Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ייצור ואפיון של ננו-מטריצת בסיס יאנוס שכבה אחר שכבה לקידום התחדשות הסחוס

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההרכבה של פיגומי ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) שכבה אחר שכבה על ידי הוספת ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) ברצף. ה-JBNm היה מפוברק ומאופיין; בנוסף, הוא הפגין פעילות ביולוגית מצוינת, ועודד תפקודי תאים כגון הידבקות, שגשוג והתמיינות.

Abstract

פיגומים ביולוגיים שונים פותחו כדי להנחות הידבקות ושגשוג של תאים בתקווה לקדם פונקציות ספציפיות לשימושים במבחנה וב-in vivo . התוספת של גורמי גדילה לתוך פיגומים ביו-חומריים אלה נעשית בדרך כלל כדי לספק סביבת תרבית תאים אופטימלית, המתווכת את התמיינות התא ואת הפונקציות הבאות שלה. עם זאת, גורמי הגדילה בפיגום ביו-חומרי קונבנציונלי מתוכננים בדרך כלל להשתחרר עם ההשתלה, מה שעלול לגרום לתופעות לוואי לא מכוונות על הרקמות או התאים הסובבים אותם. כאן, ננו-מטריצת הבסיס של Janus בהשראת הדנ"א (JBNm) השיגה בהצלחה מיקרו-סביבה מקומית ביותר עם מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמות סחוס בנות קיימא. JBNms מורכבים בעצמם מננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מטרילין-3, וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1) באמצעות ביו-אפיניות. ה-JBNm הורכב ביחס TGF-β1:matrilin-3:JBNt של 1:4:10, שכן זה היה היחס שנקבע שבו הרכבה נכונה למבנה שכבה אחר שכבה יכולה להתרחש. ראשית, הפתרון TGF-β1 נוסף לפתרון matrilin-3. לאחר מכן, תערובת זו היתה pipetted מספר פעמים כדי להבטיח הומוגניות מספקת לפני תוספת של פתרון JBNt. זה יצר את JBNm שכבה אחר שכבה, לאחר פיפטינג מספר פעמים שוב. מגוון ניסויים נערכו כדי לאפיין את מבנה JBNm שכבה אחר שכבה, JBNts לבדו, מטרילין-3 לבדו ו-TGF-β1 לבדו. היווצרות JBNm נחקרה עם ספקטרום קליטת UV-Vis, ומבנה ה- JBNm נצפה במיקרוסקופ אלקטרונים (TEM). כאשר פיגומי JBNm החדשניים שכבה אחר שכבה נוצרים בקנה מידה מולקולרי, ניתן היה לצפות ב- JBNm המסומן בצבע פלואורסצנטי. ה- TGF-β1 מוגבל בתוך השכבה הפנימית של ה- JBNm הניתן להזרקה, מה שיכול למנוע שחרור של גורמי גדילה לאזורים הסמוכים, לקדם כונדרוגנזה מקומית ולקדם מיקרו-סביבה אנטי-היפרטרופית.

Introduction

פיגומים בהנדסת רקמות ממלאים תפקיד חיוני במתן תמיכה מבנית לחיבור תאים ולהתפתחות רקמות לאחר מכן1. בדרך כלל, מבני רקמה קונבנציונליים ללא פיגומים מסתמכים על סביבת תרבית התאים ומוסיפים גורמי גדילה כדי לתווך התמיינות תאים. יתר על כן, תוספת זו של מולקולות ביו-אקטיביות לפיגומים היא לעתים קרובות הגישה המועדפת בהנחיית התמיינות תאים ותפקודם 2,3. פיגומים מסוימים יכולים לחקות את המיקרו-סביבה הביוכימית של רקמות מקומיות באופן עצמאי, בעוד שאחרים יכולים להשפיע ישירות על תפקודי התאים באמצעות גורמי גדילה. עם זאת, חוקרים נתקלים לעתים קרובות באתגרים בבחירת פיגומים שיכולים להשפיע לטובה על הידבקות התאים, גדילתם והתמיינותם, תוך מתן תמיכה מבנית ויציבות אופטימלית לאורך תקופה ארוכהשל 4,5. המולקולות הביו-אקטיביות קשורות לעתים קרובות באופן רופף לפיגום, מה שמוביל לשחרור מהיר של חלבונים אלה בעת ההשתלה, וכתוצאה מכך לשחרורן במקומות לא רצויים. זה מגיע לשיאו בתופעות לוואי על רקמות או תאים שלא הותקפו בכוונה 6,7.

פיגומים עשויים בדרך כלל מחומרים פולימריים. ננו-מטריצת בסיס יאנוס (JBNm) היא פלטפורמת פיגומים ביומימטיים שנוצרה בשיטה חדשנית שכבה אחר שכבה לבניית רקמת סחוסבת קיימא 8. ננו-צינוריות חדשניות אלה בהשראת דנ"א נקראו ננו-צינוריות בסיס יאנוס (JBNts), מכיוון שהן מחקות כראוי את המבנה ואת הכימיה של פני השטח של קולגן המצוי במטריצה החוץ-תאית (ECM). עם תוספת של מולקולות ביו-אקטיביות, כגון מטרילין-3 וגורם גדילה מתמיר בטא-1 (TGF-β1), ה-JBNm יכול ליצור מיקרו-סביבה אופטימלית שיכולה לעורר את תפקוד התאים והרקמות הרצויים9.

JBNts הם ננו-צינוריות חדשניות שמקורן בגרסאות סינתטיות של הנוקלאובסיס אדנין והתימין. ה- JBNts נוצרים באמצעות הרכבה עצמית10; שישה נוקלאו בסיסים סינתטיים נקשרים ליצירת טבעת, וטבעות אלה עוברות אינטראקציות ערימה π-π ליצירת ננו-צינורית באורך 200-300 מיקרומטרבאורך 11. ננו-צינוריות אלה דומות מבחינה מבנית לחלבוני קולגן; על ידי חיקוי היבט של מיקרו-סביבה של סחוס מקומי, הוכח כי JBNts מספקים אתר התקשרות חיובי עבור כונדרוציטים ותאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs)11,12,13,14. מכיוון שהננו-צינוריות עוברות הרכבה עצמית ואינן דורשות כל סוג של יוזם (כגון אור UV), הן מראות פוטנציאל מלהיב כפיגום הניתן להזרקה עבור אזורי פגם שקשה להגיע אליהם15.

מטרילין-3 הוא חלבון מטריצה חוץ-תאית מבנית המצוי בסחוס. חלבון זה ממלא תפקיד משמעותי בכונדרוגנזה ובתפקוד סחוס תקין16,17. לאחרונה, הוא נכלל בפיגומים ביו-חומריים, המעודדים כונדרוגנזה ללא היפרטרופיה 9,18,19. על ידי הכללת חלבון זה ב-JBNm, תאי הסחוס נמשכים לפיגום המכיל רכיבים דומים לאלה של המיקרו-סביבה המקורית שלו. בנוסף, הוכח כי מטרילין-3 נחוץ לאיתות תקין של TGF-β1 בתוך כונדרוציטים20. גורמי גדילה מתפקדים כמולקולות איתות, וגורמים לצמיחה ספציפית של תא או רקמה מסוימים. לכן, כדי להשיג התחדשות סחוס אופטימלית, matrilin-3 ו- TGF-β1 הם מרכיבים חיוניים בתוך JBNm. הוספת TGF-β1 לפיגום שכבה אחר שכבה יכולה לקדם עוד יותר את התחדשות הסחוס במבנה הרקמה. TGF-β1 הוא גורם גדילה המשמש לעידוד תהליך הריפוי של פגמים אוסטאוכונדרליים, המעודד התפשטות כונדרוציטים ו-hMSC והתמיינות21,22. לפיכך, TGF-β1 ממלא תפקיד מפתח בהתחדשות הסחוס JBNm (J/T/M JBNm)23, ומעודד צמיחה נכונה במיוחד כאשר הוא מקומי בתוך שכבות JBNm.

כאמור, גורמי גדילה מורכבים בדרך כלל על החלק החיצוני של פיגומים ללא שיטות התאגדות ספציפיות. כאן, עם הננו-ארכיטקטורה המתוכננת במדויק של הביו-חומרים, פותח ה-JBNm למיקוד ספציפי של תאים ורקמות מיועדים. ה-JBNm מורכב מ-TGF-β1 המודבק על משטחי JBNt בשכבה הפנימית ומטרילין-3 המודבק על משטחי JBNt בשכבה החיצונית24,25. השילוב של TGF-β1 בשכבה הפנימית של מבנה שכבה אחר שכבה מאפשר מיקרו-סביבה מקומית מאוד לאורך סיבי JBNm, ויוצר מבנה רקמה הומאוסטטי עם שחרור איטי בהרבה של החלבון12. יכולת ההזרקה של ה-JBNm הופכת אותו למבנה רקמת סחוס אידיאלי עבור יישומים ביו-חומריים עתידיים שונים26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. סינתזה של JBNts

  1. הכן את מונומר JBNt תוך שימוש בשיטות שפורסמו בעבר, הכוללות סינתזה של מגוון תרכובות12.
  2. נקה מונומר JBNt גולמי לאחר שהוא מסונתז עם כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) באמצעות עמודה בפאזה הפוכה. השתמש בממס A: 100% מים, ממס B: 100% אצטוניטריל, וממס C: תמיסת מים HCl עם pH = 1. השתמש בקצב זרימה של 3 מ"ל/דקה. אסוף את הפסגה הגדולה ביותר שהושגה ב- HPLC ב- 7.2 דקות.

2. ייצור עבור JBNt/Matn1/TGF-β1 (וידאו 1)

הערה: סרטון 1 מראה כי JBNm הוא מוצק הניתן להזרקה שנוצר בסביבה פיזיולוגית (תמיסת מים, ללא אור UV, ללא תוספים כימיים וללא חימום), שגם הוא בהשראה ביולוגית.

  1. יש להוסיף 8 μL של 1 מ"ג/מ"ל TGF-β1 המושהה ב-H 2 O עד 32 μL של 1 מ"ג/מ"ל מטרילין-3 מושהה ב-H2O. Pipette כדי להבטיח ערבוב תקין של חלבונים אלה.
  2. הוסף 80 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts המרחפים ב-H2O לתמיסת TGF-β1/matrilin-3. פיפטה שוב ושוב כדי להבטיח מיזוג נכון. נוכחות של floccules לבן ניתן לראות מיד לאחר תוספת של JBNts, המציין את היווצרות של JBNm (וידאו 1).

3. תצפית על דגימות עם ספיגה אולטרה סגולה גלויה (UV-Vis)

הערה: ספקטרום ספיגת UV-Vis נחקר כדי לאפיין את ההרכבה של JBNm. מדידה זו נותחה לארבע קטגוריות: JBNts בלבד, מטרילין-3 לבדו, TGF-β1 לבדו, ו- JBNm המלא שכבה אחר שכבה, המורכב מכל שלושת החלקים. כל הריכוזים ההתחלתיים מושעים ב-H2O.

  1. עבור קבוצת JBNt, הוסף 5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-50 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 90.9 מיקרוגרם/מ"ל.
  2. עבור קבוצת המטרילין-3, הוסף 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 15 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 7.3 מיקרוגרם/מ"ל.
  3. עבור קבוצת TGF-β1, הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ל-45 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 1.8 מיקרוגרם/מ"ל.
  4. עבור קבוצת JBNm, הוסף 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 10 μL של 10 מיקרוגרם/mL TGF-Β1. תסיסה כדי להבטיח ערבוב נכון, ולאחר מכן להוסיף 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNts לתמיסה, pipetting שוב ושוב לערבב את הדגימה.
  5. באמצעות ספקטרופוטומטר, מדוד את ספקטרום הקליטה של כל קבוצה.

4. מדידת פוטנציאל זטה של דגימות

הערה: פוטנציאל הזטה נותח כדי לחזות טוב יותר כיצד JBNm יתקשר עם רקמת in vivo . נמדדו שלוש קבוצות: מטרילין-3 בלבד, מטרלין-3 עם TGF-β1, ו-JBNm מלא שכבה אחר שכבה.

  1. עבור קבוצת המטרילין-3, יש להוסיף 160 μL של 10 מ"ג/מ"ל מטרילין-3 עד 640 μL של H2O כדי ליצור תמיסה של 800 μL.
  2. עבור תרכובת המטרילין-3/TGF-β1, הוסף 160 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1. פיפטה שוב ושוב כדי להבטיח הומוגניות נכונה. לאחר מכן, הוסף אותו ל- 600 μL של H2O וכתוצאה מכך תמיסת 800 μL.
  3. עבור קבוצת JBNm, הוסף 160 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1. פיפטה מספר פעמים כדי לערבב את החלבונים. לאחר מכן, הוסיפו 20 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתמיסה ופיפטה כדי להבטיח הומוגניות. לבסוף, הוסף את פתרון JBNm ל- 580 μL של H2O כדי לייצר תמיסה של 800 μL.
  4. מדוד את ערכי פוטנציאל הזטה עבור שלוש הקבוצות.

5. הכנת ננו-מטריצת JBNt/מטרילין-3 למיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM)

הערה: אפיון TEM מתבצע כדי לאפיין את המורפולוגיה של JBNts ו- JBNm.

  1. הכנס שתי רשתות למנקה פלזמה כדי לנקות כראוי את הרשתות לפני הכתם השלילי של JBNts ו- JBNm על פי הפרוטוקולים שפורסמו ופרוטוקולי היצרן12.
  2. צור תמיסת JBNt של 200 מיקרוגרם/מ"ל על-ידי ערבוב של 10 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts עם 40 μL של מים מזוקקים.
  3. יש לערבב 30 μL של 100 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עם 20 μL של 100 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ופיפטה מספר פעמים. הוסיפו 10 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתערובת המטרילין-3/TGF-β1 כדי להכין את דגימת JBNm. שוב, פיפטה שוב ושוב.
  4. הוסף 3 μL של תמיסת JBNt (200 מיקרוגרם / מ"ל) ו -3 μL של פתרון JBNm על רשתות נפרדות, והשאר אותם למשך 2 דקות.
  5. יש לשטוף כל רשת עם 100 μL של תמיסת אורניל אצטט (0.5%). השתמשו בניירות סינון כדי להסיר את התמיסה העודפת ולאפשר לרשתות להתייבש באוויר.
  6. להפעיל מיקרוסקופ אלקטרונים שידור כדי לצפות כראוי ולאפיין את הדגימות, כפי שפורסם קודםלכן 11,12.

6. מדידת ספקטרום ספיגה של חלבונים בעלי תווית פלואורסצנטית

הערה: המבנה של JBNm מאומת על ידי התבוננות במבנים של JBNm עם אנליזה ספקטרלית של בליעה.

  1. תייג את ה- TGF-β1 באמצעות ערכת תיוג חלבונים בהתאם להוראות היצרן. הוסף 20 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל עם התווית TGF-β1 עד 25 μL של H2O כדי ליצור פתרון בדיקה של 8.9 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. תייג את המטרילין-3 באמצעות ערכת תיוג נפרדת. הוסף 20 μL של 80 מיקרוגרם / מ"ל עם התווית מטרילין-3 עד 25 μL של H2O כדי ליצור פתרון בדיקה של 36 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: תיוג הצבע הפלואורסצנטי של TGF-β1 הביא לריכוז סופי של 20 מיקרוגרם/מ"ל, בעוד שהתיוג של המטרילין-3 הביא לריכוז סופי של 80 מיקרוגרם/מ"ל.
  3. יש לערבב 20 μL של 80 מיקרוגרם/מ"ל עם תווית מטרילין-3 עם 20 μL של 20 מיקרוגרם/מ"ל עם תווית TGF-β1 ו-5 μL של H2O, והתוצאה היא תרכובת TGF-β1/matrilin-3 המסומנת. פיפטה את התערובת מספר פעמים כדי לערבב.
  4. הוסף 5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNts ל 40 μL של H2O, וכתוצאה מכך פתרון 111 מיקרוגרם / מ"ל.
  5. הוסף 20 μL של 20 מיקרוגרם / מ"ל שכותרתו TGF-β1 עד 20 μL של 80 מיקרוגרם / מ"ל המסומנים מטרילין-3 ופיפטה מספר פעמים. הוסיפו 5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתמיסת TGF-β1/ matrilin-3 המסומנת, ופיפט שוב ושוב כדי לערבב כראוי את התרכובת.
    הערה: הריכוזים הסופיים של JBNt, שכותרתו TGF-β1, ודגימות מטרילין-3 שסומנו היו 111 מיקרוגרם/מ"ל, 8.9 מיקרוגרם/מ"ל ו-36 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה.
  6. העבר כל קבוצת דגימה (כלומר, מסומנת כ- TGF-β1 (שלב 6.1), מסומנת כמטרילין-3 (שלב 6.2), מסומנת כ- TGF-β1/matrilin-3 (שלב 6.3), JBNts (שלב 6.4), JBNm (שלב 6.5)) לבאר משלה של צלחת שחורה של 384 בארות.
  7. טען את הלוח השחור בעל 384 הבארות לתוך קורא מיקרו-לוחות רב-מצבי ובצע מדידות באורכי גל עירור של 488 ננומטר ו-555 ננומטר בהתאם לפרוטוקול היצרן.

7. בדיקת פונקציה ביולוגית במבחנה

  1. בדיקת הידבקות תאים על תאי כיסוי מצופים מראש
    1. הכינו שני משקפי כיסוי עם חמש קבוצות של דגימות, שכן כיסוי אחד משמש לכל סוג תא.
    2. הוסף 1.25 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-198.75 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסה של 6.25 מיקרוגרם/מ"ל.
    3. הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל מטרילין-3 עד 190 μL של מים מזוקקים, וכתוצאה מכך 0.5 מיקרוגרם / mLsolution.
    4. הוסף 2.5 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל TGF-β1 ל 197.5 מיקרוגרם / מ"ל מים מזוקקים, וכתוצאה מכך 0.125 מיקרוגרם / mLsolution.
    5. עבור קבוצת JBNm, הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 2.5 μL של 10 מיקרוגרם/mLTGF-β1 ופיפטה שוב ושוב. הוסף 1.25 μL של JBNts עם ריכוז של 1 מ"ג / מ"ל את תמיסת התערובת ואת פיפטה. לבסוף, הוסף 186.25 μL של מים מזוקקים כדי לגרום לתמיסת JBNm של 200 μL.
      1. עבור קבוצת הביקורת, יש להשתמש ב-200 μL של מים מזוקקים.
    6. הוסף כל קבוצת דגימה לתוך באר משלהם של כיסוי מס '1.5 קאמרית. הכניסו את הכיסוי למקפיא של -80°C למשך שעה אחת, ולאחר מכן הקפיא-יבש אותו בעזרת מכשיר ליופילייזר.
    7. זרעו תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSCs) ותאי כונדרוציטים אנושיים (10,000 תאים לבאר) לתוך כל באר של משקפי כיסוי חדריים מוכנים.
    8. הדגירה של שני משקפי הכיסוי במשך 4 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאפו את מדיום תרבית התאים ושטפו פעמיים עם PBS.
    9. לתקן תאים עם 4% paraformaldehyde במשך 5 דקות, ולאחר מכן להסיר ולשטוף דגימות עם PBS. שטפו את הדגימה פעם נוספת כדי להסיר לחלוטין את הפרפורמלדהיד של 4%.
    10. לדגום תאים עם 100 μL של 0.1% Triton-X במשך 10 דקות ולשטוף עם PBS. יש להוסיף 100 μL של 0.165 μM רודמין-פלואידין לכל באר. המתן 30 דקות ולאחר מכן לשטוף עם PBS שוב.
    11. הוסיפו 0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI לכל באר כדי להכתים את הגרעינים. המתן 5 דקות ושטוף את הבארות עם PBS פעמיים.
    12. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי ספקטרלי כדי לצפות במורפולוגיה של התא וללכוד תמונות פלואורסצנטיות.
    13. יתר על כן, לנתח את מספר התא ואת המורפולוגיה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה. פתח את התוכנה וטען את התמונות. הוסף סרגל קנה מידה וכייל את התוכנה. ספירת מספר התאים באזור נתון עבור כל דגימה. לאחר מכן, השתמש בכלי המדידה כדי לאסוף נתונים על מורפולוגיה של תאים עבור כל דגימה.
  2. התפשטות תאים
    1. הכינו שלוש צלחות 96 בארות שלא טופלו, והוסיפו חמש קבוצות של דגימות לכל אחת מהן.
      1. עבור קבוצת JBNt, יש להוסיף 3.75 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-596.25 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסת JBNt של 600 μL עם ריכוז של 6.25 מיקרוגרם/מ"ל.
      2. עבור קבוצת TGF-β1, הוסף 7.5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ל-592.5 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסת בדיקה של 0.125 מיקרוגרם/מ"ל.
      3. עבור קבוצת המטרילין-3, יש להוסיף 30 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 570 μL של מים מזוקקים, והתוצאה היא תמיסת בדיקה של 0.5 מיקרוגרם/מ"ל.
      4. עבור קבוצת JBNm, ערבבו 7.5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 עם 30 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 ופיפטה מספר פעמים, ולאחר מכן הוסיפו 3.75 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts לתמיסה.
      5. דלל תמיסת JBNm עם 558.75 μL של מים מזוקקים כדי להשיג את הריכוזים הסופיים של 6.25 מיקרוגרם/מ"ל, 0.125 מיקרוגרם/מ"ל ו-0.5 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה, עבור דגימות JBNt, TGF-β1 ומטרילין-3.
      6. עבור קבוצת הביקורת, יש להשתמש ב-600 μL של מים מזוקקים.
    2. חלק כל קבוצת דגימה לשש בארות (דגימת 100 μL לכל באר).
    3. מניחים את שלוש הצלחות המכילות את כל הדגימות לתוך מקפיא של -80 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ולאחר מכן מייבשים בהקפאה עם מכשיר ליופיליזציה.
    4. זרעו hMSCs על הצלחות האלה, שכל אחד מהם מקבל תרחיף תאים של 100 μL (לכל באר) המכיל 5,000 תאים. דגירה של שלוש הצלחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך יום אחד, 3 ימים או 5 ימים ב-5% CO2.
    5. הוסיפו 10 μL של תמיסת CCK-8 לכל באר עם התאים ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים נוספות.
    6. מדוד את ערכי הספיגה של כל באר עם קוראי מיקרו-פלטות מרובי מצבים במהירות של 450 ננומטר.
    7. זרעו שיפוע ידוע של hMSCs על צלחת של 96 בארות ודגרו במשך 4 שעות. השתמש במבחן CCK-8 כדי למדוד את ערכי הקליטה של מספר התאים הידוע וליצור עקומה סטנדרטית.
    8. חשב את התפשטות התאים באמצעות עקומת הספיגה הסטנדרטית.
  3. בדיקת יציבות
    הערה: ערכת ELISA ממוקדת TGF-β1 אנושית שימשה לקביעת אחוז השחרור של TGF-β1 מה- JBNm בהידרוג'ל אגרוז.
    1. הכינו 2% אגרוז על ידי הוספת 400 מ"ג אבקת אגרוז ל-20 מ"ל של PBS וחימום שלה עד 100 מעלות צלזיוס כדי להמיס לחלוטין את אבקת האגרוז.
    2. מכינים את ה-JBNm בתוך הידרוג'ל אגרוז מקורר 2%.
      1. שלב 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1, 40 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3, 5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts, ו-195 μL של PBS. מערבבים תמיסה זו עם 250 μL של 2% agarose, יצירת הידרוג'ל JBNm.
    3. הוסף 500 μL של PBS, תוך שימוש בו כפתרון שחרור, והבטח לשנות אותו כל 3 ימים. שמור כל פתרון ששוחרר, ותן לדגימה לשבת במשך 15 יום.
    4. השתמש בערכת ELISA כדי לבדוק כל אחד מפתרונות השחרור שנתפסו, על ידי ביצוע הוראות היצרן.
      הערה: על-ידי הפחתת כמות ה- TGF-β1 המשתחררת ב- PBS מערך הטעינה התיאורטי של 100%, ניתן לקבוע את הכמות הנותרת של TGF-β1.
  4. ניתוח התמיינות תאים עם PCR26.
    1. הכן שבע קבוצות של דגימות כאשר כל דגימה מכילה 20 μL של תרחיף תאים (4 x 104 תאים ), 30 μL של התמיסה הספציפית (או PBS, בהתאם לקבוצת הדגימה), ו 50 μL של 2 wt % agarose.
      1. עבור קבוצת TGF-β1, הוסף 5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ל-25 μL של PBS, והתוצאה היא תמיסה של 1.6 מיקרוגרם/מ"ל.
      2. עבור קבוצת המטרילין-3, הוסף 20 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 10 μL של PBS, והתוצאה היא תמיסה של 6.7 מיקרוגרם/מ"ל.
      3. עבור קבוצת JBNt, הוסף 2.5 μL של 1 מ"ג/מ"ל JBNts ל-27.5 μL של PBS, והתוצאה היא תמיסת 83.3 מיקרוגרם/מ"ל.
      4. עבור קבוצת J/T/M JBNm, הוסף 10 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל מטרילין-3 עד 5 μL של 10 מיקרוגרם/מ"ל TGF-β1 ופיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התמיסה. לאחר מכן, להוסיף 2.5 μL של 1 מ"ג / מ"ל JBNts פיפטה שוב. לבסוף, לדלל עם 2.5 μL של PBS.
      5. עבור כל קבוצת ביקורת, השתמש ב- 30 μL של PBS כמדגם.
    2. הוסף 0.5 מ"ל של מדיום תרבית תאים לכל באר, תוך הקפדה להחליף אותו כל 3 ימים.
      1. עבור קבוצת הביקורת החיובית, השתמש במדיום כונדרוגני hMSC זמין מסחרית המכיל תוספת TGF-β1. תוספת זו של TGF-β1 שווה לכמות בשתי הקבוצות TGF-β1 ו-J/T/M JBNm.
      2. עבור אחת מקבוצות הביקורת השליליות, השתמש במדיום כונדרוגני hMSC מסחרי שאינו מכיל TGF-β1. עבור קבוצת הביקורת השלילית האחרת, השתמשו בתרבית תאי DMEM המכיל 10% סרום בקר עוברי (FBS).
      3. עבור כל קבוצה אחרת, השתמש בתרבית תאים כונדרוגנית hMSC מסחרית ללא TGF-β1.
    3. תרכזו את הדגימות במשך 15 יום.
    4. חלץ את הרנ"א של הדגימות ובצע PCR כדי לחקור את ההתמיינות של הדגימות כפי שתואר קודםלכן 26.
  5. בדיקה חיסונית לבדיקת ביטוי קולגן מסוג X
    1. הכן שבע דגימות מבוססות אגרוז באותו אופן כמו התמיינות התאים עם סעיף שיטת PCR (שלב 7.4).
    2. תרכזו את הדגימות במשך 15 יום.
    3. לתקן את הדגימות עם 4% פורמלדהיד במשך יום אחד, להשרות 30% סוכרוז תמיסת לילה, ולאחר מכן להקפיא לילה ב -80 מעלות צלזיוס עם חנקן נוזלי. תקן את הדגימות באמצעות ריאגנט תרכובת טמפרטורת החיתוך האופטימלית (OCT), תערובת של גליקולים מסיסים במים ושרפים, בטמפרטורה של -10 מעלות צלזיוס.
    4. הפעל מיקרוטום cryostat כדי לקבל חלקים קפואים בעובי 20 מיקרומטר של כל דגימה.
    5. יש להכתים כל מקטע בנוגדן אנטי-קולגן X עם דילול של 1:800 ונוגדן משני לתיוג פלואורסצנטי המדולל ב-PBS, על פי פרוטוקולי היצרן.
    6. התבונן בכל קטע עם מיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות עירור של 488 ננומטר והגדלה של 40x על העינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעקבות הפרוטוקול, JBNts סונתזו בהצלחה ואופיינו בספיגת UV-Vis ו- TEM. ה- JBNm הוא פיגום מוצק הניתן להזרקה העובר תהליך ביומימטי מהיר. לאחר ש-JBNts נוספו לתערובת של תמיסת TGF-β1/matrilin-3 בסביבה פיזיולוגית, נוצר פיגום רשת לבן מוצק המעיד על הרכבה מוצלחת של JBNm, כפי שניתן לראות באיור 1. הדבר הודגם בשיטות האפיון.

בתנאים פיזיולוגיים, מטרילין-3 טעון שלילית בגלל הנקודה האיזואלקטרית27 שלו (איור 2A). לאחר הוספת תמיסת TGF-β1 לתמיסת מטרילין-3, פוטנציאל הזטה של תרכובת TGF-β1/matrilin-3 עלה לערך כמעט נייטרלי, מה שמצביע על כך ששני החלבונים היו קשורים באמצעות אינטראקציות מטען. כפי שניתן לראות באיור 2A, פוטנציאל הזטה של JBNm הוא הגבוה ביותר מבין שלוש הקבוצות הודות ל-JBNts, שכן הנקודה האיזואלקטרית של שרשרת הצד של ליזין היא בסביבות 9.74 בסביבה פיזיולוגית. העלייה בערכי פוטנציאל הזטה של ה- JBNm מצביעה על הרכבה מוצלחת של מבנה השכבה אחר שכבה שלו.

ספקטרום ספיגת UV-Vis (איור 2B) מבהיר את היווצרות המבנה הפנימי ההיררכי שכבה אחר שכבה של JBNm. הטבעות הארומטיות של שרשראות הצד של ליזין ושל JBNts תרמו לשתי פסגות הספיגה ב-220 ננומטר ו-280 ננומטר, בהתאמה. הירידה בערך הספיגה נצפתה לאחר הוספת TGF-β1, מה שמעיד על כך שמתרחשת קשירה בין TGF-β1 ל- JBNts. לאחר הוספת JBNts למטרלין-3, נצפתה ירידה ברורה יותר בעוצמת הקליטה של הפסגות, מה שמצביע שוב על קשירה מוצלחת בין מטרילין-3 ל- JBNts. באופן דומה, לאחר הוספת JBNts לתערובת של TGF-β1/matrilin-3, נוצר ה-JBNm, ושיאי הספיגה פחתו בעוצמתם. שיא הקליטה של JBNm קרוב יותר לקו המטרילין-3/JBNts מאשר לקו TGF-β1/JBNts, מה שמצביע על כך שה-JBNts מעדיפים להיקשר למטרילין-3, ויוצרים מבנה חיצוני שכבה אחר שכבה עם מטרילין-3 בעוד ש-TGF-β1 שוכן בשכבה הפנימית. TEM משמש לאפיון המורפולוגיה של JBNts ו-JBNm (איור 2C). לאחר שילוב עם חלבונים, צרורות עבים של JBNm נצפו יוצרים מבנה פיגומים.

מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אישרה את קיומו של מבנה שכבה אחר שכבה (איור 3A) והדגימה את החתך של ה-JBNm. לאחר תיוג TGF-β1 ומטרילין-3, נצפה כי המטרילין הפלואורסצנטי האדום -3 עוטף את צרורות JBNt, ויוצר את השכבה החיצונית של JBNm. באיור 3B, ה-TGF-β1 הירוק-פלואורסצנטי יצר שכבה פנימית, מה שתרם ליכולת לאחסן גורמי גדילה ולאפשר לוקליזציה של TGF-β1. איור 3C מציג את תהליך העברת אנרגיית התהודה הפלואורסצנטית (FRET) בין החלבונים המסומנים בצבע פלואורסצנטי כפי שהם מאופיינים בספקטרום פלואורסצנטי, עם שיאי פליטה של 520 ננומטר ו-570 ננומטר עבור קבוצות TGF-β1 ומטרלין-3 המסומנות,בהתאמה 28. לאחר הוספת JBNts על פי הפרוטוקול, נוצר מבנה שכבה אחר שכבה; פסגות נצפו הן ב-520 ננומטר והן ב-570 ננומטר עבור קבוצת JBNm, מה שמעיד על קשירה והרכבה מוצלחת של החלבונים וה-JBNts.

בנוסף, נבדקה ההשפעה של JBNm על הידבקות hMSCs והתפשטות תאים. כפי שניתן לראות באיור 4, נקבעה צפיפות ההידבקות של התאים של ה-JBNm המצופה על פני השטח של משקפי הכיסוי. ה-JBNm הראה hMSCs מקובצים לאורך עצמו (איור 4A), בעוד שפחות תאים דבקו ב-JBNts. עם זאת, עבור הקבוצות האחרות, hMSCs חולקו באופן שווה ללא יישור בהשוואה לקבוצת JBNm. יישור התאים, כמו גם גודל התאים ב-JBNm, הראו ש-JBNts מילאו תפקיד בהידבקות התאים, בעוד שהחלבונים ב-JBNm הגדילו את הזיקה של הידבקות התאים (איור 4B,C).

לאחר יום 1 של תרבית תאים עם JBNm, JBNts, מטרילין-3 בלבד, TGF-β1 בלבד ובקרה שלילית, קבוצות JBNm ו- TGF-β1 הראו שגשוג תאים משמעותי בהשוואה לקבוצות האחרות. כאשר משך הזמן של תרבית התאים הוגדל ל-3 ו-5 ימים, קבוצות JBNm ו-TGF-β1 הדגימו התפשטות תאים מוגברת עוד יותר, כפי שניתן לראות באיור 5. מחקר תפקודי ארוך טווח בוצע כדי לקבוע את ההבחנה של hMSCs עם JBNm וללא JBNm (בקרה שלילית). לאחר 15 יום, נצפה כתם כחול אלקסיאני משופר, המעיד על כונדרוגנזה של hMSCs הגדלים לצד JBNm26. לפיכך, התאים העדיפו את ה- JBNts של ה- JBNm. סביר להניח שהדבר נבע מהמבנה המחקה את הדנ"א שלו ומיכולתו להיות מפורק ליחידות של מולקולות קטנות, שהאחרונה שבהן יכולה להיות מופעלת על ידי pH נמוך או פעילות אנזימטית מספקת (כגון ספיגה על ידי תאים)14,29.

וידאו 1: הקלטת וידאו של הרכבת JBNm. הקלטה זו מתארת את היווצרותם של JBNts, מטרילין-3 ו- TGF-β1 לתוך JBNm. נתון זה שונה מ- Zhou et al. (2021)26. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Figure 1
איור 1: המחשה סכמטית של המבנה הכימי של JBNts, של JBNm של J/T/M ושל היכולת הכונדרוגנית של JBNm של J/T/M. (A) המבנה הכימי של ה-JBNts, המדגיש את היווצרותם ממונומר לטבעת רוזטה ל-JBNt. (B) הרכיבים המרכיבים את J/T/M JBNm, כמו גם האופן שבו הם מורכבים לתוך JBNm. (ג ) סכמטי של גידול תאי גזע מזנכימליים אנושיים על JBNm J/T/M. נתון זה שונה מ- Zhou et al. (2021)26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: אפיון מהותי של JBNm J/T/M. (A) ספקטרום פוטנציאל זטה של מטרילין-3 לבדו, תרכובת TGF-β1/מטרילין-3, ו-J/T/M JBNm. (B) ספקטרום ספיגת UV-Vis של JBNts בלבד, מטרילין-3 לבדו, TGF-β1 לבדו, תרכובת מטרילין-3/JBNts, תרכובת TGF-β1/JBNts ו-J/T/M JBNm. (ג ) תמונות של JBNts בלבד ושל J/T/M JBNm המתקבלות ממיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM). נתון זה שונה מ- Zhou et al. (2021)26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: הדמיה קונפוקלית פלואורסצנטית וספקטרום פלואורסצנטי של J/T/M JBNm. (A) תמונה קונפוקלית תלת-ממדית של J/T/M JBNm, עם מטרילין-3 עם תווית פלואורסצנטית אדומה ו-TGF-β1 עם תווית פלואורסצנטית ירוקה. (B) תמונות קונפוקליות דו-ממדיות של J/T/M JBNm, עם מטרילין-3 עם תווית פלואורסצנטית אדומה, TGF-β1 עם תווית פלואורסצנטית ירוקה, וגרסה ממוזגת. (C) ספקטרום פלואורסצנטי של תרכובות שונות כדי לאפיין את תהליך FRET בין החלבונים המסומנים. נתון זה שונה מ- Zhou et al. (2021)26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח של תרבית תאי גזע מזנכימליים אנושיים (hMSC). (A) תמונות מיקרוסקופיה אופטית של hMSCs עם TGF-β1, מטרילין-3 ו-JBNts, בתרבית על ג'ל אגרוז. (B) תמונות מיקרוסקופיה קונפוקלית של hMSCs בתרבית על זכוכית הכיסוי הקאמרית המצופה במגוון רכיבי JBNm. (C) גרף של מספר התאים המודבקים למילימטר מרובע עבור כל קבוצה. קווי שגיאה מציינים סטיות תקן. (D) גרף של אורך הציר הראשי של התא ב-μm לכל קבוצה. קווי שגיאה מציינים סטיות תקן. הערה: N ≥ 3, *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001, ****P< 0.0001 (בהשוואה לבקרות שליליות, NC). נתון זה שונה מ- Zhou et al. (2021)26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 5
איור 5: השוואה בין מספרי תאים עבור קבוצות שונות בין הימים 1, 3 ו-5. סטטיסטיקה של מספר תאים של hMSCs לאחר שגודלו בתרבית עם חומרים שונים בימים 1, 3 ו-5. קווי שגיאה מציינים סטיות תקן. הערה: N = 6, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. נתון זה שונה מ- Zhou et al. (2021)26. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מטרת מחקר זה היא לפתח פלטפורמת פיגומים ביומימטיים, JBNm, כדי להתגבר על המגבלות של מבני רקמה קונבנציונליים המסתמכים על סביבות תרביות תאים כדי לתווך התמיינות תאים. ה- JBNm הוא פיגום מבנה שכבה אחר שכבה לבניית רקמת סחוס בת קיימא. העיצוב החדשני מבוסס על ננו-חומרים חדשניים בהשראת דנ"א, ה-JBNts. ה-JBNm, המורכב מ-JBNts30, TGF-β1 ו-matrilin-3, מורכב בטכניקה חדשנית של שכבה אחר שכבה, שבה ההרכבה העצמית של הפיגום נשלטה ברמה המולקולרית. ההרכבה של JBNm נצפתה ואופיינה במדידת פוטנציאל זטה, ספיגת UV-Vis, TEM ואנליזה ספקטרלית פלואורסצנטית.

ספקטרום ה-UV-Vis באיור 2B (שלב 3) הדגים את היווצרות הפנים ההיררכי שכבה אחר שכבה של ה-JBNm. ניתן להבחין בהבדל בפסגות הספיגה עקב הבדל באהדה המחייבת. אינטראקציות משמעותיות יותר מתרחשות בין JBNts למטרילין-3 מאשר בין JBNts ל-TGF-β1, מה שמצביע על כך ש-JBNts מחקים חלבוני קולגן במונחים של המורפולוגיה הסיבית שלהם וכימיה של פני השטח של ליזין. טכניקה זו נחוצה כדי לבחון את הקשירה של JBNts למטרילין-3 ולא ל- TGF-β1, מה שמאפשר את הכמוסות של TGF-β1 ולכן מספק שחרור איטי של TGF-β1 לתוך הרקמה הסובבת. השלב הקריטי ביותר בהתפתחות ה-JBNm הוא שילוב של חלבונים עם ה-JBNts. יש להוסיף את TGF-β1 ומטרילין-3 לפני הוספת JBNts כדי לבחון את ההשפעה המלאה של תופעת FRET בין המטרילין-3 המסומן לבין TGF-β1. המגבלה של טכניקה זו נובעת מרצף הוספה שגוי של חלבונים וננו-צינוריות, וכתוצאה מכך מדידות מגוונות. זהו צעד חשוב להיווצרות JBNm למחקרים עתידיים, ולכן ייושם על ייצורים ומחקרים עתידיים של JBNm.

מטרילין-3 הוא חלבון שלילי ביותר, ואילו TGF-β1 הוא חלבון נייטרלי מעט, כפי שניתן לראות באיור 2A. הפרש המטען נצפה כדי לקבוע את הקישור של חלבונים אלה. מהמצב הטעון שלילית של מטרילין-3, פוטנציאל הזטה עלה לערך כמעט נייטרלי לאחר תוספת של TGF-β1 (איור 2A). שלב זה חשוב כדי לקבוע את השכבה הפנימית הראשונה של הפיגום הביומימטי, ולהצביע על כך שהשילוב של שני החלבונים הוא באמצעות אינטראקציה מטען. לאחר התוספת של JBNts, שהיא השלב השני של ייצור JBNm, פוטנציאל הזטה של JBNm נמדד ב~10 ± 5 mV (איור 2A). מכיוון ש- JBNts חיוביים מאוד, המטען של JBNm נצפה גדל כצפוי. קביעת מטענים עם פוטנציאל זטה חשובה לפיכך כדי לבחון את היווצרות JBNm צעד אחר צעד באמצעות אינטראקציות מטען. בדומה לספקטרוסקופיית UV-Vis, רצף התוספת חשוב בשלב זה, וסדר הוספה שגוי עלול לגרום למדידות מגוונות. באופן דומה, חשוב לבצע פיפטה של התערובת למעלה ולמטה לפני המדידה.

לאחר מכן, TGF-β1 ו matrilin-3 מסומנים כך שניתן לראות את הפיתוח של JBNm עם מיקרוסקופיה קונפוקלית וניתוח ספקטרלי פלואורסצנטי עם קוראי microplate multimode. הדגימות התרגשו מלייזר של 488 ננומטר והראו שיאי פליטה ב-520 ננומטר ו-570 ננומטר (איור 3). לא נצפתה פסגת פליטה עבור JBNts בלבד מכיוון שהם אינם מסומנים. FRET התרחש מתורם TGF-β1 למקבל המטרילין-3, ובכך הפחית את שיא הפליטה ב-520 ננומטר והגדיל את שיא הפליטה ב-570 ננומטר; שני הרכיבים נמצאים במרחק של 10 ננומטר זה מזה, מה שמאפשר לתופעת FRET להתרחש. לכן, ההרכבה של JBNm מבוססת על תהליכים מרחביים (כלומר, מרחק פיזי) יחד עם אינטראקציות מטען. השלב הקריטי ביותר בפיתוח JBNm הוא רצף התוספת; יש להוסיף TGF-β1 ומטרילין-3 לפני הוספת JBNts כדי לבחון את ההשפעה המלאה של תופעת FRET. הגדלה של לפחות 40x על העינית נדרשת כדי לצפות ב- JBNm הפלואורסצנטי. המגבלה של טכניקה זו היא כי JBNts אינם מסומנים, ולכן, לא ניתן לראות עם מיקרוסקופיה confocal. עם זאת, ניתן ליישם את טכניקת תיוג החלבון כדי לתייג JBNt עם כמה שינויים עבור יישומים עתידיים.

JBNm יכול לסייע לתפקודי תאים, כגון הידבקות תאים והתפשטות תאים. במחקר זה, hMSCs עברו תרבית (החל מ-5,000 תאים) על חומרים שונים (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilin-3 ובקרות שליליות ללא תוספים) כדי להשוות את מספרי התאים לאחר הדגירה במשך 1, 3 ו-5 ימים באמצעות פתרון CCK-8, בהתאם לפרוטוקולים המדויקים של היצרן כדי לקבוע את התפשטות התאים. JBNm, במיוחד בנוכחות TGF-β1, ו- TGF-β1 לבדו הראו שגשוג תאים משמעותי בהשוואה לשלוש הקבוצות האחרות. JBNts מחקים קולגן ב-ECM מבחינה מורפולוגית, בעוד שמטרילין-3 הוא חלבון ספציפי לסחוס, מה שגורם לפעילות מוגברת של התפשטות תאים לאחר דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 ו-5 ימים (איור 5). ה- JBNm הראה פוטנציאל רב לשמש כפיגום הנדסת רקמות ביומימטי הניתן להזרקה כדי להתגבר על המגבלות של מבני תאים מסורתיים ליישומים עתידיים שונים כביו-חומרים29,31. JBNm מחקה את ECM הסחוס מבחינה מורפולוגית, מספק אתרי הידבקות ומאפשר שחרור של גורמים דיפרנציאטיביים פרו-כונדרוגניים למיקרו-סביבה, כגון TGF-β132,33. היכולת של ה-JBNm לשלב TGF-β1 בשכבה הפנימית של הפיגום מונעת ממנו לדלוף לאזורים לא רצויים, ובכך לשפר את יעילות הפיגום (איור 4 ואיור 5). נראה כי תאי hMSCs רבים מתקבצים לאורך פיגום JBNm, בעוד שהתאים מפוזרים בדלילות בקבוצות מטרילין-3, TGF-β1 וקבוצות ביקורת שליליות (איור 4). המורפולוגיה של התאים נצפתה גם היא, מה שמעיד על זיקה מצוינת למשטחי JBNm. ביו-חומרים אלה, שתוכננו במדויק, מונעים שחרור מהיר של מולקולות ביו-אקטיביות משולבות בסביבת תרבית התאים ומשפרים את הקיימות העצמית של מבני הרקמה בתוך המטריצה34. מגבלה של טכניקה זו היא שמספרי התאים ההתחלתיים הם קריטיים לקביעת התפשטות התאים. מספר תאים התחלתי של 5,000 נמצא האופטימלי ביותר למחקר זה. יש צורך גם בעקומה סטנדרטית כדי לקבוע את מספר התאים על ידי התוויית מספר ידוע של תאים ומדידתם בקורא המיקרו-פלטות הרב-ממדי. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת בעתיד כשיטה סטנדרטית לקביעת התפשטות תאים בכל המחקרים הקשורים לפיגומי JBNm.

hMSCs תורבתו בכדורי אגרוז תלת-ממדיים עם ובלי JBNm כדי לקבוע את מחקר התפקוד ארוך הטווח במשך 15 יום. לאחר 15 יום, סך הרנ"א הופק מה-hMSCs בכדורי האגרוז, והכיל בקרה חיובית (גלולות סופקו עם TGF-β1 טרי בכל פעם שהמדיום השתנה), JBNm, JBNts, מטרילין-3, TGF-β1, וללא תוספים. qPCR בזמן אמת בוצע לצורך ניתוח גנים, בדיקה של סמני התמיינות כונדרוגניים, אגרקן (ACAN) וסמן היפרטרופיה מסוג קולגן מסוג X (COL X). ביטוי ACAN בקבוצת JBNm עלה באופן משמעותי בהשוואה לקבוצות אחרות, והדגים כי JBNm מקדם התמיינות כונדרוגנית של תאי גזע באופן משמעותי תוך עיכוב COL X. בינתיים, השליטה החיובית שיפרה את הכונדרוגנזה, כפי שצוין בעלייה ב- ACAN, וגם היפרטרופיה של התא הממוין26. מגבלה נוספת של מחקר זה היא שמיצוי הרנ"א הוא מהתאים המוטבעים בהידרוג'ל. סך הרנ"א המתקבל בפרוטוקול זה, אם כן, היה נמוך בריכוז ובטוהר. כדי להתגבר על מגבלה זו, דגימות נוספות עברו תרבית והוצאו כדי להשיג את הריכוז והטוהר האופטימליים לשלב הבא, qPCR בזמן אמת. בעוד ש- qPCR חשוב למחקר, שינוי קל של טכניקה זו נחוץ למחקרים עתידיים כדי להבטיח מיצוי דגימה יעיל מבלי להקריב מספר רב של דגימות.

בדיקת יציבות בוצעה עם ערכת TGF-β1 ELISA אנושית כדי לבדוק את שחרור החלבון מההידרוג'ל JBNm. במחקר זה, TGF-β1 צפוי להיות עטוף ב-J/T/M JBNm, ולכן אין לראות שחרור TGF-β1 (כלומר, ערך ההעמסה התיאורטית הוא 100%). מגבלה של שלב זה היא שכל TGF-β1 הוא הניח להיות עטוף לתוך פיגום שכבה אחר שכבה JBNm. לאחר 15 יום, פתרונות המשתחררים מההידרוג'ל נאספים ונבדקים עם הערכה, בהתאם לפרוטוקולים של היצרן. לאחר מכן, הסכום של TGF-β1 חושב על ידי הפחתת כמות TGF-β1 ששוחרר ב- PBS מערך הטעינה התיאורטי. מאחר ש-TGF-β1 היה עטוף בשכבה הפנימית של ה-JBNm, השחרור האיטי של החלבון היה צפוי. המחקר הראה כי TGF-β1 ממוקם בתוך פיגום JBNm ואינו משתחרר במהירות לאזורים הסמוכים26.

מבנה חדשני זה של רקמת סחוס JBNm שכבה אחר שכבה התממש על ידי הרכבה עצמית מאורגנת ומבוקרת ברמה המולקולרית. ה- TGF-β1 מוגבל בשכבה הפנימית של סיבי המטריצה, מונע את זליגתו למקומות לא רצויים, ומקדם כונדרוגנזה מקומית בו זמנית. בנוסף, matrilin-3 הוא מקומי בשכבה החיצונית של סיבי המטריצה, יצירת מיקרו-סביבה אנטי היפרטרופית35. הוכח כי JBNts לא רק משמשים כעמוד שדרה של פיגומים מבניים, אלא גם משפרים את העיגון וההידבקות של תאי גזע כדי למקם תאים לאורך סיבי המטריצה30,36. באשר לעבודה עתידית, עיצוב שכבה אחר שכבה של פיגום מבוסס JBNt יותאם אישית ליישומים ברקמות שונות37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד"ר יופנג צ'ן הוא מייסד שותף של Eascra Biotech, Inc. ו- NanoDe Therapeutics, Inc. .

Acknowledgments

עבודה זו נתמכת על ידי מענקי NIH 7R01AR072027 ו- 7R03AR069383, פרס הקריירה של NSF 1905785, NSF 2025362 ואוניברסיטת קונטיקט. עבודה זו נתמכת בחלקה גם על ידי מענק NIH S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 185
ייצור ואפיון של ננו-מטריצת בסיס יאנוס שכבה אחר שכבה לקידום התחדשות הסחוס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter