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Bioengineering

Fabricação e Caracterização de Nano-Matriz de Base Janus Camada por Camada para Promover a Regeneração da Cartilagem

Published: July 6, 2022 doi: 10.3791/63984
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biomedical Engineering, University of Connecticut
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve a montagem de um andaime de nanomatriz de base Janus (JBNm) camada por camada, adicionando nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e Fator de Crescimento Transformador Beta-1 (TGF-β1) sequencialmente. O JBNm foi fabricado e caracterizado; além disso, apresentou excelente bioatividade, estimulando funções celulares como adesão, proliferação e diferenciação.

Abstract

Vários andaimes de biomateriais foram desenvolvidos para orientar a adesão e proliferação celular, na esperança de promover funções específicas para usos in vitro e in vivo. A adição de fatores de crescimento a esses andaimes de biomateriais é geralmente feita para fornecer um ambiente ideal de cultura celular, mediando a diferenciação celular e suas funções subsequentes. No entanto, os fatores de crescimento em um andaime de biomaterial convencional são tipicamente projetados para serem liberados após a implantação, o que pode resultar em efeitos colaterais não intencionais no tecido ou nas células circundantes. Aqui, a nanomatriz de base Janus inspirada no DNA (JBNm) alcançou com sucesso um microambiente altamente localizado com uma estrutura camada por camada para construções de tecido cartilaginoso autossustentáveis. Os JBNms são auto-montados a partir de nanotubos de base Janus (JBNts), matrilina-3 e fator de crescimento transformador beta-1 (TGF-β1) via bioafinidade. O JBNm foi montado na proporção TGF-β1:matrilina-3:JBNt de 1:4:10, pois esta foi a razão determinada na qual a montagem adequada na estrutura camada por camada poderia ocorrer. Primeiramente, a solução de TGF-β1 foi adicionada à solução de matrilina-3. Em seguida, esta mistura foi pipetada várias vezes para garantir homogeneidade suficiente antes da adição da solução JBNt. Isso formou o JBNm camada por camada, depois de pipetar várias vezes novamente. Uma variedade de experimentos foi realizada para caracterizar a estrutura JBNm camada por camada, JBNts sozinho, matrilina-3 sozinho e TGF-β1 sozinho. A formação do JBNm foi estudada com espectros de absorção UV-Vis, e a estrutura do JBNm foi observada com microscopia eletrônica de transmissão (MET). À medida que o inovador andaime JBNm camada por camada é formado em escala molecular, o JBNm marcado com corante fluorescente pôde ser observado. O TGF-β1 é confinado dentro da camada interna do JBNm injetável, o que pode impedir a liberação de fatores de crescimento para áreas circundantes, promover condrogênese localizada e promover um microambiente anti-hipertrófico.

Introduction

Os andaimes na engenharia de tecidos desempenham um papel vital no fornecimento de suporte estrutural para a fixação celular e subsequente desenvolvimento tecidual1. Normalmente, as construções de tecidos convencionais sem qualquer andaime dependem do ambiente de cultura celular e adicionam fatores de crescimento para mediar a diferenciação celular. Além disso, essa adição de moléculas bioativas em andaimes é frequentemente a abordagem preferida para orientar a diferenciação e a função celular 2,3. Alguns andaimes podem imitar o microambiente bioquímico dos tecidos nativos de forma independente, enquanto outros podem influenciar diretamente as funções celulares através de fatores de crescimento. No entanto, os pesquisadores frequentemente encontram desafios na seleção de andaimes que poderiam afetar positivamente a adesão, o crescimento e a diferenciação celular, ao mesmo tempo em que fornecem suporte estrutural e estabilidade ideais por um longo período 4,5. As moléculas bioativas são muitas vezes frouxamente ligadas ao andaime, levando à rápida liberação dessas proteínas após a implantação, resultando em sua liberação em locais indesejados. Isso culmina em efeitos colaterais em tecidos ou células que não foram intencionalmente direcionados 6,7.

Os andaimes são tipicamente feitos de materiais poliméricos. A nanomatriz de base Janus (JBNm) é uma plataforma de andaime biomimético criada com um novo método camada por camada para construção de tecido cartilaginoso autossustentável8. Esses novos nanotubos inspirados em DNA foram nomeados nanotubos de base Janus (JBNts), pois imitam adequadamente a estrutura e a química da superfície do colágeno encontrada na matriz extracelular (ECM). Com a adição de moléculas bioativas, como a matrilina-3 e o Fator Transformador de Crescimento Beta-1 (TGF-β1), o JBNm pode criar um microambiente ideal que pode, então, estimular a funcionalidade celular e tecidual desejada9.

JBNts são novos nanotubos derivados de versões sintéticas da nucleobase adenina e timina. Os JBNts são formados através da auto-montagem10; seis nucleobases sintéticas se ligam para formar um anel, e esses anéis sofrem interações de empilhamento π-π para criar um nanotubo de 200-300 μm de comprimento11. Estes nanotubos são estruturalmente semelhantes às proteínas de colagénio; ao imitar um aspecto do microambiente da cartilagem nativa, os JBNts demonstraram fornecer um local de fixação favorável para condrócitos e células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs)11,12,13,14. Como os nanotubos são submetidos à automontagem e não requerem nenhum tipo de iniciador (como a luz UV), eles mostram um potencial excitante como um andaime injetável para áreas de defeitos de difícil acesso15.

A matrilina-3 é uma proteína da matriz extracelular estrutural encontrada na cartilagem. Essa proteína desempenha um papel significativo na condrogênese e na função adequada da cartilagem16,17. Recentemente, tem sido incluída em andaimes de biomateriais, incentivando a condrogênese sem hipertrofia 9,18,19. Ao incluir esta proteína no JBNm, as células da cartilagem são atraídas por um andaime que contém componentes semelhantes ao do seu microambiente nativo. Além disso, foi demonstrado que a matrilina-3 é necessária para a sinalização adequada do TGF-β1 dentro dos condrócitos20. Os fatores de crescimento funcionam como moléculas de sinalização, causando o crescimento específico de uma determinada célula ou tecido. Assim, para alcançar a regeneração ideal da cartilagem, a matrilina-3 e o TGF-β1 são componentes essenciais dentro do JBNm. A adição de TGF-β1 no andaime camada por camada pode promover ainda mais a regeneração da cartilagem em uma construção de tecido. O TGF-β1 é um fator de crescimento empregado para incentivar o processo de cicatrização de defeitos osteocondrais, incentivando a proliferação e diferenciação de condrócitos e hMSC21,22. Assim, o TGF-β1 desempenha um papel fundamental na regeneração da cartilagem JBNm (J/T/M JBNm)23, incentivando o crescimento adequado, especialmente quando está localizado dentro das camadas JBNm.

Como mencionado anteriormente, os fatores de crescimento são tipicamente montados do lado de fora dos andaimes sem métodos específicos de incorporação. Aqui, com a nanoarquitetura precisamente projetada dos biomateriais, o JBNm foi desenvolvido para o direcionamento específico de células e tecidos pretendidos. O JBNm é composto por TGF-β1 aderido em superfícies JBNt na camada interna e matrilina-3 aderido em superfícies JBNt na camada externa24,25. A incorporação do TGF-β1 na camada interna da estrutura camada por camada permite um microambiente altamente localizado ao longo das fibras JBNm, criando uma construção tecidual homeostática com uma liberação muito mais lenta da proteína12. A injetabilidade do JBNm o torna uma construção de tecido cartilaginoso ideal para várias aplicações futuras de biomateriais26.

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Protocol

1. Síntese dos JBNts

  1. Preparar o monômero JBNt utilizando métodos previamente publicados, envolvendo a síntese de uma variedade de compostos12.
  2. Purificar o monómero bruto JBNt depois de ter sido sintetizado com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando uma coluna de fase reversa. Use o solvente A: 100% água, o solvente B: 100% acetonitrila e o solvente C: solução de água HCl com pH = 1. Use uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Coletar o maior pico obtido na HPLC aos 7,2 min.

2. Fabricação para JBNt/Matn1/TGF-β1 (Vídeo 1)

NOTA: O vídeo 1 mostra que o JBNm é um sólido injetável formado em um ambiente fisiológico (solução de água, sem luz UV, sem aditivos químicos e sem aquecimento), que também é biologicamente inspirado.

  1. Adicionar 8 μL de TGF-β1 de 1 mg/mL suspenso em H 2 O a 32 μL de 1 mg/mL de matrilina-3 suspenso em H2O. Pipeta para garantir amistura adequada dessas proteínas.
  2. Adicionar 80 μL de JBNts de 1 mg/mL suspensos em H2O à solução de TGF-β1/matrilina-3. Pipeta repetidamente para garantir a mistura adequada. A presença de floculos brancos pode ser observada imediatamente após a adição de JBNts, indicando a formação do JBNm (Vídeo 1).

3. Observação de espécimes com absorção ultravioleta-visível (UV-Vis)

NOTA: Os espectros de absorção UV-Vis foram estudados para caracterizar a montagem do JBNm. Essa medida foi analisada para quatro categorias: JBNts isoladamente, matrilina-3 isoladamente, TGF-β1 isoladamente e JBNm completa camada por camada, composta por todas as três partes. Todas as concentrações iniciais são suspensas em H2O.

  1. Para o grupo JBNt, adicione 5 μL de 1 mg/mL JBNts a 50 μL de H2O para fazer uma solução de 90,9 μg/mL.
  2. Para o grupo matrilina-3, adicione 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 15 μL de H2O para fazer uma solução de 7,3 μg/mL.
  3. Para o grupo TGF-β1, adicione 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 45 μL de H2O para fazer uma solução de 1,8 μg/mL.
  4. Para o grupo JBNm, adicione 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 10 μL de 10 μg/mL TGF-β1. Agitar para garantir a mistura adequada e, em seguida, adicionar 5 μL de 1 mg/ml JBNts à solução, pipetando repetidamente para misturar a amostra.
  5. Usando um espectrofotômetro, meça o espectro de absorção de cada grupo.

4. Medição do potencial Zeta de espécimes

NOTA: O potencial zeta foi analisado para melhor predizer como o JBNm interagiria com o tecido in vivo. Foram mensurados três grupos: matrilina-3 isoladamente, matrilina-3 com TGF-β1 e JBNm camada por camada completa.

  1. Para o grupo matrilina-3, adicione 160 μL de 10 mg/mL de matrilina-3 a 640 μL de H2O para fazer uma solução de 800 μL.
  2. Para o composto matrilina-3/TGF-β1, adicione 160 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/mL de TGF-β1. Pipetar repetidamente para garantir a homogeneidade adequada. Em seguida, adicione-o a 600 μL de H2O resultando em uma solução de 800 μL.
  3. Para o grupo JBNm, adicione 160 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 40 μL de 10 μg/mL de TGF-β1. Pipeta várias vezes para misturar as proteínas. Em seguida, adicionar 20 μL de 1 mg/mL JBNts à solução e pipeta para garantir a homogeneidade. Finalmente, adicione a solução JBNm a 580 μL de H2O para produzir uma solução de 800 μL.
  4. Meça os valores de zeta-potencial para os três grupos.

5. Preparação da nano-matriz JBNt/matrilina-3 para microscopia eletrônica de transmissão (MET)

NOTA: A caracterização do MET é realizada para caracterizar a morfologia do JBNts e JBNm.

  1. Inserir duas grades em um limpador de plasma para limpar adequadamente as grades antes da coloração negativa do JBNts e JBNm de acordo com os protocolos publicados e protocolos do fabricante12.
  2. Criar uma solução JBNt de 200 μg/mL misturando 10 μL de 1 mg/mL de JBNts com 40 μL de água destilada.
  3. Misture 30 μL de 100 μg/mL de matrilina-3 com 20 μL de 100 μg/mL de TGF-β1 e pipeta várias vezes. Adicionar 10 μL de JBNts de 1 mg/mL à mistura de matrilina-3/TGF-β1 para preparar a amostra JBNm. Mais uma vez, pipeta repetidamente.
  4. Adicionar 3 μL da solução JBNt (200 μg/mL) e 3 μL da solução JBNm em grades separadas e deixá-las por 2 min.
  5. Enxaguar cada grelha com 100 μL de solução de acetato de uranilo (0,5%). Use papéis de filtro para remover o excesso de solução e permitir que as grades sequem ao ar.
  6. Operar um microscópio eletrônico de transmissão para observar e caracterizar adequadamente as amostras, conforme publicado anteriormente11,12.

6. Medição dos espectros de absorção de proteínas marcadas com fluorescência

NOTA: A estrutura do JBNm é verificada pela observação das estruturas do JBNm com análise espectral de absorção.

  1. Rotule o TGF-β1 usando um kit de rotulagem de proteínas seguindo as instruções do fabricante. Adicionar 20 μL de 20 μg/mL marcado com TGF-β1 a 25 μL de H2O para fazer uma solução de teste de 8,9 μg/mL.
  2. Rotule a matrilina-3 usando um kit de rotulagem separado. Adicionar 20 μL de 80 μg/mL de matrilina-3 marcada a 25 μL de H2O para fazer uma solução de teste de 36 μg/mL.
    NOTA: A marcação do corante fluorescente do TGF-β1 resultou em uma concentração final de 20 μg/mL, enquanto a marcação da matrilina-3 resultou em uma concentração final de 80 μg/mL.
  3. Misture 20 μL de 80 μg/mL de matrilina-3 marcada com 20 μL de 20 μg/mL de TGF-β1 e 5 μL de H2O, resultando em um composto de TGF-β1/matrilina-3 marcado. Pipetar a mistura várias vezes para misturar.
  4. Adicionar 5 μL de 1 mg/mL JBNts a 40 μL de H2O, resultando em uma solução de 111 μg/mL.
  5. Adicione 20 μL de 20 μg/mL marcados com TGF-β1 a 20 μL de 80 μg/mL de matrilina-3 marcados várias vezes. Adicionar 5 μL de JBNts de 1 mg/ml à solução de TGF-β1/matrilina-3 marcada e pipetar repetidamente para misturar adequadamente o composto.
    NOTA: As concentrações finais das amostras JBNt, TGF-β1 e matrilina-3 marcadas foram de 111 μg/mL, 8,9 μg/mL e 36 μg/mL, respectivamente.
  6. Transfira cada grupo de amostra (isto é, TGF-β1 (etapa 6.1), matrilina-3 (etapa 6.2), TGF-β1/matrilina-3 (etapa 6.3), JBNts (etapa 6.4), JBNm (etapa 6.5)) para seu próprio poço de uma placa preta de 384 poços.
  7. Carregue a placa preta de 384 poços em um leitor de microplacas multimodo e faça medições em comprimentos de onda de excitação de 488 nm e 555 nm, seguindo o protocolo do fabricante.

7. Ensaio da função biológica in vitro

  1. Ensaio de adesão celular em câmaras de vidro de cobertura pré-revestidas
    1. Prepare duas cobertas com câmara com cinco grupos de amostras, pois uma tampa é usada para cada tipo de célula.
    2. Adicionar 1,25 μL de 1 mg/mL de JBNts a 198,75 μL de água destilada, resultando em uma solução de 6,25 μg/mL.
    3. Adicione 10 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 190 μL de água destilada, resultando em uma solução de 0,5 μg/mL.
    4. Adicionar 2,5 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 197,5 μg/mL de água destilada, resultando em uma solução de 0,125 μg/mL.
    5. Para o grupo JBNm, adicione 10 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 2,5 μL de 10 μg/mLTGF-β1 e pipeta repetidamente. Adicionar 1,25 μL de JBNts com uma concentração de 1 mg/ml à solução de mistura e à pipeta. Finalmente, adicione 186,25 μL de água destilada para resultar em uma solução JBNm de 200 μL.
      1. Para o grupo controle, use 200 μL de água destilada.
    6. Adicione cada grupo de amostras em seu próprio poço de uma tampa com câmara nº 1.5. Coloque o vidro de cobertura num congelador a -80 °C durante 1 h e, em seguida, liofilizador com um instrumento liofilizador.
    7. Semeia células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) e células condrócitos humanas (10.000 células por poço) em cada poço dos óculos de cobertura com câmara preparados.
    8. Incubar os dois copos de cobertura durante 4 h numa incubadora a 37 °C. Em seguida, aspirar o meio de cultura celular e enxaguar duas vezes com PBS.
    9. Fixe as células com paraformaldeído a 4% por 5 minutos e, em seguida, remova e enxágue as amostras com PBS. Lave a amostra uma segunda vez para remover completamente o paraformaldeído a 4%.
    10. Incubar células com 100 μL de Triton-X a 0,1% por 10 min e lavar com PBS. Adicionar 100 μL de 0,165 μM de rodamina-faloidina a cada alvéolo. Aguarde 30 minutos e depois lave com PBS novamente.
    11. Adicione 0,1 μg/mL de DAPI a cada poço para manchar os núcleos. Aguarde 5 minutos e lave os poços com PBS duas vezes.
    12. Use um microscópio confocal espectral para observar a morfologia celular e capturar imagens fluorescentes.
    13. Além disso, analise o número de células e a morfologia usando um software de processamento de imagens. Abra o software e carregue as imagens. Adicione uma barra de escala e calibre o software. Conte o número de células em uma determinada área para cada amostra. Em seguida, use a ferramenta de medição para coletar dados sobre a morfologia celular para cada amostra.
  2. Proliferação celular
    1. Prepare três placas de 96 poços não tratadas, adicionando cinco grupos de amostras a cada uma.
      1. Para o grupo JBNt, adicionar 3,75 μL de 1 mg/mL JBNts a 596,25 μL de água destilada, resultando em uma solução JBNt de 600 μL com concentração de 6,25 μg/mL.
      2. Para o grupo TGF-β1, adicionar 7,5 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 592,5 μL de água destilada, resultando em uma solução de teste de 0,125 μg/mL.
      3. Para o grupo matrilina-3, adicionar 30 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 570 μL de água destilada, resultando em uma solução de teste de 0,5 μg/mL.
      4. Para o grupo JBNm, misture 7,5 μL de TGF-β1 de 10 μg/mL com 30 μL de matrilina-3 de 10 μg/mL e pipeta várias vezes, seguido da adição de 3,75 μL de JBNts de 1 mg/mL à solução.
      5. Diluir a solução de JBNm com 558,75 μL de água destilada para obter as concentrações finais de 6,25 μg/mL, 0,125 μg/mL e 0,5 μg/mL, respectivamente, para as amostras JBNt, TGF-β1 e matrilina-3.
      6. Para o grupo controle, use 600 μL de água destilada.
    2. Divida cada grupo de amostras em seis poços (100 μL de amostra por poço).
    3. Colocar as três placas contendo todas as amostras num congelador de -80 °C durante 1 h e, em seguida, liofilizar com um instrumento liofilizador.
    4. Semear hMSCs nessas placas, cada uma recebendo uma suspensão celular de 100 μL (por poço) contendo 5.000 células. Incubar as três placas a 37 °C durante 1 dia, 3 dias ou 5 dias a 5% de CO2.
    5. Adicionar 10 μL de solução de CCK-8 a cada poço com as células e incubar a 37 °C por mais 2 h.
    6. Meça os valores de absorção de cada poço com leitores de microplacas multimodo a 450 nm.
    7. Semeia um gradiente conhecido de hMSCs em uma placa de 96 poços e incube por 4 h. Use o ensaio CCK-8 para medir os valores de absorção do número conhecido de células e gerar uma curva padrão.
    8. Calcule a proliferação celular usando a curva padrão de absorção.
  3. Teste de estabilidade
    NOTA: Um kit ELISA direcionado ao TGF-β1 humano foi usado para determinar a liberação percentual de TGF-β1 do JBNm em um hidrogel de agarose.
    1. Preparar 2% de agarose adicionando 400 mg de agarose em pó a 20 ml de PBS e aquecendo-a até 100 °C para dissolver completamente o pó de agarose.
    2. Prepare o JBNm dentro do hidrogel de agarose a 2% refrigerado.
      1. Combinar 10 μL de 10 μg/mL de TGF-β1, 40 μL de 10 μg/mL de matrilina-3, 5 μL de 1 mg/mL JBNts e 195 μL de PBS. Misture esta solução com 250 μL de agarose a 2%, criando o hidrogel JBNm.
    3. Adicione 500 μL de PBS, usando-o como uma solução de liberação, e certifique-se de alterá-lo a cada 3 dias. Mantenha todas as soluções liberadas e deixe a amostra descansar por 15 dias.
    4. Utilize um kit ELISA para testar cada uma das soluções de liberação capturadas, seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: Subtraindo a quantidade de TGF-β1 liberada no PBS do valor teórico de carga de 100%, a quantidade restante de TGF-β1 pode ser determinada.
  4. Análise de diferenciação celular com PCR26.
    1. Preparar sete grupos de amostras com cada amostra contendo 20 μL de suspensão celular (4 x 104 células), 30 μL da solução específica (ou PBS, dependendo do grupo amostral) e 50 μL de acarose a 2 % em peso.
      1. Para o grupo TGF-β1, adicionar 5 μL de 10 μg/mL de TGF-β1 a 25 μL de PBS, resultando em uma solução de 1,6 μg/mL.
      2. Para o grupo matrilina-3, adicione 20 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 10 μL de PBS, resultando em uma solução de 6,7 μg/mL.
      3. Para o grupo JBNt, adicionar 2,5 μL de 1 mg/mL JBNts a 27,5 μL de PBS, resultando em uma solução de 83,3 μg/mL.
      4. Para o grupo JBNm J/T/M, adicionar 10 μL de 10 μg/mL de matrilina-3 a 5 μL de TGF-β1 de 10 μg/mL e pipeta para cima e para baixo para misturar a solução. Em seguida, adicione 2,5 μL de 1 mg/mL de JBNts e pipeta novamente. Finalmente, diluir com 2,5 μL de PBS.
      5. Para cada grupo controle, use 30 μL de PBS como amostra.
    2. Adicione 0,5 mL de meio de cultura celular a cada poço, certificando-se de substituí-lo a cada 3 dias.
      1. Para o grupo controle positivo, use um meio condrogênico hMSC comercialmente disponível contendo TGF-β1 adicionado. Este TGF-β1 adicional é igual à quantidade nos grupos TGF-β1 e J/T/M JBNm.
      2. Para um dos grupos de controle negativos, use um meio condrogênico comercial de hMSC que não contenha TGF-β1. Para o outro grupo controle negativo, use um meio de cultura de células DMEM contendo 10% de soro fetal bovino (FBS).
      3. Para cada outro grupo, use um meio comercial de cultura de células condrogênicas hMSC sem TGF-β1.
    3. Cultive as amostras por 15 dias.
    4. Extrair o RNA das amostras e realizar a PCR para estudar a diferenciação das amostras conforme descrito anteriormente26.
  5. Imunocoloração para ensaio de expressão de colágeno tipo X
    1. Preparar sete amostras à base de agarose da mesma forma que a diferenciação celular com a secção do método de PCR (passo 7.4).
    2. Cultive as amostras por 15 dias.
    3. Fixar as amostras com formaldeído a 4% durante 1 dia, mergulhar em solução de sacarose a 30% durante a noite e, em seguida, congelar durante a noite a -80 °C com azoto líquido. Fixar as amostras utilizando o reagente composto de temperatura de corte ideal (OCT), uma mistura de glicóis e resinas solúveis em água, a -10 °C.
    4. Operar um micrótomo criostato para obter seções congeladas de 20 μm de espessura de cada amostra.
    5. Coloração de cada secção com um anticorpo Anti-Colagénio X com diluição 1:800 e um anticorpo secundário de marcação fluorescente diluído com PBS, de acordo com os protocolos do fabricante.
    6. Observe cada seção com um microscópio confocal, usando uma excitação de 488 nm e uma ampliação de 40x na ocular.

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Representative Results

Seguindo o protocolo, os JBNts foram sintetizados com sucesso e caracterizados com absorção de UV-Vis e MET. O JBNm é um andaime sólido injetável que passa por um rápido processo biomimético. Após a adição de JBNts a uma mistura de solução de TGF-β1/matrilina-3 em ambiente fisiológico, formou-se um andaime sólido de malha branca, indicando a montagem bem-sucedida do JBNm, como pode ser observado na Figura 1. Isso foi demonstrado nos métodos de caracterização.

Em condições fisiológicas, a matrilina-3 é carregada negativamente devido ao seu ponto isoelétrico27 (Figura 2A). Após a adição da solução de TGF-β1 à solução de matrilina-3, o potencial zeta do composto TGF-β1/matrilina-3 aumentou para um valor quase neutro, indicando que as duas proteínas estavam ligadas através de interações de carga. Como visto na Figura 2A, o potencial zeta do JBNm é o maior entre os três grupos devido ao JBNts, pois o ponto isoelétrico da cadeia lateral da lisina é de cerca de 9,74 em um ambiente fisiológico. O aumento nos valores de zeta-potencial do JBNm indica a montagem bem-sucedida de sua estrutura camada por camada.

Os espectros de absorção UV-Vis (Figura 2B) esclarecem a formação da estrutura interior hierárquica camada por camada do JBNm. Os anéis aromáticos das cadeias laterais de lisina e dos JBNts contribuíram para os dois picos de absorção a 220 nm e 280 nm, respectivamente. A diminuição do valor de absorção foi observada após a adição de TGF-β1, indicando que a ligação ocorre entre TGF-β1 e JBNts. Após a adição de JBNts à matrilina-3, observou-se uma diminuição mais evidente na intensidade de absorção dos picos, mais uma vez indicando uma ligação bem-sucedida entre a matrilina-3 e a JBNts. Da mesma forma, após a adição de JBNts a uma mistura de TGF-β1/matrilina-3, o JBNm foi formado, e os picos de absorção diminuíram de intensidade. O pico de absorção do JBNm é mais próximo da linha matrilina-3/JBNts do que da linha TGF-β1/JBNts, indicando que os JBNts preferem se ligar à matrilina-3, formando uma estrutura externa camada por camada com matrilina-3 enquanto o TGF-β1 reside na camada interna. O ETM é utilizado para caracterizar a morfologia dos JBNts e JBNm (Figura 2C). Após a combinação com proteínas, feixes espessos de JBNm foram observados formando uma estrutura de andaime.

A microscopia de fluorescência confirmou a presença da estrutura camada por camada (Figura 3A) e demonstrou a seção transversal do JBNm. Após a marcação do TGF-β1 e da matrilina-3, observou-se que a matrilina-3 fluorescente vermelha envolve os feixes JBNt, formando a camada externa do JBNm. Na Figura 3B, o TGF-β1 verde-fluorescente formou uma camada interna, contribuindo para a capacidade de armazenar fatores de crescimento e permitindo a localização do TGF-β1. A Figura 3C mostra o processo de transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) entre as proteínas marcadas com corante fluorescente, caracterizado por espectros de fluorescência, com picos de emissão de 520 nm e 570 nm para os grupos TGF-β1 e matrilina-3 marcados, respectivamente28. Após a adição de JBNts de acordo com o protocolo, a estrutura camada por camada é formada; picos foram observados em 520 nm e 570 nm para o grupo JBNm, indicando uma ligação e montagem bem-sucedidas das proteínas e JBNts.

Além disso, o efeito do JBNm na adesão e proliferação celular de hMSCs foi explorado. Como mostra a Figura 4, determinou-se a densidade de adesão celular do JBNm revestido na superfície dos óculos de cobertura com câmara. O JBNm mostrou hMSCs agrupadas ao longo de si mesmo (Figura 4A), enquanto menos células aderiram ao JBNts. No entanto, para os demais grupos, as hMSCs foram distribuídas uniformemente sem alinhamento em relação ao grupo JBNm. O alinhamento das células, bem como o tamanho das células no JBNm, demonstrou que o JBNts desempenhou um papel na adesão celular, enquanto as proteínas no JBNm aumentaram a afinidade da adesão celular (Figura 4B,C).

Após o 1º dia de cultura celular com JBNm, JBNts, matrilina-3 isoladamente, TGF-β1 isoladamente e controle negativo, os grupos JBNm e TGF-β1 apresentaram proliferação celular significativa quando comparados aos demais grupos. Quando a duração da cultura celular foi aumentada para 3 e 5 dias, os grupos JBNm e TGF-β1 demonstraram ainda mais aumento da proliferação celular, como pode ser observado na Figura 5. Um estudo de função de longo prazo foi realizado para determinar a diferenciação de hMSCs com JBNm e sem JBNm (controle negativo). Após 15 dias, uma coloração azul de Alcian aumentada foi observada, indicando condrogênese de hMSCs crescendo ao lado de JBNm26. Assim, as células preferiram os JBNts do JBNm. Isso provavelmente se deveu à sua estrutura que imita o DNA e à capacidade de ser desmontada em unidades de moléculas pequenas, a última das quais pode ser desencadeada por um pH baixo ou atividade enzimática suficiente (como a absorção pelas células)14,29.

Vídeo 1: Gravação de vídeo da montagem JBNm. Esta gravação retrata a formação do JBNts, matrilina-3 e TGF-β1 no JBNm. Essa figura foi modificada a partir de Zhou et al. (2021)26. Clique aqui para baixar este vídeo.

Figure 1
Figura 1: Ilustração esquemática da estrutura química dos JBNts, do JBNm J/T/M e da capacidade condrogênica do JBNm do J/T/M. (A) A estrutura química dos JBNts, destacando sua formação do monômero ao anel de roseta ao JBNt. (B) Os componentes que compõem o JBNm do J/T/M, bem como a forma como eles se montam no JBNm. (C ) Esquema da cultura de células-tronco mesenquimais humanas no JBNm J/T/M. Essa figura foi modificada a partir de Zhou et al. (2021)26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Caracterização do material dos espectros J/T/M JBNm. (A) Zeta-potencial da matrilina-3 isoladamente, do composto TGF-β1/matrilina-3 e dos espectros de absorção J/T/M J/T/M JBNm. (B) UV-Vis de JBNts isoladamente, matrilina-3 isoladamente, TGF-β1 isoladamente, matrilina-3/JBNts, TGF-β1/JBNts e J/T/M JBNm. (C ) Imagens do JBNts isolado e do J/T/M JBNm obtidas por microscopia eletrônica de transmissão (MET). Essa figura foi modificada a partir de Zhou et al. (2021)26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Imagem confocal fluorescente e espectros de fluorescência de J/T/M JBNm. (A) Imagem confocal 3D do J/T/M JBNm, com matrilina-3 marcada com fluorescência vermelha e TGF-β1 marcada com fluorescência verde. (B) Imagens confocais 2D de J/T/M JBNm, com matrilina-3 marcada com fluorescência vermelha, TGF-β1 com marcação fluorescente verde e uma versão mesclada. (C) Espectros de fluorescência de vários compostos para caracterizar o processo FRET entre as proteínas marcadas. Essa figura foi modificada a partir de Zhou et al. (2021)26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Análise da cultura de células-tronco mesenquimais humanas (hMSC). (A) Imagens de microscopia óptica de hMSCs com TGF-β1, matrilina-3 e JBNts, cultivadas em gel de agarose. (B) Imagens de microscopia confocal de hMSCs cultivadas no vidro de cobertura com câmara revestido com uma variedade de componentes JBNm. (C) Gráfico do número de células aderidas por milímetro quadrado para cada grupo. As barras de erro denotam desvios padrão. (D) Gráfico do comprimento do eixo maior da célula em μm por grupo. As barras de erro denotam desvios padrão. Nota: N ≥ 3, *P< 0,05, **P< 0,01, ***P< 0,001, ****P< 0,0001 (comparado com controles negativos, NC). Essa figura foi modificada a partir de Zhou et al. (2021)26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Comparação do número de células para vários grupos entre os dias 1, 3 e 5. Estatísticas do número de células de hMSCs após serem cultivadas com diferentes materiais nos dias 1, 3 e 5. As barras de erro denotam desvios padrão. Nota: N = 6, *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Essa figura foi modificada a partir de Zhou et al. (2021)26. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O objetivo deste estudo é desenvolver uma plataforma de andaimes biomiméticos, o JBNm, para superar as limitações dos construtos teciduais convencionais que dependem de ambientes de cultura celular para mediar a diferenciação celular. O JBNm é um andaime de estrutura camada por camada para uma construção de tecido cartilaginoso autossustentável. O design inovador é baseado em novos nanomateriais inspirados no DNA, os JBNts. O JBNm, composto por JBNts30, TGF-β1 e matrilina-3, é montado através de uma nova técnica camada por camada, onde a automontagem do andaime foi controlada no nível molecular. A montagem do JBNm foi observada e caracterizada com medição do potencial zeta, absorção de UV-Vis, ETM e análise espectral de fluorescência.

Os espectros UV-Vis da Figura 2B (etapa 3) demonstraram a formação do interior hierárquico camada por camada do JBNm. Uma diferença nos picos de absorbância pode ser observada devido a uma diferença na afinidade de ligação. Interações mais importantes ocorrem entre JBNts e matrilina-3 do que entre JBNts e TGF-β1, indicando que JBNts imitam proteínas de colágeno em termos de morfologia fibrosa e química da superfície de lisina. Esta técnica é necessária para observar a ligação do JBNts à matrilina-3 em vez do TGF-β1, permitindo o encapsulamento do TGF-β1 e, portanto, proporcionando uma liberação lenta de TGF-β1 no tecido circundante. O passo mais crítico no desenvolvimento do JBNm é a combinação de proteínas com o JBNts. TGF-β1 e matrilina-3 devem ser adicionados antes da adição de JBNts para observar o efeito total do fenômeno FRET entre a matrilina-3 marcada e TGF-β1. A limitação dessa técnica decorre da sequência incorreta de adição de proteínas e nanotubos, resultando em medidas variadas. Este é um passo importante para a formação do JBNm para estudos futuros e, portanto, será aplicado a futuras fabricações e estudos do JBNm.

A matrilina-3 é uma proteína altamente negativa, enquanto a TGF-β1 é uma proteína ligeiramente neutra, como visto na Figura 2A. A diferença de carga foi observada para determinar a ligação dessas proteínas. A partir do estado carregado negativamente da matrilina-3, o potencial zeta aumentou para um valor quase neutro após a adição de TGF-β1 (Figura 2A). Esta etapa é importante para determinar a primeira camada interna do andaime biomimético e para indicar que a combinação de ambas as proteínas é através da interação de carga. Após a adição do JBNts, que é a segunda etapa da fabricação do JBNm, o zeta-potencial do JBNm foi medido em ~10 ± 5 mV (Figura 2A). Como os JBNts são altamente positivos, observou-se que a carga de JBNm aumentou conforme o esperado. A determinação de cargas com potencial zeta é, portanto, importante para observar a formação do JBNm passo a passo por meio de interações de carga. Semelhante à espectroscopia UV-Vis, a sequência de adição é importante nesta etapa, e a ordem incorreta de adição pode resultar em medições variadas. Da mesma forma, é importante pipetar a mistura para cima e para baixo antes da medição.

Em seguida, o TGF-β1 e a matrilina-3 são marcados para que o desenvolvimento do JBNm possa ser observado com microscopia confocal e análise espectral de fluorescência com leitores de microplacas multimodo. As amostras foram excitadas com laser de 488 nm e apresentaram picos de emissão de 520 nm e 570 nm (Figura 3). Nenhum pico de emissão foi observado apenas para JBNts porque eles não são marcados. O FRET ocorreu do doador de TGF-β1 para o aceitador de matrilina-3, reduzindo assim o pico de emissão em 520 nm e aumentando o pico de emissão em 570 nm; os dois componentes estão separados por 10 nm de distância, permitindo que o fenômeno FRET ocorra. Portanto, a montagem do JBNm é baseada em processos espaciais (ou seja, distância física) juntamente com interações de carga. A etapa mais crítica no desenvolvimento do JBNm é a sequência de adição; TGF-β1 e matrilina-3 devem ser adicionados antes da adição de JBNts para observar o efeito total do fenômeno FET. A ampliação de pelo menos 40x na ocular é necessária para observar o JBNm fluorescente. A limitação dessa técnica é que os JBNts não são marcados e, portanto, não puderam ser observados com microscopia confocal. No entanto, a técnica de marcação de proteínas pode ser aplicada para rotular o JBNt com algumas modificações para futuras aplicações.

O JBNm pode auxiliar as funções celulares, como a adesão celular e a proliferação celular. Neste estudo, as hMSCs foram cultivadas (começando com 5.000 células) em diferentes materiais (JBNm, JBNts, TGF-β1, matrilina-3 e controles negativos sem aditivos) para comparar o número de células após incubação por 1, 3 e 5 dias usando solução CCK-8, seguindo os protocolos exatos do fabricante para determinar a proliferação celular. O JBNm, especialmente na presença de TGF-β1, e o TGF-β1 isolados apresentaram proliferação celular significativa em comparação com os outros três grupos. Os JBNts imitam o colágeno na MEC morfologicamente, enquanto a matrilina-3 é uma proteína específica da cartilagem, resultando em aumento da atividade de proliferação celular após incubação a 37 °C por 3 e 5 dias (Figura 5). O JBNm tem mostrado grande potencial para servir como um andaime de engenharia de tecidos injetáveis e biomiméticos para superar as limitações das construções celulares tradicionais para várias aplicações futuras como biomateriais29,31. O JBNm mimetiza morfologicamente a ECM da cartilagem, proporcionando locais de adesão e permitindo a liberação de fatores diferenciadores pró-condrogênicos no microambiente, como o TGF-β132,33. A capacidade do JBNm de incorporar TGF-β1 na camada interna do andaime evita que ele vaze para áreas indesejadas, melhorando assim a eficácia do andaime (Figura 4 e Figura 5). Muitas hMSCs se agrupam ao longo do andaime JBNm, enquanto as células são esparsamente distribuídas nos grupos matrilina-3, TGF-β1 e controle negativo (Figura 4). A morfologia das células também foi observada, indicando excelente afinidade com as superfícies JBNm. Esses biomateriais precisamente projetados impedem a rápida liberação de moléculas bioativas incorporadas no ambiente de cultura celular e melhoram a autossustentabilidade das construções teciduais dentro da matriz34. Uma limitação desta técnica é que os números de células iniciais são críticos para determinar a proliferação de células. Um número de células iniciais de 5.000 foi considerado o mais ideal para este estudo. Uma curva padrão também é necessária para determinar o número de células, plotando um número conhecido de células e medindo-as no leitor de microplacas multimodo. Esta técnica pode ser aplicada no futuro como um método padronizado para determinar a proliferação celular em todos os estudos relacionados a andaimes JBNm.

As hMSCs foram cultivadas em pellets de agarose 3D com e sem JBNm para determinar o estudo de função a longo prazo por 15 dias. Após 15 dias, o RNA total foi extraído das hMSCs nos pellets de agarose, contendo controle positivo (os pellets foram fornecidos com TGF-β1 fresco toda vez que o meio foi trocado), JBNm, JBNts, matrilina-3, TGF-β1 e sem aditivos. A qPCR em tempo real foi realizada para análise gênica, testando marcadores de diferenciação condrogênica, Aggrecan (ACAN) e marcador de hipertrofia colágeno tipo X (COL X). A expressão de ACAN no grupo JBNm aumentou significativamente em comparação com outros grupos, demonstrando que o JBNm promove a diferenciação condrogênica de células-tronco significativamente enquanto inibe o COL X. Enquanto isso, o controle positivo tem potencializado a condrogênese, como observado no aumento da ACAN, e também a hipertrofia da célula diferenciada26. Uma outra limitação deste estudo é que a extração de RNA é das células embutidas em um hidrogel. O RNA total obtido neste protocolo, portanto, foi de baixa concentração e pureza. Para superar essa limitação, mais amostras foram cultivadas e extraídas para obter a concentração e a pureza ideais para a próxima etapa, a qPCR em tempo real. Embora a qPCR seja importante para o estudo, pequenas modificações dessa técnica são necessárias para estudos futuros para garantir a extração eficiente da amostra sem sacrificar um grande número de amostras.

Um teste de estabilidade foi realizado com um kit ELISA TGF-β1 humano para testar a liberação de proteína do hidrogel JBNm. Neste estudo, espera-se que o TGF-β1 seja encapsulado no JBNm J/T/M e, portanto, nenhuma liberação de TGF-β1 deve ser observada (ou seja, o valor teórico de carga é de 100%). Uma limitação desta etapa é que todo o TGF-β1 é assumido como encapsulado no andaime JBNm camada por camada. Após 15 dias, as soluções liberadas do hidrogel são coletadas e testadas com o kit, seguindo os protocolos do fabricante. Em seguida, a quantidade de TGF-β1 foi calculada subtraindo-se a quantidade de TGF-β1 liberado em PBS do valor teórico de carga. Como o TGF-β1 foi encapsulado na camada interna do JBNm, a liberação lenta da proteína foi antecipada. O estudo demonstrou que o TGF-β1 está localizado dentro do andaime JBNm e não se solta rapidamente nas áreas circundantes26.

Esta inovadora construção de tecido cartilaginoso JBNm camada por camada foi realizada por auto-montagem altamente organizada e controlada no nível molecular. O TGF-β1 é confinado na camada interna das fibras da matriz, evitando seu vazamento para locais indesejados e promovendo condrogênese localizada simultaneamente. Além disso, a matrilina-3 está localizada na camada externa das fibras da matriz, criando um microambiente anti-hipertrófico35. Demonstrou-se que os JBNts não apenas servem como uma espinha dorsal estrutural do andaime, mas também aumentam a ancoragem e a adesão das células-tronco para localizar células ao longo das fibras da matriz30,36. Quanto aos trabalhos futuros, o projeto camada por camada do andaime à base de JBNt será customizado para aplicações em diversos tecidos37,38,39.

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Disclosures

O Dr. Yupeng Chen é co-fundador da Eascra Biotech, Inc. e da NanoDe Therapeutics, Inc.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado pelos subsídios do NIH 7R01AR072027 e 7R03AR069383, NSF Career Award 1905785, NSF 2025362 e pela Universidade de Connecticut. Este trabalho também é apoiado em parte pela concessão do NIH S10OD016435.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 % Normal Goat Serum Thermo Fisher 50062Z Agent used to block nonspecific antibody binding actions during staining.
24-well plate Corning 07-200-740 24-well plate used for comparative cell culture.
384-Well Black Untreated Plate Thermo Fisher 262260 384-well plate used for absorption measurements.
8-well chambered coverglass Thermo Fisher 155409PK 8-well coverglass used for comparative cell culture.
96-well flat bottom Corning 07-200-91 96-well plate used for comparative cell culture.
96-Well Plate non- treated Thermo Fisher 260895 96-well plate used for comparative cell culture and analysis.
Agarose Gel Sigma-Aldrich A9539 Hydrogel used for cell culture.
Agarose Gel Sigma Aldrich A9539 Hydrogel used as an environment for cell culture.
Alexa Fluor Microscale Protein Labeling Kit Thermo Fisher A30006 (488) and A30007 (555) Fluorescent dye used to label proteins.
Anti-Collagen X Antibody Thermo Fisher 41-9771-82 Antibody used to stain collagen-X.
Bio-Rad PCR Machine Bio-Rad Equipment used to perform PCR on samples.
C28/I2 Chondrocyte Cell Line Cells used to analyze proliferative abilities of various samples.
Cell Counting Kit 8 Milipore Sigma 96992 Cell proliferation assay.
Cell Profiler Broad Institute Software used to analyze cell images.
Cryostat Microtome Equipment used to produce thin segments of samples for use in staining and microscopy.
DAPI Invitrogen D1306 Blue fluorescent stain that binds to adenine-thymine DNA regions.
Disposable cuvettes FISHER Scientific 14-955-128 Container used for spectrophotometry.
DMEM Cell Culture Medium Thermo Fisher 10566032 Media used to support cellular growth.
Fetal Bovine Serum GIBCO A4766801 Serum used in cell culture medium to support cell growth.
Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher 00-4958-02 Solution used to mount slides for immunostaining.
Formaldehyde Compound used to fix samples prior to microtoming.
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Thermo Fisher A16110 Antibody used for protein staining.
Human Mesenchymal Stem Cells LONZA PT-2501 Cells used to analyze differentiative abilities of various samples.
Human Mesenchymal Stem Chondrogenic Medium LONZA PT-3003 Cell medium used to promote chondrogenic differentiation.
ImageJ National Institutes of Health Image analysis software used in conjunction with microscopy.
itaq Universal SYBR Green One-Step Kit BioRad 1725150 Kit used for PCR.
Janus-base nanotubes (JBNts) Nanotube made from synthetic nucleobases to act as cell scaffolding tool.
LaB6 20-120 kV Transmission Electronic Microscope Tecnai Equipment used to perform transmission electron microscopy on a sample.
MATLAB MathWorks Statistical software used for modeling and data analysis.
Matrilin-3 Fisher Scientific 3017MN050 Structural protein used as adhesion sites for chondrocytes.
NanoDrop Spectrophotometer Thermo Fisher Equipment used to measure absorption values of a sample.
Nikon A1R Spectral Confocal Microscope Nikon A1R HD25 Confocal microscope used to analyze samples.
Number 1.5 Chamber Coverglass Thermo Fisher 152250 Environment for sterile cell culture and imaging.
Optimal Cutting Temperature Compound Reagent Compound used to embed cells prior to microtoming.
Paraformaldehyde Thermo Scientific AAJ19943K2 Compound used to fix cells.
PDC-32G Plasma Cleaner Harrick Plasma Cleaner used to prepare grids prior to transmission electron microscopy.
penicillin-streptomycin GIBCO 15-140-148 Antibiotic agent used to discourage bacterial growth during cell culture.
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher 10010023 Solution used to wash cell medium and act as a buffer during experimentation.
Rhodamine-phalloidin Invitrogen R415 F-Actin red fluorescent dye.
Rneasy Plant Mini Kit QIAGEN 74904 Kit used to filter and homogenize samples during RNA extraction.
Sucrose Solution Solution used to process samples prior to microtoming.
TGF beta-1 Human ELISA Kit Invitrogen BMS249-4 Assay kit used to determine the presence of TGF-β1 in a sample.
TGF-β1 PEPROTECH 100-21C Growth factor used for the stimulation of chondrogenic differentiation and proliferation.
Triton-X Invitrogen HFH10 Compound used to lyse cells not fixed during staining process.
TRIzol Reagent Thermo Fisher 15596026 Reagent used to isolate RNA.
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical Equipment used to measure zeta-potential values of a sample.

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Bioengenharia Edição 185
Fabricação e Caracterização de Nano-Matriz de Base Janus Camada por Camada para Promover a Regeneração da Cartilagem
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Landolina, M., Yau, A., Chen, Y.… More

Landolina, M., Yau, A., Chen, Y. Fabrication and Characterization of Layer-By-Layer Janus Base Nano-Matrix to Promote Cartilage Regeneration. J. Vis. Exp. (185), e63984, doi:10.3791/63984 (2022).

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