de (1 mg/mL de solution mère) PEI au tube, puis vortex et rotation brève comme décrit ci-dessus pour recueillir. Le volume d’Î.-P.-É. utilisé est basé sur un rapport de 1:3 de l’ADN total (μg) :P EI (μg).
  6. Pour la transfection à base de lipofectamine, diluer les vecteurs ci-dessus dans 500 μL de milieuX DMEM sans sérum contenant 45 μL de réactif P fourni dans le kit et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  7. Diluer 70 μL de réactif L fourni dans le kit à l’aide de 500 μL de milieu DMEM sans sérum et incuber à température ambiante pendant 5 min.
  8. Combinez le contenu des deux tubes et incubez les tubes à température ambiante pendant 20 minutes pour permettre une formation complexe.
  9. Ajouter goutte à goutte 1 mL d’ADN/PEI ou 1 mL de complexes ADN/lipofectamine à la plaque contenant des cellules et incuber pendant 6 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % de CO2 et 21 % d’O2.
  10. Après 6 h, passer à un milieu de croissance complet frais (10 mL) et renvoyer les cellules dans l’incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21% d’O2.

2. Collecte LVS et ultracentrifugation

  1. Après 2 jours de transfection, prélever le milieu contenant le virus et superposer à nouveau les cellules avec 10 mL de milieu de croissance complet frais.
  2. Après 3 jours de transfection, collectez le milieu contenant le virus et combinez-le avec le milieu contenant le virus recueilli au point de temps de 2 jours.
  3. Centrifuger le surnageant viral à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les débris cellulaires.
  4. Filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre à faible liaison aux protéines de 0,45 μm de taille de pore (PES ou SFCA) et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’ultracentrifugation. Le surnageant filtré contenant des particules lentivirales peut être conservé à 4 °C pendant 5 jours sans perte significative de titres viraux.
  5. Stériliser les tubes d’ultracentrifugation contenant les gobelets en les lavant avec de l’éthanol à 70 % pendant 10 min, sécher à l’air, fermer et conserver à 4 °C.
  6. Ajouter 36 mL de milieu filtré contenant des particules lentivirales dans un tube ultracentrifuge stérile.
  7. Remplir 5 mL d’une stripette stérile avec 4 mL de solution stérile de saccharose à 20 % (préparée dans du PBS) et la distribuer directement au fond du tube ultracentrifuge (UC) contenant du LVS. Il est important que la solution de saccharose ne soit pas mélangée au milieu et fasse un gradient au fond du tube.
  8. Équilibrez tous les tubes d’ultracentrifugation à l’aide d’un milieu DMEM sans sérum, placez-les dans les gobelets de maintien du tube d’ultracentrifugation froide et fermez les couvercles.
  9. Faire tourner les tubes à 125 000 x g pendant 2 h à 4 °C.
  10. Après la rotation, jetez soigneusement le surnageant en inversant le contenu du tube dans un récipient contenant de l’eau de Javel sans perturber la pastille. Marquez la pastille si elle est visible.
  11. Placez le tube d’ultracentrifugation dans un tube stérile de 50 mL et ajoutez 200 μL de DPBS stérile exactement au sommet de la pastille. Conserver à 4 °C pendant la nuit sans être dérangé.
  12. Le lendemain, mélanger doucement en pipetant de haut en bas 40x.
  13. Tournez brièvement à 13 000 x g dans une centrifugeuse de table pour granuler les débris.
  14. Transférer le surnageant dans un nouveau tube et aliquoter la préparation du virus sous forme d’aliquotes de 20 μL. Conserver à −80 °C.
  15. Réserver 5 μL de la préparation pour les mesures de titre viral.

3. Mesure de titre LVS pour vecteurs basés sur pLKO.1

  1. Déterminez le titre des particules lentivirales à l’aide d’une qPCR en suivant les recommandations du fabricant.
  2. Pour une courbe standard, préparez cinq dilutions en série 10 fois de l’ADN de contrôle standard (fourni dans le kit) en diluant 5 μL d’ADN en 45 μL de H2O sans nucléase à chaque étape. Utilisez des dilutions de 1:100 à 1:100 000 pour générer une courbe standard.
  3. Mettre en place des réactions sur la glace en double de la manière suivante:
    2x mélange maître qPCR 10 μL
    Mélange d’apprêt 2 μL
    Échantillon ou ADN standard 2 μL
    Sans nucléase H2O 6 μL
  4. Effectuez la qPCR en utilisant les conditions de cyclisme mentionnées dans le manuel du kit pour un total de 35 cycles.
  5. Tracez les valeurs de seuil de cycle (Ct) sur l’axe Y par rapport au titre de virus sur l’axe X.
  6. Générez une régression logarithmique à l’aide de quatre dilutions d’ADN de contrôle standard (1:100 à 1:100 000) pour déterminer le titre d’échantillon de virus inconnu à l’aide d’une équation de ligne de tendance.

4. Mesure du titre LVS pour les vecteurs pll3.7

  1. Ensemencer 1 x 105 cellules HEK293T dans chaque puits d’une plaque de puits P12 dans 1 mL de milieu de croissance complet 24 h avant les infections.
  2. Complétez le milieu avec 8 μg/mL de polybrene et ajoutez 1 mL dans chaque tube stérile de 1,5 mL.
  3. Diluer les particules virales en utilisant 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL et 0,1 μL de particules lentivirales concentrées dans chacun des 1 mL de milieux contenant du polybrene.
  4. Remplacer les milieux des cellules HEK293T par les milieux contenant les quantités indiquées de particules lentivirales ainsi que 8 μg/mL de polybrène et incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5 % de CO2 et 21 % d’O2.
  5. Le lendemain, passez à des milieux frais et poursuivez la culture pendant 72 h à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21% d’O2.
  6. Après 72 h, laver les cellules avec du PBS, trypsiniser à 37 °C selon le protocole du fabricant et remettre en suspension dans 1 mL de PBS.
  7. Effectuez le tri des cellules FACS à l’aide d’un trieur de cellules, en suivant les recommandations du fabricant. Réglez la porte sur 0% de cellules GFP positives en utilisant des cellules HEK293T non infectées et comptez 50 000 événements pour chaque échantillon afin de déterminer le pourcentage de cellules positives pour chaque dilution virale.
  8. Utilisez uniquement les volumes de particules lentivirales qui donnent des cellules %GFP positives de l’ordre de 2% à 20% pour calculer le titre des particules lentivirales.

5. Infection des CSEh et sélection stable

  1. Lavez les cellules avec 2 mL de PBS en croissance dans chaque puits d’une plaque multipuits de culture cellulaire à 6 puits.
  2. Détacher les cellules de la plaque de culture cellulaire à l’aide de 1 mL de réactif de dissociation cellulaire 1x par incubation à 37 °C pendant 5 min.
  3. Prélever les cellules dans un milieu DMEM/F12 et centrifuger à 1 500 x g pendant 5 min à température ambiante pour recueillir la pastille de cellule.
  4. Aspirer, remettre les cellules en suspension dans 1 mL et compter à l’aide d’un hémocytomètre.
  5. Fabriquer une suspension cellulaire avec 2 x 105 cellules/mL de milieu de croissance complet contenant mTeSR1 complété par un facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF) de 10 ng/mL, de pénicilline/streptomycine (P/S) et un inhibiteur de ROCHE (RI) de 10 μM.
  6. Ensemencez 1 x 105 cellules sur 50x plaques de puits P24 enduites de matrice de membrane basale complète diluée dans 500 μL de milieu de croissance complet et cultivez les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% de CO2 et 21% d’O2.
  7. Le lendemain, infecter les CSEh à une multiplicité d’infection (MOI) de 10 avec 8 μg/mL de polybrene et incuber à 37 °C pendant 8 h.
  8. Après 8 h, remplacer le milieu contenant le virus par un milieu de croissance frais (-RI) et poursuivre la culture jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 90 %.
  9. Commencez la sélection de la puromycine (0,8 μg / mL) lorsque les cellules atteignent 90% de confluence, ce qui est généralement 48-72 h après l’infection.
  10. Une fois la sélection terminée (généralement 4-6 jours), divisez les cellules stables (1:4) et élargissez les cellules pour la cryoconservation et une analyse plus approfondie.

6. Transduction des cellules progénitrices neurales (PNJ) dérivées de H9

REMARQUE: Les NPC ont été dérivés de cellules H9 à l’aide d’un protocole d’inhibition à double Smad, comme décrit précédemment19.

  1. En bref, traiter les cellules H9 avec un réactif de dissociation cellulaire à 37 °C pendant 5 min pour générer des cellules individuelles et les remettre en suspension dans un milieu de croissance complet contenant mTeSR1 complété par un facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) de 10 ng/mL, de la pénicilline/streptomycine (P/S) et un inhibiteur de ROCK (RI) de 10 μM. Semer sur des boîtes de culture cellulaire à 6 puits diluées enrobées de Matrigel à une densité de 60 000 cellules/cm2 (jour 0).
  2. Initier la différenciation lorsque les cellules atteignent une confluence de 95 % à 100 % en passant à un milieu KSR à 100 % contenant du LDN193189 (200 nM) et du SB431542 (10 μM) (jour 1).
  3. Le jour 2, changez à nouveau le support avec 100% KSR complété par LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) et XAV939 (5 μM).
  4. Au jour 4 de la différenciation, passez à un mélange de milieu KSR (75%) et de milieu N2 (25%) avec LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) et XAV939 (5 μM).
  5. Du jour 6 au jour 12, passez progressivement le média à 100% N2 complété par LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) et XAV939 (5 μM) en augmentant le média N2 de 25% chaque jour et en changeant le support tous les 2 jours.
  6. Journée de la culture 12 PNJ dans les médias N2:B27 complétés par 20 ng / mL bFGF.
  7. Ensemencez 2 x 105 cellules dans chaque puits d’une plaque P6 enduite de matrice de membrane basale complète diluée de 1:50 dans 2 mL de milieux de culture de PNJ et incubez pour permettre aux cellules de se fixer.
  8. Le lendemain, infecter les cellules avec des particules lentivirales à un MOI 6 en présence de polybrene de 8 μg/mL.
  9. Après 8 h, remplacez le milieu contenant le virus par un milieu de croissance NPC frais.
  10. Le lendemain, répétez les infections et changez le média à 8 h.
  11. Gardez les cellules en culture pendant 72 h avant de les récolter pour une analyse plus approfondie.

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Representative Results

Après le transfert de gènes, une viabilité élevée des CSEh est inévitablement requise. Malgré les efforts et l’optimisation des protocoles pour réduire la mort cellulaire après l’électroporation des CSEh, plus de 50% de la mort cellulaire est encore observée après l’électroporation de ces cellules, ainsi qu’une faible efficacité de transfection20. Le transfert de gènes à médiation lentivirale entraîne non seulement une grande efficacité du transfert de gènes, mais démontre également des niveaux élevés de viabilité cellulaire après la transduction. Les résultats ci-dessous présentent deux approches : l’une utilisant la GFP comme rapporteur et l’expression transitoire dans les NPC dérivés des CSEh et l’autre utilisant la puromycine pour la sélection stable des CSEh pour les expériences de différenciation à long terme.

Dans la première série d’expériences, des particules lentivirales ont été produites en co-transfectant des shRNA portant le vecteur pll3.7 avec GFP comme rapporteur avec des plasmides d’emballage lentiviraux de deuxième génération psPAX2.0 et pMD2.G. Les particules lentivirales ont été collectées après 48 h et 72 h après la transfection et concentrées par ultracentrifugation. La figure 1A montre l’expression abondante de GFP dans les cellules HEK293T après 72 h de transfection. L’expression de protéines virales a également entraîné la formation de syncytie de cellules HEK293T où des cellules individuelles sont fusionnées, comme le montrent les flèches de la figure 1A. Les titres ont été déterminés à l’aide de l’analyse FACS. Nous avons également comparé les titres lentiviraux à l’aide du réactif PEI et Lipofectamine 3000 à faible coût et n’avons trouvé aucune différence significative entre les deux en termes de titres viraux (Figure 2A). Ensuite, les PNJ dérivés des H9 HESC ont été infectés deux fois avec ces particules lentivirales contenant du GFP à un MOI de 6 et récoltés pour analyse après 72 h. La figure 1B montre l’expression marquée de GFP dans les PNJ après l’infection. Comme indiqué ci-dessus, pour les expériences de différenciation à long terme, il est impératif d’avoir des CSEh qui expriment de manière stable les shRNA. Dans une tentative de créer des lignées cellulaires stables exprimant l’ARNh pour divers gènes, nous avons utilisé des vecteurs à base de plKO.1 et des shRNA clonés conformément aux recommandations du fabricant. Ensuite, des particules lentivirales ont été produites comme décrit ci-dessus, et les titres ont été déterminés à l’aide d’un kit commercial de mesure de titre lentiviral à l’aide de méthodes basées sur la qPCR (Figure 2B). Les CSEh ont été infectés par des particules lentivirales à un MOI de 10 et sélectionnés à l’aide de la sélection de puromycine. La figure 3 montre les résultats d’une sélection stable des CSEh après transduction. Après 5 jours de sélection avec 0,8 μg/mL de puromycine, les cellules transfectées lentivirales ont montré une viabilité cellulaire de plus de 80% par rapport aux cellules non transduites, où aucune cellule n’a survécu au traitement. Après la sélection, les cellules H9 transduites de manière stable ont été élargies, cryoconservées et analysées à l’aide du transfert Western pour tester l’efficacité de l’élimination des gènes.

Dans notre laboratoire, nous avons créé plusieurs lignées cellulaires stables de CSEh H9 exprimant des shRNA pour différents gènes en utilisant l’approche ci-dessus. Ici, nous avons présenté les résultats de l’un d’entre eux, qui est le gène L-2-hydroxyglutarate déshydrogénase (L2HGDH) en utilisant l’analyse par transfert western. Une expression abondante de L2HGDH est observée dans les cellules transduites avec une colonne vertébrale vectorielle vide. Cependant, aucune expression de L2HGDH n’est observée dans les cellules transduites avec un vecteur porteur de shRNA pour L2HGDH, ce qui montre l’efficacité de la génération stable d’une lignée cellulaire H9 hESCs avec une expression réduite de L2HGDH, qui peut être utilisée pour d’autres études de différenciation (Figure 4).

Figure 1
Figure 1 : Expression de la GFP dans les cellules HEK293T et les PNJ infectés par le virus. (A) Les shRNA ont été clonés dans un vecteur pll3.7 porteur de GFP comme rapporteur et co-transfectés avec des plasmides d’emballage dans des cellules HEK293T à l’aide de PEI. L’expression GFP élevée montre une efficacité de transfection efficace après 72 h de transfection. Les flèches indiquent la formation de syncytie dans les cellules HEK293T, où des groupes de cellules HEK293T individuelles ont fusionné en raison de l’expression de protéines virales. (B) Les PNJ dérivés de H9 ont été infectés deux fois à un MOI de 6 avec des particules lentivirales contenant du GFP comme rapporteur, et l’expression du GFP a été observée à 72 h après l’infection. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Mesures du titre LVS. (A) Les titres viraux pour les vecteurs à base de pll3,7 ont été mesurés à l’aide de l’analyse FACS en quantifiant les cellules positives %GFP pour les dilutions virales qui ont donné 2% à 20% de cellules GFP positives. (B) Les titres viraux des vecteurs à base de pLKO.1 ont été déterminés à l’aide d’un kit de titre de lentivirus qPCR commercial, conformément aux recommandations du fabricant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Établissement de lignées hESC H9 exprimant des shRNA stables. Les shRNA ont été clonés en vecteurs lentiviraux à base de pLKO.1 porteurs du gène de sélection de la puromycine. Les CSEh H9 ont été infectés par des particules lentivirales à un MOI de 10 et sélectionnés à l’aide de puromycine. En utilisant 0,8 μg/mL de puromycine pendant 5 jours, 100% des cellules non infectées ont été tuées, tandis que la plupart des cellules ont survécu au traitement dans le groupe infecté par le virus. Ces cellules ont été agrandies sans sélection clonale pour la cryoconservation et une analyse plus approfondie. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Une analyse représentative par transfert de Western pour l’élimination stable du gène L2HGDH dans les CSEh H9. Les lysats cellulaires totaux provenant de cellules témoins négatives (H9, puro non coupées), ainsi que de cellules exprimant de manière stable des shRNA contre L2HGDH (H9, sh-L2HGDH) ont été soumis à un transfert western à l’aide de l’anticorps anti-L2HGDH. Comme le montre la figure, aucune expression de L2HGDH n’a été observée dans les CSEh H9 exprimant de manière stable les shRNA pour L2HGDH. Une bande non spécifique a été observée juste au-dessus de la bande spécifique correspondant au poids moléculaire correct de 46-48 kDa (indiqué par un triangle) pour l’anticorps L2HGDH. Anti-GAPDH a été utilisé comme contrôle de chargement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Discussion

La capacité de modifier génétiquement les cellules souches à des fins d’étude ou cliniques est limitée à la fois par la technologie et la compréhension de base de la biologie des CSEh. Les techniques qui ont montré un potentiel important dans les CSE de souris, comme la lipofection et l’électroporation, ne sont pas très efficaces pour les CSEh, qui sont notoirement difficiles pour l’administration de gènes par les méthodes conventionnelles20. Cette notion a conduit non seulement à l’optimisation des techniques existantes, mais aussi au développement de nouvelles méthodes pour augmenter l’efficacité de la transfection dans les CSEh. Ces nouveaux développements se sont concentrés sur l’administration efficace et stable de gènes aux CSEh tout en maintenant un effet minimal sur la croissance, la pluripotence et le potentiel de différenciation des CSEh sur des périodes prolongées. Parmi les différents nouveaux développements qui répondent à ces critères stricts figure le transfert de gènes à médiation lentivirale vers lesCSEh 21,22. Pour la production de particules lentivirales exprimant un certain gène, le gène souhaité est cloné dans l’un des vecteurs de transfert et est transfecté dans les cellules HEK293T avec des plasmides d’emballage pour récolter un surnageant de culture cellulaire contenant des particules lentivirales. Pour être utilisé dans les CSEh, il est essentiel de concentrer ces particules virales en utilisant diverses techniques pour produire des titres élevés de virus au moins dans la gamme de 1 x 107-1 x 108 UI / mL. En général, de grands volumes de LVS sont concentrés de 200x à 500x le volume d’origine pour obtenir ces titres. Cela signifie que l’utilisation d’une méthode très rentable sans compromettre l’efficacité de la transfection dans les cellules HEK293T est une condition préalable à l’utilisation systématique de ces méthodes en laboratoire. La présente méthode décrit l’utilisation du polymère cationique PEI comme méthode rentable pour produire de grands volumes de LVS avec une efficacité de transfection similaire aux méthodes basées sur la lipofection, qui sont considérées comme de référence. En utilisant la méthode présentée, nous pouvons obtenir des titres LVS moyens bien au-dessus de 5 x 107 UI / mL après un facteur de concentration de 200x le volume d’origine. En utilisant ces particules LVS, nous avons pu établir plusieurs lignées cellulaires stables de H9 hESC exprimant des shRNA pour plusieurs gènes en infectant les cellules à des MIO élevés. La méthode présentée ici contourne l’utilisation de méthodes fastidieuses et chronophages de sélection et d’expansion clonales tout en obtenant des rendements de knockdown proches de 100%, comme le montre l’un des résultats représentatifs du transfert western pour l’élimination du gène L2HGDH à la figure 4. Voici quelques-unes des recommandations pour une approche réussie.

L’utilisation d’un faible nombre de passage de cellules HEK293T est nécessaire (idéalement inférieur à 30) pour les titres viraux élevés. La confluence des cellules HEK293T est un autre facteur important à cet égard. Les cellules HEK293T doivent être confluentes à au moins 80 % avant la transfection, car le contact cellule-cellule réduit considérablement la cytotoxicité et améliore la production de virus. Les vecteurs utilisés doivent être préparés à l’aide de kits d’isolement de plasmides sans endotoxines suivis d’une précipitation d’éthanol et reconstitués à une concentration minimale de 1 mg/mL avant utilisation pour la transfection. Il pourrait y avoir des variations de lot à lot de solutions de l’Île-du-Prince-Édouard préparées à différentes dates. Pour cette raison, chaque lot de solution PEI doit d’abord être testé pour la performance en utilisant des vecteurs GFP, et la solution doit être stockée à −20 °C dans des aliquotes à usage unique pour éviter les cycles répétés de gel-dégel. Pour les titres élevés, la collecte du surnageant LVS après 72 h de transfection des cellules HEK293T n’est recommandée que si les cellules sont saines et attachées. La filtration du surnageant contenant du LVS augmente considérablement la solubilité du LVS après ultracentrifugation. Il n’est pas conseillé de conserver le surnageant LVS à 4 °C pendant plus de 5 jours, car cela entraînerait une réduction significative des titres de virus. Le gradient de saccharose pendant l’ultracentrifugation est nécessaire pour des titres optimaux. Les températures doivent être maintenues à près de 4 °C pendant toutes les étapes de l’ultracentrifugation. L’incubation pendant la nuit de particules de LVS concentrées dans le DPBS est nécessaire pour une remise en suspension complète. La centrifugation après la remise en suspension du LVS élimine les débris cellulaires (le cas échéant) car elle peut provoquer une cytotoxicité lorsqu’elle est utilisée sur des cellules cibles. Après l’infection des cellules H9, il est important de remplacer les milieux contenant le virus par des milieux de croissance frais après 8 h, car une incubation prolongée avec le virus entraînerait une mort cellulaire importante des CSEh H9. La sélection de la puromycine ne doit être commencée que lorsque la confluence est supérieure à 80%.

La méthode décrite ci-dessus a été adaptée à l’origine pour l’expression des shRNA. Une approche similaire pourrait être utilisée pour l’expression ectopique des ADNc à cloner en vecteurs d’expression. Cependant, une limitation majeure de l’administration de gènes à médiation lentivirale est la contrainte de taille. À mesure que la taille augmente, l’emballage des vecteurs lentiviraux n’est pas optimal, ce qui entraîne une réduction des titres viraux23. Les recherches futures devraient viser à optimiser le protocole pour surmonter ces contraintes.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche de l’Université des Émirats arabes unis (UAEU), la subvention n ° 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) et # 12R010 (subvention UAEU-AUA). Nous remercions le professeur Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) de nous avoir aidés à éditer le manuscrit pour le style et la grammaire.

Toutes les données sont disponibles sur demande.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol Invitrogen 31350010
38.5 mL, Sterile + Certified Free Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tubes Beckman Coulter C14292
Accutase Stem Cell Technologies 7920
bFGF Recombinant human Invitrogen PHG0261
Bovine serum albumin FRAC V Invitrogen 15260037
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free Corning 354234
Cyclopamine Stem Cell Technologies 72074
DMEM media Invitrogen 11995073
DMEM Nutrient mix F12  Invitrogen 11320033
DPBS w/o: Ca and Mg PAN Biotech P04-36500
Fetal bovie serum Invitrogen 10270106
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Antibody CST 2118S
Gentle Cell Dissociation Reagent Stem Cell Technologies 7174
HyClone Non Essential Amino Acids (NEAA) 100X Solution GE healthcare SH30238.01
L Glutamine, 100X  Invitrogen 2924190090
L2HGDH Polyclonal antibody Proteintech 15707-1-AP
L2HGDH shRNA Macrogen Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT
Lipofectamine 3000 kit Thermo Fisher L3000001
mTesR1 complete media Stem Cell Technologies 85850
Neurobasal medium 1X CTS Invitrogen A1371201
Neuropan 2 Supplement 100x PAN Biotech P07-11050
Neuropan 27 Supplement 50x PAN Biotech P07-07200
Penicillin streptomycin SOL Invitrogen 15140122
pLKO.1 TRC vector Addgene 10878
pLL3.7 vector  Addgene 11795
pMD2.G Addgene 12259
Polybrene infection reagent Sigma TR1003- G
Polyethylenimine, branched Sigma 408727
psPAX2.0 Addgene 12260
Purmorphamine Tocris 4551/10
Puromycin Invitrogen A1113802
ROCK inhibitor Y-27632
dihydrochloride 		 Tocris 1254
SB 431542 Tocris 1614/10
Trypsin .05% EDTA  Invitrogen 25300062
XAV 939 Tocris 3748/10

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References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: Somatic differentiation in vitro. Nature Biotechnology. 18 (4), 399-404 (2000).
  3. Strulovici, Y., Leopold, P. L., O'Connor, T. P., Pergolizzi, R. G., Crystal, R. G. Human embryonic stem cells and gene therapy. Molecular Therapy. 15 (5), 850-866 (2007).
  4. Kane, N., McRae, S., Denning, C., Baker, A. Viral and nonviral gene delivery and its role in pluripotent stem cell engineering. Drug Discovery Today. Technologies. 5 (4), 105 (2008).
  5. Li, S. D., Huang, L. Nonviral is superior to viral gene delivery. Journal of Controlled Release. 123 (3), 181-183 (2007).
  6. Mastrobattista, E., Bravo, S. A., vander Aa, M., Crommelin, D. J. Nonviral gene delivery systems: From simple transfection agents to artificial viruses. Drug Discovery Today. Technologies. 2 (1), 103-109 (2005).
  7. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  8. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Electroporation of human embryonic stem cells: Small and macromolecule loading and DNA transfection. Biotechnology Progress. 22 (3), 825-834 (2006).
  9. Sukhorukov, V. L., et al. Surviving high-intensity field pulses: Strategies for improving robustness and performance of electrotransfection and electrofusion. The Journal of Membrane Biology. 206 (3), 187-201 (2005).
  10. Floch, V., et al. Cationic phosphonolipids as non viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells. Blood Cells, Molecules and Diseases. 23 (1), 69-87 (1997).
  11. Lakshmipathy, U., et al. Efficient transfection of embryonic and adult stem cells. Stem Cells. 22 (4), 531-543 (2004).
  12. Siemen, H., et al. Nucleofection of human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (4), 378-383 (2005).
  13. Zhang, X., Godbey, W. T. Viral vectors for gene delivery in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4), 515-534 (2006).
  14. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  15. Gropp, M., et al. Stable genetic modification of human embryonic stem cells by lentiviral vectors. Molecular Therapy. 7 (2), 281-287 (2003).
  16. Tan, E., Chin, C. S. H., Lim, Z. F. S., Ng, S. K. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 796991 (2021).
  17. Merten, O. W., Hebben, M., Bovolenta, C. Production of lentiviral vectors. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 3, 16017 (2016).
  18. Lungwitz, U., Breunig, M., Blunk, T., Göpferich, A. Polyethylenimine-based nonviral gene delivery systems. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 60 (2), 247-266 (2005).
  19. Parween, S., et al. Higher O-GlcNAc levels are associated with defects in progenitor proliferation and premature neuronal differentiation during in-vitro human embryonic cortical neurogenesis. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 415 (2017).
  20. Weissinger, F., et al. Gene transfer in purified human hematopoietic peripheral-blood stem cells by means of electroporation without prestimulation. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 141 (2), 138-149 (2003).
  21. Cui, Y., et al. Targeting transgene expression to antigen-presenting cells derived from lentivirus-transduced engrafting human hematopoietic stem/progenitor cells. Blood. 99 (2), 399-408 (2002).
  22. Yu, X., et al. Lentiviral vectors with two independent internal promoters transfer high-level expression of multiple transgenes to human hematopoietic stem-progenitor cells. Molecular Therapy. 7 (6), 827-838 (2003).
  23. Sweeney, N. P., Vink, C. A. The impact of lentiviral vector genome size and producer cell genomic to gag-pol mRNA ratios on packaging efficiency and titre. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 21, 574-584 (2021).

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Biologie numéro 183 Lentivirus shRNA CSEh NPC polyéthylénimine cellules HEK293T
Administration par médiation lentivirale d’ARNs aux CSEh et aux PNJ à l’aide de polyéthylénimine polymère cationique à faible coût (PEI)
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Sheikh, M. A., Ansari, S. A.… More

Sheikh, M. A., Ansari, S. A. Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI). J. Vis. Exp. (183), e63953, doi:10.3791/63953 (2022).

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