Summary
该协议描述了通过依次添加Janus碱基纳米管（JBNts），基质素-3和转化生长因子β-1（TGF-β1）来逐层组装Janus碱基纳米基（JBNm）支架。JBNm 是制造和表征的;此外，它显示出优异的生物活性，促进细胞功能，如粘附、增殖和分化。
Abstract
已经开发了各种生物材料支架来引导细胞粘附和增殖，以期促进 体外 和 体内 使用的特定功能。将生长因子添加到这些生物材料支架中通常是为了提供最佳的细胞培养环境，介导细胞分化及其后续功能。然而，传统生物材料支架中的生长因子通常设计为在植入时释放，这可能导致对周围组织或细胞的意外副作用。在这里，受DNA启发的Janus碱基纳米基质（JBNm）成功地实现了高度本地化的微环境，具有逐层结构，用于自我可持续的软骨组织构建。JBNms由Janus基纳米管（JBNts），基质素-3和通过生物亲和力 转化 生长因子β-1（TGF-β1）自组装而成。JBNm以1：4：10的TGF-β1：matrilin-3：JBNt比例组装，因为这是可以正确组装到逐层结构中的确定比例。首先，将TGF-β1溶液加入到基质素-3溶液中。然后，将该混合物移液数次以确保在加入JBNt溶液之前具有足够的均匀性。这形成了逐层JBNm，在再次移液几次后。通过多种实验表征了JBNm结构、单独JBNts、单独使用基质素-3和单独表征TGF-β1。利用紫外-可见吸收光谱研究了JBNm的形成，并用透射电子显微镜（TEM）观察了JBNm的结构。由于创新的逐层JBNm支架是在分子尺度上形成的，可以观察到荧光染料标记的JBNm。TGF-β1被限制在可注射的JBNm的内层内，可以阻止生长因子向周围区域释放，促进局部软骨形成，促进抗肥大的微环境。
Introduction
组织工程中的支架在为细胞附着和随后的组织发育提供结构支持方面起着至关重要的作用1。通常，没有任何支架的常规组织构建体依赖于细胞培养环境和添加的生长因子来介导细胞分化。此外，这种将生物活性分子添加到支架中通常是指导细胞分化和功能的首选方法2，3。一些支架可以独立地模仿天然组织的生化微环境，而另一些支架可以通过生长因子直接影响细胞功能。然而，研究人员在选择可能对细胞粘附、生长和分化产生积极影响的支架时经常遇到挑战，同时在很长一段时间内提供最佳的结构支持和稳定性4，5.生物活性分子通常松散地结合在支架上，导致这些蛋白质在植入时快速释放，导致它们在不需要的位置释放。这最终导致对非故意靶向的组织或细胞的副作用6，7。
脚手架通常由聚合物材料制成。Janus基础纳米基质（JBNm）是一种仿生支架平台，采用新颖的逐层方法创建，用于自我可持续的软骨组织构建8。这些新型DNA启发的纳米管被命名为Janus碱基纳米管（JBNts），因为它们正确地模仿了细胞外基质（ECM）中胶原蛋白的结构和表面化学。通过添加生物活性分子，如马曲林-3和转化生长因子β-1（TGF-β1），JBNm可以创造一个最佳的微环境，然后可以刺激所需的细胞和组织功能9。
JBNts是源自核碱基腺嘌呤和胸腺嘧啶合成版本的新型纳米管。JBNts通过自组装10形成;六个合成核碱基键合形成一个环，这些环经历π π堆积相互作用，形成长度为200-300μm的纳米管11。这些纳米管在结构上类似于胶原蛋白;通过模拟天然软骨微环境的一个方面，JBNts已被证明为软骨细胞和人间充质干细胞（hMSCs）提供了有利的附着位点11，12，13，14。由于纳米管经过自组装并且不需要任何类型的引发剂（例如紫外线），因此它们作为难以到达的缺陷区域的可注射支架显示出令人兴奋的潜力15。
基质蛋白-3是一种在软骨中发现的结构细胞外基质蛋白。这种蛋白质在软骨生成和适当的软骨功能中起重要作用16，17。最近，它已被纳入生物材料支架，促进软骨形成而不肥大9，18，19。通过将这种蛋白质包含在JBNm中，软骨细胞被吸引到含有与其天然微环境相似成分的支架上。此外，已经表明基曲林-3是软骨细胞20内适当的TGF-β1信号传导所必需的。生长因子作为信号分子发挥作用，导致某种细胞或组织的特定生长。因此，为了实现最佳的软骨再生，基质素-3和TGF-β1是JBNm中必不可少的成分。将TGF-β1添加到逐层支架中可以进一步促进组织结构中的软骨再生。TGF-β1是一种生长因子，用于促进骨软骨缺陷的愈合过程，促进软骨细胞和hMSC增殖和分化21，22。因此，TGF-β1在软骨再生JBNm（J/T/M JBNm）23中起关键作用，促进适当的生长，特别是当它位于JBNm层内时。
如前所述，生长因子通常组装在支架的外部，没有特定的掺入方法。在这里，凭借精确设计的生物材料的纳米结构，JBNm被开发用于特定靶向目标细胞和组织。JBNm由粘附在内层JBNt表面上的TGF-β1和粘附在外层24，25的JBNt表面上的基质素-3组成。TGF-β1 掺入逐层结构的内层允许沿 JBNm 纤维的高度局部微环境，从而产生稳态组织结构，蛋白质12 的释放速度要慢得多。JBNm的可注射性使其成为未来各种生物材料应用的理想软骨组织结构26。
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Protocol
1. JBNts的合成
- 利用先前发表的方法制备JBNt单体，涉及多种化合物的合成12。
- 使用反相柱用高效液相色谱（HPLC）合成粗JBNt单体后纯化粗单体。使用溶剂A：100%水，溶剂B：100%乙腈和溶剂C：HCl水溶液，pH = 1。使用3毫升/分钟的流速。在7.2分钟收集HPLC中获得的最大峰。
2. JBNt/matn1/TGF-β1的制造（视频1）
注意： 视频 1 显示 JBNm 是在生理环境（水溶液、无紫外线、无化学添加剂和无加热）中形成的可注射固体，这也是生物启发的。
- 加入 8 μL 悬浮在 H 2 O 中的 1 mg/mL TGF-β1 至 32μL 悬浮在 H2O 中的 1 mg/mL 马嗔素-3 移液器，以确保这些蛋白质的适当混合。
- 将 80 μL 悬浮在 H2O 中的 1 mg/mL JBNts 加入 TGF-β1/马嗔啉-3 溶液中。反复移液以确保正确混合。添加JBNts后可以立即观察到白色絮凝物的存在，表明JBNm的形成（视频1）。
3. 观察紫外可见（UV-Vis）吸收的标本
注意：研究了紫外-可见吸收光谱以表征JBNm的组装。该测量结果针对四类进行了分析：单独的JBNts，单独的matrilin-3，单独的TGF-β1和由所有三个部分组成的完整的逐层JBNm。所有初始浓度悬浮在H2O中。
- 对于 JBNt 组，将 5 μL 的 1 mg/mL JBNt 加入 50 μL 的 H2O 中，制成 90.9 μg/mL 溶液。
- 对于马曲林-3 组，将 40 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 15 μL H2O 中，制成 7.3 μg/mL 溶液。
- 对于 TGF-β1 组，将 10 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入 45 μL 的 H2O 中，制成 1.8 μg/mL 溶液。
- 对于 JBNm 组，将 40 μL 的 10 μg/mL 马嗔啉-3 添加到 10 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 中。搅拌以确保正确混合，然后将 5 μL 1 mg/mL JBNts 加入溶液中，反复移液以混合样品。
- 使用分光光度计，测量每组的吸收光谱。
4. 试样的Zeta电位测量
注意：分析zeta电位以更好地预测JBNm如何与 体内 组织相互作用。测量三组：单独使用马嗔啉-3，含TGF-β1的马嗔啉-3和全层JBNm。
- 对于马曲林-3 组，将 160 μL 10 mg/mL 马嗔啉-3 加入 640 μL H2O 中，制成 800 μL 溶液。
- 对于马嗔啉-3/TGF-β1 化合物，将 160 μL 的 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 40 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 中。反复移液以确保适当的均匀性。然后，将其添加到 600 μL H2O 中，得到 800 μL 溶液。
- 对于 JBNm 组，将 160 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 40 μL 10 μg/mL TGF-β1 中。多次移液以混合蛋白质。然后，向溶液和移液器中加入 20 μL 1 mg/mL JBNt 以确保均匀性。最后，将 JBNm 溶液加入 580 μL H2O 中，以产生 800 μL 溶液。
- 测量三组的 zeta 电位值。
5. 透射电子显微镜（TEM）用JBNt/基质啉-3纳米基质的制备
注意：执行TEM表征是为了表征JBNts和JBNm的形态。
- 根据已发布的协议和制造商的协议，将两个网格插入等离子清洁器，以便在 JBNts 和 JBNm 进行负染色之前正确清洁网格12。
- 通过将 10 μL 1 mg/mL JBNt 与 40 μL 蒸馏水混合，制备 200 μg/mL JBNt 溶液。
- 将 30 μL 100 μg/mL 马腈林-3 与 20 μL 100 μg/mL TGF-β1 混合，并移液数次。向基质素-3/TGF-β1 混合物中加入 10 μL 1 mg/mL JBNts，以制备 JBNm 样品。再次，反复移液。
- 在单独的网格上加入 3 μL JBNt 溶液 （200 μg/mL） 和 3 μL JBNm 溶液，静置 2 分钟。
- 用 100 μL 乙酸铀酰溶液 （0.5%） 冲洗每个网格。使用滤纸去除多余的溶液，让网格风干。
- 操作透射电子显微镜以正确观察和表征样品，如之前发表的11，12所示。
6. 荧光标记蛋白的吸收光谱测量
注意：JBNm的结构是通过吸收光谱分析观察JBNm的结构来验证的。
- 按照制造商的说明使用蛋白质标记试剂盒标记TGF-β1。将 20 μL 标记的 TGF-β1 的 20 μg/mL 加入 25 μL H2O 中，制成 8.9 μg/mL 测试溶液。
- 使用单独的标记试剂盒标记基质素-3。将 20 μL 标记的 80 μg/mL 标记的马曲林-3 加入 25 μL H2O 中，制成 36 μg/mL 测试溶液。
注意：TGF-β1的荧光染料标记导致最终浓度为20μg/ mL，而matrilin-3的标记导致最终浓度为80μg/ mL。 - 将 20 μL 标记的 80 μg/mL 马嗔啉-3 与 20 μL 标记的 TGF-β1 的 20 μg/mL 和 5 μL H2O 混合，得到标记的 TGF-β1/马嗔啉-3 化合物。将混合物移液几次以混合。
- 将 5 μL 的 1 mg/mL JBNt 加入 40 μL 的 H2O 中，得到 111 μg/mL 的溶液。
- 将 20 μL 标记的 TGF-β1 的 20 μg/mL 加入 20 μL 标记的 80 μg/mL 的马曲林-3 中，并移液数次。向标记的TGF-β1 /马曲林-3溶液中加入5 μL 1 mg/mL JBNts，并重复移液以适当混合化合物。
注意：标记TGF-β1和标记的matrilin-3样品的JBNt的最终浓度分别为111μg/ mL，8.9μg/ mL和36μg/ mL。 - 将每个样品组（即标记的TGF-β1（步骤6.1），标记的基兔素-3（步骤6.2），标记的TGF-β1 / matrilin-3（步骤6.3），JBNts（步骤6.4），JBNm（步骤6.5））转移到自己的黑色384孔板孔中。
- 将黑色 384 孔板装入多模式酶标仪中，并按照制造商的方案在 488 nm 和 555 nm 的激发波长下进行测量。
7. 体外 生物学功能测定
- 预涂盖玻璃室的电池附着力测试
- 准备两个带有五组样品的腔室盖玻片，因为每种细胞类型使用一个盖玻片。
- 将 1.25 μL 的 1 mg/mL JBNts 加入 198.75 μL 蒸馏水中，得到 6.25 μg/mL 的溶液。
- 将 10 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入到 190 μL 蒸馏水中，得到 0.5 μg/mL 溶液。
- 将 2.5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入到 197.5 μg/mL 蒸馏水中，得到 0.125 μg/mL 溶液。
- 对于 JBNm 组，将 10 μL 的 10 μg/mL 马曲林-3 加入 2.5 μL 的 10 μg/mLTGF-β1 中并重复移液。向混合物溶液和移液器中加入 1.25 μL 浓度为 1 mg/mL 的 JBNts。最后，加入 186.25 μL 蒸馏水，得到 200 μL JBNm 溶液。
- 对于对照组，使用 200 μL 蒸馏水。
- 将每个样品组添加到他们自己的1.5号腔室盖玻片孔中。将盖玻片放入-80°C冰箱中1小时，然后用冻干仪器冷冻干燥。
- 将人间充质干细胞（hMSCs）和人软骨细胞（每孔10，000个细胞）接种到制备的腔室盖玻片的每个孔中。
- 将两个盖玻片在37°C培养箱中孵育4小时。然后，吸出细胞培养基并用PBS冲洗两次。
- 用4%多聚甲醛固定细胞5分钟，然后取出并用PBS冲洗样品。再次冲洗样品以完全去除4%的多聚甲醛。
- 用 100 μL 的 0.1% Triton-X 孵育细胞 10 分钟，并用 PBS 洗涤。向每个孔中加入 100 μL 0.165 μM 罗丹明-鬼笔环肽。等待30分钟，然后再次用PBS洗涤。
- 向每个孔中加入 0.1 μg/mL DAPI 以染色细胞核。等待5分钟，然后用PBS冲洗孔两次。
- 使用光谱共聚焦显微镜观察细胞形态并捕获荧光图像。
- 此外，使用图像处理软件分析细胞数量和形态。打开软件并加载图像。添加比例尺并校准软件。计算每个样品在给定区域中的细胞数。然后，使用测量工具收集每个样品的细胞形态数据。
- 细胞增殖
- 准备三个未经处理的96孔板，每个板添加五组样品。
- 对于 JBNt 组，将 3.75 μL 1 mg/mL JBNts 加入 596.25 μL 蒸馏水中，得到浓度为 6.25 μg/mL 的 600 μL JBNt 溶液。
- 对于 TGF-β1 组，将 7.5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入到 592.5 μL 蒸馏水中，得到 0.125 μg/mL 的测试溶液。
- 对于马兔林-3 组，将 30 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 570 μL 蒸馏水中，得到 0.5 μg/mL 测试溶液。
- 对于 JBNm 组，将 7.5 μL 10 μg/mL TGF-β1 与 30 μL 10 μg/mL 马曲林-3 混合并移液数次，然后向溶液中加入 3.75 μL 1 mg/mL JBNts。
- 用 558.75 μL 蒸馏水稀释 JBNm 溶液，以获得 JBNt、TGF-β1 和马先啉-3 样品的最终浓度分别为 6.25 μg/mL、0.125 μg/mL 和 0.5 μg/mL。
- 对于对照组，使用 600 μL 蒸馏水。
- 将每个样品组分成六个孔（每孔 100 μL 样品）。
- 将含有所有样品的三个板放入-80°C冰箱中1小时，然后用冻干仪器冷冻干燥。
- 将hMSCs接种到这些平板上，每个平板接受含有5，000个细胞的100μL细胞悬液（每孔）。将三个板在37°C下在5%CO2下孵育1天，3天或5天。
- 向每个孔中加入10μLCCK-8溶液，并在37°C下再孵育2小时。
- 使用多模式酶标仪在450nm处测量每个孔的吸收值。
- 将已知的hMSCs梯度接种到96孔板上并孵育4小时。使用 CCK-8 测定法测量已知数量细胞的吸收值并生成标准曲线。
- 使用吸收标准曲线计算细胞增殖。
- 准备三个未经处理的96孔板，每个板添加五组样品。
- 稳定性试验
注意：使用人TGF-β1靶向ELISA试剂盒来确定琼脂糖水凝胶中JBNm中TGF-β1的释放百分比。- 通过将400mg琼脂糖粉末加入20mL PBS中并加热至100°C以完全溶解琼脂糖粉末来制备2%琼脂糖。
- 在冷却的2%琼脂糖水凝胶内制备JBNm。
- 混合 10 μL 10 μg/mL TGF-β1、40 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3、5 μL 1 mg/mL JBNts 和 195 μL PBS。将此溶液与 250 μL 2% 琼脂糖混合，制成 JBNm 水凝胶。
- 加入 500 μL PBS，将其用作释放溶液，并确保每 3 天更换一次。保留每个释放的溶液，让样品静置 15 天。
- 按照制造商的说明，利用 ELISA 试剂盒测试每个捕获的释放溶液。
注意：通过从100%的理论负载值中减去PBS中释放的TGF-β1量，可以确定TGF-β1的剩余量。
- 用PCR26进行细胞分化分析。
- 制备七组样品，每组样品含有 20 μL 细胞悬液（4 x 104 个细胞）、30 μL 特定溶液（或 PBS，取决于样品组）和 50 μL 2 wt % 琼脂糖。
- 对于 TGF-β1 组，将 5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 加入到 25 μL PBS 中，得到 1.6 μg/mL 溶液。
- 对于马嗔啉-3 组，将 20 μL 10 μg/mL 马嗔啉-3 加入 10 μL PBS 中，得到 6.7 μg/mL 溶液。
- 对于 JBNt 组，将 2.5 μL 的 1 mg/mL JBNt 添加到 27.5 μL PBS 中，得到 83.3 μg/mL 的溶液。
- 对于 J/T/M JBNm 组，将 10 μL 的 10 μg/mL 马曲林-3 加入 5 μL 的 10 μg/mL TGF-β1 中，上下移液以混合溶液。然后，加入 2.5 μL 的 1 mg/mL JBNts 并再次移液。最后，用 2.5 μL PBS 稀释。
- 对于每个对照组，使用 30 μL PBS 作为样品。
- 向每个孔中加入 0.5 mL 细胞培养基，确保每 3 天更换一次。
- 对于阳性对照组，使用含有添加TGF-β1的市售hMSC致软骨培养基。这个额外的TGF-β1等于TGF-β1和J/T/M JBNm组中的量。
- 对于其中一个阴性对照组，使用不含TGF-β1的商用hMSC软骨培养基。对于另一个阴性对照组，使用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM细胞培养基。
- 对于其他每组，使用不含TGF-β1的市售hMSC软骨细胞培养基。
- 培养样品15天。
- 提取样品的RNA并进行PCR以研究样品的分化，如前所述26。
- 制备七组样品，每组样品含有 20 μL 细胞悬液（4 x 104 个细胞）、30 μL 特定溶液（或 PBS，取决于样品组）和 50 μL 2 wt % 琼脂糖。
- X型胶原表达测定的免疫染色
- 以与PCR方法部分的细胞分化相同的方式制备七个琼脂糖样品（步骤7.4）。
- 培养样品15天。
- 用4%甲醛固定样品1天，在30%蔗糖溶液中浸泡过夜，然后用液氮在-80°C冷冻过夜。使用最佳切割温度化合物试剂（OCT），水溶性乙二醇和树脂的混合物，在-10°C下固定样品。
- 操作低温恒温器切片机以获得每个样品的 20 μm 厚的冷冻切片。
- 根据制造商的方案，用1：800稀释度的抗胶原蛋白X抗体和用PBS稀释的荧光标记二抗对每个切片进行染色。
- 用共聚焦显微镜观察每个切片，在目镜上使用488 nm的激发和40倍的放大倍率。
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Representative Results
按照实验方案，成功合成了JBNts，并用紫外-可见吸收和透射电镜进行了表征。JBNm 是一种可注射的固体支架，经过快速仿生过程。在生理环境中将JBNts加入TGF-β1/matrilin-3溶液的混合物中后，形成固体白色网状支架，表明JBNm组装成功，如图 1所示。这在表征方法中得到了证明。
在生理条件下，基曲林-3由于其等电点27 而带负电（图2A）。将TGF-β1溶液加入到基兮啉-3溶液中后，TGF-β1/马嗔啉-3化合物的zeta电位增加到接近中性值，表明两种蛋白质通过电荷相互作用 结合 。 如图2A所示，由于JBNts，JBNm的zeta电位在三组中最高，因为赖氨酸侧链的等电点在生理环境中约为9.74。JBNm的zeta电位值的增加表明其逐层结构的成功组装。
紫外-可见吸收光谱（图2B）阐明了JBNm分层逐层内部结构的形成。赖氨酸侧链和JBNts的芳环分别促成了220 nm和280 nm处的两个吸收峰。加入TGF-β1后观察到吸收值降低，表明TGF-β1与JBNts之间发生结合。在基质蛋白-3中加入JBNts后，观察到峰的吸收强度降低更明显，再次表明马兗啉-3与JBNts成功结合。同样，在TGF-β1/马嗔啉-3的混合物中加入JBNts后，形成了JBNm，吸收峰强度降低。JBNm的吸收峰比TGF-β1/JBNts系更接近母质-3/JBNts系，表明JBNts更倾向于与基质素-3结合，与基质素-3形成逐层外结构，而TGF-β1位于内层。TEM用于表征JBNts和JBNm的形态（图2C）。与蛋白质结合后，观察到JBNm的厚束形成支架结构。
荧光显微镜证实了逐层结构的存在（图3A），并展示了JBNm的横截面。标记TGF-β1和基嗔啉-3后，观察到红色荧光基质素-3包裹JBNt束，形成JBNm的外层。 在图3B中，绿色荧光TGF-β1形成内层，有助于储存生长因子的能力并允许TGF-β1的定位。 图3C 显示了荧光染料标记蛋白之间的荧光共振能量转移（FRET）过程，通过荧光光谱表征，标记的TGF-β1和基质-3基团的发射峰分别为520 nm和570 nm，分别为28。按照协议加入JBNts后，形成逐层结构;JBNm基团在520 nm和570 nm处均观察到峰，表明蛋白质和JBNts成功结合和组装。
此外，还探讨了JBNm对hMSCs粘附和细胞增殖的影响。如图 4所示，测定了涂覆在腔室盖玻片表面上的JBNm的细胞粘附密度。JBNm显示hMSCs沿着自身聚集（图4A），而粘附在JBNts上的细胞较少。然而，对于其他组，与JBNm组相比，hMSCs均匀分布而不对齐。细胞的排列以及JBNm上细胞的大小表明JBNts在细胞粘附中起作用，而JBNm中的蛋白质增加了细胞粘附的亲和力（图4B，C）。
使用JBNm、JBNts、单独使用母质-3、单独使用TGF-β1和阴性对照进行细胞培养第1天后，与其他组相比，JBNm和TGF-β1组显示出显着的细胞增殖。当细胞培养持续时间增加到3天和5天时，JBNm和TGF-β1组表现出更多的细胞增殖，如图 5所示。进行长期功能研究以确定具有JBNm和不使用JBNm（阴性对照）的hMSCs的分化。15 天后，观察到增强的阿尔新蓝色染色，表明 hMSC 的软骨生成与JBNm 26 一起生长。因此，细胞更喜欢JBNm的JBNts。这可能是由于其DNA模拟结构和分解成小分子单元的能力，后者可以通过低pH值或足够的酶活性（例如细胞摄取）触发14，29。
视频1：JBNm组装的视频录制。 这段记录描述了JBNts，matrilin-3和TGF-β1在JBNm中的形成。该数字已修改自周等人（2021）26。 请点击此处下载此视频。
图1：JBNts的化学结构示意图， J/T/M JBNm和J/T/M JBNm的软骨生成能力。 （A）JBNts的化学结构，突出了它们从单体到莲环再到JBNt的形成。 （B）构成J/T/M JBNm的组件，以及它们如何组装成JBNm（C） 在 J/T/M JBNm 上培养人间充质干细胞的示意图。该数字已修改自周等人（2021）26。 请点击此处查看此图的大图。
图2：J/T/M JBNm的材料表征。 （A）单独使用基兔素-3、TGF-β1/基兔啉-3化合物和J/T/M JBNm的Zeta电位光谱。 （B）单独使用JBNts、单独使用母质素-3、单独使用TGF-β1、基质素-3/JBNts化合物、TGF-β1/JBNts化合物和J/T/M JBNm的紫外-可见吸收光谱（C） JBNts的单独图像和从透射电子显微镜（TEM）获得的J/T/M JBNm的图像。该数字已修改自周等人（2021）26。请点击此处查看此图的大图。
图3：J/T/M JBNm的荧光共聚焦成像和荧光光谱。 （A）J/T/M JBNm的3D共聚焦图像，红色荧光标记的MATRILIN-3和绿色荧光标记的TGF-β1。（B）J/T/M JBNm的2D共聚焦图像，带有红色荧光标记的基嗔啉-3，绿色荧光标记的TGF-β1和合并版本。（C）各种化合物的荧光光谱，以表征标记蛋白质之间的FRET过程。该数字已修改自周等人（2021）26。请点击此处查看此图的大图。
图 4：人间充质干细胞 （hMSC ） 培养的分析。 （A） 在琼脂糖凝胶上培养的含有 TGF-β1、基质素-3 和 JBNts 的 hMSC 的光学显微镜图像。（B）在涂有各种JBNm组分的腔室盖玻片上培养的hMSCs的共聚焦显微镜图像。（C）每组每平方毫米粘附的细胞数图。误差线表示标准偏差。（D） 每组细胞长轴长度图（以μm为单位）。误差线表示标准偏差。注：N ≥ 3，*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001，****P< 0.0001（与阴性对照NC相比）。该数字已修改自周等人（2021）26。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：第 1、3 和 5 天之间不同组的细胞数比较。 在第 1、3 和 5 天用不同材料培养后 hMSC 的细胞数统计。误差线表示标准偏差。注：N = 6，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。该数字已修改自周等人（2021）26。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本研究的目标是开发一种仿生支架平台JBNm，以克服依赖细胞培养环境介导细胞分化的传统组织结构的局限性。JBNm 是一种逐层结构支架，用于自我可持续的软骨组织结构。创新设计基于新型DNA启发的纳米材料JBNts。JBNm由JBNts30，TGF-β1和matrilin-3组成，通过一种新的逐层技术组装，其中支架的自组装在分子水平上得到控制。通过zeta电位测量、紫外-可见吸收、TEM和荧光光谱分析对JBNm的组装进行了观察和表征。
图2B（步骤3）中的紫外-可见光谱显示了JBNm分层内部逐层的形成。由于结合亲和力的差异，可以观察到吸光度峰的差异。JBNts和基质素-3之间比JBNts和TGF-β1之间发生更主要的相互作用，这表明JBNts在纤维形态和赖氨酸表面化学方面模仿胶原蛋白。该技术对于观察JBNts与基质蛋白-3而不是TGF-β1的结合是必要的，允许TGF-β1的包封，因此TGF-β1缓慢释放到周围组织中。JBNm开发中最关键的一步是蛋白质与JBNts的结合.在添加JBNts之前必须添加TGF-β1和matrilin-3，以观察标记的matrilin-3和TGF-β1之间FRET现象的全部影响。该技术的局限性源于蛋白质和纳米管的加成序列不正确，导致测量结果不同。这是未来研究形成JBNm的重要一步，因此将应用于未来的JBNm制造和研究。
Matrilin-3是一种高度阴性的蛋白质，而TGF-β1是一种微中性的蛋白质，如图 2A所示。观察电荷差异以确定这些蛋白质的结合。从基嗔啉-3的带负电状态，加入TGF-β1后，zeta电位增加到接近中性的值（图2A）。此步骤对于确定仿生支架的第一内层很重要，并指示两种蛋白质的组合是通过电荷相互作用。添加JBNts（这是JBNm制造的第二步）后，在~10±5 mV下测量JBNm的zeta电位（图2A）。由于JBNt是高度正的，因此观察到JBNm的电荷按预期增加。因此，确定具有zeta电位的电荷对于通过电荷相互作用 逐步 观察JBNm的形成非常重要。与紫外-可见光谱类似，添加顺序在此步骤中很重要，不正确的添加顺序可能会导致测量结果不同。同样，在测量之前上下移液混合物也很重要。
接下来，标记TGF-β1和基嗉-3，以便可以通过共聚焦显微镜观察JBNm的发展，并使用多模式酶标仪进行荧光光谱分析。样品用488 nm激光激发，并在520 nm和570 nm处显示发射峰（图3）。单独使用JBNts没有观察到发射峰值，因为它们没有标记。FRET从TGF-β1供体到马嗔啉-3受体，从而降低520 nm处的发射峰，增加570 nm处的发射峰;两个分量相距10 nm，允许发生FRET现象。因此，JBNm的组装基于空间（即物理距离）过程以及电荷相互作用。JBNm开发中最关键的一步是加法序列;在添加JBNts之前必须添加TGF-β1和matrilin-3，以观察FRET现象的全部影响。观察荧光 JBNm 需要目镜至少放大 40 倍。该技术的局限性在于JBNts没有标记，因此无法用共聚焦显微镜观察到。然而，蛋白质标记技术可以应用于标记JBNt，并为未来的应用进行一些修改。
JBNm可以帮助细胞功能，如细胞粘附和细胞增殖。在这项研究中，将hMSCs在不同材料（JBNm，JBNts，TGF-β1，matrilin-3和无添加剂的阴性对照）上培养（从5，000个细胞开始），以比较使用CCK-8溶液孵育1，3和5天的细胞数量，按照确切的制造商方案确定细胞增殖。JBNm，特别是在TGF-β1存在下，与其他三组相比，单独TGF-β1显示出显着的细胞增殖。JBNts在形态上模仿ECM中的胶原蛋白，而基质蛋白-3是一种软骨特异性蛋白，导致在37°C孵育3天和5天后细胞增殖活性增加（图5）。JBNm已显示出作为可注射和仿生组织工程支架的巨大潜力，以克服传统细胞构建体作为生物材料的各种未来应用的局限性29，31。JBNm在形态上模仿软骨ECM，提供粘附位点并允许将促软骨分化因子释放到微环境中，例如TGF-β132，33。JBNm 将 TGF-β1 掺入脚手架内层的能力可防止其泄漏到不需要的区域，从而提高支架的有效性（图 4 和图 5）。观察到许多hMSCs沿着JBNm支架聚集，而细胞稀疏分布在基质素-3，TGF-β1和阴性对照组中（图4）。还观察到细胞的形态，表明与JBNm表面具有出色的亲和力。这些精确设计的生物材料可防止掺入的生物活性分子快速释放到细胞培养环境中，并提高基质内组织结构的自我可持续性34。该技术的局限性在于起始细胞数对于确定细胞增殖至关重要。发现起始细胞数为5，000是本研究的最佳选择。还需要标准曲线来确定细胞数，方法是绘制已知数量的细胞并在多模式酶标仪中测量它们。该技术可以在未来作为标准化方法应用于确定与JBNm支架相关的所有研究中的细胞增殖。
在有和没有JBNm的3D琼脂糖沉淀中培养hMSCs以确定15天的长期功能研究。15 天后，从琼脂糖沉淀中的 hMSC 中提取总 RNA，含有阳性对照（每次更换培养基时向沉淀提供新鲜的 TGF-β1）、JBNm、JBNts、基质素-3、TGF-β1，无添加剂。进行实时qPCR进行基因分析，检测软骨分化标志物，Aggrecan（ACAN）和肥大标志物X型胶原蛋白（COL X）。与其他组相比，JBNm组的ACAN表达显著增加，表明JBNm在抑制COL X的同时显着促进干细胞成软骨分化。同时，阳性对照增强了软骨生成，如ACAN的增加所指出的那样，以及分化细胞26的肥大。这项研究的另一个局限性是RNA提取来自嵌入水凝胶中的细胞。因此，在该协议中获得的总RNA浓度和纯度都很低。为了克服这一限制，对更多的样品进行了培养和提取，以获得下一步实时qPCR的最佳浓度和纯度。虽然qPCR对研究很重要，但对该技术的微小修改对于未来的研究是必要的，以确保在不牺牲大量样品的情况下进行有效的样品提取。
使用人TGF-β1 ELISA试剂盒进行稳定性测试，以测试JBNm水凝胶中蛋白质的释放。在这项研究中，TGF-β1有望被包封在J/T/M JBNm中，因此不应观察到TGF-β1释放（即理论负载值为100%）。此步骤的局限性是假定所有TGF-β1都封装在JBNm逐层支架中。15天后，按照制造商的方案收集从水凝胶释放的溶液并用试剂盒进行测试。然后，通过从理论负载值中减去PBS中释放的TGF-β1量来计算TGF-β1的量。由于TGF-β1被封装在JBNm的内层，因此预计蛋白质的缓慢释放。研究表明，TGF-β1位于JBNm支架内，不会迅速释放到周围区域26。
这种创新的逐层JBNm软骨组织结构是通过分子水平上高度组织和可控的自组装实现的。TGF-β1被限制在基质纤维的内层，防止其泄漏到不需要的位置，同时促进局部软骨形成。此外，基质素-3定位于基质纤维的外层，形成抗肥大的微环境35。JBNts已被证明不仅可以作为结构支架骨架，还可以增强干细胞的锚定和粘附，以定位沿基质纤维的细胞30，36。至于未来的工作，基于JBNt的支架的逐层设计将针对各种组织中的应用进行定制37，38，39。
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Disclosures
陈宇鹏博士是Eascra Biotech， Inc.和NanoDe Therapeutics， Inc.的联合创始人。
Acknowledgments
这项工作得到了NIH资助7R01AR072027和7R03AR069383，NSF职业奖1905785，NSF 2025362和康涅狄格大学的支持。这项工作也得到了NIH拨款S10OD016435的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 % Normal Goat Serum | Thermo Fisher | 50062Z | Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining. |
| 24-well plate | Corning | 07-200-740 | 24-well plate used for comparative cell culture. |
| 384-Well Black Untreated Plate | Thermo Fisher | 262260 | 384-well plate used for absorption measurements. |
| 8-well chambered coverglass | Thermo Fisher | 155409PK | 8-well coverglass used for comparative cell culture. |
| 96-well flat bottom | Corning | 07-200-91 | 96-well plate used for comparative cell culture. |
| 96-Well Plate non- treated | Thermo Fisher | 260895 | 96-well plate used for comparative cell culture and analysis. |
| Agarose Gel | Sigma-Aldrich | A9539 | Hydrogel used for cell culture. |
| Agarose Gel | Sigma Aldrich | A9539 | Hydrogel used as an environment for cell culture. |
| Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit | Thermo Fisher | A30006 (488) and A30007 (555) | Fluorescent dye used to label proteins. |
| Anti-Collagen X Antibody | Thermo Fisher | 41-9771-82 | Antibody used to stain collagen-X. |
| Bio-Rad PCR Machine | Bio-Rad | Equipment used to perform PCR on samples. | |
| C28/I2 Chondrocyte Cell Line | Cells used to analyze proliferative abilities of various samples. | ||
| Cell Counting Kit 8 | Milipore Sigma | 96992 | Cell proliferation assay. |
| Cell Profiler | Broad Institute | Software used to analyze cell images. | |
| Cryostat Microtome | Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy. | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions. |
| Disposable cuvettes | FISHER Scientific | 14-955-128 | Container used for spectrophotometry. |
| DMEM Cell Culture Medium | Thermo Fisher | 10566032 | Media used to support cellular growth. |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO | A4766801 | Serum used in cell culture medium to support cell growth. |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher | 00-4958-02 | Solution used to mount slides for immunostaining. |
| Formaldehyde | Compound used to fix samples prior to microtoming. | ||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Thermo Fisher | A16110 | Antibody used for protein staining. |
| Human Mesenchymal Stem Cells | LONZA | PT-2501 | Cells used to analyze differentiative abilities of various samples. |
| Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium | LONZA | PT-3003 | Cell medium used to promote chondrogenic differentiation. |
| ImageJ | National Institutes of Health | Image analysis software used in conjunction with microscopy. | |
| itaq Universal SYBR Green One-Step Kit | BioRad | 1725150 | Kit used for PCR. |
| Janus-base nanotubes (JBNts) | Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool. | ||
| LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope | Tecnai | Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample. | |
| MATLAB | MathWorks | Statistical software used for modeling and data analysis. | |
| Matrilin-3 | Fisher Scientific | 3017MN050 | Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes. |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Fisher | Equipment used to measure absorption values of a sample. | |
| Nikon A1R Spectral Confocal Microscope | Nikon | A1R HD25 | Confocal microscope used to analyze samples. |
| Number 1.5 Chamber Coverglass | Thermo Fisher | 152250 | Environment for sterile cell culture and imaging. |
| Optimal Cutting Temperature Compound Reagent | Compound used to embed cells prior to microtoming. | ||
| Paraformaldehyde | Thermo Scientific | AAJ19943K2 | Compound used to fix cells. |
| PDC-32G Plasma Cleaner | Harrick Plasma | Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy. | |
| penicillin-streptomycin | GIBCO | 15-140-148 | Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture. |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher | 10010023 | Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation. |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | F-Actin red fluorescent dye. |
| Rneasy Plant Mini Kit | QIAGEN | 74904 | Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction. |
| Sucrose Solution | Solution used to process samples prior to microtoming. | ||
| TGF beta-1 Human ELISA Kit | Invitrogen | BMS249-4 | Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample. |
| TGF-β1 | PEPROTECH | 100-21C | Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation. |
| Triton-X | Invitrogen | HFH10 | Compound used to lyse cells not fixed during staining process. |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher | 15596026 | Reagent used to isolate RNA. |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | Equipment used to measure zeta-potential values of a sample. |
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