Summary

Fremstilling og karakterisering af lag-for-lag Janus base nano-matrix for at fremme bruskregenerering

Published: July 06, 2022
doi:

Summary

Denne protokol beskriver samlingen af et lag for lag Janus base nano-matrix (JBNm) stillads ved at tilføje Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1) sekventielt. JBNm blev fabrikeret og karakteriseret; Derudover viste den fremragende bioaktivitet og tilskyndede cellefunktioner såsom vedhæftning, spredning og differentiering.

Abstract

Forskellige biomateriale stilladser er blevet udviklet til at styre celleadhæsion og spredning i håb om at fremme specifikke funktioner til in vitro og in vivo anvendelser. Tilsætningen af vækstfaktorer i disse biomaterialestilladser udføres generelt for at give et optimalt cellekulturmiljø, medierende celledifferentiering og dets efterfølgende funktioner. Imidlertid er vækstfaktorerne i et konventionelt biomaterialestillads typisk designet til at blive frigivet ved implantation, hvilket kan resultere i utilsigtede bivirkninger på omgivende væv eller celler. Her har den DNA-inspirerede Janus base nano-matrix (JBNm) med succes opnået et meget lokaliseret mikromiljø med en lag-for-lag struktur til selvbærende bruskvævskonstruktioner. JBNms er selvsamlet fra Janus base nanorør (JBNts), matrilin-3 og transformerende vækstfaktor beta-1 (TGF-β1) via bioaffinitet. JBNm blev samlet i et TGF-β1: matrilin-3: JBNt-forhold på 1: 4: 10, da dette har været det bestemte forhold, hvor korrekt samling i lag-for-lag-strukturen kunne forekomme. Først blev TGF-β1-opløsningen tilsat til matrilin-3-opløsningen. Derefter blev denne blanding pipetteret flere gange for at sikre tilstrækkelig homogenitet før tilsætningen af JBNt-opløsningen. Dette dannede lag for lag JBNm efter pipettering flere gange igen. En række eksperimenter blev udført for at karakterisere JBNm-strukturen lag for lag, JBNts alene, matrilin-3 alene og TGF-β1 alene. Dannelsen af JBNm blev undersøgt med UV-Vis absorptionsspektre, og strukturen af JBNm blev observeret med transmissionselektronmikroskopi (TEM). Da det innovative JBNm-stillads lag for lag dannes i molekylær skala, kunne det fluorescerende farvestofmærkede JBNm observeres. TGF-β1 er begrænset inden for det indre lag af den injicerbare JBNm, som kan forhindre frigivelse af vækstfaktorer til omkringliggende områder, fremme lokaliseret chondrogenese og fremme et antihypertrofisk mikromiljø.

Introduction

Stilladser inden for vævsteknik spiller en afgørende rolle i at yde strukturel støtte til cellebinding og efterfølgende vævsudvikling1. Typisk er konventionelle vævskonstruktioner uden stilladser afhængige af cellekulturmiljøet og tilføjede vækstfaktorer for at formidle celledifferentiering. Desuden er denne tilsætning af bioaktive molekyler til stilladser ofte den foretrukne tilgang til styring af celledifferentiering og funktion 2,3. Nogle stilladser kan efterligne det biokemiske mikromiljø af naturligt væv uafhængigt, mens andre direkte kan påvirke cellefunktioner via vækstfaktorer. Forskere støder dog ofte på udfordringer med at vælge stilladser, der kan påvirke celleadhæsion, vækst og differentiering positivt, samtidig med at de giver optimal strukturel støtte og stabilitet over en lang periode 4,5. De bioaktive molekyler er ofte løst bundet til stilladset, hvilket fører til hurtig frigivelse af disse proteiner ved implantation, hvilket resulterer i deres frigivelse på uønskede steder. Dette kulminerer i bivirkninger på væv eller celler, der ikke bevidst blev målrettet 6,7.

Stilladser er typisk lavet af polymere materialer. Janus base nano-matrix (JBNm) er en biomimetisk stilladsplatform skabt med en ny lag-for-lag metode til selvbærende bruskvævskonstruktion8. Disse nye DNA-inspirerede nanorør er blevet navngivet Janus base nanorør (JBNts), da de korrekt efterligner strukturen og overfladekemien af kollagen, der findes i den ekstracellulære matrix (ECM). Med tilføjelsen af bioaktive molekyler, såsom matrilin-3 og Transforming Growth Factor Beta-1 (TGF-β1), kan JBNm skabe et optimalt mikromiljø, som derefter kan stimulere ønsket celle- og vævsfunktionalitet9.

JBNts er nye nanorør afledt af syntetiske versioner af nukleobase-adenin og thymin. JBNts dannes gennem selvmontering10; Seks syntetiske nukleobaser binder sig til dannelse af en ring, og disse ringe gennemgår π-π stablingsinteraktioner for at skabe et nanorør 200-300 μm i længde11. Disse nanorør ligner strukturelt kollagenproteiner; ved at efterligne et aspekt af det indfødte bruskmikromiljø har JBNts vist sig at give et gunstigt fastgørelsessted for chondrocytter og humane mesenkymale stamceller (hMSC’er)11,12,13,14. Fordi nanorørene gennemgår selvmontering og ikke kræver nogen form for initiator (såsom UV-lys), viser de spændende potentiale som et injicerbart stillads til svært tilgængelige defektområder15.

Matrilin-3 er et strukturelt ekstracellulært matrixprotein, der findes i brusk. Dette protein spiller en væsentlig rolle i chondrogenese og korrekt bruskfunktion16,17. For nylig er det blevet inkluderet i biomateriale stilladser, der tilskynder til chondrogenese uden hypertrofi 9,18,19. Ved at inkludere dette protein i JBNm tiltrækkes bruskceller til et stillads, der indeholder lignende komponenter som dets oprindelige mikromiljø. Derudover har det vist sig, at matrilin-3 er nødvendig for korrekt TGF-β1-signalering inden for kondrocytter20. Vækstfaktorer fungerer som signalmolekyler, der forårsager specifik vækst af en bestemt celle eller væv. For at opnå optimal bruskregenerering er matrilin-3 og TGF-β1 væsentlige komponenter inden for JBNm. Tilsætningen af TGF-β1 i stilladset lag for lag kan yderligere fremme bruskregenerering i en vævskonstruktion. TGF-β1 er en vækstfaktor, der anvendes til at fremme helingsprocessen af osteochondrale defekter, tilskynde til chondrocyt og hMSC-spredning og differentiering21,22. TGF-β1 spiller således en nøglerolle i bruskregenereringen JBNm (J / T / M JBNm)23, hvilket tilskynder til korrekt vækst, især når den er lokaliseret inden for JBNm-lagene.

Som tidligere nævnt samles vækstfaktorer typisk på ydersiden af stilladser uden specifikke metoder til inkorporering. Her, med biomaterialernes præcist designede nanoarkitektur, blev JBNm udviklet til specifik målretning af tilsigtede celler og væv. JBNm består af TGF-β1 klæbet på JBNt-overflader i det indre lag og matrilin-3 klæbet på JBNt-overflader i det ydre lag24,25. Inkorporeringen af TGF-β1 i det indre lag af lag-for-lag-strukturen muliggør et stærkt lokaliseret mikromiljø langs JBNm-fibrene, hvilket skaber en homeostatisk vævskonstruktion med en meget langsommere frigivelse af proteinet12. JBNm’s injicerbarhed gør det til en ideel bruskvævskonstruktion til forskellige fremtidige biomaterialeanvendelser26.

Protocol

1. Syntese af JBNts Forbered JBNt-monomeren ved hjælp af tidligere offentliggjorte metoder, der involverer syntesen af en række forbindelser12. Rens rå JBNt-monomer, efter at den er blevet syntetiseret med højtydende væskekromatografi (HPLC) ved hjælp af en omvendt fasekolonne. Brug opløsningsmiddel A: 100% vand, opløsningsmiddel B: 100% acetonitril og opløsningsmiddel C: HCI-vandopløsning med pH = 1. Brug en strømningshastighed på 3 ml/min. Saml de…

Representative Results

Efter protokollen blev JBNts med succes syntetiseret og karakteriseret med UV-Vis-absorption og TEM. JBNm er et injicerbart fast stillads, der gennemgår en hurtig biomimetisk proces. Efter at JBNts blev tilsat til en blanding af TGF-β1/matrilin-3-opløsning i et fysiologisk miljø, blev der dannet et fast hvidmasket stillads, der indikerer den vellykkede samling af JBNm, som det ses i figur 1. Dette blev demonstreret i karakteriseringsmetoderne. Under fysiologis…

Discussion

Målet med denne undersøgelse er at udvikle en biomimetisk stilladsplatform, JBNm, for at overvinde begrænsningerne ved konventionelle vævskonstruktioner, der er afhængige af cellekulturmiljøer for at formidle celledifferentiering. JBNm er et lag-for-lag strukturstillads til en selvbærende bruskvævskonstruktion. Det innovative design er baseret på nye DNA-inspirerede nanomaterialer, JBNts. JBNm, der består af JBNts30, TGF-β1 og matrilin-3, er samlet gennem en ny lag-for-lag-teknik, hvor …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde understøttes af NIH-tilskud 7R01AR072027 og 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 og University of Connecticut. Dette arbejde støttes også delvist af NIH-bevillingen S10OD016435.

Materials

10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

References

  1. Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. European Spine Journal. 17, 467-479 (2008).
  2. Heo, D. N., et al. 3D bioprinting of carbohydrazide-modified gelatin into microparticle-suspended oxidized alginate for the fabrication of complex-shaped tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 12 (18), 20295-20306 (2020).
  3. Almeida, H. V., et al. Anisotropic shape-memory alginate scaffolds functionalized with either type i or type ii collagen for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part A. 23 (1-2), 55-68 (2017).
  4. Vinatier, C., Guicheux, J. Cartilage tissue engineering: From biomaterials and stem cells to osteoarthritis treatments. Annals of Physical and Rehabilitation Medicine. 59 (3), 139-144 (2016).
  5. Filardo, G., Kon, E., Roffi, A., Di Martino, A., Marcacci, M. Scaffold-based repair for cartilage healing: a systematic review and technical note. Arthroscopy. 29 (1), 174-186 (2013).
  6. James, A. W., et al. A review of the clinical side effects of bone morphogenetic protein-2. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 22 (4), 284-297 (2016).
  7. Blaney Davidson, E. N., vander Kraan, P. M., vanden Berg, W. B. TGF-beta and osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 15 (6), 597-604 (2007).
  8. Chen, Y., Yang, K. Intra-articular drug delivery systems for arthritis treatment. Rheumatology Current Research. 2, 106 (2012).
  9. Liu, Q., et al. Suppressing mesenchymal stem cell hypertrophy and endochondral ossification in 3D cartilage regeneration with nanofibrous poly(l-lactic acid) scaffold and matrilin-3. Acta Biomaterialia. 76, 29-38 (2018).
  10. Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments. International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).
  11. Zhou, L., et al. Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell anchorage. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 108 (4), 984-991 (2020).
  12. Zhou, L., Yau, A., Zhang, W., Chen, Y. Fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion. Journal of Visualized Experiments. (159), e61317 (2020).
  13. Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone. International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).
  14. Chen, Y., et al. Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering. Tissue Engineering. Part C, Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).
  15. Yu, H., Chen, Y. Advanced biomedical techniques for gene delivery. Recent Patents on Biomedical Engineering (Discontinued). 5 (1), 23-28 (2012).
  16. Muttigi, M. S., Han, I., Park, H. K., Park, H., Lee, S. H. Matrilin-3 role in cartilage development and osteoarthritis). International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 590 (2016).
  17. Pei, M., Luo, J., Chen, Q. Enhancing and maintaining chondrogenesis of synovial fibroblasts by cartilage extracellular matrix protein matrilins. Osteoarthritis Cartilage. 16 (9), 1110-1117 (2008).
  18. Bello, A. B., et al. Matrilin3/TGFbeta3 gelatin microparticles promote chondrogenesis, prevent hypertrophy, and induce paracrine release in MSC spheroid for disc regeneration. NPJ Regenerative Medicine. 6 (1), 50 (2021).
  19. Muttigi, M. S., et al. Matrilin-3 codelivery with adipose-derived mesenchymal stem cells promotes articular cartilage regeneration in a rat osteochondral defect model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 667-675 (2018).
  20. Jayasuriya, C. T., et al. Matrilin-3 chondrodysplasia mutations cause attenuated chondrogenesis, premature hypertrophy and aberrant response to TGF-beta in chondroprogenitor cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (8), 14555-14573 (2014).
  21. Poniatowski, L. A., Wojdasiewicz, P., Gasik, R., Szukiewicz, D. Transforming growth factor Beta family: insight into the role of growth factors in regulation of fracture healing biology and potential clinical applications. Mediators of Inflammation. 2015, 137823 (2015).
  22. Sun, Y., Lu, Y., Hu, Y., Ma, F., Chen, W. Induction of osteogenesis by bovine platelet transforming growth factor-beta (TGF-beta) in adult mouse femur. Chinese Medical Journal (English). 108 (12), 914-918 (1995).
  23. Sun, X., et al. Anti-miRNA oligonucleotide therapy for chondrosarcoma). Molecular Cancer Therapeutics. 18 (11), 2021-2029 (2019).
  24. Jayasuriya, C. T., Chen, Y., Liu, W., Chen, Q. The influence of tissue microenvironment on stem cell-based cartilage repair. Annals of the New York Academy of Sciences. 1383 (1), 21-33 (2016).
  25. Chen, Y., et al. Deficient mechanical activation of anabolic transcripts and post-traumatic cartilage degeneration in matrilin-1 knockout mice. PLoS One. 11 (6), 0156676 (2016).
  26. Zhou, L., Zhang, W., Lee, J., Kuhn, L., Chen, Y. Controlled self-assembly of DNA-mimicking nanotubes to form a layer-by-layer scaffold for homeostatic tissue constructs. ACS Applied Material Interfaces. 13 (43), 51321-51332 (2021).
  27. Belluoccio, D., Schenker, T., Baici, A., Trueb, B. Characterization of human matrilin-3 (MATN3). Genomics. 53 (3), 391-394 (1998).
  28. Yau, A., Yu, H., Chen, Y. mRNA detection with fluorescence-base imaging techniques for arthritis diagnosis. Journal of Rheumatology Research. 1 (2), 39-46 (2019).
  29. Lee, J., Sands, I., Zhang, W., Zhou, L., Chen, Y. DNA-inspired nanomaterials for enhanced endosomal escape. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (19), (2021).
  30. Zhang, W., Chen, Y. Molecular engineering of DNA-inspired Janus base nanomaterials. Juniper Online Journal Material Science. 5 (4), 555670 (2019).
  31. Yau, A., Sands, I., Chen, Y. Nano-scale surface modifications to advance current treatment options for cervical degenerative disc disease (CDDD). Journal of Orthopedic Research and Therapy. 4 (9), 1147 (2019).
  32. Mello, M. A., Tuan, R. S. Effects of TGF-beta1 and triiodothyronine on cartilage maturation: in vitro analysis using long-term high-density micromass cultures of chick embryonic limb mesenchymal cells. Journal of Orthopaedic Research. 24 (11), 2095-2105 (2006).
  33. Shi, Y., Massague, J. Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus. Cell. 113 (6), 685-700 (2003).
  34. Sands, I., Lee, J., Zhang, W., Chen, Y. RNA delivery via DNA-inspired janus base nanotubes for extracellular matrix penetration. MRS Advances. 5 (16), 815-823 (2020).
  35. Zhou, L., Rubin, L. E., Liu, C., Chen, Y. Short interfering RNA (siRNA)-based therapeutics for cartilage diseases. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (3), 283-290 (2020).
  36. Bi, H., et al. Deposition of PEG onto PMMA microchannel surface to minimize nonspecific adsorption. Lab on a Chip. 6 (6), 769-775 (2006).
  37. Chen, Y., Webster, T. J. Increased osteoblast functions in the presence of BMP-7 short peptides for nanostructured biomaterial applications. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 91 (1), 296-304 (2009).
  38. Sun, M., Lee, J., Chen, Y., Hoshino, K. Studies of nanoparticle delivery with in vitro bio-engineered microtissues. Bioactive Materials. 5 (4), 924-937 (2020).
  39. Yau, A., Lee, J., Chen, Y. Nanomaterials for protein delivery in anticancer applications. Pharmaceutics. 13 (2), 155 (2021).

Play Video

Cite This Article
Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

View Video