Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Kıkırdak Rejenerasyonunu Teşvik Etmek için Katman Katman Janus Baz Nano-Matrisinin Üretimi ve Karakterizasyonu

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, Janus baz nanotüpleri (JBNt'ler), matrilin-3 ve Dönüştürücü Büyüme Faktörü Beta-1'i (TGF-β1) sırayla ekleyerek katman katman Janus baz nano-matris (JBNm) iskelesinin montajını açıklar. JBNm imal edildi ve karakterize edildi; Ek olarak, mükemmel biyoaktivite göstererek yapışma, çoğalma ve farklılaşma gibi hücre fonksiyonlarını teşvik etti.

Abstract

İn vitro ve in vivo kullanımlar için spesifik fonksiyonları teşvik etme umuduyla hücre yapışmasını ve çoğalmasını yönlendirmek için çeşitli biyomalzeme iskeleleri geliştirilmiştir. Bu biyomalzeme iskelelerine büyüme faktörlerinin eklenmesi genellikle optimal bir hücre kültürü ortamı sağlamak, hücre farklılaşmasına ve sonraki işlevlerine aracılık etmek için yapılır. Bununla birlikte, geleneksel bir biyomateryal iskelesindeki büyüme faktörleri tipik olarak implantasyon üzerine salınmak üzere tasarlanmıştır, bu da çevredeki doku veya hücreler üzerinde istenmeyen yan etkilere neden olabilir. Burada, DNA'dan ilham alan Janus baz nano-matrisi (JBNm), kendi kendine sürdürülebilir kıkırdak doku yapıları için katman katman bir yapıya sahip oldukça lokalize bir mikro ortamı başarıyla elde etti. JBNm'ler, Janus baz nanotüplerinden (JBNts), matrilin-3'ten ve biyoafinite yoluyla dönüştürücü büyüme faktörü beta-1'den (TGF-β1) kendi kendine monte edilir. JBNm, TGF-β1: matrilin-3: JBNt oranında 1: 4: 10'da monte edildi, çünkü bu, katman katman yapıya uygun montajın gerçekleşebileceği belirlenmiş orandı. İlk olarak, TGF-β1 çözeltisi matrilin-3 çözeltisine eklendi. Daha sonra, JBNt çözeltisinin eklenmesinden önce yeterli homojenliği sağlamak için bu karışım birkaç kez pipetlendi. Bu, birkaç kez tekrar pipetlemeden sonra katman katman JBNm'yi oluşturdu. Katman katman JBNm yapısını, yalnızca JBNts'leri, tek başına matrilin-3'ü ve yalnızca TGF-β1'i karakterize etmek için çeşitli deneyler yapıldı. JBNm'nin oluşumu UV-Vis absorpsiyon spektrumları ile incelendi ve JBNm'nin yapısı transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile gözlendi. Yenilikçi katman katman JBNm iskelesi moleküler ölçekte oluşturulduğundan, floresan boya etiketli JBNm gözlemlenebilir. TGF-β1, enjekte edilebilir JBNm'nin iç tabakası içinde sınırlıdır, bu da büyüme faktörlerinin çevredeki alanlara salınmasını önleyebilir, lokalize kondrogenezi teşvik edebilir ve anti-hipertrofik bir mikro ortamı teşvik edebilir.

Introduction

Doku mühendisliğindeki iskeleler, hücre bağlanması ve sonraki doku gelişimi için yapısal destek sağlamada hayati bir rol oynamaktadır1. Tipik olarak, herhangi bir iskele olmadan geleneksel doku yapıları, hücre kültürü ortamına dayanır ve hücre farklılaşmasına aracılık etmek için büyüme faktörleri ekler. Ayrıca, biyoaktif moleküllerin iskelelere eklenmesi, hücre farklılaşmasına ve fonksiyonuna rehberlik etmede sıklıkla tercih edilen yaklaşımdır 2,3. Bazı iskeleler, doğal dokuların biyokimyasal mikro ortamını bağımsız olarak taklit edebilirken, diğerleri büyüme faktörleri yoluyla hücre fonksiyonlarını doğrudan etkileyebilir. Bununla birlikte, araştırmacılar genellikle hücre yapışmasını, büyümesini ve farklılaşmasını olumlu yönde etkileyebilecek iskelelerin seçiminde zorluklarla karşılaşırken, uzun bir süre boyunca optimal yapısal destek ve stabilite sağlar 4,5. Biyoaktif moleküller genellikle iskeleye gevşek bir şekilde bağlanır ve implantasyon sırasında bu proteinlerin hızlı bir şekilde salınmasına neden olur ve bu da istenmeyen yerlerde salınımlarına neden olur. Bu, kasıtlı olarak hedeflenmeyen dokular veya hücreler üzerinde yan etkilerle sonuçlanır 6,7.

İskeleler tipik olarak polimerik malzemelerden yapılır. Janus baz nano-matrisi (JBNm), kendi kendine sürdürülebilir kıkırdak dokusu yapısı8 için yeni bir katman katman yöntemiyle oluşturulan biyomimetik bir iskele platformudur. Bu yeni DNA'dan ilham alan nanotüpler, hücre dışı matriste (ECM) bulunan kollajenin yapısını ve yüzey kimyasını düzgün bir şekilde taklit ettikleri için Janus baz nanotüpleri (JBNts) olarak adlandırılmıştır. Matrilin-3 ve Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta-1 (TGF-β1) gibi biyoaktif moleküllerin eklenmesiyle, JBNm daha sonra istenen hücre ve doku işlevselliğini uyarabilen optimal bir mikro ortam yaratabilir9.

JBNt'ler, nükleobaz adenin ve timinin sentetik versiyonlarından türetilen yeni nanotüplerdir. JBNt'ler kendi kendine montaj10 ile oluşturulur; altı sentetik nükleobaz bir halka oluşturmak için bağlanır ve bu halkalar11 μm uzunluğunda 200-300 μm uzunluğunda bir nanotüp oluşturmak için π-π istifleme etkileşimine uğrar. Bu nanotüpler yapısal olarak kollajen proteinlerine benzer; Doğal kıkırdak mikro ortamının bir yönünü taklit ederek, JBNt'lerin kondrositler ve insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'ler) için uygun bir bağlanma bölgesi sağladığı gösterilmiştir 11,12,13,14. Nanotüpler kendi kendine montaja tabi tutuldukları ve herhangi bir başlatıcı (UV ışığı gibi) gerektirmedikleri için, ulaşılması zor kusur alanları için enjekte edilebilir bir iskele olarak heyecan verici bir potansiyel gösterirler15.

Matrilin-3, kıkırdakta bulunan yapısal bir hücre dışı matriks proteinidir. Bu protein kondrogenezde ve uygun kıkırdak fonksiyonunda önemli bir rol oynar16,17. Son zamanlarda, biyomateryal iskelelerine dahil edilmiş ve hipertrofi olmadan kondrogenezi teşvik etmiştir 9,18,19. Bu proteini JBNm'ye dahil ederek, kıkırdak hücreleri, doğal mikro ortamınınkine benzer bileşenler içeren bir iskeleye çekilir. Ek olarak, kondrositler20 içinde uygun TGF-β1 sinyalizasyonu için matrilin-3'ün gerekli olduğu gösterilmiştir. Büyüme faktörleri, belirli bir hücrenin veya dokunun spesifik büyümesine neden olan sinyal molekülleri olarak işlev görür. Bu nedenle, optimal kıkırdak rejenerasyonu elde etmek için, matrilin-3 ve TGF-β1, JBNm içindeki temel bileşenlerdir. TGF-β1'in katman katman iskeleye eklenmesi, bir doku yapısında kıkırdak rejenerasyonunu daha da destekleyebilir. TGF-β1, osteokondral defektlerin iyileşme sürecini teşvik etmek, kondrosit ve hMSC proliferasyonunu ve farklılaşmasını teşvik etmek için kullanılan bir büyüme faktörüdür21,22. Bu nedenle, TGF-β1, kıkırdak rejenerasyonu JBNm'de (J / T / M JBNm)23'te önemli bir rol oynar ve özellikle JBNm katmanları içinde lokalize olduğunda uygun büyümeyi teşvik eder.

Daha önce de belirtildiği gibi, büyüme faktörleri tipik olarak belirli bir kuruluş yöntemi olmadan iskelelerin dışına monte edilir. Burada, biyomalzemelerin hassas bir şekilde tasarlanmış nano-mimarisi ile JBNm, amaçlanan hücrelerin ve dokuların spesifik olarak hedeflenmesi için geliştirilmiştir. JBNm, iç katmandaki JBNt yüzeylerine yapıştırılan TGF-β1 ve dış katman24,25'teki JBNt yüzeylerine yapıştırılan matrilin-3'ten oluşur. TGF-β1'in katman katman yapının iç tabakasına dahil edilmesi, JBNm lifleri boyunca oldukça lokalize bir mikro çevreye izin verir ve protein12'nin çok daha yavaş salınımıyla homeostatik bir doku yapısı oluşturur. JBNm'nin enjekte edilebilirliği, onu gelecekteki çeşitli biyomateryal uygulamaları için ideal bir kıkırdak doku yapısı haline getirir26.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. JBNt'lerin sentezi

  1. JBNt monomerini, çeşitli bileşiklerin sentezini içeren daha önce yayınlanmış yöntemleri kullanarak hazırlayın12.
  2. Ham JBNt monomerini, ters fazlı bir kolon kullanılarak yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ile sentezlendikten sonra saflaştırın. Solvent A: %100 su, çözücü B: %100 asetonitril ve çözücü C: pH = 1 ile HCl su çözeltisi kullanın. 3 mL/dak akış hızı kullanın. HPLC'de elde edilen en büyük zirveyi 7,2 dakikada toplayın.

2. JBNt/Matn1/TGF-β1 için imalat (Video 1)

NOT: Video 1 , JBNm'nin fizyolojik bir ortamda (su çözeltisi, UV ışığı yok, kimyasal katkı maddesi yok ve ısıtma yok) oluşan enjekte edilebilir bir katı olduğunu ve biyolojik olarak da ilham aldığını göstermektedir.

  1. Bu proteinlerin uygun şekilde karıştırılmasını sağlamak için H2 O'da askıya alınmış 8 μL 1 mg/mL TGF-β1 ila H 2 O'da asılı 1 mg/mL matrilin-3'ün32μL'sine ilave edin.
  2. TGF-β1/matrilin-3 çözeltisineH2O'da asılı 80 μL 1 mg/mL JBNts ekleyin. Doğru karıştırmayı sağlamak için tekrar tekrar pipet. Beyaz topakların varlığı, JBNt'lerin eklenmesinden hemen sonra gözlemlenebilir ve bu da JBNm'nin oluşumunu gösterir (Video 1).

3. Ultraviyole görünür (UV-Vis) absorpsiyonlu örneklerin gözlemlenmesi

NOT: UV-Vis absorpsiyon spektrumları, JBNm'nin montajını karakterize etmek için incelenmiştir. Bu ölçüm dört kategori için analiz edildi: JBNts tek başına, matrilin-3 tek başına, TGF-β1 ve üç parçadan oluşan tam katman katman JBNm. Tüm başlangıç konsantrasyonlarıH2O'da askıya alınır.

  1. JBNt grubu için, 90.9 μg / mL'lik bir çözelti oluşturmak için 50 μL H2O'ya 5 μL 1 mg / mL JBNts ekleyin.
  2. Matrilin-3 grubu için, 7.3 μg / mL'lik bir çözelti oluşturmak için 40 μL 10 μg / mL matrilin-3 ila 15 μLH2O ekleyin.
  3. TGF-β1 grubu için, 1,8 μg/mL'lik bir çözelti oluşturmak üzere 10 μL 10 μg/mL TGF-β1 ila 45 μLH2O ekleyin.
  4. JBNm grubu için, 10 μg/mL matrilin-3'ün 40 μL'sini 10 μL'lik 10 μg/mL TGF-β1'e ekleyin. Doğru karıştırmayı sağlamak için çalkalayın ve ardından çözeltiye 5 μL 1 mg/mL JBNt ekleyerek numuneyi karıştırmak için tekrar tekrar pipetleyin.
  5. Bir spektrofotometre kullanarak, her grubun absorpsiyon spektrumunu ölçün.

4. Örneklerin Zeta-potansiyel ölçümü

NOT: Zeta potansiyeli, JBNm'nin in vivo doku ile nasıl etkileşime gireceğini daha iyi tahmin etmek için analiz edilmiştir. Üç grup ölçüldü: tek başına matrilin-3, TGF-β1 ile matrilin-3 ve katman katman JBNm.

  1. Matrilin-3 grubu için, 800 μL'lik bir çözelti oluşturmak için 160 μL 10 mg / mL matrilin-3 ila 640 μLH2O ekleyin.
  2. Matrilin-3/TGF-β1 bileşiği için, 10 μg/mL matrilin-3'ün 160 μL'sini 10 μg/mL TGF-β1'in 40 μL'sine ekleyin. Uygun homojenliği sağlamak için tekrar tekrar pipet. Daha sonra, 800 μL'lik bir çözelti ile sonuçlanan 600 μLH2O'ya ekleyin.
  3. JBNm grubu için, 10 μg/mL matrilin-3'ün 160 μL'sini 10 μg/mL TGF-β1'in 40 μL'sine ekleyin. Proteinleri karıştırmak için birkaç kez pipet kullanın. Ardından, homojenliği sağlamak için çözeltiye ve pipete 20 μL 1 mg/mL JBNt ekleyin. Son olarak, 800 μL'lik bir çözelti üretmek için JBNm çözümünü 580 μLH2O'ya ekleyin.
  4. Üç grup için zeta-potansiyel değerlerini ölçün.

5. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) için JBNt / matrilin-3 nano-matrisinin hazırlanması

NOT: JBNts ve JBNm'lerin morfolojisini karakterize etmek için TEM karakterizasyonu yapılır.

  1. JBNt'lerin ve JBNm'nin yayınlanan protokollere ve üreticinin protokollerine göre negatif boyanmasından önce ızgaraları düzgün bir şekilde temizlemek için iki ızgarayı bir plazma temizleyiciye yerleştirin12.
  2. 10 μL 1 mg/mL JBNt'yi 40 μL damıtılmış suyla karıştırarak 200 μg/mL JBNt çözeltisi oluşturun.
  3. 30 μL 100 μg/mL matrilin-3 ile 20 μL 100 μg/mL TGF-β1 ve pipeti birkaç kez karıştırın. JBNm örneğini hazırlamak için matrilin-3/TGF-β1 karışımına 10 μL 1 mg/mL JBNts ekleyin. Yine, tekrar tekrar pipet.
  4. Ayrı ızgaralara 3 μL JBNt çözeltisi (200 μg/mL) ve JBNm çözeltisinden 3 μL ekleyin ve bunları 2 dakika bekletin.
  5. Her ızgarayı 100 μL uranil asetat çözeltisi (% 0.5) ile durulayın. Fazla çözeltiyi çıkarmak ve ızgaraların hava ile kurumasını sağlamak için filtre kağıtları kullanın.
  6. Daha önce yayınlandığı gibi numuneleri düzgün bir şekilde gözlemlemek ve karakterize etmek için bir transmisyon elektron mikroskobu çalıştırın11,12.

6. Floresan etiketli proteinlerin absorpsiyon spektrumlarının ölçümü

NOT: JBNm'nin yapısı, absorpsiyon spektral analizi ile JBNm'nin yapıları gözlemlenerek doğrulanır.

  1. TGF-β1'i, üreticinin talimatlarını izleyerek bir protein etiketleme kiti kullanarak etiketleyin. 8,9 μg/mL'lik bir test çözeltisi oluşturmak için TGF-β1 etiketli 20 μL ila 25 μL H 2 O arasına20μL ekleyin.
  2. Matrilin-3'ü ayrı bir etiketleme kiti kullanarak etiketleyin. 36 μg/mL'lik bir test çözeltisi oluşturmak için 20 μL 80 μg/mL etiketli matrilin-3 ila25μL H 2 O ekleyin.
    NOT: TGF-β1'in floresan boya etiketlemesi 20 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonla sonuçlanırken, matrilin-3'ün etiketlenmesi 80 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonla sonuçlandı.
  3. 20 μL 80 μg/mL etiketli matrilin-3 ile 20 μL 20 μL etiketli TGF-β1 ve 5 μL H2O ile karıştırın ve etiketli TGF-β1/matrilin-3 bileşiği elde edin. Karıştırmak için karışımı birkaç kez pipetleyin.
  4. 40 μLH2O'ya 5 μL 1 mg/mL JBNts ekleyin, bu da 111 μg/mL'lik bir çözelti ile sonuçlanır.
  5. TGF-β1 etiketli 20 μg/mL'lik 20 μL ila 80 μg/mL'lik 20 μL'lik matrilin-3 etiketli matrilin-3 ve pipeti birkaç kez ekleyin. Etiketli TGF-β1/ matrilin-3 çözeltisine 5 μL 1 mg/mL JBNt ekleyin ve bileşiği düzgün bir şekilde karıştırmak için tekrar tekrar pipet ekleyin.
    NOT: TGF-β1 etiketli JBNt ve etiketli matrilin-3 numunelerinin nihai konsantrasyonları sırasıyla 111 μg / mL, 8.9 μg / mL ve 36 μg / mL idi.
  6. Her numune grubunu (yani, TGF-β1 (adım 6.1) etiketli, matrilin-3 etiketli (adım 6.2), TGF-β1/matrilin-3 etiketli (adım 6.3), JBNts (adım 6.4), JBNm (adım 6.5)) siyah 384 delikli bir plakanın kendi kuyusuna aktarın.
  7. Siyah 384 delikli plakayı çok modlu bir mikro plaka okuyucuya yükleyin ve üreticinin protokolünü izleyerek 488 nm ve 555 nm uyarma dalga boylarında ölçümler yapın.

7. In vitro biyolojik fonksiyon testi

  1. Önceden kaplanmış kapak camı odalarında hücre yapışma testi
    1. Her hücre tipi için bir kapak camı kullanıldığından, beş grup numune içeren iki odacıklı kapak camı hazırlayın.
    2. 198.75 μL damıtılmış suya 1.25 μL 1 mg/mL JBNts ekleyin ve 6.25 μg/mL'lik bir çözelti elde edin.
    3. 10 μL 10 μg / mL matrilin-3 ila 190 μL damıtılmış su ekleyin, bu da 0,5 μg / mLsolution ile sonuçlanır.
    4. 197,5 μg/mLof damıtılmış suya 2,5 μL 10 μg/mL TGF-β1 ekleyin ve 0,125 μg/mLsolution elde edin.
    5. JBNm grubu için 10 μL 10 μg/mL matrilin-3 ila 2,5 μL 10 μg/mLTGF-β1 ekleyin ve tekrar tekrar pipet ekleyin. Karışım çözeltisine ve pipete 1 mg/mL'lik bir konsantrasyonda 1.25 μL JBNt ekleyin. Son olarak, 200 μL JBNm çözeltisi elde etmek için 186.25 μL damıtılmış su ekleyin.
      1. Kontrol grubu için 200 μL damıtılmış su kullanın.
    6. Her numune grubunu 1,5 numaralı odacıklı bir kapak camının kendi kuyusuna ekleyin. Kapak camını 1 saat boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin ve ardından bir liyofilizatör aletiyle dondurarak kurutun.
    7. İnsan mezenkimal kök hücrelerini (hMSC'ler) ve insan kondrosit hücrelerini (kuyu başına 10.000 hücre) hazırlanan odacıklı örtü camlarının her bir kuyucuğuna tohumlayın.
    8. İki kapak gözlüğünü 37 °C'lik bir inkübatörde 4 saat boyunca inkübe edin. Daha sonra, hücre kültürü ortamını aspire edin ve PBS ile iki kez durulayın.
    9. Hücreleri 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve ardından PBS ile numuneleri çıkarın ve durulayın. % 4'lük paraformaldehiti tamamen çıkarmak için numuneyi ikinci kez durulayın.
    10. 10 dakika boyunca 100 μL% 0.1 Triton-X içeren hücreleri inkübe edin ve PBS ile yıkayın. Her bir kuyucuğa 100 μL 0.165 μM rodamin-faloidin ekleyin. 30 dakika bekleyin ve ardından PBS ile tekrar yıkayın.
    11. Çekirdekleri boyamak için her bir oyuğa 0,1 μg / mL DAPI ekleyin. 5 dakika bekleyin ve kuyucukları PBS ile iki kez durulayın.
    12. Hücre morfolojisini gözlemlemek ve floresan görüntüleri yakalamak için spektral konfokal mikroskop kullanın.
    13. Ayrıca, görüntü işleme yazılımını kullanarak hücre sayısını ve morfolojisini analiz edin. Yazılımı açın ve görüntüleri yükleyin. Bir ölçek çubuğu ekleyin ve yazılımı kalibre edin. Her örnek için belirli bir alandaki hücre sayısını sayın. Ardından, her örnek için hücre morfolojisi hakkında veri toplamak üzere ölçüm aracını kullanın.
  2. Hücre çoğalması
    1. Her birine beş grup numune ekleyerek işlenmemiş üç adet 96 kuyucuklu plaka hazırlayın.
      1. JBNt grubu için, 596.25 μL damıtılmış suya 3.75 μL 1 mg / mL JBNts ekleyin, böylece 6.25 μg / mL konsantrasyonda 600 μL JBNt çözeltisi elde edilir.
      2. TGF-β1 grubu için, 7,5 μL 10 μg/mL TGF-β1 ila 592,5 μL damıtılmış su ilave edilerek 0,125 μg/mL test çözeltisi elde edilir.
      3. Matrilin-3 grubu için, 30 μL 10 μg / mL matrilin-3 ila 570 μL damıtılmış su ekleyin, bu da 0.5 μg / mL'lik bir test çözeltisi ile sonuçlanır.
      4. JBNm grubu için, 7,5 μL 10 μg/mL TGF-β1'i 30 μL 10 μg/mL matrilin-3 ve pipetle birkaç kez karıştırın, ardından çözeltiye 3,75 μL 1 mg/mL JBNt ekleyin.
      5. JBNt, TGF-β1 ve matrilin-3 numuneleri için sırasıyla 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL ve 0,5 μg/mL nihai konsantrasyonları elde etmek için JBNm çözeltisini 558,75 μL damıtılmış su ile seyreltin.
      6. Kontrol grubu için 600 μL damıtılmış su kullanın.
    2. Her numune grubunu altı kuyucuğa bölün (kuyu başına 100 μL numune).
    3. Tüm numuneleri içeren üç plakayı 1 saat boyunca -80 °C'lik bir dondurucuya yerleştirin ve ardından bir liyofilizasyon aleti ile dondurarak kurutun.
    4. Bu plakalara hMSC'leri tohumlayın, her biri 5.000 hücre içeren 100 μL hücre süspansiyonu (kuyu başına) alır. Üç plakayı 37 ° C'de 1 gün, 3 gün veya 5 gün% 5 CO2'de inkübe edin.
    5. Hücrelerle birlikte her bir oyuğa 10 μL CCK-8 çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 2 saat daha inkübe edin.
    6. Her bir kuyucuğun absorpsiyon değerlerini, 450 nm'de çok modlu mikro plakalı okuyucularla ölçün.
    7. Bilinen bir hMSC gradyanını 96 kuyucuklu bir plakaya tohumlayın ve 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın. Bilinen hücre sayısının absorpsiyon değerlerini ölçmek ve standart bir eğri oluşturmak için CCK-8 testini kullanın.
    8. Emilim standart eğrisini kullanarak hücre proliferasyonunu hesaplayın.
  3. Stabilite testi
    NOT: Bir insan TGF-β1 hedefli ELISA kiti, TGF-β1'in bir agaroz hidrojelinde JBNm'den yüzde salınımını belirlemek için kullanılmıştır.
    1. 20 mL PBS'ye 400 mg agaroz tozu ekleyerek ve agaroz tozunu tamamen çözmek için 100 ° C'ye kadar ısıtarak% 2 agaroz hazırlayın.
    2. JBNm'yi soğutulmuş% 2 agaroz hidrojeli içinde hazırlayın.
      1. 10 μL 10 μg/mL TGF-β1, 40 μL 10 μg/mL matrilin-3, 5 μL 1 mg/mL JBNts ve 195 μL PBS'yi birleştirin. Bu çözeltiyi 250 μL% 2 agaroz ile karıştırın ve JBNm hidrojelini oluşturun.
    3. Bir serbest bırakma çözümü olarak kullanarak 500 μL PBS ekleyin ve her 3 günde bir değiştirdiğinizden emin olun. Serbest bırakılan her çözeltiyi saklayın ve numuneyi 15 gün bekletin.
    4. Üreticinin talimatlarını izleyerek yakalanan serbest bırakma çözümlerinin her birini test etmek için bir ELISA kiti kullanın.
      NOT: PBS'de salınan TGF-β1 miktarının teorik yükleme değeri olan %100'den çıkarılmasıyla, kalan TGF-β1 miktarı belirlenebilir.
  4. PCR26 ile hücre farklılaşma analizi.
    1. Her numune 20 μL hücre süspansiyonu (4 x 104 hücre), spesifik çözeltinin 30 μL'si (veya numune grubuna bağlı olarak PBS) ve 50 μL ağırlıkça %2 agaroz içeren yedi numune grubu hazırlayın.
      1. TGF-β1 grubu için, 5 μL 10 μg / mL TGF-β1 ila 25 μL PBS ekleyin, bu da 1.6 μg / mL'lik bir çözelti ile sonuçlanır.
      2. Matrilin-3 grubu için, 20 μL 10 μg / mL matrilin-3 ila 10 μL PBS ekleyin, bu da 6.7 μg / mL'lik bir çözelti ile sonuçlanır.
      3. JBNt grubu için, 27,5 μL PBS'ye 2,5 μL 1 mg/mL JBNt ekleyin ve 83,3 μg/mL'lik bir çözelti elde edin.
      4. J/T/M JBNm grubu için, çözeltiyi karıştırmak üzere 10 μL 10 μg/mL matrilin-3 ila 5 μL 10 μg/mL TGF-β1 ve pipet yukarı ve aşağı ekleyin. Ardından, 2,5 μL 1 mg/mL JBNt ve pipeti tekrar ekleyin. Son olarak, 2.5 μL PBS ile seyreltin.
      5. Her kontrol grubu için örnek olarak 30 μL PBS kullanın.
    2. Her bir kuyucuğa 0,5 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve her 3 günde bir değiştirdiğinizden emin olun.
      1. Pozitif kontrol grubu için, ilave TGF-β1 içeren ticari olarak temin edilebilen bir hMSC kondrojenik ortam kullanın. Bu ek TGF-β1, hem TGF-β1 hem de J/T/M JBNm gruplarındaki miktara eşittir.
      2. Negatif kontrol gruplarından biri için, TGF-β1 içermeyen ticari bir hMSC kondrojenik ortam kullanın. Diğer negatif kontrol grubu için,% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren bir DMEM hücre kültürü ortamı kullanın.
      3. Diğer tüm gruplar için, TGF-β1 olmadan ticari bir hMSC kondrojenik hücre kültürü ortamı kullanın.
    3. Örnekleri 15 gün boyunca kültürleyin.
    4. Örneklerin RNA'sını çıkarın ve daha önce açıklandığı gibi örneklerin farklılaşmasını incelemek için PCR gerçekleştirin26.
  5. Tip X kollajen ekspresyon testi için immün boyama
    1. Yedi agaroz bazlı numuneyi, PCR yöntemi bölümü ile hücre farklılaşması ile aynı şekilde hazırlayın (adım 7.4).
    2. Örnekleri 15 gün boyunca kültürleyin.
    3. Numuneleri 1 gün boyunca% 4 formaldehit ile sabitleyin, gece boyunca% 30 sakkaroz çözeltisine batırın ve daha sonra sıvı azot ile -80 ° C'de gece boyunca dondurun. Numuneleri, suda çözünür glikoller ve reçinelerin bir karışımı olan optimum kesme sıcaklığı bileşik reaktifini (OCT) kullanarak -10 °C'de sabitleyin.
    4. Her numunenin 20 μm kalınlığında dondurulmuş bölümlerini elde etmek için bir kriyostat mikrotomu çalıştırın.
    5. Üreticinin protokollerine göre, her bölümü 1:800 seyreltme ile bir Anti-Collagen X antikoru ve PBS ile seyreltilmiş bir floresan etiketleme ikincil antikoru ile sabitleyin.
    6. Her bölümü, 488 nm'lik bir uyarım ve göz merceği üzerinde 40x büyütme kullanarak bir konfokal mikroskopla gözlemleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokolü takiben, JBN'ler başarıyla sentezlendi ve UV-Vis absorpsiyonu ve TEM ile karakterize edildi. JBNm, hızlı bir biyomimetik işlemden geçen enjekte edilebilir katı bir iskeledir. JBNt'ler fizyolojik bir ortamda TGF-β1 / matrilin-3 çözeltisinin bir karışımına eklendikten sonra, Şekil 1'de görüldüğü gibi JBNm'nin başarılı bir şekilde monte edildiğini gösteren katı bir beyaz örgülü iskele oluşturuldu. Bu, karakterizasyon yöntemlerinde gösterilmiştir.

Fizyolojik koşullar altında, matrilin-3, izoelektrik noktası27 nedeniyle negatif yüklüdür (Şekil 2A). TGF-β1 çözeltisinin matrilin-3 çözeltisine eklenmesinden sonra, TGF-β1 / matrilin-3 bileşiğinin zeta-potansiyeli, iki proteinin yük etkileşimleri yoluyla bağlandığını gösteren nötr bir değere yükselmiştir. Şekil 2A'da görüldüğü gibi, JBNm'nin zeta potansiyeli, JBNt'ler nedeniyle üç grup arasında en yüksek olanıdır, çünkü lizin yan zincirinin izoelektrik noktası fizyolojik bir ortamda 9.74 civarındadır. JBNm'nin zeta potansiyeli değerlerindeki artış, katman katman yapısının başarılı bir şekilde monte edildiğini gösterir.

UV-Vis absorpsiyon spektrumları (Şekil 2B), JBNm'nin hiyerarşik katman katman iç yapısının oluşumunu açıklığa kavuşturur. Lizin yan zincirlerinin ve JBNt'lerin aromatik halkaları, sırasıyla 220 nm ve 280 nm'deki iki absorpsiyon zirvesine katkıda bulunmuştur. Emilim değerindeki azalma, TGF-β1 ilavesinden sonra gözlendi, bu da TGF-β1 ve JBNts arasında bağlanmanın gerçekleştiğini gösterdi. JBN'lerin matrilin-3'e eklenmesinden sonra, zirvelerin absorpsiyon yoğunluğunda daha belirgin bir azalma gözlendi ve bir kez daha matrilin-3 ve JBNt'ler arasında başarılı bir bağlanma olduğunu gösterdi. Benzer şekilde, JBNt'lerin TGF-β1 / matrilin-3 karışımına eklenmesinden sonra, JBNm oluşturuldu ve absorpsiyon zirveleri yoğunlukta azaldı. JBNm'nin absorpsiyon zirvesi, matrilin-3 / JBNts hattına TGF-β1 / JBNts hattından daha yakındır, bu da JBNt'lerin matrilin-3'e bağlanmayı tercih ettiğini, TGF-β1 ise iç katmanda bulunurken matrilin-3 ile katman katman dış yapı oluşturduğunu gösterir. TEM, JBNts ve JBNm'nin morfolojisini karakterize etmek için kullanılır (Şekil 2C). Proteinlerle birleştikten sonra, kalın JBNm demetlerinin bir iskele yapısı oluşturduğu gözlendi.

Floresan mikroskopi, katman katman yapının varlığını doğrulamıştır (Şekil 3A) ve JBNm'nin kesitini göstermiştir. TGF-β1 ve matrilin-3 etiketlendikten sonra, kırmızı floresan matrilin-3'ün JBNt demetlerini sardığı ve JBNm'nin dış tabakasını oluşturduğu gözlenmiştir. Şekil 3B'de, yeşil floresan TGF-β1, büyüme faktörlerini depolama kabiliyetine katkıda bulunan ve TGF-β1'in lokalizasyonuna izin veren bir iç tabaka oluşturdu. Şekil 3C , floresan spektrumları ile karakterize edilen floresan boya etiketli proteinler arasındaki floresan rezonans enerji transferi (FRET) sürecini, etiketli TGF-β1 ve matrilin-3 grupları için sırasıyla 520 nm ve 570 nm'de emisyon zirveleri ile göstermektedir28. JBNt'lerin protokole göre eklenmesinden sonra, katman katman yapı oluşturulur; JBNm grubu için hem 520 nm hem de 570 nm'de zirveler gözlendi, bu da proteinlerin ve JBNt'lerin başarılı bir şekilde bağlandığını ve birleştirildiğini gösterdi.

Ek olarak, JBNm'nin hMSC'lerin yapışması ve hücre proliferasyonu üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Şekil 4'te gösterildiği gibi, odacıklı kapak camlarının yüzeyindeki JBNm kaplamasının hücre yapışma yoğunluğu belirlenmiştir. JBNm, hMSC'lerin kendi boyunca kümelendiğini gösterdi (Şekil 4A), oysa JBNt'lere daha az hücre yapıştı. Bununla birlikte, diğer gruplar için, hMSC'ler JBNm grubuna kıyasla hizalama olmadan eşit olarak dağıtıldı. Hücrelerin hizalanması ve JBNm'deki hücrelerin büyüklüğü, JBNt'lerin hücre yapışmasında rol oynadığını, JBNm'deki proteinlerin ise hücre yapışmasının afinitesini arttırdığını göstermiştir (Şekil 4B, C).

JBNm, JBNts, tek başına matrilin-3, tek başına TGF-β1 ve negatif kontrol ile hücre kültürünün 1. gününden sonra, JBNm ve TGF-β1 grupları diğer gruplara kıyasla önemli hücre proliferasyonu gösterdi. Hücre kültürü süresi 3 ve 5 güne yükseldiğinde, JBNm ve TGF-β1 grupları, Şekil 5'te görüldüğü gibi daha da artmış hücre proliferasyonu göstermiştir. hMSC'lerin JBNm ile ve JBNm olmadan (negatif kontrol) farklılaşmasını belirlemek için uzun süreli bir fonksiyon çalışması yapıldı. 15 gün sonra, JBNm26 ile birlikte büyüyen hMSC'lerin kondrogenezini gösteren gelişmiş bir Alcian mavisi lekesi gözlendi. Böylece, hücreler JBNm'nin JBNt'lerini tercih ettiler. Bu muhtemelen DNA taklit eden yapısı ve küçük moleküllü birimlere demonte edilme kabiliyetinden kaynaklanıyordu, ikincisi düşük pH veya yeterli enzimatik aktivite (hücreler tarafından alım gibi) ile tetiklenebilir14,29.

Video 1: JBNm montajının video kaydı. Bu kayıt, JBNt'lerin, matrilin-3'ün ve TGF-β1'in JBNm'ye oluşumunu göstermektedir. Bu rakam Zhou ve ark. (2021)26'dan değiştirilmiştir. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Figure 1
Şekil 1: JBNt'lerin kimyasal yapısının, J/T/M JBNm'in kondrojenik yeteneğinin şematik gösterimi. (A) JBNt'lerin kimyasal yapısı, monomerden rozet halkasına ve JBNt'ye oluşumlarını vurgulayarak. (B) J/T/M JBNm'i oluşturan bileşenler ve JBNm'e nasıl monte edildikleri (C ) J/T/M JBNm üzerinde insan mezenkimal kök hücrelerinin kültürlenmesinin şeması. Bu rakam Zhou ve ark. (2021)26'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: J/T/M JBNm. (A) Tek başına matrilin-3'ün Zeta-potansiyel spektrumlarının, TGF-β1/matrilin-3 bileşiğinin ve J/T/M JBNm. (B) JBNt'lerin UV-Vis absorpsiyon spektrumlarının tek başına, matrilin-3, TGF-β1 tek başına, matrilin-3/JBNts bileşiğinin, TGF-β1/JBNts bileşiğinin ve J/T/M JBNm. (C ) Tek başına JBNt'lerin ve transmisyon elektron mikroskobundan (TEM) elde edilen J/T/M JBNm'nin görüntüleri. Bu rakam Zhou ve ark. (2021)26'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: J/T/M JBNm'in floresan konfokal görüntüleme ve floresan spektrumları. (A) J/T/M JBNm'nin kırmızı floresan etiketli matrilin-3 ve yeşil floresan etiketli TGF-β1 ile 3D konfokal görüntüsü. (B) J/T/M JBNm'in kırmızı floresan etiketli matrilin-3, yeşil-floresan etiketli TGF-β1 ve birleştirilmiş versiyonlu 2D konfokal görüntüleri. (C) Etiketli proteinler arasındaki FRET sürecini karakterize etmek için çeşitli bileşiklerin floresan spektrumları. Bu rakam Zhou ve ark. (2021)26'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: İnsan mezenkimal kök hücre (hMSC) kültürünün analizi. (A) Bir agaroz jeli üzerinde kültürlenen TGF-β1, matrilin-3 ve JBNts ile hMSC'lerin optik mikroskopi görüntüleri. (B) Çeşitli JBNm bileşenleri ile kaplanmış odacıklı kapak camı üzerinde kültürlenmiş hMSC'lerin konfokal mikroskopi görüntüleri. (C) Her grup için milimetre kare başına yapıştırılan hücre sayısının grafiği. Hata çubukları standart sapmaları gösterir. (D) Grup başına μm cinsinden hücre ana eksen uzunluğunun grafiği. Hata çubukları standart sapmaları gösterir. Not: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (negatif kontrollerle karşılaştırıldığında, NC). Bu rakam Zhou ve ark. (2021)26'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: 1, 3 ve 5. günler arasında çeşitli gruplar için hücre sayılarının karşılaştırılması. 1, 3 ve 5. günlerde farklı malzemelerle kültürlendikten sonra hMSC'lerin hücre sayısı istatistikleri. Hata çubukları standart sapmaları gösterir. Not: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P 0,0001 <. Bu rakam Zhou ve ark. (2021)26'dan değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu çalışmanın amacı, hücre farklılaşmasına aracılık etmek için hücre kültürü ortamlarına dayanan geleneksel doku yapılarının sınırlamalarının üstesinden gelmek için biyomimetik bir iskele platformu olan JBNm'yi geliştirmektir. JBNm, kendi kendine sürdürülebilir bir kıkırdak doku yapısı için katman katman bir yapı iskelesi. Yenilikçi tasarım, DNA'dan ilham alan yeni nanomalzemelere, JBNts'lere dayanmaktadır. JBNts30, TGF-β1 ve matrilin-3'ten oluşan JBNm, iskelenin kendi kendine montajının moleküler düzeyde kontrol edildiği yeni bir katman katman tekniği ile birleştirilmiştir. JBNm'nin montajı gözlemlendi ve zeta-potansiyel ölçümü, UV-Vis emilimi, TEM ve floresan spektral analizi ile karakterize edildi.

Şekil 2B'deki (adım 3) UV-Vis spektrumları, JBNm'nin hiyerarşik katman katman iç kısmının oluşumunu göstermiştir. Bağlanma afinitesindeki bir farklılık nedeniyle absorbans piklerinde bir fark gözlenebilir. JBNt'ler ve matrilin-3 arasında, JBNt'ler ve TGF-β1 arasındakinden daha büyük etkileşimler meydana gelir, bu da JBNt'lerin lifli morfolojileri ve lizin yüzey kimyası açısından kollajen proteinlerini taklit ettiğini gösterir. Bu teknik, JBN'lerin TGF-β1 yerine matrilin-3'e bağlanmasını gözlemlemek için gereklidir, TGF-β1'in kapsüllenmesine izin verir ve bu nedenle TGF-β1'in çevre dokuya yavaş bir şekilde salınmasını sağlar. JBNm'nin geliştirilmesindeki en kritik adım, proteinlerin JBNt'lerle kombinasyonudur. TGF-β1 ve matrilin-3, etiketli matrilin-3 ve TGF-β1 arasındaki FRET fenomeninin tam etkisini gözlemlemek için JBNt'lerin eklenmesinden önce eklenmelidir. Bu tekniğin sınırlandırılması, proteinlerin ve nanotüplerin yanlış ekleme dizisinden kaynaklanır ve çeşitli ölçümlerle sonuçlanır. Bu, gelecekteki çalışmalar için JBNm'nin oluşumu için önemli bir adımdır ve bu nedenle gelecekteki JBNm imalatlarına ve çalışmalarına uygulanacaktır.

Matrilin-3 oldukça negatif bir proteindir, oysa TGF-β1, Şekil 2A'da görüldüğü gibi hafif nötr bir proteindir. Bu proteinlerin bağlanmasını belirlemek için yük farkı gözlendi. Matrilin-3'ün negatif yüklü durumundan, zeta-potansiyeli, TGF-β1'in eklenmesinden sonra nötre yakın bir değere yükselmiştir (Şekil 2A). Bu adım, biyomimetik iskelenin ilk iç tabakasını belirlemek ve her iki proteinin kombinasyonunun yük etkileşimi yoluyla olduğunu belirtmek için önemlidir. JBNm üretiminin ikinci adımı olan JBNts'lerin eklenmesinden sonra, JBNm'nin zeta potansiyeli ~ 10 ± 5 mV'de ölçülmüştür (Şekil 2A). JBNt'ler oldukça pozitif olduğundan, JBNm yükünün beklendiği gibi arttığı gözlenmiştir. Zeta-potansiyeli olan yüklerin belirlenmesi, yük etkileşimleri yoluyla JBNm'nin oluşumunu adım adım gözlemlemek için önemlidir. UV-Vis spektroskopisine benzer şekilde, toplama sırası bu adımda önemlidir ve yanlış ekleme sırası çeşitli ölçümlere neden olabilir. Benzer şekilde, ölçümden önce karışımın yukarı ve aşağı pipetlenmesi de önemlidir.

Daha sonra, TGF-β1 ve matrilin-3, JBNm'nin gelişiminin konfokal mikroskopi ve çok modlu mikroplaka okuyucularla floresan spektral analizi ile gözlemlenebilmesi için etiketlenmiştir. Örnekler 488 nm lazer ile uyarıldı ve 520 nm ve 570 nm'de emisyon zirveleri gösterdi (Şekil 3). Etiketlenmedikleri için yalnızca JBNt'ler için emisyon zirvesi gözlenmemiştir. FRET, TGF-β1 donöründen matrilin-3 alıcısına meydana geldi, böylece emisyon zirvesini 520 nm'de azalttı ve emisyon zirvesini 570 nm'de artırdı; İki bileşen, FRET fenomeninin meydana gelmesine izin veren mesafeden 10 nm uzaklıktadır. Bu nedenle, JBNm'nin montajı, yük etkileşimleriyle birlikte mekansal (yani fiziksel mesafe) süreçlere dayanır. JBNm'nin geliştirilmesindeki en kritik adım ekleme dizisidir; FRET fenomeninin tam etkisini gözlemlemek için JBNt'lerin eklenmesinden önce TGF-β1 ve matrilin-3 eklenmelidir. Floresan JBNm'yi gözlemlemek için göz merceğinde en az 40x büyütme gereklidir. Bu tekniğin sınırlaması, JBN'lerin etiketlenmemesi ve bu nedenle konfokal mikroskopi ile gözlemlenememesidir. Bununla birlikte, protein etiketleme tekniği, gelecekteki uygulamalar için bazı değişikliklerle JBNt'yi etiketlemek için uygulanabilir.

JBNm, hücre yapışması ve hücre çoğalması gibi hücre fonksiyonlarına yardımcı olabilir. Bu çalışmada, hMSC'ler, hücre proliferasyonunu belirlemek için kesin üreticinin protokollerini izleyerek, CCK-8 çözeltisi kullanılarak 1, 3 ve 5 gün boyunca inkübasyondan sonraki hücre sayılarını karşılaştırmak için farklı materyaller (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilin-3 ve katkı maddesi içermeyen negatif kontroller) üzerinde (5.000 hücreden başlayarak) kültürlendi. JBNm, özellikle TGF-β1 varlığında ve TGF-β1 tek başına diğer üç gruba kıyasla önemli hücre proliferasyonu gösterdi. JBN'ler ECM'deki kollajeni morfolojik olarak taklit ederken, matrilin-3 kıkırdak spesifik bir proteindir ve 3 ve 5 gün boyunca 37 ° C'de inkübasyondan sonra hücre proliferasyon aktivitesinin artmasına neden olur (Şekil 5). JBNm, biyomalzemeler29,31 gibi gelecekteki çeşitli uygulamalar için geleneksel hücre yapılarının sınırlamalarının üstesinden gelmek için enjekte edilebilir ve biyomimetik doku mühendisliği iskelesi olarak hizmet etmek için büyük bir potansiyel göstermiştir. JBNm, kıkırdak ECM'yi morfolojik olarak taklit eder, yapışma bölgeleri sağlar ve TGF-β132,33 gibi pro-kondrojenik diferansiyatif faktörlerin mikro çevreye salınmasına izin verir. JBNm'nin TGF-β1'i iskelenin iç tabakasına dahil etme yeteneği, istenmeyen alanlara sızmasını önler, böylece iskelenin etkinliğini arttırır (Şekil 4 ve Şekil 5). Birçok hMSC'nin JBNm iskelesi boyunca kümelendiği görülürken, hücreler matrilin-3, TGF-β1 ve negatif kontrol gruplarında seyrek olarak dağılmıştır (Şekil 4). Hücrelerin morfolojisi de gözlendi ve JBNm yüzeyleriyle mükemmel afinite gösterdi. Bu hassas şekilde tasarlanmış biyomalzemeler, birleştirilmiş biyoaktif moleküllerin hücre kültürü ortamına hızlı bir şekilde salınmasını önler ve matris34 içindeki doku yapılarının kendi kendine sürdürülebilirliğini arttırır. Bu tekniğin bir sınırlaması, başlangıç hücre sayılarının hücrelerin çoğalmasını belirlemek için kritik öneme sahip olmasıdır. Bu çalışma için en uygun 5.000 başlangıç hücre sayısı bulundu. Bilinen sayıda hücreyi çizerek ve bunları çok modlu mikroplaka okuyucuda ölçerek hücre sayısını belirlemek için standart bir eğriye de ihtiyaç vardır. Bu teknik, gelecekte JBNm iskeleleri ile ilgili tüm çalışmalarda hücre proliferasyonunu belirlemek için standartlaştırılmış bir yöntem olarak uygulanabilir.

hMSC'ler, 15 gün boyunca uzun vadeli fonksiyon çalışmasını belirlemek için JBNm'li ve JBNm'siz 3D agaroz peletlerinde kültürlendi. 15 gün sonra, agaroz peletlerindeki hMSC'lerden pozitif kontrol içeren toplam RNA ekstrakte edildi (peletler, ortam her değiştirildiğinde taze TGF-β1 ile beslendi), JBNm, JBNts, matrilin-3, TGF-β1 ve hiçbir katkı maddesi içermedi. Gen analizi için gerçek zamanlı qPCR gerçekleştirildi, kondrojenik farklılaşma belirteçleri, Aggrekan (ACAN) ve hipertrofi belirteci tip X kollajen (COL X) için test edildi. JBNm grubundaki ACAN ekspresyonu, diğer gruplara kıyasla anlamlı olarak artmıştır ve JBNm'nin COL X'i inhibe ederken kök hücre kondrojenik farklılaşmasını önemli ölçüde desteklediğini göstermiştir. Bu arada, pozitif kontrol, ACAN'daki artışta belirtildiği gibi kondrogenezi ve ayrıca farklılaşmış hücre26'nın hipertrofisini arttırmıştır. Bu çalışmanın bir başka sınırlaması, RNA ekstraksiyonunun bir hidrojel içine gömülü hücrelerden olmasıdır. Bu nedenle bu protokolde elde edilen toplam RNA, konsantrasyon ve saflık bakımından düşüktü. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, bir sonraki adım olan gerçek zamanlı qPCR için en uygun konsantrasyonu ve saflığı elde etmek üzere daha fazla numune kültürlendi ve ekstrakte edildi. qPCR çalışma için önemli olsa da, çok sayıda numuneden ödün vermeden verimli numune ekstraksiyonu sağlamak için gelecekteki çalışmalar için bu tekniğin küçük bir modifikasyonu gereklidir.

JBNm hidrojelinden protein salınımını test etmek için bir insan TGF-β1 ELISA kiti ile bir stabilite testi yapıldı. Bu çalışmada, TGF-β1'in J/T/M JBNm'de kapsüllenmesi beklenmektedir ve bu nedenle TGF-β1 salınımı gözlenmemelidir (yani teorik yükleme değeri %100'dür). Bu adımın bir sınırlaması, tüm TGF-β1'in JBNm katman katman iskelesine kapsüllendiğinin varsayılmasıdır. 15 gün sonra, hidrojelden salınan çözeltiler, üreticinin protokollerini izleyerek kit ile toplanır ve test edilir. Daha sonra, TGF-β1 miktarı, PBS'de serbest bırakılan TGF-β1 miktarının teorik yükleme değerinden çıkarılmasıyla hesaplandı. TGF-β1, JBNm'nin iç tabakasında kapsüllendiğinden, proteinin yavaş salınması bekleniyordu. Çalışma, TGF-β1'in JBNm iskelesi içinde lokalize olduğunu ve çevredeki alanlara hızla salınmadığını göstermiştir26.

Bu yenilikçi katman katman JBNm kıkırdak doku yapısı, moleküler düzeyde son derece organize ve kontrollü kendi kendine montaj ile gerçekleştirildi. TGF-β1, matris liflerinin iç tabakasında hapsedilir, istenmeyen yerlere sızmasını önler ve aynı anda lokalize kondrogenezi teşvik eder. Ek olarak, matrilin-3, matris liflerinin dış tabakasında lokalize olur ve anti-hipertrofik bir mikro ortam35 oluşturur. JBN'lerin sadece yapısal bir iskele omurgası olarak hizmet etmekle kalmayıp, aynı zamanda matris lifleri boyunca hücreleri lokalize etmek için kök hücre ankrajını ve yapışmasını arttırdığı gösterilmiştir30,36. Gelecekteki çalışmalara gelince, JBNt tabanlı iskelenin katman katman tasarımı, çeşitli dokulardaki uygulamalar için özelleştirilecektir37,38,39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Yupeng Chen, Eascra Biotech, Inc. ve NanoDe Therapeutics, Inc.'in kurucu ortaklarından biridir.

Acknowledgments

Bu çalışma, NIH hibeleri 7R01AR072027 ve 7R03AR069383, NSF Kariyer Ödülü 1905785, NSF 2025362 ve Connecticut Üniversitesi tarafından desteklenmektedir. Bu çalışma kısmen NIH hibesi S10OD016435 tarafından da desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Tags

Biyomühendislik Sayı 185
Kıkırdak Rejenerasyonunu Teşvik Etmek için Katman Katman Janus Baz Nano-Matrisinin Üretimi ve Karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter