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Bioengineering

Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll beschreibt den Aufbau eines Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nanomatrix-Gerüsts (JBNm) durch nacheinander Hinzufügen von Janus-Basis-Nanoröhren (JBNts), Matrilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1). Der JBNm wurde hergestellt und charakterisiert; Darüber hinaus zeigte es eine ausgezeichnete Bioaktivität, die Zellfunktionen wie Adhäsion, Proliferation und Differenzierung fördert.

Abstract

Verschiedene Biomaterial-Scaffolds wurden entwickelt, um die Zelladhäsion und -proliferation zu steuern, in der Hoffnung, spezifische Funktionen für In-vitro - und In-vivo-Anwendungen zu fördern. Die Zugabe von Wachstumsfaktoren in diese Biomaterialgerüste erfolgt im Allgemeinen, um eine optimale Zellkulturumgebung zu schaffen, die die Zelldifferenzierung und ihre nachfolgenden Funktionen vermittelt. Die Wachstumsfaktoren in einem herkömmlichen Biomaterialgerüst sind jedoch typischerweise so konzipiert, dass sie bei der Implantation freigesetzt werden, was zu unbeabsichtigten Nebenwirkungen auf das umgebende Gewebe oder die Zellen führen kann. Hier ist es der DNA-inspirierten Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) gelungen, eine hochlokalisierte Mikroumgebung mit einer Schicht-für-Schicht-Struktur für selbsttragende Knorpelgewebekonstrukte zu erreichen. JBNms sind selbstorganisierend aus Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts), Matrilin-3 und dem transformierenden Wachstumsfaktor beta-1 (TGF-β1) über Bioaffinität. Der JBNm wurde in einem TGF-β1:matrilin-3:JBNt-Verhältnis von 1:4:10 zusammengebaut, da dies das bestimmte Verhältnis war, bei dem eine ordnungsgemäße Montage in die Schicht-für-Schicht-Struktur erfolgen konnte. Zunächst wurde die TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung gegeben. Dann wurde diese Mischung mehrmals pipettiert, um eine ausreichende Homogenität vor der Zugabe der JBNt-Lösung zu gewährleisten. Dieser bildete Schicht für Schicht JBNm, nachdem er erneut mehrfach pipettiert hatte. Eine Vielzahl von Experimenten wurde durchgeführt, um die Schicht-für-Schicht-JBNm-Struktur, JBNts allein, Matilin-3 allein und TGF-β1 allein zu charakterisieren. Die Bildung von JBNm wurde mit UV-Vis-Absorptionsspektren untersucht, und die Struktur des JBNm wurde mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) beobachtet. Da das innovative schichtweise JBNm-Gerüst auf molekularer Ebene gebildet wird, konnte der fluoreszierende Farbstoff JBNm beobachtet werden. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht des injizierbaren JBNm eingeschlossen, was die Freisetzung von Wachstumsfaktoren in die Umgebung verhindern, die lokalisierte Chondrogenese fördern und eine antihypertrophe Mikroumgebung fördern kann.

Introduction

Gerüste im Tissue Engineering spielen eine wichtige Rolle bei der strukturellen Unterstützung der Zellanheftung und der anschließenden Gewebeentwicklung1. Typischerweise verlassen sich konventionelle Gewebekonstrukte ohne Gerüst auf die Zellkulturumgebung und zusätzliche Wachstumsfaktoren, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Darüber hinaus ist diese Zugabe von bioaktiven Molekülen in Gerüste oft der bevorzugte Ansatz zur Steuerung der Zelldifferenzierung und -funktion 2,3. Einige Gerüste können die biochemische Mikroumgebung nativer Gewebe unabhängig voneinander nachahmen, während andere die Zellfunktionen über Wachstumsfaktoren direkt beeinflussen können. Forscher stoßen jedoch häufig auf Herausforderungen bei der Auswahl von Gerüsten, die die Zelladhäsion, das Wachstum und die Differenzierung positiv beeinflussen und gleichzeitig eine optimale strukturelle Unterstützung und Stabilität über einen langen Zeitraum bietenkönnten 4,5. Die bioaktiven Moleküle sind oft lose an das Gerüst gebunden, was zu einer schnellen Freisetzung dieser Proteine bei der Implantation führt, was zu ihrer Freisetzung an unerwünschten Stellen führt. Dies gipfelt in Nebenwirkungen auf Gewebe oder Zellen, die nicht absichtlich gezielt angegriffen wurden 6,7.

Gerüste bestehen typischerweise aus polymeren Materialien. Die Janus-Basis-Nanomatrix (JBNm) ist eine biomimetische Gerüstplattform, die mit einer neuartigen Schicht-für-Schicht-Methode für selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt8 erstellt wurde. Diese neuartigen DNA-inspirierten Nanoröhren wurden Janus-Basis-Nanoröhrchen (JBNts) genannt, da sie die Struktur und Oberflächenchemie von Kollagen in der extrazellulären Matrix (ECM) richtig nachahmen. Durch die Zugabe von bioaktiven Molekülen wie Matilin-3 und Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) kann das JBNm eine optimale Mikroumgebung schaffen, die dann die gewünschte Zell- und Gewebefunktionalität stimulieren kann9.

JBNts sind neuartige Nanoröhrchen, die aus synthetischen Versionen der Nukleobase Adenin und Thymin gewonnen werden. Die JBNts werden durch Selbstorganisation10 gebildet; Sechs synthetische Nukleobasen verbinden sich zu einem Ring, und diese Ringe unterliegen π-π-Stapelwechselwirkungen, um eine Nanoröhre von 200-300 μm Länge11 zu erzeugen. Diese Nanoröhrchen ähneln strukturell Kollagenproteinen; Durch die Nachahmung eines Aspekts der nativen Knorpelmikroumgebung wurde gezeigt, dass JBNts eine günstige Bindungsstelle für Chondrozyten und humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) bieten11,12,13,14. Da die Nanoröhrchen einer Selbstorganisation unterzogen werden und keinerlei Initiator (wie UV-Licht) benötigen, zeigen sie ein aufregendes Potenzial als injizierbares Gerüst für schwer zugängliche Defektbereiche15.

Matrilin-3 ist ein strukturelles extrazelluläres Matrixprotein, das im Knorpel vorkommt. Dieses Protein spielt eine bedeutende Rolle bei der Chondrogenese und der richtigen Knorpelfunktion16,17. Vor kurzem wurde es in Biomaterialgerüste aufgenommen, was die Chondrogenese ohne Hypertrophie fördert 9,18,19. Durch die Aufnahme dieses Proteins in das JBNm werden Knorpelzellen von einem Gerüst angezogen, das ähnliche Komponenten wie seine native Mikroumgebung enthält. Zusätzlich wurde gezeigt, dass Matrilin-3 für die korrekte TGF-β1-Signalisierung innerhalb der Chondrozytenbenötigt wird 20. Wachstumsfaktoren fungieren als Signalmoleküle und verursachen spezifisches Wachstum einer bestimmten Zelle oder eines bestimmten Gewebes. Um eine optimale Knorpelregeneration zu erreichen, sind Matrilin-3 und TGF-β1 wesentliche Bestandteile innerhalb des JBNm. Die Zugabe von TGF-β1 in das schichtweise Gerüst kann die Knorpelregeneration in einem Gewebekonstrukt weiter fördern. TGF-β1 ist ein Wachstumsfaktor, der eingesetzt wird, um den Heilungsprozess von osteochondralen Defekten zu fördern und die Proliferation und Differenzierung von Chondrozyten und hMSC zu fördern21,22. Somit spielt TGF-β1 eine Schlüsselrolle bei der Knorpelregeneration JBNm (J/T/M JBNm)23 und fördert das richtige Wachstum, insbesondere wenn es innerhalb der JBNm-Schichten lokalisiert ist.

Wie bereits erwähnt, werden Wachstumsfaktoren typischerweise auf der Außenseite von Gerüsten ohne spezifische Einbaumethoden montiert. Hier wurde mit der präzise gestalteten Nanoarchitektur der Biomaterialien das JBNm für das spezifische Targeting von beabsichtigten Zellen und Geweben entwickelt. Das JBNm besteht aus TGF-β1, das auf JBNt-Oberflächen in der inneren Schicht und Matrilin-3 auf JBNt-Oberflächen in der äußeren Schicht24,25 haftet. Der Einbau von TGF-β1 in die innere Schicht der Schicht-für-Schicht-Struktur ermöglicht eine stark lokalisierte Mikroumgebung entlang der JBNm-Fasern, wodurch ein homöostatisches Gewebekonstrukt mit einer viel langsameren Freisetzung des Proteins12 entsteht. Die Injektionsfähigkeit des JBNm macht es zu einem idealen Knorpelgewebekonstrukt für verschiedene zukünftige Biomaterialanwendungen26.

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Protocol

1. Synthese von JBNts

  1. Herstellung des JBNt-Monomers unter Verwendung zuvor veröffentlichter Methoden, die die Synthese einer Vielzahl von Verbindungenbeinhalten 12.
  2. Reinigen Sie das rohe JBNt-Monomer, nachdem es mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Umkehrphasensäule synthetisiert wurde. Verwenden Sie Lösungsmittel A: 100% Wasser, Lösungsmittel B: 100% Acetonitril und Lösungsmittel C: HCl-Wasserlösung mit pH = 1. Verwenden Sie eine Durchflussrate von 3 ml/min. Sammeln Sie den größten in der HPLC erhaltenen Peak nach 7,2 min.

2. Fertigung für JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

HINWEIS: Video 1 zeigt, dass der JBNm ein injizierbarer Feststoff ist, der in einer physiologischen Umgebung (Wasserlösung, kein UV-Licht, keine chemischen Zusätze und keine Erwärmung) gebildet wird und auch biologisch inspiriert ist.

  1. 8 μL 1 mg/ml TGF-β1 suspendiert in H2O auf32μL 1 mg/ml Matrilin-3 suspendiert inH2O. Pipette zugeben, um eine ordnungsgemäße Mischung dieser Proteine zu gewährleisten.
  2. 80 μL 1 mg/ml JBNts suspendiert inH2Ozur TGF-β1/Matrilin-3-Lösung zugeben. Pipetten Sie wiederholt, um eine ordnungsgemäße Mischung zu gewährleisten. Das Vorhandensein von weißen Flocken kann unmittelbar nach der Zugabe von JBNts beobachtet werden, was auf die Bildung des JBNm hinweist (Video 1).

3. Beobachtung von Proben mit UV-sichtbarer (UV-Vis) Absorption

HINWEIS: Die UV-Vis-Absorptionsspektren wurden untersucht, um die Assemblierung des JBNm zu charakterisieren. Diese Messung wurde für vier Kategorien analysiert: JBNts allein, Matrilin-3 allein, TGF-β1 allein und das gesamte Schicht-für-Schicht-JBNm, bestehend aus allen drei Teilen. Alle Anfangskonzentrationen sind inH2Osuspendiert.

  1. Für die JBNt-Gruppe werden 5 μL 1 mg/ml JBNts zu 50 μLH2Ohinzugefügt, um eine 90,9 μg/ml Lösung herzustellen.
  2. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 15 μLH2Ogegeben, um eine 7,3 μg/ml Lösung zu erhalten.
  3. Für die TGF-β1-Gruppe werden 10 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 45 μLH2Ogegeben, um eine 1,8 μg/ml Lösung herzustellen.
  4. Für die JBNm-Gruppe addieren Sie 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 10 μL 10 μg/mL TGF-β1. Rühren, um eine ordnungsgemäße Mischung sicherzustellen, und dann 5 μL 1 mg / ml JBNts zur Lösung hinzufügen und wiederholt pipettieren, um die Probe zu mischen.
  5. Messen Sie mit einem Spektralphotometer das Absorptionsspektrum jeder Gruppe.

4. Zetapotentialmessung von Proben

HINWEIS: Das Zeta-Potential wurde analysiert, um besser vorhersagen zu können, wie der JBNm mit in vivo Gewebe interagieren würde. Drei Gruppen wurden gemessen: Matrilin-3 allein, Matilin-3 mit TGF-β1 und das gesamte Schicht-für-Schicht-JBNm.

  1. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 160 μL 10 mg/ml Matrilin-3 zu 640 μLH2Ogegeben, um eine 800 μL Lösung herzustellen.
  2. Für die Matrilin-3/TGF-β1-Verbindung werden 160 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 40 μL 10 μg/ml TGF-β1 hinzugefügt. Pipetten Sie wiederholt, um die richtige Homogenität zu gewährleisten. Dann fügen Sie es zu 600 μLH2Ohinzu, was zu einer 800 μL Lösung führt.
  3. Für die JBNm-Gruppe fügen Sie 160 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 40 μL 10 μg/ml TGF-β1 hinzu. Pipette mehrmals, um die Proteine zu mischen. Dann 20 μL 1 mg/ml JBNts in die Lösung geben und pipetten, um die Homogenität zu gewährleisten. Schließlich wird die JBNm-Lösung zu 580 μLH2Ogegeben, um eine 800 μL-Lösung zu erhalten.
  4. Messen Sie die Zeta-Potentialwerte für die drei Gruppen.

5. Herstellung von JBNt/matrilin-3 Nanomatrix für die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)

HINWEIS: Die TEM-Charakterisierung wird durchgeführt, um die Morphologie von JBNts und JBNm zu charakterisieren.

  1. Führen Sie zwei Gitter in einen Plasmareiniger ein, um die Gitter vor der negativen Färbung der JBNts und JBNm gemäß den veröffentlichten Protokollen und den Protokollen des Herstellers12 ordnungsgemäß zu reinigen.
  2. Man kann eine 200 μg/ml JBNt-Lösung herstellen, indem man 10 μL 1 mg/ml JBNts mit 40 μL destilliertem Wasser mischt.
  3. Mischen Sie 30 μL 100 μg/ml Matrilin-3 mit 20 μL 100 μg/ml TGF-β1 und pipetten Sie mehrmals. Zur Herstellung der JBNm-Probe werden 10 μL 1 mg/ml JBNts in das Matilin-3/TGF-β1-Gemisch gegeben. Wieder wiederholt pipetten.
  4. 3 μL der JBNt-Lösung (200 μg/ml) und 3 μL der JBNm-Lösung auf getrennten Gittern zugeben und 2 min stehen lassen.
  5. Spülen Sie jedes Gitter mit 100 μL Uranylacetatlösung (0,5%). Verwenden Sie Filterpapiere, um die überschüssige Lösung zu entfernen und die Gitter an der Luft trocknen zu lassen.
  6. Bedienen Sie ein Transmissionselektronenmikroskop, um die Proben richtig zu beobachten und zu charakterisieren, wie zuvorveröffentlicht 11,12.

6. Messung von Absorptionsspektren fluoreszenzmarkierter Proteine

HINWEIS: Die Struktur von JBNm wird durch Beobachtung der Strukturen des JBNm mit Absorptionsspektralanalyse verifiziert.

  1. Beschriften Sie den TGF-β1 mit einem Proteinmarkierungskit gemäß den Anweisungen des Herstellers. 20 μL 20 μg/ml markiertes TGF-β1 zu 25 μLH2Ogeben, um eine 8,9 μg/ml Testlösung herzustellen.
  2. Beschriften Sie den Matrilin-3 mit einem separaten Beschriftungskätzchen. Man fügt 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 zu 25 μLH2Ohinzu, um eine 36 μg/ml Testlösung herzustellen.
    HINWEIS: Die fluoreszierende Farbstoffmarkierung des TGF-β1 ergab eine Endkonzentration von 20 μg/ml, während die Markierung des Matrilin-3 zu einer Endkonzentration von 80 μg/ml führte.
  3. Mischen Sie 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 mit 20 μL von 20 μg/ml markiertem TGF-β1 und 5 μLH2O, was zu einer markierten TGF-β1/Matrilin-3-Verbindung führt. Pipetten Sie die Mischung mehrmals, um sie zu mischen.
  4. Man gibt 5 μL 1 mg/ml JBNts zu 40 μLH2O, was zu einer 111 μg/ml Lösung führt.
  5. 20 μL 20 μg/mL markiertes TGF-β1 auf 20 μL 80 μg/ml markiertes Matrilin-3 geben und mehrmals pipettieren. Fügen Sie 5 μL 1 mg/ml JBNts zu der markierten TGF-β1/Matrilin-3-Lösung hinzu und pipetten Sie wiederholt, um die Verbindung richtig zu mischen.
    HINWEIS: Die Endkonzentrationen der JBNt-Proben, gekennzeichnet mit TGF-β1, und der markierten Matrilin-3-Proben betrugen 111 μg/ml, 8,9 μg/ml bzw. 36 μg/ml.
  6. Übertragen Sie jede Probengruppe (d. h. TGF-β1 (Schritt 6.1), beschriftete Matrilin-3 (Schritt 6.2), beschriftete TGF-β1/matrilin-3 (Schritt 6.3), JBNts (Schritt 6.4), JBNm (Schritt 6.5)) in ihre eigene Vertiefung einer schwarzen 384-Well-Platte.
  7. Legen Sie die schwarze 384-Well-Platte in einen Multimode-Mikroplattenleser ein und messen Sie bei Anregungswellenlängen von 488 nm und 555 nm gemäß dem Protokoll des Herstellers.

7. In-vitro-Test der biologischen Funktion

  1. Zellhaftungstest an vorbeschichteten Deckglaskammern
    1. Bereiten Sie zwei Kammerdeckgläser mit fünf Probengruppen vor, da für jeden Zelltyp ein Deckglas verwendet wird.
    2. 1,25 μL 1 mg/ml JBNts zu 198,75 μL destilliertem Wasser geben, was zu einer 6,25 μg/ml Lösung führt.
    3. 10 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 190 μL destilliertem Wasser geben, was zu einer 0,5 μg/mLLösung führt.
    4. 2,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 197,5 μg/ml destilliertem Wasser geben, was zu einer 0,125 μg/ml Lösung führt.
    5. Für die JBNm-Gruppe 10 μL 10 μg/ml Matilin-3 zu 2,5 μL 10 μg/mLTGF-β1 geben und wiederholt pipettieren. 1,25 μL JBNts mit einer Konzentration von 1 mg/ml in die Mischungslösung geben und pipetten. Schließlich werden 186,25 μL destilliertes Wasser hinzugefügt, um eine 200 μL JBNm-Lösung zu erhalten.
      1. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe 200 μL destilliertes Wasser.
    6. Fügen Sie jede Probengruppe in eine eigene Vertiefung aus einem Kammerdeckglas Nr. 1,5 hinzu. Das Deckglas für 1 h in einen Gefrierschrank bei -80 °C geben und anschließend mit einem Gefriergerät gefriertrocknen.
    7. Samen Sie humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) und menschliche Chondrozytenzellen (10.000 Zellen pro Well) in jede Vertiefung der vorbereiteten Kammerdeckgläser.
    8. Die beiden Deckgläser für 4 h in einem 37 °C Inkubator inkubieren. Dann saugen Sie das Zellkulturmedium ab und spülen Sie zweimal mit PBS ab.
    9. Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 5 min und entfernen und spülen Sie dann Proben mit PBS. Spülen Sie die Probe ein zweites Mal, um das 4% ige Paraformaldehyd vollständig zu entfernen.
    10. Zellen mit 100 μL 0,1% Triton-X für 10 min inkubieren und mit PBS waschen. Geben Sie 100 μL 0,165 μM Rhodamin-Phalloidin in jede Vertiefung. Warten Sie 30 Minuten und waschen Sie dann erneut mit PBS.
    11. Fügen Sie 0,1 μg/ml DAPI zu jeder Vertiefung hinzu, um die Kerne zu färben. Warten Sie 5 min und spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS ab.
    12. Verwenden Sie ein spektrales konfokales Mikroskop, um die Zellmorphologie zu beobachten und fluoreszierende Bilder aufzunehmen.
    13. Analysieren Sie außerdem die Zellzahl und Morphologie mit Bildverarbeitungssoftware. Öffnen Sie die Software und laden Sie die Bilder. Fügen Sie einen Maßstabsbalken hinzu und kalibrieren Sie die Software. Zählen Sie die Anzahl der Zellen in einem bestimmten Bereich für jede Probe. Verwenden Sie dann das Messwerkzeug, um Daten zur Zellmorphologie für jede Probe zu sammeln.
  2. Zellproliferation
    1. Bereiten Sie drei unbehandelte 96-Well-Platten vor und fügen Sie jeweils fünf Gruppen von Proben hinzu.
      1. Für die JBNt-Gruppe werden 3,75 μL 1 mg/ml JBNts zu 596,25 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer 600 μL JBNt-Lösung mit einer Konzentration von 6,25 μg/ml führt.
      2. Für die TGF-β1-Gruppe werden 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 592,5 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer Testlösung von 0,125 μg/ml führt.
      3. Für die Matrilin-3-Gruppe werden 30 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 570 μL destilliertem Wasser gegeben, was zu einer 0,5 μg/ml Testlösung führt.
      4. Für die JBNm-Gruppe 7,5 μL 10 μg/ml TGF-β1 mit 30 μL 10 μg/ml Matilin-3 mischen und mehrmals pipettieren, gefolgt von Zugabe von 3,75 μL 1 mg/ml JBNts zur Lösung.
      5. JBNm-Lösung wird mit 558,75 μl destilliertem Wasser verdünnt, um die Endkonzentrationen von 6,25 μg/ml, 0,125 μg/ml bzw. 0,5 μg/ml für JBNt-, TGF-β1- und Matrilin-3-Proben zu erhalten.
      6. Verwenden Sie für die Kontrollgruppe 600 μL destilliertes Wasser.
    2. Teilen Sie jede Probengruppe in sechs Vertiefungen auf (100 μL Probe pro Vertiefung).
    3. Die drei Platten mit allen Proben werden für 1 h in einen Gefrierschrank bei -80 °C gegeben und anschließend mit einem Gefriergerät gefriergetrocknet.
    4. Säen Sie hMSCs auf diese Platten und erhalten jeweils eine 100-μL-Zellsuspension (pro Vertiefung) mit 5.000 Zellen. Die drei Platten bei 37 °C für 1 Tag, 3 Tage oder 5 Tage bei 5% CO2 inkubieren.
    5. 10 μL CCK-8-Lösung in jede Vertiefung mit den Zellen geben und bei 37 °C für weitere 2 h inkubieren.
    6. Messen Sie die Absorptionswerte jeder Vertiefung mit Multimode-Mikroplattenlesern bei 450 nm.
    7. Säen Sie einen bekannten Gradienten von hMSCs auf eine 96-Well-Platte und inkubieren Sie für 4 h. Verwenden Sie den CCK-8-Assay, um die Absorptionswerte der bekannten Anzahl von Zellen zu messen und eine Standardkurve zu erstellen.
    8. Berechnen Sie die Zellproliferation mithilfe der Absorptionsstandardkurve.
  3. Stabilitätstest
    HINWEIS: Ein humanes TGF-β1-gezieltes ELISA-Kit wurde verwendet, um die prozentuale Freisetzung von TGF-β1 aus dem JBNm in einem Agarose-Hydrogel zu bestimmen.
    1. Bereiten Sie 2% Agarose vor, indem Sie 400 mg Agarosepulver zu 20 ml PBS geben und auf 100 °C erhitzen, um das Agarosepulver vollständig aufzulösen.
    2. Bereiten Sie das JBNm im gekühlten 2% igen Agarose-Hydrogel vor.
      1. Kombinieren Sie 10 μL 10 μg/ml TGF-β1, 40 μL 10 μg/ml Matrilin-3, 5 μL 1 mg/ml JBNts und 195 μL PBS. Mischen Sie diese Lösung mit 250 μL 2% Agarose, wodurch das JBNm-Hydrogel entsteht.
    3. Fügen Sie 500 μL PBS hinzu, verwenden Sie es als Release-Lösung, und stellen Sie sicher, dass Sie es alle 3 Tage wechseln. Bewahren Sie jede freigegebene Lösung auf und lassen Sie die Probe 15 Tage lang ruhen.
    4. Verwenden Sie ein ELISA-Kit, um jede der erfassten Release-Lösungen zu testen, indem Sie die Anweisungen des Herstellers befolgen.
      ANMERKUNG: Durch Subtraktion der im PBS freigesetzten TGF-β1-Menge vom theoretischen Belastungswert von 100% kann die verbleibende Menge an TGF-β1 bestimmt werden.
  4. Zelldifferenzierungsanalyse mit PCR26.
    1. Es werden sieben Probengruppen vorbereitet, wobei jede Probe 20 μL Zellsuspension (4 x 104 Zellen), 30 μL der spezifischen Lösung (oder PBS, je nach Probengruppe) und 50 μL 2 Gew.-% Agarose enthält.
      1. Für die TGF-β1-Gruppe werden 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zu 25 μL PBS hinzugefügt, was zu einer 1,6 μg/ml Lösung führt.
      2. Für die Matrilin-3-Gruppe fügen Sie 20 μL 10 μg/ml Matrilin-3 zu 10 μL PBS hinzu, was zu einer 6,7 μg/mL Lösung führt.
      3. Für die JBNt-Gruppe fügen Sie 2,5 μL 1 mg/ml JBNts zu 27,5 μL PBS hinzu, was zu einer 83,3 μg/ml Lösung führt.
      4. Für die J/T/M JBNm-Gruppe 10 μL 10 μg/ml Matrilin-3 auf 5 μL 10 μg/ml TGF-β1 zugeben und nach oben und unten pipettieren, um die Lösung zu mischen. Dann fügen Sie 2,5 μL 1 mg / ml JBNts hinzu und pipetten Sie erneut. Zum Schluss mit 2,5 μL PBS verdünnen.
      5. Verwenden Sie für jede Kontrollgruppe 30 μL PBS als Probe.
    2. Fügen Sie 0,5 ml Zellkulturmedium zu jeder Vertiefung hinzu und ersetzen Sie sie alle 3 Tage.
      1. Verwenden Sie für die Positivkontrollgruppe ein kommerziell erhältliches chondrogenes hMSC-Medium, das zugesetztes TGF-β1 enthält. Dieser zusätzliche TGF-β1 entspricht dem Betrag in den Gruppen TGF-β1 und J/T/M JBNm.
      2. Verwenden Sie für eine der Negativkontrollgruppen ein handelsübliches chondrogenes hMSC-Medium, das kein TGF-β1 enthält. Verwenden Sie für die andere Negativkontrollgruppe ein DMEM-Zellkulturmedium, das 10% fötales Rinderserum (FBS) enthält.
      3. Verwenden Sie für jede andere Gruppe ein kommerzielles chondrogenes hMSC-Zellkulturmedium ohne TGF-β1.
    3. Kultivieren Sie die Proben für 15 Tage.
    4. Extrahieren Sie die RNA der Proben und führen Sie eine PCR durch, um die Differenzierung der Proben wie zuvor beschriebenzu untersuchen 26.
  5. Immunfärbung für Typ-X-Kollagenexpressionstest
    1. Bereiten Sie sieben Agarose-basierte Proben auf die gleiche Weise vor wie die Zelldifferenzierung mit dem PCR-Methodenabschnitt (Schritt 7.4).
    2. Kultivieren Sie die Proben für 15 Tage.
    3. Die Proben 1 Tag lang mit 4% Formaldehyd fixieren, über Nacht in 30%iger Saccharoselösung einweichen und dann über Nacht bei -80 °C mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Fixieren Sie die Proben mit dem optimalen Schnitttemperatur-Compound-Reagenz (OCT), einer Mischung aus wasserlöslichen Glykolen und Harzen, bei -10 °C.
    4. Bedienen Sie ein Kryostat-Mikrotom, um 20 μm dicke gefrorene Abschnitte jeder Probe zu erhalten.
    5. Färben Sie jeden Abschnitt mit einem Anti-Collagen X-Antikörper mit einer Verdünnung von 1:800 und einem fluoreszierenden sekundären Antikörper, der gemäß den Protokollen des Herstellers mit PBS verdünnt ist.
    6. Beobachten Sie jeden Abschnitt mit einem konfokalen Mikroskop mit einer Anregung von 488 nm und einer 40-fachen Vergrößerung des Okulars.

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Representative Results

Nach dem Protokoll wurden JBNts erfolgreich synthetisiert und mit UV-Vis-Absorption und TEM charakterisiert. Das JBNm ist ein injizierbares festes Gerüst, das einen schnellen biomimetischen Prozess durchläuft. Nachdem JBNts zu einer Mischung aus TGF-β1/Matrilin-3-Lösung in einer physiologischen Umgebung gegeben wurden, bildete sich ein festes Weißmaschengerüst, das auf den erfolgreichen Zusammenbau von JBNm hinweist, wie in Abbildung 1 zu sehen ist. Dies wurde in den Charakterisierungsmethoden nachgewiesen.

Unter physiologischen Bedingungen ist Matrilin-3 aufgrund seines isoelektrischen Punktes27 negativ geladen (Abbildung 2A). Nach der Zugabe der TGF-β1-Lösung zur Matrilin-3-Lösung stieg das Zeta-Potential der TGF-β1/Matrilin-3-Verbindung auf einen nahezu neutralen Wert, was darauf hindeutet, dass die beiden Proteine über Ladungswechselwirkungen gebunden waren. Wie in Abbildung 2A zu sehen ist, ist das Zeta-Potential von JBNm aufgrund der JBNts das höchste unter den drei Gruppen, da der isoelektrische Punkt der Lysinseitenkette in einer physiologischen Umgebung etwa 9,74 beträgt. Der Anstieg der Zeta-Potentialwerte des JBNm zeigt den erfolgreichen Aufbau seiner Schicht-für-Schicht-Struktur an.

UV-Vis-Absorptionsspektren (Abbildung 2B) verdeutlichen die Bildung der hierarchischen Schicht-für-Schicht-Innenstruktur des JBNm. Die aromatischen Ringe der Lysinseitenketten und der JBNts trugen zu den beiden Absorptionspeaks bei 220 nm bzw. 280 nm bei. Die Abnahme des Absorptionswertes wurde nach der Zugabe von TGF-β1 beobachtet, was darauf hindeutet, dass eine Bindung zwischen TGF-β1 und JBNts stattfindet. Nach der Zugabe von JBNts zu Matrilin-3 wurde eine deutlichere Abnahme der Absorptionsintensität der Peaks beobachtet, was wiederum auf eine erfolgreiche Bindung zwischen Matrilin-3 und JBNts hindeutet. In ähnlicher Weise wurde nach der Zugabe von JBNts zu einer Mischung von TGF-β1 / Matrilin-3 das JBNm gebildet, und die Absorptionsspitzen nahmen an Intensität ab. Der Absorptionspeak von JBNm liegt näher an der Matrilin-3/JBNts-Linie als an der TGF-β1/JBNts-Linie, was darauf hindeutet, dass die JBNts es vorziehen, an Matrilin-3 zu binden und eine schichtweise äußere Struktur mit Matrilin-3 zu bilden, während TGF-β1 in der inneren Schicht liegt. TEM wird verwendet, um die Morphologie der JBNts und JBNm zu charakterisieren (Abbildung 2C). Nach der Kombination mit Proteinen wurden dicke Bündel von JBNm beobachtet, die eine Gerüststruktur bildeten.

Die Fluoreszenzmikroskopie hat das Vorhandensein der Schicht-für-Schicht-Struktur bestätigt (Abbildung 3A) und den Querschnitt des JBNm demonstriert. Nach der Markierung von TGF-β1 und Matrilin-3 wurde beobachtet, dass das rot fluoreszierende Matrilin-3 die JBNt-Bündel umhüllt und die äußere Schicht des JBNm bildet. In Abbildung 3B bildete das grün fluoreszierende TGF-β1 eine innere Schicht, die zur Speicherung von Wachstumsfaktoren beiträgt und die Lokalisierung von TGF-β1 ermöglicht. Abbildung 3C zeigt den Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET) zwischen den fluoreszierenden Farbstoff-markierten Proteinen, charakterisiert durch Fluoreszenzspektren, mit Emissionsspitzen bei 520 nm bzw. 570 nm für markierte TGF-β1- bzw. Matrilin-3-Gruppen28. Nach dem Hinzufügen von JBNts gemäß dem Protokoll wird die Schicht-für-Schicht-Struktur gebildet; Peaks wurden sowohl bei 520 nm als auch bei 570 nm für die JBNm-Gruppe beobachtet, was auf eine erfolgreiche Bindung und Assemblierung der Proteine und JBNts hinweist.

Zusätzlich wurde die Wirkung des JBNm auf die hMSCs-Adhäsion und Zellproliferation untersucht. Wie in Abbildung 4 gezeigt, wurde die Zelladhäsionsdichte des auf der Oberfläche der Kammerdeckgläser beschichteten JBNm bestimmt. Der JBNm zeigte hMSCs, die entlang sich selbst gruppiert waren (Abbildung 4A), während weniger Zellen an JBNts hafteten. Für die anderen Gruppen waren die hMSCs jedoch im Vergleich zur JBNm-Gruppe gleichmäßig verteilt. Die Ausrichtung der Zellen sowie die Größe der Zellen auf dem JBNm zeigten, dass JBNts eine Rolle bei der Zelladhäsion spielten, während die Proteine im JBNm die Affinität der Zelladhäsion erhöhten (Abbildung 4B,C).

Nach Tag 1 der Zellkultur mit JBNm, JBNts, Matilin-3 allein, TGF-β1 allein und Negativkontrolle zeigten die JBNm- und TGF-β1-Gruppen im Vergleich zu den anderen Gruppen eine signifikante Zellproliferation. Wenn die Zellkulturdauer auf 3 und 5 Tage verlängert wurde, zeigten die JBNm- und TGF-β1-Gruppen eine noch stärkere Zellproliferation, wie in Abbildung 5 zu sehen ist. Eine Langzeitfunktionsstudie wurde durchgeführt, um die Differenzierung von hMSCs mit JBNm und ohne JBNm (Negativkontrolle) zu bestimmen. Nach 15 Tagen wurde ein verstärkter Alcian-Blaufleck beobachtet, der auf eine Chondrogenese von hMSCs hinweist, die neben JBNm26 wachsen. Somit bevorzugten die Zellen die JBNts des JBNm. Dies war wahrscheinlich auf seine DNA-nachahmende Struktur und seine Fähigkeit zurückzuführen, in niedermolekulare Einheiten zerlegt zu werden, von denen letztere durch einen niedrigen pH-Wert oder eine ausreichende enzymatische Aktivität (wie die Aufnahme durch Zellen) ausgelöst werden können14,29.

Video 1: Videoaufzeichnung der JBNm-Montage. Diese Aufnahme zeigt die Bildung der JBNts, matrilin-3 und TGF-β1 zum JBNm. Diese Zahl wurde von Zhou et al. (2021)26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der chemischen Struktur von JBNts, des J/T/M JBNm und der chondrogenen Fähigkeit des J/T/M JBNm. (A) Die chemische Struktur der JBNts, wobei ihre Bildung vom Monomer über den Rosettenring bis zum JBNt hervorgehoben wird. (B) Die Komponenten, aus denen der J/T/M JBNm besteht, sowie wie sie sich zum JBNm zusammensetzen. (C ) Schematische Darstellung der Kultivierung humaner mesenchymaler Stammzellen auf dem J/T/M JBNm. Diese Zahl wurde von Zhou et al. (2021)26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Materialcharakterisierung des J/T/M JBNm. (A) Zetapotentialspektren von Matrilin-3 allein, der TGF-β1/matrilin-3-Verbindung und der J/T/M JBNm. (B) UV-Vis-Absorptionsspektren von JBNts allein, Matrilin-3 allein, TGF-β1 allein, Matrilin-3/JBNts-Verbindung, TGF-β1/JBNts-Verbindung und J/T/M JBNm. (C ) Bilder von JBNts allein und dem J/T/M JBNm aus der Transmissionselektronenmikroskopie (TEM). Diese Zahl wurde von Zhou et al. (2021)26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Fluoreszierende konfokale Bildgebung und Fluoreszenzspektren von J/T/M JBNm. (A) Konfokales 3D-Bild des J/T/M JBNm, mit rot-fluoreszierendem markiertem Matrilin-3 und grün-fluoreszierendem TGF-β1. (B) konfokale 2D-Bilder von J/T/M JBNm mit rot fluoreszierendem Matrilin-3, grün fluoreszierendem TGF-β1 und einer zusammengeführten Version. (C) Fluoreszenzspektren verschiedener Verbindungen zur Charakterisierung des FRET-Prozesses zwischen den markierten Proteinen. Diese Zahl wurde von Zhou et al. (2021)26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: Analyse der Kultur humaner mesenchymaler Stammzellen (hMSC). (A) Optische Mikroskopiebilder von hMSCs mit TGF-β1, Matrilin-3 und JBNts, kultiviert auf einem Agarosegel. (B) Konfokalmikroskopische Bilder von hMSCs, die auf dem mit einer Vielzahl von JBNm-Komponenten beschichteten Kammerdeckglas kultiviert wurden. (C) Graph der Anzahl der pro Quadratmillimeter für jede Gruppe aufgeklebten Zellen. Fehlerbalken kennzeichnen Standardabweichungen. (D) Graph der Länge der Hauptachse der Zellen in μm pro Gruppe. Fehlerbalken kennzeichnen Standardabweichungen. Anmerkung: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (im Vergleich zu Negativkontrollen, NC). Diese Zahl wurde von Zhou et al. (2021)26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 5
Abbildung 5: Vergleich der Zellzahlen für verschiedene Gruppen zwischen Tag 1, 3 und 5. Zellzahlstatistik von hMSCs nach Kultivierung mit verschiedenen Materialien an den Tagen 1, 3 und 5. Fehlerbalken kennzeichnen Standardabweichungen. Hinweis: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Diese Zahl wurde von Zhou et al. (2021)26 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Das Ziel dieser Studie ist es, eine biomimetische Gerüstplattform, das JBNm, zu entwickeln, um die Einschränkungen herkömmlicher Gewebekonstrukte zu überwinden, die auf Zellkulturumgebungen angewiesen sind, um die Zelldifferenzierung zu vermitteln. Das JBNm ist ein Schicht-für-Schicht-Strukturgerüst für ein selbsttragendes Knorpelgewebekonstrukt. Das innovative Design basiert auf neuartigen DNA-inspirierten Nanomaterialien, den JBNts. Das JBNm, bestehend aus JBNts30, TGF-β1 und Matrilin-3, wird durch eine neuartige Schicht-für-Schicht-Technik zusammengesetzt, bei der die Selbstorganisation des Gerüsts auf molekularer Ebene gesteuert wurde. Der Aufbau von JBNm wurde beobachtet und mit Zeta-Potentialmessung, UV-Vis-Absorption, TEM und Fluoreszenzspektralanalyse charakterisiert.

Die UV-Vis-Spektren in Abbildung 2B (Schritt 3) haben die Bildung des hierarchischen Schicht-für-Schicht-Inneren des JBNm gezeigt. Ein Unterschied in den Absorptionsspitzen kann aufgrund eines Unterschieds in der Bindungsaffinität beobachtet werden. Zwischen JBNts und Matrilin-3 treten mehr größere Wechselwirkungen auf als zwischen JBNts und TGF-β1, was darauf hindeutet, dass JBNts Kollagenproteine in Bezug auf ihre faserige Morphologie und Lysinoberflächenchemie nachahmen. Diese Technik ist notwendig, um die Bindung von JBNts an Matilin-3 anstelle von TGF-β1 zu beobachten, was die Verkapselung von TGF-β1 ermöglicht und somit eine langsame Freisetzung von TGF-β1 in das umgebende Gewebe ermöglicht. Der kritischste Schritt in der Entwicklung des JBNm ist die Kombination von Proteinen mit den JBNts. TGF-β1 und Matrilin-3 müssen vor der Zugabe von JBNts hinzugefügt werden, um die volle Wirkung des FRET-Phänomens zwischen dem markierten Matrilin-3 und TGF-β1 zu beobachten. Die Einschränkung dieser Technik ergibt sich aus der falschen Additionsreihenfolge von Proteinen und Nanoröhrchen, was zu unterschiedlichen Messungen führt. Dies ist ein wichtiger Schritt für die Bildung von JBNm für zukünftige Studien und wird daher auf zukünftige JBNm-Fabrikationen und -Studien angewendet.

Matrilin-3 ist ein sehr negatives Protein, während TGF-β1 ein leicht neutrales Protein ist, wie in Abbildung 2A zu sehen ist. Die Ladungsdifferenz wurde beobachtet, um die Bindung dieser Proteine zu bestimmen. Aus dem negativ geladenen Zustand von Matrilin-3 stieg das Zeta-Potential nach der Zugabe von TGF-β1 auf einen nahezu neutralen Wert an (Abbildung 2A). Dieser Schritt ist wichtig, um die erste innere Schicht des biomimetischen Gerüsts zu bestimmen und anzuzeigen, dass die Kombination beider Proteine durch Ladungswechselwirkung erfolgt. Nach der Zugabe von JBNts, dem zweiten Schritt der JBNm-Herstellung, wurde das Zeta-Potential von JBNm bei ~10 ± 5 mV gemessen (Abbildung 2A). Da JBNts sehr positiv sind, wurde beobachtet, dass die Ladung von JBNm wie erwartet zunimmt. Die Bestimmung von Ladungen mit Zeta-Potential ist daher wichtig, um die Bildung von JBNm Schritt für Schritt über Ladungswechselwirkungen zu beobachten. Ähnlich wie bei der UV-Vis-Spektroskopie ist in diesem Schritt die Reihenfolge der Addition wichtig, und eine falsche Additionsreihenfolge kann zu unterschiedlichen Messungen führen. Ebenso ist es wichtig, die Mischung vor der Messung nach oben und unten zu pipettieren.

Als nächstes werden TGF-β1 und Matrilin-3 markiert, so dass die Entwicklung von JBNm mit konfokaler Mikroskopie und Fluoreszenzspektralanalyse mit Multimode-Mikroplatten-Readern beobachtet werden kann. Die Proben wurden mit einem 488-nm-Laser angeregt und zeigten Emissionsspitzen bei 520 nm und 570 nm (Abbildung 3). Für JBNts allein wurde kein Emissionspeak beobachtet, da sie nicht gekennzeichnet sind. FRET trat vom TGF-β1-Donor zum Matrilin-3-Akzeptor auf, wodurch der Emissionspeak bei 520 nm reduziert und der Emissionspeak bei 570 nm erhöht wurde; Die beiden Komponenten sind 10 nm voneinander entfernt, so dass das FRET-Phänomen auftreten kann. Daher basiert der Aufbau von JBNm auf räumlichen (d.h. physikalischen Distanz-) Prozessen zusammen mit Ladungswechselwirkungen. Der kritischste Schritt bei der Entwicklung von JBNm ist die Additionssequenz; TGF-β1 und Matrilin-3 müssen vor der Zugabe von JBNts hinzugefügt werden, um die volle Wirkung des FRET-Phänomens zu beobachten. Eine Vergrößerung von mindestens 40x am Okular ist erforderlich, um den fluoreszierenden JBNm zu beobachten. Die Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass die JBNts nicht markiert sind und daher nicht mit konfokaler Mikroskopie beobachtet werden konnten. Die Proteinmarkierungstechnik kann jedoch angewendet werden, um JBNt mit einigen Modifikationen für zukünftige Anwendungen zu markieren.

JBNm kann Zellfunktionen wie Zelladhäsion und Zellproliferation unterstützen. In dieser Studie wurden hMSCs (beginnend mit 5.000 Zellen) auf verschiedenen Materialien (JBNm, JBNts, TGF-β1, Matilin-3 und Negativkontrollen ohne Zusatzstoffe) kultiviert, um die Zellzahlen nach Inkubation für 1, 3 und 5 Tage mit CCK-8-Lösung zu vergleichen, wobei die genauen Herstellerprotokolle zur Bestimmung der Zellproliferation eingehalten wurden. JBNm, insbesondere in Gegenwart von TGF-β1, und TGF-β1 allein zeigten im Vergleich zu den anderen drei Gruppen eine signifikante Zellproliferation. JBNts ahmen Kollagen in der ECM morphologisch nach, während Matilin-3 ein knorpelspezifisches Protein ist, was zu einer erhöhten Zellproliferationsaktivität nach Inkubation bei 37 °C für 3 und 5 Tage führt (Abbildung 5). Das JBNm hat ein großes Potenzial gezeigt, als injizierbares und biomimetisches Gewebegerüst zu dienen, um die Einschränkungen traditioneller Zellkonstrukte für verschiedene zukünftige Anwendungen als Biomaterialien zu überwinden29,31. JBNm ahmt die Knorpel-ECM morphologisch nach, stellt Adhäsionsstellen bereit und ermöglicht die Freisetzung von pro-chondrogenen differenzierenden Faktoren in die Mikroumgebung, wie TGF-β132,33. Die Fähigkeit des JBNm, TGF-β1 in die innere Schicht des Gerüsts einzubauen, verhindert, dass es in unerwünschte Bereiche austritt, wodurch die Wirksamkeit des Gerüsts verbessert wird (Abbildung 4 und Abbildung 5). Viele hMSCs gruppieren sich entlang des JBNm-Gerüsts, während die Zellen spärlich in Matrilin-3-, TGF-β1- und Negativkontrollgruppen verteilt sind (Abbildung 4). Die Morphologie der Zellen wurde ebenfalls beobachtet, was auf eine ausgezeichnete Affinität zu JBNm-Oberflächen hinweist. Diese präzise entworfenen Biomaterialien verhindern die schnelle Freisetzung von eingebauten bioaktiven Molekülen in die Zellkulturumgebung und verbessern die Selbstversorgung der Gewebekonstrukte innerhalb der Matrix34. Eine Einschränkung dieser Technik besteht darin, dass die Ausgangszellzahlen entscheidend für die Bestimmung der Zellproliferation sind. Eine Startzellzahl von 5.000 wurde für diese Studie als am optimalsten befunden. Eine Standardkurve wird auch benötigt, um die Zellzahl zu bestimmen, indem eine bekannte Anzahl von Zellen aufgetragen und im Multimode-Mikroplattenleser gemessen wird. Diese Technik kann in Zukunft als standardisierte Methode zur Bestimmung der Zellproliferation in allen Studien im Zusammenhang mit JBNm-Gerüsten angewendet werden.

hMSCs wurden in 3D-Agarosepellets mit und ohne JBNm kultiviert, um die Langzeitfunktionsstudie für 15 Tage zu bestimmen. Nach 15 Tagen wurde die Gesamt-RNA aus den hMSCs in den Agarosepellets extrahiert, die eine Positivkontrolle (die Pellets wurden bei jedem Mediumwechsel mit frischem TGF-β1 versorgt), JBNm, JBNts, Matrilin-3, TGF-β1 und keine Zusatzstoffe enthielt. Die Echtzeit-qPCR wurde für die Genanalyse durchgeführt und auf chondrogene Differenzierungsmarker, Aggrecan (ACAN) und Hypertrophiemarker Typ X Kollagen (COL X) getestet. Die ACAN-Expression in der JBNm-Gruppe nahm im Vergleich zu anderen Gruppen signifikant zu, was zeigt, dass JBNm die chondrogene Differenzierung von Stammzellen signifikant fördert und gleichzeitig COL X hemmt. In der Zwischenzeit hat die Positivkontrolle die Chondrogenese verbessert, wie in der Zunahme von ACAN und auch Hypertrophie der differenzierten Zelle26 festgestellt wurde. Eine weitere Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass die RNA-Extraktion aus den Zellen stammt, die in ein Hydrogel eingebettet sind. Die in diesem Protokoll erhaltene Gesamt-RNA war daher in Konzentration und Reinheit niedrig. Um diese Einschränkung zu überwinden, wurden weitere Proben kultiviert und extrahiert, um die optimale Konzentration und Reinheit für den nächsten Schritt, die real-time qPCR, zu erhalten. Während qPCR für die Studie wichtig ist, ist eine geringfügige Änderung dieser Technik für zukünftige Studien erforderlich, um eine effiziente Probenextraktion zu gewährleisten, ohne eine große Anzahl von Proben zu opfern.

Ein Stabilitätstest wurde mit einem humanen TGF-β1 ELISA-Kit durchgeführt, um die Freisetzung von Protein aus dem JBNm-Hydrogel zu testen. In dieser Studie wird erwartet, dass TGF-β1 im J/T/M JBNm verkapselt wird, und daher sollte keine TGF-β1-Freisetzung beobachtet werden (d.h. der theoretische Belastungswert beträgt 100%). Eine Einschränkung dieses Schritts besteht darin, dass davon ausgegangen wird, dass das gesamte TGF-β1 Schicht für Schicht in das JBNm-Gerüst eingekapselt ist. Nach 15 Tagen werden die aus dem Hydrogel freigesetzten Lösungen gesammelt und mit dem Kit gemäß den Protokollen des Herstellers getestet. Dann wurde die Menge an TGF-β1 berechnet, indem die Menge des freigesetzten TGF-β1 in PBS vom theoretischen Belastungswert subtrahiert wurde. Da TGF-β1 in der inneren Schicht des JBNm eingekapselt war, wurde die langsame Freisetzung des Proteins erwartet. Die Studie zeigte, dass das TGF-β1 innerhalb des JBNm-Gerüsts lokalisiert ist und nicht schnell in die Umgebung freigesetztwird 26.

Dieses innovative Schicht-für-Schicht-JBNm-Knorpelgewebekonstrukt wurde durch hochorganisierte und kontrollierte Selbstorganisation auf molekularer Ebene realisiert. Das TGF-β1 ist in der inneren Schicht der Matrixfasern eingeschlossen, verhindert sein Austreten an unerwünschte Stellen und fördert gleichzeitig die lokalisierte Chondrogenese. Darüber hinaus ist Matrilin-3 in der äußeren Schicht der Matrixfasern lokalisiert, wodurch eine antihypertrophe Mikroumgebung35 entsteht. Es wurde gezeigt, dass JBNts nicht nur als strukturelles Gerüstrückgrat dienen, sondern auch die Verankerung und Adhäsion von Stammzellen verbessern, um Zellen entlang der Matrixfasern30,36 zu lokalisieren. Was zukünftige Arbeiten betrifft, so wird das Schicht-für-Schicht-Design des JBNt-basierten Gerüsts für Anwendungen in verschiedenen Geweben37,38,39 angepasst.

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Disclosures

Dr. Yupeng Chen ist Mitbegründer von Eascra Biotech, Inc. und NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Diese Arbeit wird durch die NIH-Zuschüsse 7R01AR072027 und 7R03AR069383, den NSF Career Award 1905785, die NSF 2025362 und die University of Connecticut unterstützt. Diese Arbeit wird teilweise auch durch den NIH-Zuschuss S10OD016435 unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

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Bioengineering Ausgabe 185
Herstellung und Charakterisierung von Schicht-für-Schicht-Janus-Basis-Nano-Matrix zur Förderung der Knorpelregeneration
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Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

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