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Bioengineering

Fabbricazione e caratterizzazione di nano-matrice di base Janus strato per strato per promuovere la rigenerazione della cartilagine

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Questo protocollo descrive l'assemblaggio di un'impalcatura a nano-matrice di base Janus (JBNm) strato per strato aggiungendo sequenzialmente nanotubi di base Janus (JBNts), matrilina-3 e fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1). Il JBNm è stato fabbricato e caratterizzato; Inoltre, ha mostrato un'eccellente bioattività, incoraggiando le funzioni cellulari come l'adesione, la proliferazione e la differenziazione.

Abstract

Sono stati sviluppati vari scaffold di biomateriali per guidare l'adesione e la proliferazione cellulare nella speranza di promuovere funzioni specifiche per usi in vitro e in vivo . L'aggiunta di fattori di crescita in questi scaffold di biomateriali viene generalmente effettuata per fornire un ambiente di coltura cellulare ottimale, mediando la differenziazione cellulare e le sue successive funzioni. Tuttavia, i fattori di crescita in uno scaffold di biomateriale convenzionale sono tipicamente progettati per essere rilasciati al momento dell'impianto, il che potrebbe causare effetti collaterali non intenzionali sui tessuti o sulle cellule circostanti. Qui, la nano-matrice di base Janus ispirata al DNA (JBNm) ha ottenuto con successo un microambiente altamente localizzato con una struttura strato per strato per costrutti di tessuto cartilagineo autosostenibili. I JBNm sono auto-assemblati da nanotubi di base Janus (JBNts), matrilina-3 e fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1) tramite bioaffinità. Il JBNm è stato assemblato con un rapporto TGF-β1:matrilin-3:JBNt di 1:4:10, poiché questo è stato il rapporto determinato al quale potrebbe avvenire un corretto assemblaggio nella struttura strato per strato. In primo luogo, la soluzione TGF-β1 è stata aggiunta alla soluzione di matrilina-3. Quindi, questa miscela è stata pipettata più volte per garantire una sufficiente omogeneità prima dell'aggiunta della soluzione JBNt. Questo ha formato il JBNm strato per strato, dopo aver pipettettato più volte di nuovo. Sono stati eseguiti una varietà di esperimenti per caratterizzare la struttura JBNm strato per strato, JBNts da solo, matrilina-3 da solo, e TGF-β1 da solo. La formazione di JBNm è stata studiata con spettri di assorbimento UV-Vis e la struttura del JBNm è stata osservata con microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Poiché l'innovativa impalcatura JBNm strato per strato si forma su scala molecolare, è stato possibile osservare il JBNm marcato con colorante fluorescente. Il TGF-β1 è confinato all'interno dello strato interno del JBNm iniettabile, che può impedire il rilascio di fattori di crescita nelle aree circostanti, promuovere la condrogenesi localizzata e promuovere un microambiente anti-ipertrofico.

Introduction

Gli scaffold nell'ingegneria tissutale svolgono un ruolo vitale nel fornire supporto strutturale per l'attaccamento cellulare e il successivo sviluppo tissutale1. Tipicamente, i costrutti tissutali convenzionali senza alcuna impalcatura si basano sull'ambiente di coltura cellulare e sui fattori di crescita aggiunti per mediare la differenziazione cellulare. Inoltre, questa aggiunta di molecole bioattive negli scaffold è spesso l'approccio preferito nel guidare la differenziazione e la funzione cellulare 2,3. Alcuni scaffold possono imitare il microambiente biochimico dei tessuti nativi in modo indipendente, mentre altri possono influenzare direttamente le funzioni cellulari attraverso fattori di crescita. Tuttavia, i ricercatori incontrano spesso sfide nella selezione di scaffold che potrebbero influenzare positivamente l'adesione, la crescita e la differenziazione cellulare, fornendo al contempo supporto strutturale e stabilità ottimali per un lungo periodo 4,5. Le molecole bioattive sono spesso legate liberamente allo scaffold portando a un rapido rilascio di queste proteine al momento dell'impianto, con conseguente rilascio in posizioni indesiderate. Ciò culmina in effetti collaterali su tessuti o cellule che non sono stati intenzionalmente mirati 6,7.

Gli scaffold sono tipicamente realizzati con materiali polimerici. La nano-matrice di base Janus (JBNm) è una piattaforma di scaffold biomimetica creata con un nuovo metodo strato per strato per il costrutto autosostenibile del tessuto cartilagineo8. Questi nuovi nanotubi ispirati al DNA sono stati chiamati Janus base nanotubes (JBNts), poiché imitano correttamente la struttura e la chimica superficiale del collagene presente nella matrice extracellulare (ECM). Con l'aggiunta di molecole bioattive, come la matrilina-3 e il fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1), il JBNm può creare un microambiente ottimale che può quindi stimolare la funzionalità cellulare e tissutale desiderata9.

I JBNt sono nuovi nanotubi derivati da versioni sintetiche della nucleobase adenina e della timina. I JBNt sono formati attraverso l'auto-assemblaggio10; Sei nucleobasi sintetiche si legano per formare un anello, e questi anelli subiscono interazioni di impilamento π-π per creare un nanotubo di 200-300 μm di lunghezza11. Questi nanotubi sono strutturalmente simili alle proteine del collagene; imitando un aspetto del microambiente cartilagineo nativo, i JBNt hanno dimostrato di fornire un sito di attacco favorevole per i condrociti e le cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs)11,12,13,14. Poiché i nanotubi subiscono l'auto-assemblaggio e non richiedono alcun tipo di iniziatore (come la luce UV), mostrano un potenziale entusiasmante come impalcatura iniettabile per aree difettose difficili da raggiungere15.

La matrilina-3 è una proteina strutturale della matrice extracellulare presente nella cartilagine. Questa proteina svolge un ruolo significativo nella condrogenesi e nella corretta funzione della cartilagine16,17. Recentemente, è stato incluso negli scaffold di biomateriali, favorendo la condrogenesi senza ipertrofia 9,18,19. Includendo questa proteina nel JBNm, le cellule della cartilagine sono attratte da un'impalcatura che contiene componenti simili a quelli del suo microambiente nativo. Inoltre, è stato dimostrato che la matrilina-3 è necessaria per una corretta segnalazione del TGF-β1 all'interno dei condrociti20. I fattori di crescita funzionano come molecole di segnalazione, causando la crescita specifica di una determinata cellula o tessuto. Pertanto, per ottenere una rigenerazione ottimale della cartilagine, matrilina-3 e TGF-β1 sono componenti essenziali all'interno del JBNm. L'aggiunta di TGF-β1 nello scaffold strato per strato può promuovere ulteriormente la rigenerazione della cartilagine in un costrutto tissutale. Il TGF-β1 è un fattore di crescita impiegato per favorire il processo di guarigione dei difetti osteocondrali, favorendo la proliferazione e la differenziazione dei condrociti e delle hMSC21,22. Pertanto, TGF-β1 svolge un ruolo chiave nella rigenerazione della cartilagine JBNm (J/T/M JBNm)23, incoraggiando una corretta crescita soprattutto quando è localizzato all'interno degli strati JBNm.

Come accennato in precedenza, i fattori di crescita sono tipicamente assemblati all'esterno delle impalcature senza metodi specifici di incorporazione. Qui, con la nano-architettura progettata con precisione dei biomateriali, il JBNm è stato sviluppato per il targeting specifico delle cellule e dei tessuti previsti. Il JBNm è composto da TGF-β1 aderito su superfici JBNt nello strato interno e matrilina-3 aderente su superfici JBNt nello strato esterno24,25. L'incorporazione di TGF-β1 nello strato interno della struttura strato per strato consente un microambiente altamente localizzato lungo le fibre JBNm, creando un costrutto tissutale omeostatico con un rilascio molto più lento della proteina12. L'iniettabilità del JBNm lo rende un costrutto di tessuto cartilagineo ideale per varie applicazioni future di biomateriali26.

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Protocol

1. Sintesi di JBNts

  1. Preparare il monomero JBNt utilizzando metodi precedentemente pubblicati, che coinvolgono la sintesi di una varietà di composti12.
  2. Purificare il monomero JBNt grezzo dopo che è stato sintetizzato con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) utilizzando una colonna di fase inversa. Utilizzare solvente A: 100% acqua, solvente B: 100% acetonitrile e solvente C: soluzione acquosa HCl con pH = 1. Utilizzare una portata di 3 ml/min. Raccogliere il picco più grande ottenuto nell'HPLC a 7,2 min.

2. Fabbricazione per JBNt/Matn1/TGF-β1 (Video 1)

NOTA: Il video 1 mostra che il JBNm è un solido iniettabile formato in un ambiente fisiologico (soluzione acquosa, assenza di luce UV, assenza di additivi chimici e senza riscaldamento), anch'esso di ispirazione biologica.

  1. Aggiungere 8 μL di 1 mg/mL di TGF-β1 sospeso in H 2 O a 32 μL di 1 mg/mL di matrilina-3 sospesa in H2O. Pipetta per garantire una correttamiscelazione di queste proteine.
  2. Aggiungere 80 μL di 1 mg/mL di JBNts sospesi in H2O alla soluzione di TGF-β1/matrilina-3. Pipettare ripetutamente per garantire una corretta miscelazione. La presenza di flocculi bianchi può essere osservata immediatamente dopo l'aggiunta di JBNts, indicando la formazione del JBNm (Video 1).

3. Osservazione di campioni con assorbimento ultravioletto-visibile (UV-Vis)

NOTA: Gli spettri di assorbimento UV-Vis sono stati studiati per caratterizzare l'assemblaggio del JBNm. Questa misurazione è stata analizzata per quattro categorie: JBNts da solo, matrilina-3 da solo, TGF-β1 da solo e l'intero JBNm strato per strato, composto da tutte e tre le parti. Tutte le concentrazioni iniziali sono sospese in H2O.

  1. Per il gruppo JBNt, aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts a 50 μL di H2O per ottenere una soluzione da 90,9 μg/mL.
  2. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 40 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 15 μL di H2O per ottenere una soluzione da 7,3 μg/ml.
  3. Per il gruppo TGF-β1, aggiungere 10 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 45 μL di H2O per ottenere una soluzione da 1,8 μg/ml.
  4. Per il gruppo JBNm, aggiungere 40 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 10 μL di 10 μg/mL TGF-β1. Agitare per garantire una corretta miscelazione, quindi aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione, pipettando ripetutamente per miscelare il campione.
  5. Utilizzando uno spettrofotometro, misurare lo spettro di assorbimento di ciascun gruppo.

4. Misurazione del potenziale zeta dei campioni

NOTA: Il potenziale zeta è stato analizzato per prevedere meglio come il JBNm interagirebbe con il tessuto in vivo . Sono stati misurati tre gruppi: matrilina-3 da sola, matrilina-3 con TGF-β1 e JBNm strato per strato.

  1. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 160 μL di matrilina-3 da 10 mg/ml a 640 μL di H2O per ottenere una soluzione da 800 μL.
  2. Per il composto matrilina-3/TGF-β1, aggiungere 160 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 40 μL di TGF-β1 da 10 μg/mL. Pipettare ripetutamente per garantire la corretta omogeneità. Quindi, aggiungerlo a 600 μL di H2O ottenendo una soluzione di 800 μL.
  3. Per il gruppo JBNm, aggiungere 160 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 40 μL di TGF-β1 da 10 μg/ml. Pipettare più volte per mescolare le proteine. Quindi, aggiungere 20 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione e pipettare per garantire l'omogeneità. Infine, aggiungere la soluzione JBNm a 580 μL di H2O per produrre una soluzione da 800 μL.
  4. Misurare i valori del potenziale zeta per i tre gruppi.

5. Preparazione di nano-matrice JBNt/matrilin-3 per microscopia elettronica a trasmissione (TEM)

NOTA: La caratterizzazione TEM viene eseguita per caratterizzare la morfologia di JBNts e JBNm.

  1. Inserire due griglie in un pulitore al plasma per pulire correttamente le griglie prima della colorazione negativa di JBNts e JBNm secondo i protocolli pubblicati e i protocolli del produttore12.
  2. Creare una soluzione di 200 μg/mL di JBNt mescolando 10 μL di 1 mg/mL di JBNt con 40 μL di acqua distillata.
  3. Mescolare 30 μL di matrilina-3 da 100 μg/mL con 20 μL di TGF-β1 da 100 μg/mL e pipettare più volte. Aggiungere 10 μL di 1 mg/mL di JBNts alla miscela matrilina-3/TGF-β1 per preparare il campione di JBNm. Ancora una volta, pipetta ripetutamente.
  4. Aggiungere 3 μL della soluzione JBNt (200 μg/mL) e 3 μL della soluzione JBNm su griglie separate, e lasciarli per 2 minuti.
  5. Risciacquare ogni griglia con 100 μL di soluzione di acetato di uranile (0,5%). Utilizzare carta da filtro per rimuovere la soluzione in eccesso e lasciare asciugare le griglie all'aria.
  6. Utilizzare un microscopio elettronico a trasmissione per osservare e caratterizzare correttamente i campioni, come pubblicato in precedenza11,12.

6. Misurazione degli spettri di assorbimento di proteine marcate con fluorescenza

NOTA: La struttura di JBNm viene verificata osservando le strutture del JBNm con analisi spettrale di assorbimento.

  1. Etichettare il TGF-β1 utilizzando un kit di etichettatura proteica seguendo le istruzioni del produttore. Aggiungere 20 μL di 20 μg/mL marcato TGF-β1 a 25 μL di H2O per ottenere una soluzione di prova da 8,9 μg/ml.
  2. Etichettare la matrilin-3 utilizzando un kit di etichettatura separato. Aggiungere 20 μL di matrilina-3 marcata con 80 μg/mL a 25 μL di H2O per ottenere una soluzione di prova da 36 μg/ml.
    NOTA: L'etichettatura del colorante fluorescente del TGF-β1 ha portato a una concentrazione finale di 20 μg/ml, mentre l'etichettatura della matrilina-3 ha portato ad una concentrazione finale di 80 μg/ml.
  3. Mescolare 20 μL di matrilina-3 marcata con 80 μg/mL con 20 μL di TGF-β1 marcato con 20 μg/mL e 5 μL di H2O, ottenendo un composto TGF-β1/matrilina-3 marcato. Pipettare la miscela più volte per mescolare.
  4. Aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts a 40 μL di H2O, ottenendo una soluzione da 111 μg/mL.
  5. Aggiungere 20 μL di 20 μg/mL marcato TGF-β1 a 20 μL di matrilina-3 marcata con 80 μg/mL e pipettare più volte. Aggiungere 5 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione marcata di TGF-β1/matrilina-3 e pipettare ripetutamente per miscelare correttamente il composto.
    NOTA: Le concentrazioni finali del JBNt, marcato TGF-β1, e dei campioni marcati matrilina-3 erano rispettivamente 111 μg / mL, 8,9 μg / ml e 36 μg / ml.
  6. Trasferire ogni gruppo di campioni (cioè marcato TGF-β1 (passo 6.1), marcato matrilina-3 (passo 6.2), marcato TGF-β1/matrilina-3 (passo 6.3), JBNts (passo 6.4), JBNm (passo 6.5)) nel proprio pozzetto di una piastra nera da 384 pozzetti.
  7. Caricare la piastra nera a 384 pozzetti in un lettore di micropiastre multimodale ed effettuare misurazioni a lunghezze d'onda di eccitazione di 488 nm e 555 nm seguendo il protocollo del produttore.

7. Saggio di funzione biologica in vitro

  1. Test di adesione cellulare su camere di vetro di copertura preverniciate
    1. Preparare due coverglass camerati con cinque gruppi di campioni, poiché per ogni tipo di cella viene utilizzato un vetro di copertura.
    2. Aggiungere 1,25 μL di 1 mg/mL di JBNts a 198,75 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione da 6,25 μg/ml.
    3. Aggiungere 10 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 190 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di 0,5 μg/ml.
    4. Aggiungere 2,5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 197,5 μg/mL di acqua distillata, ottenendo una soluzione da 0,125 μg/ml.
    5. Per il gruppo JBNm, aggiungere 10 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 2,5 μL di 10 μg/mLTGF-β1 e pipettare ripetutamente. Aggiungere 1,25 μL di JBNts con una concentrazione di 1 mg/mL alla soluzione di miscela e alla pipetta. Infine, aggiungere 186,25 μL di acqua distillata per ottenere una soluzione JBNm da 200 μL.
      1. Per il gruppo di controllo, utilizzare 200 μL di acqua distillata.
    6. Aggiungere ogni gruppo di campioni nel proprio pozzetto di un vetro di copertura a camera n. 1,5. Mettere il vetro di copertura in un congelatore a -80 °C per 1 ora, quindi liofilizzarlo con uno strumento liofilizzatore.
    7. Seminare cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) e cellule condrocitarie umane (10.000 cellule per pozzetto) in ciascun pozzetto degli occhiali di copertura camerati preparati.
    8. Incubare i due coverglass per 4 ore in un'incubatrice a 37 °C. Quindi, aspirare il terreno di coltura cellulare e risciacquare due volte con PBS.
    9. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 5 minuti, quindi rimuovere e risciacquare i campioni con PBS. Risciacquare il campione una seconda volta per rimuovere completamente la paraformaldeide al 4%.
    10. Incubare le cellule con 100 μL di Triton-X allo 0,1% per 10 minuti e lavare con PBS. Aggiungere 100 μL di rodamina-falloidina 0,165 μM a ciascun pozzetto. Attendere 30 minuti e quindi lavare nuovamente con PBS.
    11. Aggiungere 0,1 μg/mL DAPI a ciascun pozzetto per colorare i nuclei. Attendere 5 minuti e sciacquare i pozzetti con PBS due volte.
    12. Utilizzare un microscopio confocale spettrale per osservare la morfologia cellulare e catturare immagini fluorescenti.
    13. Inoltre, analizzare il numero di cellule e la morfologia utilizzando il software di elaborazione delle immagini. Apri il software e carica le immagini. Aggiungi una barra della scala e calibra il software. Contare il numero di celle in una determinata area per ogni campione. Quindi, utilizzare lo strumento di misurazione per raccogliere dati sulla morfologia cellulare per ciascun campione.
  2. Proliferazione cellulare
    1. Preparare tre piastre da 96 pozzetti non trattate, aggiungendo cinque gruppi di campioni a ciascuna.
      1. Per il gruppo JBNt, aggiungere 3,75 μL di 1 mg/mL di JBNts a 596,25 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di JBNt da 600 μL con una concentrazione di 6,25 μg/mL.
      2. Per il gruppo TGF-β1, aggiungere 7,5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 592,5 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di prova di 0,125 μg/ml.
      3. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 30 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 570 μL di acqua distillata, ottenendo una soluzione di prova da 0,5 μg/ml.
      4. Per il gruppo JBNm, miscelare 7,5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 con 30 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL e pipettare più volte, quindi aggiungere 3,75 μL di 1 mg/mL di JBNts alla soluzione.
      5. Diluire la soluzione di JBNm con 558,75 μL di acqua distillata per ottenere le concentrazioni finali di 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL e 0,5 μg/mL, rispettivamente, per campioni di JBNt, TGF-β1 e matrilina-3.
      6. Per il gruppo di controllo, utilizzare 600 μL di acqua distillata.
    2. Dividere ciascun gruppo di campioni in sei pozzetti (100 μL di campione per pozzetto).
    3. Porre le tre piastre contenenti tutti i campioni in un congelatore a -80 °C per 1 ora e poi liofilizzare con uno strumento liofilizzante.
    4. Seminare hMSC su queste piastre, ciascuna ricevendo una sospensione cellulare di 100 μL (per pozzetto) contenente 5.000 cellule. Incubare le tre piastre a 37 °C per 1 giorno, 3 giorni o 5 giorni al 5% di CO2.
    5. Aggiungere 10 μL di soluzione di CCK-8 a ciascun pozzetto con le cellule e incubare a 37 °C per altre 2 ore.
    6. Misurare i valori di assorbimento di ciascun pozzetto con lettori di micropiastre multimodali a 450 nm.
    7. Seminare un gradiente noto di hMSC su una piastra a 96 pozzetti e incubare per 4 ore. Utilizzare il test CCK-8 per misurare i valori di assorbimento del numero noto di cellule e generare una curva standard.
    8. Calcolare la proliferazione cellulare utilizzando la curva standard di assorbimento.
  3. Test di stabilità
    NOTA: Un kit ELISA mirato al TGF-β1 umano è stato utilizzato per determinare la percentuale di rilascio di TGF-β1 dal JBNm in un idrogel di agarosio.
    1. Preparare il 2% di agarosio aggiungendo 400 mg di polvere di agarosio a 20 ml di PBS e riscaldandolo fino a 100 °C per sciogliere completamente la polvere di agarosio.
    2. Preparare il JBNm all'interno dell'idrogel di agarosio raffreddato al 2%.
      1. Combinare 10 μL di 10 μg/mL di TGF-β1, 40 μL di 10 μg/mL di matrilina-3, 5 μL di 1 mg/mL di JBNts e 195 μL di PBS. Mescolare questa soluzione con 250 μL di agarosio al 2%, creando l'idrogel JBNm.
    3. Aggiungere 500 μL di PBS, utilizzandolo come soluzione di rilascio, e assicurarsi di cambiarlo ogni 3 giorni. Conservare ogni soluzione rilasciata e lasciare riposare il campione per 15 giorni.
    4. Utilizzare un kit ELISA per testare ciascuna delle soluzioni di rilascio acquisite, seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: sottraendo la quantità di TGF-β1 rilasciata nel PBS dal valore di carico teorico del 100%, è possibile determinare la quantità rimanente di TGF-β1.
  4. Analisi del differenziamento cellulare con PCR26.
    1. Preparare sette gruppi di campioni con ciascun campione contenente 20 μL di sospensione cellulare (4 x 104 cellule), 30 μL della soluzione specifica (o PBS, a seconda del gruppo del campione) e 50 μL di agarosio al 2% in peso.
      1. Per il gruppo TGF-β1, aggiungere 5 μL di 10 μg/mL di TGF-β1 a 25 μL di PBS, ottenendo una soluzione da 1,6 μg/mL.
      2. Per il gruppo matrilina-3, aggiungere 20 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 10 μL di PBS, ottenendo una soluzione da 6,7 μg/ml.
      3. Per il gruppo JBNt, aggiungere 2,5 μL di 1 mg/mL di JBNts a 27,5 μL di PBS, ottenendo una soluzione di 83,3 μg/mL.
      4. Per il gruppo J/T/M JBNm, aggiungere 10 μL di matrilina-3 da 10 μg/mL a 5 μL di TGF-β1 da 10 μg/mL e pipettare su e giù per miscelare la soluzione. Quindi, aggiungere 2,5 μL di 1 mg/mL di JBNts e pipettare nuovamente. Infine, diluire con 2,5 μL di PBS.
      5. Per ciascun gruppo di controllo, utilizzare 30 μL di PBS come campione.
    2. Aggiungere 0,5 ml di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto, assicurandosi di sostituirlo ogni 3 giorni.
      1. Per il gruppo di controllo positivo, utilizzare un mezzo condrogeno hMSC disponibile in commercio contenente TGF-β1 aggiunto. Questo TGF-β1 aggiuntivo è uguale alla quantità in entrambi i gruppi TGF-β1 e J/T/M JBNm.
      2. Per uno dei gruppi di controllo negativi, utilizzare un mezzo condrogeno hMSC commerciale che non contenga TGF-β1. Per l'altro gruppo di controllo negativo, utilizzare un terreno di coltura cellulare DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale (FBS).
      3. Per ogni altro gruppo, utilizzare un terreno di coltura cellulare condrogena hMSC commerciale senza TGF-β1.
    3. Coltiva i campioni per 15 giorni.
    4. Estrarre l'RNA dei campioni ed eseguire la PCR per studiare la differenziazione dei campioni come descritto in precedenza26.
  5. Immunocolorazione per il saggio di espressione del collagene di tipo X
    1. Preparare sette campioni a base di agarosio nello stesso modo della differenziazione cellulare con la sezione del metodo PCR (fase 7.4).
    2. Coltiva i campioni per 15 giorni.
    3. Fissare i campioni con formaldeide al 4% per 1 giorno, immergere in una soluzione di saccarosio al 30% durante la notte e quindi congelare per una notte a -80 °C con azoto liquido. Fissare i campioni utilizzando il reagente composto a temperatura di taglio ottimale (OCT), una miscela di glicoli e resine solubili in acqua, a -10 °C.
    4. Utilizzare un microtomo di criostato per ottenere sezioni congelate spesse 20 μm di ciascun campione.
    5. Colorare ogni sezione con un anticorpo Anti-Collagen X con diluizione 1:800 e un anticorpo secondario di etichettatura fluorescente diluito con PBS, secondo i protocolli del produttore.
    6. Osservare ogni sezione con un microscopio confocale, utilizzando un'eccitazione di 488 nm e un ingrandimento di 40x sull'oculare.

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Representative Results

Seguendo il protocollo, i JBNt sono stati sintetizzati con successo e caratterizzati con assorbimento UV-Vis e TEM. Il JBNm è un'impalcatura solida iniettabile che subisce un rapido processo biomimetico. Dopo che i JBNt sono stati aggiunti a una miscela di soluzione di TGF-β1/matrilina-3 in un ambiente fisiologico, si è formata un'impalcatura solida a maglia bianca che indica il successo dell'assemblaggio di JBNm, come si vede nella Figura 1. Ciò è stato dimostrato nei metodi di caratterizzazione.

In condizioni fisiologiche, la matrilina-3 è caricata negativamente a causa del suo punto isoelettrico27 (Figura 2A). Dopo l'aggiunta della soluzione di TGF-β1 alla soluzione di matrilina-3, il potenziale zeta del composto TGF-β1/matrilina-3 è aumentato ad un valore quasi neutro, indicando che le due proteine erano legate tramite interazioni di carica. Come si vede nella Figura 2A, il potenziale zeta di JBNm è il più alto tra i tre gruppi a causa dei JBNts, poiché il punto isoelettrico della catena laterale della lisina è di circa 9,74 in un ambiente fisiologico. L'aumento dei valori di potenziale zeta del JBNm indica il successo dell'assemblaggio della sua struttura strato per strato.

Gli spettri di assorbimento UV-Vis (Figura 2B) chiariscono la formazione della struttura interna gerarchica strato per strato del JBNm. Gli anelli aromatici delle catene laterali della lisina e dei JBNt hanno contribuito ai due picchi di assorbimento rispettivamente a 220 nm e 280 nm. La diminuzione del valore di assorbimento è stata osservata dopo l'aggiunta di TGF-β1, indicando che si verifica il legame tra TGF-β1 e JBNts. Dopo l'aggiunta di JBNts alla matrilina-3, è stata osservata una diminuzione più evidente dell'intensità di assorbimento dei picchi, indicando ancora una volta il legame riuscito tra matrilina-3 e JBNts. Allo stesso modo, dopo l'aggiunta di JBNts a una miscela di TGF-β1/matrilina-3, si è formato il JBNm e i picchi di assorbimento sono diminuiti di intensità. Il picco di assorbimento di JBNm è più vicino alla linea matrilina-3/JBNts rispetto alla linea TGF-β1/JBNts, indicando che i JBNt preferiscono legarsi alla matrilina-3, formando una struttura esterna strato per strato con matrilina-3 mentre TGF-β1 risiede nello strato interno. TEM è usato per caratterizzare la morfologia dei JBNts e JBNm (Figura 2C). Dopo la combinazione con le proteine, sono stati osservati spessi fasci di JBNm che formano una struttura di impalcatura.

La microscopia a fluorescenza ha confermato la presenza della struttura strato per strato (Figura 3A) e ha dimostrato la sezione trasversale del JBNm. Dopo aver marcato TGF-β1 e matrilina-3, è stato osservato che la matrilina-3 fluorescente rossa avvolge i fasci JBNt, formando lo strato esterno del JBNm. Nella Figura 3B, il TGF-β1 fluorescente verde ha formato uno strato interno, contribuendo alla capacità di immagazzinare fattori di crescita e consentendo la localizzazione di TGF-β1. La figura 3C mostra il processo di trasferimento dell'energia di risonanza di fluorescenza (FRET) tra le proteine marcate con colorante fluorescente caratterizzate da spettri di fluorescenza, con picchi di emissione a 520 nm e 570 nm per i gruppi TGF-β1 e matrilina-3 marcati, rispettivamente28. Dopo l'aggiunta di JBNts secondo il protocollo, viene formata la struttura strato per strato; sono stati osservati picchi sia a 520 nm che a 570 nm per il gruppo JBNm, indicando un legame e un assemblaggio di successo delle proteine e dei JBNt.

Inoltre, è stato esplorato l'effetto del JBNm sull'adesione delle hMSCs e sulla proliferazione cellulare. Come mostrato nella Figura 4, è stata determinata la densità di adesione cellulare del JBNm rivestito sulla superficie dei vetri di copertura camerati. Il JBNm ha mostrato hMSC raggruppati lungo se stesso (Figura 4A), mentre meno cellule hanno aderito a JBNts. Tuttavia, per gli altri gruppi, le hMSC erano distribuite uniformemente senza allineamento rispetto al gruppo JBNm. L'allineamento delle cellule, così come la dimensione delle cellule sul JBNm, hanno dimostrato che i JBNt hanno svolto un ruolo nell'adesione cellulare, mentre le proteine nel JBNm hanno aumentato l'affinità di adesione cellulare (Figura 4B,C).

Dopo il giorno 1 della coltura cellulare con JBNm, JBNts, matrilina-3 da sola, TGF-β1 da solo e controllo negativo, i gruppi JBNm e TGF-β1 hanno mostrato una proliferazione cellulare significativa rispetto agli altri gruppi. Quando la durata della coltura cellulare è stata aumentata a 3 e 5 giorni, i gruppi JBNm e TGF-β1 hanno dimostrato una proliferazione cellulare ancora maggiore, come si vede nella Figura 5. È stato condotto uno studio funzionale a lungo termine per determinare la differenziazione delle hMSC con JBNm e senza JBNm (controllo negativo). Dopo 15 giorni, è stata osservata una colorazione blu di Alcian migliorata, indicando la condrogenesi delle hMSC che crescono insieme a JBNm26. Pertanto, le cellule preferivano i JBNt del JBNm. Ciò era probabilmente dovuto alla sua struttura che imita il DNA e alla capacità di essere disassemblato in unità di piccole molecole, l'ultima delle quali può essere innescata da un pH basso o da un'attività enzimatica sufficiente (come l'assorbimento da parte delle cellule)14,29.

Video 1: Registrazione video dell'assemblaggio JBNm. Questa registrazione descrive la formazione dei JBNts, matrilin-3 e TGF-β1 nel JBNm. Questa cifra è stata modificata da Zhou et al. (2021)26. Clicca qui per scaricare questo video.

Figure 1
Figura 1: Illustrazione schematica della struttura chimica dei JBNt, del J/T/M JBNm e della capacità condrogena del J/T/M JBNm. (A) La struttura chimica dei JBNt, evidenziando la loro formazione dal monomero all'anello a rosetta a JBNt. (B) I componenti che compongono il J/T/M JBNm, nonché il modo in cui si assemblano nel JBNm. (C ) Schema di coltura di cellule staminali mesenchimali umane sul J/T/M JBNm. Questa cifra è stata modificata da Zhou et al. (2021)26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Caratterizzazione del materiale degli spettri del potenziale zeta J/T/M JBNm. (A) della sola matrilina-3, del composto TGF-β1/matrilina-3 e del JBNm J/T/M. (B) SPETTRI DI ASSORBIMENTO UV-Vis dei soli JBNt, della sola matrilina-3, del solo TGF-β1, del composto matrilina-3/JBNts, del composto TGF-β1/JBNts e del JBNm J/T/M. (C ) Immagini dei soli JBNt e del J/T/M JBNm ottenuti mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Questa cifra è stata modificata da Zhou et al. (2021)26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Imaging confocale fluorescente e spettri di fluorescenza di J/T/M JBNm. (A) Immagine confocale 3D del J/T/M JBNm, con matrilina-3 marcata con fluorescenza rossa e TGF-β1 marcata con fluorescenza verde. (B) Immagini confocali 2D di J/T/M JBNm, con matrilina-3 marcata con fluorescenza rossa, TGF-β1 marcata con fluorescenza verde e una versione unita. (C) Spettri di fluorescenza di vari composti per caratterizzare il processo FRET tra le proteine marcate. Questa cifra è stata modificata da Zhou et al. (2021)26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Analisi della coltura di cellule staminali mesenchimali umane (hMSC). (A) Immagini al microscopio ottico di hMSCs con TGF-β1, matrilina-3 e JBNts, coltivate su gel di agarosio. (B) Immagini al microscopio confocale di hMSC coltivate sul vetro di copertura camerato rivestito con una varietà di componenti JBNm. (C) Grafico del numero di celle aderenti per millimetro quadrato per ciascun gruppo. Le barre di errore indicano deviazioni standard. (D) Grafico della lunghezza dell'asse maggiore della cella in μm per gruppo. Le barre di errore indicano deviazioni standard. Nota: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (rispetto ai controlli negativi, NC). Questa cifra è stata modificata da Zhou et al. (2021)26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Confronto dei numeri di cellule per vari gruppi tra i giorni 1, 3 e 5. Statistiche del numero di cellule delle hMSC dopo essere state coltivate con materiali diversi nei giorni 1, 3 e 5. Le barre di errore indicano deviazioni standard. Nota: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Questa cifra è stata modificata da Zhou et al. (2021)26. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Discussion

L'obiettivo di questo studio è sviluppare una piattaforma di scaffold biomimetico, il JBNm, per superare i limiti dei costrutti tissutali convenzionali che si basano su ambienti di coltura cellulare per mediare la differenziazione cellulare. Il JBNm è un'impalcatura a struttura strato per strato per un costrutto di tessuto cartilagineo autosufficiente. Il design innovativo si basa su nuovi nanomateriali ispirati al DNA, i JBNts. Il JBNm, composto da JBNts30, TGF-β1 e matrilina-3, è assemblato attraverso una nuova tecnica strato per strato in cui l'auto-assemblaggio dello scaffold è stato controllato a livello molecolare. L'assemblaggio di JBNm è stato osservato e caratterizzato con misurazione del potenziale zeta, assorbimento UV-Vis, TEM e analisi spettrale di fluorescenza.

Gli spettri UV-Vis nella Figura 2B (fase 3) hanno dimostrato la formazione dell'interno gerarchico strato per strato del JBNm. Una differenza nei picchi di assorbanza può essere osservata a causa di una differenza nell'affinità di legame. Si verificano interazioni più importanti tra JBNts e matrilina-3 che tra JBNts e TGF-β1, indicando che JBNts imitano le proteine del collagene in termini di morfologia fibrosa e chimica della superficie della lisina. Questa tecnica è necessaria per osservare il legame di JBNts alla matrilina-3 piuttosto che al TGF-β1, consentendo l'incapsulamento di TGF-β1 e quindi fornendo un lento rilascio di TGF-β1 nel tessuto circostante. Il passo più critico nello sviluppo del JBNm è la combinazione di proteine con i JBNt. TGF-β1 e matrilina-3 devono essere aggiunti prima dell'aggiunta di JBNt per osservare il pieno effetto del fenomeno FRET tra la matrilina-3 marcata e TGF-β1. La limitazione di questa tecnica deriva dall'errata sequenza di aggiunta di proteine e nanotubi, con conseguente misurazione varia. Questo è un passo importante per la formazione di JBNm per studi futuri e, pertanto, sarà applicato alle future fabbricazioni e studi JBNm.

La matrilina-3 è una proteina altamente negativa, mentre TGF-β1 è una proteina leggermente neutra, come si vede nella Figura 2A. La differenza di carica è stata osservata per determinare il legame di queste proteine. Dallo stato caricato negativamente della matrilina-3, il potenziale zeta è aumentato a un valore quasi neutro dopo l'aggiunta di TGF-β1 (Figura 2A). Questo passaggio è importante per determinare il primo strato interno dello scaffold biomimetico e per indicare che la combinazione di entrambe le proteine avviene attraverso l'interazione di carica. Dopo l'aggiunta di JBNts, che è la seconda fase della fabbricazione di JBNm, il potenziale zeta di JBNm è stato misurato a ~ 10 ± 5 mV (Figura 2A). Poiché i JBNt sono altamente positivi, è stato osservato che la carica di JBNm è aumentata come previsto. La determinazione delle cariche con potenziale zeta è quindi importante per osservare la formazione di JBNm passo dopo passo attraverso le interazioni di carica. Analogamente alla spettroscopia UV-Vis, la sequenza di addizione è importante in questa fase e un ordine di aggiunta errato può comportare misurazioni variabili. Allo stesso modo, è importante pipettare la miscela su e giù prima della misurazione.

Successivamente, TGF-β1 e matrilina-3 sono marcati in modo che lo sviluppo di JBNm possa essere osservato con microscopia confocale e analisi spettrale di fluorescenza con lettori di micropiastre multimodali. I campioni sono stati eccitati con un laser a 488 nm e hanno mostrato picchi di emissione a 520 nm e 570 nm (Figura 3). Nessun picco di emissione è stato osservato per i soli JBNt perché non sono etichettati. La FRET si è verificata dal donatore di TGF-β1 all'accettore di matrilina-3, riducendo così il picco di emissione a 520 nm e aumentando il picco di emissione a 570 nm; le due componenti sono distanti 10 nm in distanza, consentendo il fenomeno FRET di verificarsi. Pertanto, l'assemblaggio di JBNm si basa su processi spaziali (cioè di distanza fisica) insieme alle interazioni di carica. Il passo più critico nello sviluppo di JBNm è la sequenza di addizione; TGF-β1 e matrilina-3 devono essere aggiunti prima dell'aggiunta di JBNts per osservare il pieno effetto del fenomeno FRET. Per osservare il JBNm fluorescente è necessario un ingrandimento di almeno 40x sull'oculare. Il limite di questa tecnica è che i JBNt non sono marcati e, quindi, non possono essere osservati con la microscopia confocale. Tuttavia, la tecnica di etichettatura delle proteine può essere applicata per etichettare JBNt con alcune modifiche per applicazioni future.

JBNm può aiutare le funzioni cellulari, come l'adesione cellulare e la proliferazione cellulare. In questo studio, le hMSC sono state coltivate (a partire da 5.000 cellule) su diversi materiali (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilina-3 e controlli negativi senza additivi) per confrontare il numero di cellule dopo l'incubazione per 1, 3 e 5 giorni utilizzando la soluzione CCK-8, seguendo i protocolli esatti del produttore per determinare la proliferazione cellulare. JBNm, specialmente in presenza di TGF-β1, e TGF-β1 da soli hanno mostrato una proliferazione cellulare significativa rispetto agli altri tre gruppi. I JBNt imitano morfologicamente il collagene nella ECM mentre la matrilina-3 è una proteina specifica della cartilagine, con conseguente aumento dell'attività di proliferazione cellulare dopo l'incubazione a 37 °C per 3 e 5 giorni (Figura 5). Il JBNm ha dimostrato un grande potenziale per servire come impalcatura iniettabile e biomimetica di ingegneria tissutale per superare i limiti dei costrutti cellulari tradizionali per varie applicazioni future come biomateriali29,31. JBNm imita morfologicamente l'ECM cartilagineo, fornendo siti di adesione e consentendo il rilascio di fattori differenziativi pro-condrogeni nel microambiente, come TGF-β132,33. La capacità del JBNm di incorporare TGF-β1 nello strato interno dello scaffold impedisce che fuoriesca in aree indesiderate, migliorando così l'efficacia dello scaffold (Figura 4 e Figura 5). Molte hMSC sono raggruppate lungo lo scaffold JBNm, mentre le cellule sono scarsamente distribuite in matrilina-3, TGF-β1 e gruppi di controllo negativi (Figura 4). È stata osservata anche la morfologia delle cellule, che indica un'eccellente affinità con le superfici JBNm. Questi biomateriali progettati con precisione impediscono il rapido rilascio di molecole bioattive incorporate nell'ambiente di coltura cellulare e migliorano l'autosostenibilità dei costrutti tissutali all'interno della matrice34. Una limitazione di questa tecnica è che il numero di cellule di partenza è fondamentale per determinare la proliferazione delle cellule. Un numero di cellule di partenza di 5.000 è risultato ottimale per questo studio. È inoltre necessaria una curva standard per determinare il numero di celle tracciando un numero noto di celle e misurandole nel lettore di micropiastre multimodali. Questa tecnica può essere applicata in futuro come metodo standardizzato per determinare la proliferazione cellulare in tutti gli studi relativi agli scaffold JBNm.

Le hMSC sono state coltivate in pellet di agarosio 3D con e senza JBNm per determinare lo studio funzionale a lungo termine per 15 giorni. Dopo 15 giorni, l'RNA totale è stato estratto dalle hMSC nei pellet di agarosio, contenente un controllo positivo (i pellet sono stati forniti con TGF-β1 fresco ogni volta che il terreno è stato cambiato), JBNm, JBNts, matrilina-3, TGF-β1 e nessun additivo. La qPCR in tempo reale è stata effettuata per l'analisi genica, testando i marcatori di differenziazione condrogenica, Aggrecan (ACAN) e il collagene di tipo X del marcatore ipertrofico (COL X). L'espressione di ACAN nel gruppo JBNm è aumentata significativamente rispetto ad altri gruppi, dimostrando che JBNm promuove significativamente la differenziazione condrogena delle cellule staminali mentre inibisce il COL X. Nel frattempo, il controllo positivo ha migliorato la condrogenesi, come notato nell'aumento di ACAN, e anche l'ipertrofia della cellula differenziata26. Un'ulteriore limitazione di questo studio è che l'estrazione dell'RNA avviene dalle cellule incorporate in un idrogel. L'RNA totale ottenuto in questo protocollo, quindi, era basso in concentrazione e purezza. Per superare questa limitazione, sono stati coltivati ed estratti più campioni per ottenere la concentrazione e la purezza ottimali per la fase successiva, la qPCR in tempo reale. Mentre la qPCR è importante per lo studio, è necessaria una piccola modifica di questa tecnica per gli studi futuri per garantire un'estrazione efficiente del campione senza sacrificare un gran numero di campioni.

È stato eseguito un test di stabilità con un kit ELISA TGF-β1 umano per testare il rilascio di proteine dall'idrogel JBNm. In questo studio, si prevede che il TGF-β1 sia incapsulato nel J/T/M JBNm, e pertanto non deve essere osservato alcun rilascio di TGF-β1 (cioè, il valore di carico teorico è del 100%). Una limitazione di questo passaggio è che si presume che tutto il TGF-β1 sia incapsulato nello scaffold JBNm strato per strato. Dopo 15 giorni, le soluzioni rilasciate dall'idrogel vengono raccolte e testate con il kit, seguendo i protocolli del produttore. Quindi, la quantità di TGF-β1 è stata calcolata sottraendo la quantità di TGF-β1 rilasciato in PBS dal valore di carico teorico. Poiché TGF-β1 era incapsulato nello strato interno del JBNm, era previsto il lento rilascio della proteina. Lo studio ha dimostrato che il TGF-β1 è localizzato all'interno dello scaffold JBNm e non si rilascia rapidamente nelle aree circostanti26.

Questo innovativo costrutto di tessuto cartilagineo JBNm strato per strato è stato realizzato mediante auto-assemblaggio altamente organizzato e controllato a livello molecolare. Il TGF-β1 è confinato nello strato interno delle fibre della matrice, impedendone la fuoriuscita in posizioni indesiderate e promuovendo condrogenesi localizzata contemporaneamente. Inoltre, la matrilina-3 è localizzata nello strato esterno delle fibre della matrice, creando un microambiente anti-ipertrofico35. I JBNt hanno dimostrato non solo di servire come spina dorsale strutturale dello scaffold, ma anche di migliorare l'ancoraggio e l'adesione delle cellule staminali per localizzare le cellule lungo le fibre della matrice30,36. Per quanto riguarda il lavoro futuro, il design strato per strato dell'impalcatura basata su JBNt sarà personalizzato per applicazioni in vari tessuti37,38,39.

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Disclosures

Il Dr. Yupeng Chen è co-fondatore di Eascra Biotech, Inc. e NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato dalle sovvenzioni NIH 7R01AR072027 e 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 e l'Università del Connecticut. Questo lavoro è anche supportato in parte dalla sovvenzione NIH S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

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References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, Suppl 4 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

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Bioingegneria Numero 185
Fabbricazione e caratterizzazione di nano-matrice di base Janus strato per strato per promuovere la rigenerazione della cartilagine
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Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

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